DOI: https://doi.org/10.1038/s41594-024-01214-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38321148
تاريخ النشر: 2024-02-06
المؤلف: Alexandra K.L.F.S. Rebak وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات العدلات، الميالوبيروكسيداز والأكسدة
نظرة عامة
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون تقنيات البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي الكمي لبناء أطلس شامل لمواقع السيتريلين في خط خلايا اللوكيميا HL60 التي تم تمايزها إلى خلايا شبيهة بالعدلات. وقد حددوا ما مجموعه 14,056 موقع سيتريلين عبر 4,008 بروتين وقاموا بتقييم تنظيم هذه المواقع بعد تثبيط إنزيم السيتريلين PADI4. توفر هذه الموارد رؤى كمية وتفصيلية حول العديد من ركائز PADI4، بما في ذلك علامات الهيستون الرئيسية ومنظمات النسخ.
علاوة على ذلك، تسلط الأبحاث الضوء على الأهمية السريرية لمواقع السيتريلين المحددة من خلال استخدام مصفوفات الببتيد الدقيقة، مما يظهر تفاعلات الأجسام المضادة المتميزة في السائل الزليلي من الأفراد المصابين بالتهاب المفاصل الروماتويدي، المصنفين على أنهم إيجابيون لمضاد CCP السلبي وإيجابيون لمضاد CCP. بشكل عام، توفر هذه الدراسة توصيفًا شاملًا للسيتريلينوم البشري، مما يعزز فهم آليات السيتريلين ويؤسس روابط مع التهاب المفاصل الروماتويدي. تؤكد الدراسة على دور التعديلات بعد الترجمة، وخاصة السيتريلين، في تعديل وظيفة البروتين والمساهمة في تعقيد التنظيم الخلوي.
النتائج
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون نهجًا قائمًا على البروتيوميات لتحديد البروتينات السيتريلينية ومواقع تعديلها في خلايا اللوكيميا البشرية المبدئية (HL60)، سواء مع أو بدون معالجة أيون الكالسيوم. لمواجهة تحدي الكشف عن السيتريلين منخفض الوفرة في عينات معقدة، استخدموا فصل الطور العكسي عالي الرقم الهيدروجيني خارج الخط، مما أنتج 46 جزءًا لتقليل تعقيد العينة. سهلت هذه الطريقة، إلى جانب تقنيات قياس الطيف الكتلي المتقدمة، التحليل المباشر لفعاليات السيتريلين دون الحاجة إلى إثراء محدد لتعديل ما بعد الترجمة (PTM).
تم تأكيد تمايز خلايا HL60 إلى خلايا شبيهة بالعدلات (NLCs) عبر تقنية الوسترن بلوت، مما أشار إلى زيادة تنظيم إنزيم PADI4. استكشفت الدراسة خمسة ظروف بيولوجية بناءً على معالجات مختلفة لأيون الكالسيوم، مما أدى إلى سيتريلين عالمي كبير، بما في ذلك الكشف عن الهيستون السيتريليني H3R2 (H3R2Cit) والسيتريلين المعدل باستخدام جسم مضاد شامل للببتيد السيتريليني. لتعزيز تحديد مواقع السيتريلين، تم هضم العينات باستخدام إنزيم البروتيناز Lys-C، مما يضمن أن بقايا الأرجينين المستهدفة كانت موضوعة داخليًا في تسلسلات الببتيد. سمح التحليل، الذي تم إجراؤه باستخدام قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (Q-Exactive HF-X)، بالتوصيف الشامل للسيتريلينوم خلال ثلاثة أيام، مع إجراء ما مجموعه 138 عملية كروماتوغرافيا سائلة-قياس طيف الكتلة (LC-MS/MS) عبر جميع الظروف، مما يضمن تحديدًا قويًا وكمية للببتيدات السيتريلينية من خلال تصفية بيانات صارمة باستخدام MaxQuant.
المناقشة
في قسم المناقشة هذا، يقدم المؤلفون نتائج حول التغيرات في البروتيوم المرتبطة بتنشيط PADI، باستخدام تقنيات البروتيوميات المتقدمة للتحقيق في السيتريلينوم في خلايا HL60 المتميزة إلى خلايا شبيهة بالعدلات (NLCs). حققت الدراسة دقة عالية في الكمية، حيث حددت 143,403 ببتيد فريد ورسمتها إلى 10,630 جين مشفر للبروتين، مع معدل اكتشاف خاطئ قدره 1%. ومن الجدير بالذكر أن التحليل كشف عن 14,056 موقع سيتريلين عالي الثقة على 4,008 بروتين، مما وسع بشكل كبير السيتريلينوم المعروف وأبرز الأدوار التنظيمية للسيتريلين في عمليات بيولوجية متنوعة، بما في ذلك الاستجابة المناعية وإشارات الخلايا.
يؤكد المؤلفون على أهمية PADI4 في الوساطة للسيتريلين، خاصة في سياق الأمراض المناعية الذاتية مثل التهاب المفاصل الروماتويدي (RA). يظهرون أن تعبير PADI4 يتم تنظيمه بشكل متزايد خلال تمايز HL60 إلى NLCs، وتم العثور على فعاليات السيتريلين لتنظيمها بشكل محكم بواسطة تحفيز أيون الكالسيوم. توفر الدراسة أيضًا رؤى حول النسبة المئوية للسيتريلين، كاشفة عن زيادة من ~7% في خلايا HL60 إلى ~16% في NLCs، مما يشير إلى أن مستويات التعديل الأعلى قد ترتبط بالأهمية الوظيفية. بشكل عام، تؤكد النتائج على فائدة قياس الطيف الكتلي عالي الدقة في توضيح تعقيدات التعديلات بعد الترجمة وآثارها في التنظيم الخلوي والمرض.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41594-024-01214-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38321148
Publication Date: 2024-02-06
Author(s): Alexandra K.L.F.S. Rebak et al.
Primary Topic: Neutrophil, Myeloperoxidase and Oxidative Mechanisms
Overview
In this study, the authors utilized quantitative mass spectrometry-based proteomics to construct a comprehensive atlas of citrullination sites in the HL60 leukemia cell line differentiated into neutrophil-like cells. They identified a total of 14,056 citrullination sites across 4,008 proteins and assessed the regulation of these sites following the inhibition of the citrullinating enzyme PADI4. This resource offers detailed quantitative and site-specific insights into numerous PADI4 substrates, including key histone marks and transcriptional regulators.
Furthermore, the research highlights the clinical relevance of specific citrullination sites through the use of peptide microarrays, demonstrating distinct antibody reactivities in synovial fluid from individuals with rheumatoid arthritis, categorized as anti-CCP-positive and anti-CCP-negative. Overall, this work provides a systems-wide characterization of the human citrullinome, enhancing the understanding of citrullination mechanisms and establishing connections to rheumatoid arthritis. The study emphasizes the role of post-translational modifications, particularly citrullination, in modulating protein function and contributing to cellular regulatory complexity.
Results
In this study, the authors employed a proteomics-based approach to identify citrullinated proteins and their modification sites in human promyelocytic leukemia cells (HL60), both with and without calcium ionophore treatment. To address the challenge of detecting low-abundance citrullination in complex samples, they utilized offline high-pH reversed-phase fractionation, generating 46 fractions to reduce sample complexity. This method, coupled with advanced mass spectrometry (MS) techniques, facilitated the direct analysis of citrullination events without the need for post-translational modification (PTM)-specific enrichment.
The differentiation of HL60 cells into neutrophil-like cells (NLCs) was confirmed via western blot, which indicated upregulation of the PADI4 enzyme. The study explored five biological conditions based on varying calcium ionophore treatments, leading to significant global citrullination, including the detection of citrullinated histone H3R2 (H3R2Cit) and modified citrulline using a pan-peptidyl-citrulline antibody. For enhanced identification of citrullination sites, samples were digested with endoproteinase Lys-C, ensuring that targeted arginine residues were positioned internally in the peptide sequences. The analysis, conducted using high-resolution MS (Q-Exactive HF-X), allowed for the comprehensive profiling of the citrullinome within three days, with a total of 138 liquid chromatography-tandem MS (LC-MS/MS) runs performed across all conditions, ensuring robust identification and quantification of citrullinated peptides through stringent data filtering with MaxQuant.
Discussion
In this discussion section, the authors present findings on proteome changes associated with PADI activation, utilizing advanced proteomics techniques to investigate the citrullinome in HL60 cells differentiated into neutrophil-like cells (NLCs). The study achieved high quantification accuracy, identifying 143,403 unique peptides and mapping them to 10,630 protein-coding genes, with a false discovery rate of 1%. Notably, the analysis revealed 14,056 high-confidence citrullination sites on 4,008 proteins, significantly expanding the known citrullinome and highlighting the regulatory roles of citrullination in various biological processes, including immune response and cell signaling.
The authors emphasize the importance of PADI4 in mediating citrullination, particularly in the context of autoimmune diseases like rheumatoid arthritis (RA). They demonstrate that PADI4 expression is upregulated during HL60 differentiation into NLCs, and citrullination events were found to be tightly regulated by calcium ionophore stimulation. The study also provides insights into the stoichiometry of citrullination, revealing an increase from ~7% in HL60 cells to ~16% in NLCs, suggesting that higher modification levels may correlate with functional significance. Overall, the findings underscore the utility of high-resolution mass spectrometry in elucidating the complexities of post-translational modifications and their implications in cellular regulation and disease.