DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.052
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38936360
تاريخ النشر: 2024-06-26
المؤلف: S. A. Berger وآخرون
الموضوع الرئيسي: نقص المناعة والاضطرابات المناعية الذاتية
نظرة عامة
تسلط الأبحاث الضوء على تطوير بروتينات صغيرة مصممة من جديد تستهدف مستقبل IL-23R و IL-17، والتي تعتبر بدائل واعدة للعلاجات التقليدية بالأجسام المضادة للأمراض الالتهابية الذاتية. تظهر هذه البروتينات الصغيرة تقاربًا منخفضًا في البيكومولار وتثبط بشكل فعال إشارات الخلايا في المختبر، مما يظهر استقرارًا كبيرًا يسمح بالإعطاء عن طريق الفم – مما يعالج قيود العلاجات الحالية، مثل التكاليف العالية ومخاوف السلامة المرتبطة بالتسليم عن طريق الحقن. ومن الجدير بالذكر أن بروتين IL-23R الصغير تفوق على جسم مضاد سريري مضاد لـ IL-23 في نموذج الفئران لالتهاب القولون، مما يظهر حركية دوائية وتوزيع حيوي ملائمين في الجرذان.
تؤكد النتائج على إمكانية استخدام هذه البروتينات الصغيرة بوزن 7 كيلودالتون كعلاجات فموية للالتهابات التي تتوسطها خلايا T H 17. يظهر بروتين IL-17A الصغير قوة أكبر بمقدار 200 مرة من الجسم المضاد الأحادي النسيلة السريري سيكوكينوماب، مما يمنع بشكل فعال إشارات الالتهاب التي تتوسطها IL-17A في الأعضاء الظهارية البشرية. يحقق بروتين IL-23R الصغير، الذي يتم إعطاؤه بجرعة ذات صلة سريرية تبلغ 8 ملغ/كغ مرة واحدة يوميًا، تركيزات كافية لتشبع IL-23R في المصل والأنسجة المعوية. على الرغم من الإزالة السريعة من مجرى الدم، قد يسهل تقاربه العالي ومعدل الانفصال البطيء تشبع الهدف المستدام مع جرعات مريحة. بشكل عام، الحجم الصغير، والاستقرار، والقدرة على الترميز الجيني لهذه البروتينات الصغيرة تجعلها مرشحة جذابة لتطوير الأدوية البيولوجية الفموية، متجاوزة التحديات التي تطرحها الأجسام المضادة الأكبر وتعزيز إمكانية الوصول للعلاج.
مقدمة
تناقش المقدمة دور IL-23 في تعزيز تمايز وصيانة خلايا T-helper من النوع 17 (TH17)، التي تنتج بعد ذلك السيتوكين المؤيد للالتهاب IL-17. يُعترف بكل من IL-23 و IL-17 كأهداف علاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض الالتهابية الذاتية التي تتوسطها TH17، مثل مرض الأمعاء الالتهابي (IBD) والصدفية. ومع ذلك، تظهر العلاجات الحالية بالأجسام المضادة، بما في ذلك الجسم المضاد الأحادي النسيلة المضاد لـ IL-23 ستيلارا، فعالية محدودة، حيث يحقق حوالي 30% فقط من مرضى IBD الشفاء، ويفقد نسبة كبيرة من المستجيبين فعاليتهم مع مرور الوقت بسبب الأجسام المضادة المضادة للعقاقير. بالإضافة إلى ذلك، يزيد تثبيط المناعة النظامية الناتج عن هذه العلاجات من خطر الأورام والعدوى، بينما يتطلب الحجم الكبير ونفاذية الأجسام المضادة الضعيفة طرق إدارة غير مريحة.
لمعالجة هذه التحديات، تسلط المقدمة الضوء على تطوير علاجات بديلة فموية وموضعية، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة، والببتيدات، والإصدارات الفموية من الأجسام المضادة الحالية. بينما تعد هذه البدائل بتوفير مزيد من الراحة، غالبًا ما تأتي مع تكاليف عالية، ومخاطر سلامة، وفعالية محدودة. يقترح المؤلفون أن طرق التصميم الحسابي يمكن أن تسهل إنشاء بروتينات ربط صغيرة ذات خصائص مرغوبة – مثل انخفاض المناعية، والاستقرار العالي، وتقارب البيكومولار المنخفض – تستهدف IL-23R و IL-17. تهدف هذه الطريقة إلى تلبية الحاجة غير الملباة لعلاجات فعالة وآمنة وفعالة من حيث التكلفة للأمراض الالتهابية الذاتية.
طرق
تحدد قسم الطرق في ورقة البحث مجموعة شاملة من البروتوكولات التجريبية والموارد المستخدمة طوال الدراسة. تشمل المنهجيات الرئيسية تقنيات زراعة الخلايا لمجموعة متنوعة من الكائنات الحية، بما في ذلك E. coli، والخميرة، وخلايا الدم البيضاء المحيطية البشرية (PBMCs)، بالإضافة إلى إنشاء نماذج من القوارض للتجارب الحية. يوضح القسم إعداد مكتبة خميرة، وفرز الخلايا المعتمد على الفلورية (FACS)، والمسح الطفري العميق، جنبًا إلى جنب مع مجموعة متنوعة من الاختبارات لتعبير البروتين وتنقيته، مثل كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء بفصل الحجم (SE-HPLC) وكروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS).
بالإضافة إلى ذلك، يبرز القسم استخدام تقنيات متقدمة مثل البلورة بالأشعة السينية والتداخل الحيوي للدراسات الهيكلية والدراسات الربط، بالإضافة إلى اختبارات الإشارة في المختبر لـ IL-23 و IL-17. تم تقييم الحركية الدوائية والتوزيع الحيوي لبروتينات IL-23R الصغيرة في نماذج الجرذان، وتم زراعة الأعضاء الظهارية المشتقة من الجلد البشري لدراسة الاستجابات الظهارية. يوفر القسم أيضًا قائمة مفصلة من المواد الكيميائية، والأجسام المضادة، والعينات البيولوجية المستخدمة، مما يضمن إمكانية إعادة الإنتاج والشفافية في منهجية البحث.
نتائج
نجحت الدراسة في تصميم بروتينات ذات تقارب منخفض نانومولاري لمستقبل IL-23 (IL-23R) و IL-17A، تستهدف تفاعلاتها مع الوحدة الفرعية p19 لـ IL-23 ومجمع مستقبل IL-17. استخدمت عملية التصميم مزيجًا من النقاط الساخنة الأصلية والمولدة حسابيًا لإنشاء بروتينات صغيرة متنوعة، والتي تم فحصها بعد ذلك لتقارب الربط باستخدام فرز الخلايا المعتمد على الفلورية (FACS). ومن الجدير بالذكر أن تصميمين لـ IL-23R (23R-1 و 23R-2) وثلاثة تصميمات لـ IL-17A (17-1، 17-2، و 17-3) أظهرت غنىً كبيرًا خلال الاختيار، مما يشير إلى إمكاناتها كمثبطات فعالة.
كشفت الخصائص الكيميائية الحيوية أن جميع البروتينات الصغيرة المصممة أظهرت تقاربًا منخفضًا نانومولاري وأظهرت استقرارًا عاليًا تحت الضغط الحراري والكيميائي، مع درجات حرارة انتقال (Tm) تتجاوز 90 درجة مئوية لبروتينات IL-23R الصغيرة. أكدت الاختبارات الوظيفية أن هذه البروتينات الصغيرة منعت بشكل فعال إشارات IL-23 و IL-17A بطريقة تعتمد على الجرعة. بالإضافة إلى ذلك، قدمت دراسات الطفرات المشبعة رؤى حول أوضاع الربط وسلامة الهيكل للبروتينات الصغيرة، مؤكدة أنها حافظت على تشكيلاتها وتفاعلاتها المصممة مع البروتينات المستهدفة. بشكل عام، تؤكد النتائج على إمكانية التصميم الحسابي في تطوير العلاجات المستهدفة للأمراض الالتهابية الذاتية.
مناقشة
تناقش الأبحاث التقدم في تصميم وتحسين مضادات البروتين التي تستهدف IL-23R و IL-17A، مع التركيز على تحسين قوتها واستقرارها للإعطاء عن طريق الفم. من خلال التطور في المختبر والتصميم الحسابي، تم هندسة البروتينات الصغيرة لتظهر تقاربًا محسّنًا بشكل كبير – يصل إلى 1,000 مرة لـ IL-23R و 60 مرة لـ IL-17A – مقارنة بتصميماتها الأصلية. ومن الجدير بالذكر أن إدخال الروابط الثنائية الجزيئية في متغيرات مثل 23R-64 و 23R-91 أدى إلى تحسين الاستقرار ضد البروتينات الهضمية، مع نصف أعمار في سوائل المعدة والأمعاء المحاكية تمتد من دقائق إلى عدة ساعات. أظهرت المتغيرات الأكثر وعدًا، 23R-72 و 23R-91، حجبًا فعالًا لإشارات IL-23 في نماذج خلايا الجرذان والبشر، مما يشير إلى أهميتها العلاجية المحتملة.
علاوة على ذلك، كشفت الدراسات الحركية الدوائية في الجرذان أن هذه البروتينات الصغيرة يمكن أن تصل إلى تركيزات ذات صلة علاجية في الأنسجة المعوية بعد الإعطاء عن طريق الفم، مع إظهار 23R-91 معدل انفصال بطيء يدعم الارتباط المستمر بالهدف. في نموذج الفئران المحسن لالتهاب القولون، أدى الإعطاء عن طريق الفم لـ 23R-91 إلى تحسينات كبيرة في درجات المرض، مقارنة بجسم مضاد أحادي النسيلة ذي صلة سريرية، مما يوضح فعالية علاج بروتين فموي في نموذج مرض الأمعاء الالتهابي. تؤكد هذه النتائج على إمكانية استخدام البروتينات الصغيرة المهندسة كعلاجات فموية فعالة للحالات المناعية الذاتية، مما يمهد الطريق للتطبيقات السريرية المستقبلية.
القيود
تقدم الدراسة عدة قيود بشأن استخدام البروتين الصغير 23R-91 في علاج التهاب القولون ضمن نموذج NSG-IBD. بينما أظهر المركب فعالية مع جرعة فموية مرة واحدة يوميًا، يتم إزالته بسرعة من مجرى الدم بعد الإعطاء، مما يشير إلى الحاجة لمزيد من البحث لتعزيز عمله المستدام، خاصةً من أجل تثبيط IL-23R خارج الأمعاء. تثير الجرعات العالية المستخدمة في الدراسات الحركية الدوائية (PK) والدراسات الفعالية مخاوف بشأن جدوى التطبيقات السريرية، مما يشير إلى أن تطوير أشكال جرعات فموية صلبة تزيد من تركيزات البروتين الصغير المحلي يمكن أن يحسن الامتصاص ويقلل من الجرعات المطلوبة.
بالإضافة إلى ذلك، لم تقم الدراسة بتأسيس فعالية حية للبروتينات الصغيرة IL-17، مما يبرز فجوة تتطلب مزيدًا من التحقيق. إن معالجة هذه القيود أمر حاسم للتحقق من البروتينات الصغيرة كوسيلة بيولوجية فموية قابلة للتطبيق لكل من المؤشرات المعوية وغير المعوية.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.052
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38936360
Publication Date: 2024-06-26
Author(s): S. A. Berger et al.
Primary Topic: Immunodeficiency and Autoimmune Disorders
Overview
The research highlights the development of de novo-designed miniproteins targeting Interleukin (IL)-23R and IL-17, which serve as promising alternatives to traditional antibody therapies for autoinflammatory diseases. These minibinders exhibit low picomolar affinities and effectively inhibit cell signaling in vitro, demonstrating significant stability that allows for oral administration—addressing the limitations of existing therapies, such as high costs and safety concerns associated with parenteral delivery. Notably, the IL-23R minibinder outperformed a clinical anti-IL-23 antibody in a mouse model of colitis, showcasing favorable pharmacokinetics and biodistribution in rats.
The findings underscore the potential of these 7 kDa minibinders as oral therapeutics for T H 17-mediated inflammation. The IL-17A minibinder exhibits 200-fold greater potency than the clinical monoclonal antibody secukinumab, effectively preventing IL-17A-mediated inflammatory signaling in human epithelial organoids. The IL-23R minibinder, administered at a clinically relevant dose of 8 mg/kg once daily, achieves concentrations sufficient to saturate IL-23R in serum and intestinal tissues. Despite rapid clearance from the bloodstream, its high affinity and slow dissociation rate may facilitate sustained target saturation with convenient dosing. Overall, the small size, stability, and genetic encodability of these minibinders position them as attractive candidates for the development of oral biologics, overcoming the challenges posed by larger antibodies and enhancing therapeutic accessibility.
Introduction
The introduction discusses the role of Interleukin (IL)-23 in promoting the differentiation and maintenance of T-helper type 17 (TH17) cells, which subsequently produce the pro-inflammatory cytokine IL-17. Both IL-23 and IL-17 are recognized as therapeutic targets for various TH17-mediated autoinflammatory diseases, such as inflammatory bowel disease (IBD) and psoriasis. However, current antibody therapies, including the anti-IL-23 monoclonal antibody Stelara, show limited efficacy, with only about 30% of IBD patients achieving remission and a significant proportion of responders losing efficacy over time due to anti-drug antibodies. Additionally, systemic immune suppression from these therapies increases the risk of malignancies and infections, while the large size and poor permeability of antibodies necessitate inconvenient administration routes.
To address these challenges, the introduction highlights the development of alternative oral and topical therapies, including small molecules, peptides, and oral versions of existing antibodies. While these alternatives promise greater convenience, they often come with high costs, safety risks, and limited efficacy. The authors propose that computational design methods can facilitate the creation of small binding proteins with desirable properties—such as low immunogenicity, high stability, and low picomolar affinity—targeting IL-23R and IL-17. This approach aims to fulfill the unmet need for effective, safe, and cost-efficient treatments for autoinflammatory diseases.
Methods
The methods section of the research paper outlines a comprehensive array of experimental protocols and resources utilized throughout the study. Key methodologies include cell culture techniques for various organisms, including E. coli, yeast, and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), as well as the establishment of rodent models for in vivo experiments. The section details the preparation of a yeast library, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and deep mutational scanning, alongside various assays for protein expression and purification, such as size exclusion high-performance liquid chromatography (SE-HPLC) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Additionally, the section emphasizes the use of advanced techniques like X-ray crystallography and biolayer interferometry for structural and binding studies, as well as in vitro signaling assays for interleukin (IL)-23 and IL-17. The pharmacokinetics and biodistribution of IL-23 receptor minibinders were assessed in rat models, and human skin-derived epithelial organoids were cultured to study epithelial responses. The section also provides a detailed list of reagents, antibodies, and biological samples used, ensuring reproducibility and transparency in the research methodology.
Results
The study successfully designed proteins with low nanomolar affinity for the IL-23 receptor (IL-23R) and IL-17A, targeting their respective interactions with the p19 subunit of IL-23 and the IL-17 receptor complex. The design process utilized a combination of native and computationally generated hotspots to create diverse miniproteins, which were then screened for binding affinity using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Notably, two IL-23R designs (23R-1 and 23R-2) and three IL-17A designs (17-1, 17-2, and 17-3) exhibited significant enrichment during selection, indicating their potential as effective inhibitors.
Biochemical characterization revealed that all designed minibinders exhibited low nanomolar binding affinities and demonstrated high stability under thermal and chemical stress, with transition temperatures (Tm) exceeding 90°C for IL-23R minibinders. Functional assays confirmed that these minibinders effectively blocked IL-23 and IL-17A-mediated signaling in a dose-dependent manner. Additionally, saturation mutagenesis studies provided insights into the binding modes and structural integrity of the minibinders, confirming that they maintained their designed conformations and interactions with the target proteins. Overall, the findings underscore the potential of computational design in developing targeted therapeutics for autoinflammatory diseases.
Discussion
The research discusses advancements in the design and optimization of protein antagonists targeting IL-23R and IL-17A, focusing on improving their potency and stability for oral administration. Through in vitro evolution and computational design, minibinders were engineered to exhibit significantly enhanced binding affinities—up to 1,000-fold for IL-23R and 60-fold for IL-17A—compared to their parent designs. Notably, the introduction of intramolecular disulfides in variants like 23R-64 and 23R-91 resulted in improved stability against gastrointestinal proteases, with half-lives in simulated gastric and intestinal fluids extending from minutes to several hours. The most promising variants, 23R-72 and 23R-91, demonstrated effective blockade of IL-23-mediated signaling in both rat and human cell models, indicating their potential therapeutic relevance.
Furthermore, pharmacokinetic studies in rats revealed that these minibinders could reach therapeutically relevant concentrations in gastrointestinal tissues after oral administration, with 23R-91 showing a slow dissociation rate that supports prolonged target engagement. In a humanized mouse model of colitis, oral administration of 23R-91 yielded significant improvements in disease scores, comparable to a clinically relevant monoclonal antibody, thereby demonstrating the efficacy of an oral protein therapeutic in a model of inflammatory bowel disease. These findings underscore the potential of engineered minibinders as effective oral therapeutics for autoimmune conditions, paving the way for future clinical applications.
Limitations
The study presents several limitations regarding the use of minibinder 23R-91 in treating colitis within the NSG-IBD model. While the compound demonstrated efficacy with once-daily oral dosing, it is rapidly cleared from the bloodstream post-administration, indicating a need for further research to enhance its sustained action, particularly for extraintestinal inhibition of IL-23R. The high doses utilized in pharmacokinetic (PK) and efficacy studies raise concerns about the feasibility of clinical applications, suggesting that the development of solid oral dosage forms that increase local minibinder concentrations could optimize uptake and reduce required dosages.
Additionally, the study did not establish in vivo efficacy for IL-17 minibinders, highlighting a gap that necessitates further investigation. Addressing these limitations is crucial for validating minibinders as a viable oral biologic modality for both gastrointestinal and non-gastrointestinal indications.