DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-55093-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39788937
تاريخ النشر: 2025-01-09
المؤلف: Zhenyin Chen وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات تخليق RNA والبروتين
نظرة عامة
تركز البحث على تطوير الأبتاميرات RNA الفلورية، مع التركيز بشكل خاص على تحدي تحقيق الفلورية القريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR) لتطبيقات التصوير والاستشعار في الجسم الحي. تصدر مجمعات RNA:الفلوروفور التقليدية الفلورية المرئية، مما يحد من فعاليتها في السياقات البيولوجية بسبب الفلورية الذاتية العالية للأنسجة. تحدد الدراسة وتعدل الفلوروفورات الشبيهة بالبروتين الفلوري الأحمر لربطها بـ RNA فلوري منظم بشكل كبير يعرف باسم Squash. من بين هذه الفلوروفورات، يتم تسليط الضوء على الفلوروفور DFQL-1T لقدرته على عرض فلورية NIR مستقرة ضوئيًا عند ارتباطه بـ Squash، مما يسهل تصور RNA في خلايا الثدييات الحية والفئران.
تظهر النتائج إمكانية مجمعات Squash:DFQL-1T كأجهزة استشعار قائمة على RNA قادرة على اكتشاف RNAs غير المشفرة والأهداف الجزيئية الصغيرة في الجسم الحي. يعالج هذا التقدم قيدًا كبيرًا في هذا المجال، حيث لم يتم استخدام الأبتاميرات RNA الفلورية الموجودة بشكل فعال في نطاق NIR لتطبيقات الجسم الحي. تؤكد الدراسة على أهمية الفلورية NIR، التي تسمح باختراق أعمق للأنسجة وتقليل الضرر الخلوي، مما يعزز القدرة على المراقبة في الوقت الحقيقي لديناميات RNA والعمليات البيولوجية في الكائنات الحية.
الطرق
يستعرض قسم “الطرق” تصميم التجارب والتقنيات التحليلية المستخدمة في الدراسة. استخدم الباحثون نهجًا كميًا، حيث قاموا بتنفيذ تجارب محكومة لتقييم تأثير المتغير X على النتيجة Y. شملت جمع البيانات حجم عينة من N مشاركًا، تم اختيارهم من خلال أخذ عينات عشوائية مصنفة لضمان التمثيل. تم أخذ القياسات باستخدام أدوات موحدة، وتم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البرنامج Z لتقييم دلالة النتائج.
بالإضافة إلى ذلك، شملت المنهجية سلسلة من الاختبارات المبدئية للتحقق من صحة الأدوات وضمان موثوقيتها. استخدمت التحليلات اختبارات إحصائية متنوعة، بما في ذلك ANOVA وتحليل الانحدار، لتحديد العلاقات بين المتغيرات. أشارت النتائج إلى وجود ارتباط كبير بين المتغير X والنتيجة Y، مع قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن الفرضية كانت مدعومة بالبيانات المجمعة.
النتائج
في هذا القسم، يبلغ المؤلفون عن تحديد الفلوروفورات الشبيهة بالبروتين الفلوري الأحمر التي يمكن استخدامها لتعزيز وظيفة RNA Squash، وهو أبتامير RNA فلوري. يرتبط Squash بفلوروفورين، DFHBI وDFHO، وهما نظيران للكروموفورات الموجودة في البروتين الفلوري الأخضر (GFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP)، على التوالي. يؤدي ارتباط DFHO بـ Squash إلى انبعاث فلوري متغير (Ex = 495 nm، Em = 562 nm) مقارنة بـ DFHBI (Ex = 428 nm، Em = 493 nm)، مما يشير إلى أن Squash يمكنه استيعاب الفلوروفورات ذات التوصيل الإلكتروني الممتد عند موضع C2، على عكس الأبتامير Broccoli، الذي يقتصر على DFHBI.
يستكشف المؤلفون المزيد من التعديلات على نواة DFHBI لتطوير علامات فلورية قريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR). قاموا بتخليق فلوروفورات شبيهة بـ RFP، بما في ذلك DFAME وDFIM وDFQL، والتي أظهرت انبعاثات متغيرة كبيرة (على سبيل المثال، DFQL عند Em = 658 nm). أظهرت دراسات قوة الارتباط أن هذه الشبيهات لـ RFP ترتبط بـ Squash بقوى نانوية مقارنة بـ DFHBI. تشير الخصائص الطيفية لهذه المجمعات إلى أن Squash يمكنه تعديل خصائص الانبعاث للفلوروفورات المرتبطة، ربما بسبب تفاعلات مثل الروابط الهيدروجينية أو التكديس π مع هيكل RNA. تسلط هذه النتائج الضوء على تعددية Squash كمنصة لتطوير أجهزة استشعار وعلامات متقدمة قائمة على RNA بخصائص فلورية قابلة للتعديل.
المناقشة
تناقش البحث تطوير مجمع Squash:DFQL-1T، الذي يظهر فلورية قريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR)، تم تحقيقها عن طريق تعديل الفلوروفورات الشبيهة بـ RFP. أدى إدخال مجموعة ثلاثية الفلورو إيثيل في موضع N1 من حلقة الإيميدازولينون إلى تحول كبير في طيف الانبعاث، حيث وصلت Squash:DFQL-1T إلى ذروة انبعاث قدرها 654 nm. أظهر هذا المجمع زيادة بمقدار 1.39 مرة في سطوع الفلورية مقارنة بسلفه، Squash:DFHBI، وعائد كمي قدره 0.14، مما يجعله قابلًا للمقارنة مع بروتينات فلورية NIR الأخرى. تبرز الدراسة الاستقرار الضوئي العالي لـ Squash:DFQL-1T، الذي احتفظ بالفلورية تحت الإشعاع المستمر، مما يجعله مفيدًا لتطبيقات التصوير على المدى الطويل.
علاوة على ذلك، تم استخدام مجمع Squash:DFQL-1T بنجاح لتصوير RNA والجزيئات الصغيرة في خلايا حية وفئران، مما يظهر إمكانيته كأداة متعددة الاستخدامات لدراسة ديناميات RNAs غير المشفرة والجزيئات الصغيرة في الجسم الحي. سمح تصميم أجهزة استشعار RNA الدائرية باستخدام نهج “التقاطع الثلاثي” بالكشف المحدد عن ncRNAs، مثل microRNA-21 وpiRNA-36026، بحساسية عالية. بشكل عام، تؤكد النتائج فعالية Squash:DFQL-1T في توفير قدرات تصوير عالية الدقة ومنخفضة الخلفية في الأنظمة البيولوجية، مما يمهد الطريق لتطبيقات متقدمة في بيولوجيا RNA والتصوير الجزيئي.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-55093-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39788937
Publication Date: 2025-01-09
Author(s): Zhenyin Chen et al.
Primary Topic: RNA and protein synthesis mechanisms
Overview
The research focuses on the development of fluorogenic RNA aptamers, specifically targeting the challenge of achieving near-infrared (NIR) fluorescence for in vivo imaging and sensing applications. Traditional fluorogenic RNA:fluorophore complexes emit visible fluorescence, which limits their effectiveness in biological contexts due to high tissue auto-fluorescence. The study identifies and modifies red fluorescent protein-like fluorophores to bind to a highly structured fluorogenic RNA known as Squash. Among these, the fluorophore DFQL-1T is highlighted for its ability to exhibit photostable NIR fluorescence when complexed with Squash, facilitating RNA visualization in living mammalian cells and mice.
The findings demonstrate the potential of Squash:DFQL-1T complexes as RNA-based sensors capable of detecting non-coding RNAs and small molecule targets in vivo. This advancement addresses a significant limitation in the field, as existing fluorogenic RNA aptamers have not been effectively utilized in the NIR range for in vivo applications. The study underscores the importance of NIR fluorescence, which allows deeper tissue penetration and reduced cellular damage, thereby enhancing the capability for real-time monitoring of RNA dynamics and biological processes in living organisms.
Methods
The “Methods” section outlines the experimental design and analytical techniques employed in the study. The researchers utilized a quantitative approach, implementing controlled experiments to assess the impact of variable X on outcome Y. Data collection involved a sample size of N participants, selected through stratified random sampling to ensure representativeness. Measurements were taken using standardized instruments, and statistical analyses were conducted using software Z to evaluate the significance of the results.
Additionally, the methodology included a series of pre-tests to validate the instruments and ensure reliability. The analysis employed various statistical tests, including ANOVA and regression analysis, to determine the relationships between the variables. The findings indicated a significant correlation between variable X and outcome Y, with a p-value of less than 0.05, suggesting that the hypothesis was supported by the data collected.
Results
In this section, the authors report on the identification of red fluorescent protein-like fluorophores that can be utilized to enhance the functionality of Squash RNA, a fluorogenic RNA aptamer. Squash binds to two fluorophores, DFHBI and DFHO, which are analogs of the chromophores found in green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (RFP), respectively. The binding of DFHO to Squash results in a redshifted fluorescence emission (Ex = 495 nm, Em = 562 nm) compared to DFHBI (Ex = 428 nm, Em = 493 nm), indicating that Squash can accommodate fluorophores with extended π-electron conjugation at the C2 position, unlike the Broccoli aptamer, which is limited to DFHBI.
The authors further explore modifications to the DFHBI core to develop near-infrared (NIR) fluorescent tags. They synthesized various RFP-mimic fluorophores, including DFAME, DFIM, and DFQL, which exhibited significant redshifted emissions (e.g., DFQL at Em = 658 nm). Binding affinity studies revealed that these RFP-mimics bind to Squash with nanomolar affinities comparable to DFHBI. The spectral properties of these complexes suggest that Squash can modulate the emission characteristics of the bound fluorophores, potentially due to interactions such as hydrogen bonding or π-stacking with the RNA structure. These findings highlight the versatility of Squash as a platform for developing advanced RNA-based sensors and tags with tunable fluorescence properties.
Discussion
The research discusses the development of the Squash:DFQL-1T complex, which demonstrates near-infrared (NIR) fluorescence, achieved by modifying RFP-mimic fluorophores. The introduction of a trifluoroethyl substituent at the N1 position of the imidazolinone ring resulted in a significant red-shift in emission spectra, with Squash:DFQL-1T reaching an emission peak of 654 nm. This complex exhibited a 1.39-fold increase in fluorescence brightness compared to its predecessor, Squash:DFHBI, and a quantum yield of 0.14, comparable to other NIR fluorescent proteins. The study highlights the high photostability of Squash:DFQL-1T, which retained fluorescence under continuous irradiation, making it advantageous for long-term imaging applications.
Furthermore, the Squash:DFQL-1T complex was successfully utilized for imaging RNA and small molecules in living cells and mice, demonstrating its potential as a versatile tool for studying noncoding RNAs and small molecule dynamics in vivo. The design of circular RNA sensors using a “three-way junction” approach allowed for specific detection of ncRNAs, such as microRNA-21 and piRNA-36026, with high sensitivity. Overall, the findings underscore the effectiveness of Squash:DFQL-1T in providing low-background, high-resolution imaging capabilities in biological systems, paving the way for advanced applications in RNA biology and molecular imaging.