“الوظيفة الرئيسية للجسم هي حمل الدماغ.””
توماس أ. إديسون (1847-1931)
قد لا أكون قد ذهبت إلى حيث كنت أنوي الذهاب،
لكن أعتقد أنني انتهيت حيث كنت بحاجة أن أكون.
دوغلاس آدامز (1952-2001)

تم الاستلام في 28 مارس 2024؛
إي بوب 6 أبريل 2024؛
© المؤلفون، 2024.
المراسلات:
توماس هارتونغ، دكتور في الطب، دكتوراه، مركز البدائل لاختبار الحيوانات (CAAT)، جامعة جونز هوبكنز، 615 شمال شارع وولف، بالتيمور، ماريلاند، 21205، الولايات المتحدة الأمريكية
(THartun1 @jhu.edu)

ALTEX 41(2)، 152-178. doi:10.14573/altex.2403281

اختبار السمية العصبية التنموية (DNT) يتنبأ بخطر التعرض للمواد الكيميائية على تطوير الدماغ البشري. يمكن الآن لاستراتيجيات الاختبار المتقدمة الشاملة غير الحيوانية باستخدام التكنولوجيا المتطورة أن تحل محل الأساليب المعتمدة على الحيوانات لتقييم هذا الخطر المعقد. يمكن لهذه الاستراتيجيات تقييم أعداد كبيرة من المواد الكيميائية بدقة وكفاءة أكبر من الأسلوب المعتمد على الحيوانات. وقد قامت توجيهات الاختبار الحديثة من منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD) بتوثيق هذه البطارية من طرق الاختبار في المختبر لـ DNT، مما يمثل إنجازًا محوريًا في هذا المجال. إن التحول نحو الاختبار غير الحيواني يعكس التزامًا برفاهية الحيوانات واعترافًا متزايدًا بالتأثيرات الاقتصادية والصحية العامة المرتبطة بالوظائف الإدراكية المتضررة الناتجة عن التعرض للمواد الكيميائية. تسهم هذه الابتكارات في النهاية في إدارة كيميائية أكثر أمانًا وحماية أفضل للصحة البشرية، خاصة خلال المراحل الحساسة من تطوير الدماغ.

مقالنا في عام 2014 في هذه السلسلة من “غذاء للتفكير” … “السمية العصبية التنموية – التحديات في قرن والفرص في المختبر” حلل حالة الفن والفرص الناشئة لاختبار السمية العصبية التنموية (DNT) (سميرنوفا وآخرون، 2014). لقد تم إحراز تقدم كبير منذ ذلك الحين. هنا، سنربط التطور الاستراتيجي للمجال من عدم وجود بديل لاختبار الحيوانات للسمية العصبية التنموية إلى التأسيس الأخير لمنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD) “التوصيات الأولية بشأن تقييم البيانات من بطارية اختبار السمية العصبية التنموية (DNT) في المختبر” (OECD، 2023) على مدى 18 عامًا.

DNT هو قضية صحية عامة رئيسية في سياق اضطراب طيف التوحد (ASD) واضطراب نقص الانتباه مع فرط النشاط (ADHD) وغيرها من التأخيرات النمائية العصبية (الجدول 1). الدماغ النامي أكثر عرضة للتأثيرات البيئية من الدماغ الناضج بسبب عوامل الديناميكا الدوائية، وآليات الدفاع غير الناضجة، والعمليات المعقدة للنمو العصبي (مثل التكاثر، والهجرة، والتمايز) (رايس وبارون، 2000؛ رودير، 1995). تحدث هذه العمليات في أطر زمنية مضبوطة بدقة على مدى عدة سنوات وتخلق نوافذ مختلفة من الضعف. يمكن أن تسهم التدخلات في العمليات النمائية، مثل التعرض للمواد الكيميائية، في الاضطرابات النمائية العصبية مثل ASD وADHD والإعاقات الذهنية (كوهين، 2010؛ ساجيف وآخرون، 2010؛ غراندجان ولاندريغان، 2004؛ لاندريغان، 2010؛ روسينيول وآخرون، 2014). ومع ذلك، تم تحديد عدد قليل جداً من المواد على أنها سموم عصبية نمائية بسبب نقص المعلومات العامة عن سمية المواد الكيميائية (غراندجان ولاندريغان، 2006، 2014) (الشكل 1)، وتستراتيجيات اختبار الحيوانات الحالية لـ DNT لها عدة قيود (وكالة حماية البيئة الأمريكية، 1998؛ منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية، 2007): فهي مكلفة (1.4 مليون دولار لكل مادة)، تستغرق وقتاً طويلاً (حوالي عامين)، وتتطلب أعداداً كبيرة من الحيوانات. بالإضافة إلى ذلك، هناك مخاوف علمية مبررة بشأن مدى صلة هذه الدراسات بصحة الإنسان (انظر القسم 2).

اختبار DNT أمر حيوي في سياق الصحة العامة بسبب الزيادة في حدوث الاضطرابات النمائية العصبية مثل اضطراب طيف التوحد (ASD) وزيادة الوعي العام بها؛ تشير أحدث البيانات من عام 2023 إلى أنه في الولايات المتحدة، يتم تشخيص 1 من كل 36 طفلًا يبلغ من العمر 8 سنوات الآن باضطراب طيف التوحد (ماينر وآخرون، 2023) (جدول. ). وبالمثل، من 2009 إلى 2017، كان هناك زيادة ملحوظة في انتشار اضطراب فرط الحركة وتشتت الانتباه (ADHD) بين الأطفال الأمريكيين الذين تتراوح أعمارهم بين 3-17 عامًا (من 8.5% إلى 9.5% وفقًا لمسح المقابلات الصحية الوطنية، وهو مسح تمثيلي على مستوى البلاد للسكان المدنيين غير المؤسسيين (زابلو تسكي وآخرون، 2019)) وغيرها من الحالات التي تؤثر على التطور المعرفي والسلوكي لدى الأطفال. هذه الاضطرابات لها تأثيرات اجتماعية واقتصادية كبيرة، بما في ذلك فقدان الإنتاجية-

الحاجة إلى الرعاية مدى الحياة، والتي يمكن أن تصل تكلفتها إلى ملايين الدولارات لكل حالة.

يعتبر اضطراب الغدد الصماء، وخاصة نظام هرمون الغدة الدرقية، أحد المساهمين في الإعاقة التنموية العصبية (DNT). قام غايلورد وآخرون (2020) بتحليل بيانات المسح الوطني للصحة والتغذية (NHANES) من 2001-2016 لتقييم عبء الإعاقة التنموية العصبية والتكاليف المرتبطة بها بسبب التعرض المبكر لمركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم (PBDEs) والفوسفات العضوية والزئبق العضوي والرصاص في الولايات المتحدة. ساهم التعرض لمركبات PBDE في الرحم بأكبر قدر في عبء الإعاقة الفكرية (ID)، مما أدى إلى فقدان 162 مليون نقطة من معدل الذكاء (IQ) و738,000 حالة ID، تليها الرصاص والفوسفات العضوية والزئبق العضوي. من 2001 إلى 2016، انخفض فقدان IQ الناتج عن مركبات PBDE والزئبق العضوي والرصاص أو ظل ثابتًا، بينما زاد فقدان IQ الناتج عن الفوسفات العضوية. انخفضت التكلفة الإجمالية لحالات ID من مليار سنويًا في 2001-2002 إلى حوالي مليار سنويًا في 2015-2016، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى تقليل التعرض لمركبات PBDE والرصاص. أشار المؤلفون إلى أنه على الرغم من أن هذه الاتجاهات تظهر عمومًا فوائد من تنظيم المواد الكيميائية، فإن الاستخدام المتزايد للبدائل المحتملة الضارة للمواد الكيميائية التي تم التخلص منها يثير القلق. قدر بويل وآخرون (2021) أن التعرض للرصاص في مرحلة الطفولة المبكرة في الولايات المتحدة من 1999-2010 أدى إلى

فقدان حوالي مليار سنويًا. كان للتعرض للرصاص لدى الرضع من الأمريكيين الأفارقة أكبر تأثير اقتصادي، مع متوسط فقدان قدره لكل طفل، مما يمثل مليار) من إجمالي الخسائر على الرغم من أنهم يمثلون فقط من السكان. ومن الجدير بالذكر أن 74% من إجمالي العبء الاقتصادي كان مرتبطًا بمستويات الرصاص في الدم أقل من , مما يبرز العواقب الكبيرة حتى للتعرض المنخفض للرصاص في مرحلة الطفولة.

قدر بيلانجر وآخرون (2015) عبء الإعاقة التنموية العصبية والتكاليف المرتبطة بمركبات PBDE والفوسفات العضوية وغيرها من التعرضات للمواد الكيميائية المسببة للاضطرابات الهرمونية في الاتحاد الأوروبي. قامت لجنة خبراء بتقييم الأدلة الوبائية والسمية التي تسهم في فقدان IQ والإعاقة الفكرية وASD وADHD. كان التعرض لمركبات PBDE مرتبطًا بفرصة لفقدان 873,000 نقطة IQ و3,290 حالة إعاقة فكرية، بتكلفة
€9.59 مليار سنويًا. كان التعرض للفوسفات العضوية مرتبطًا بفرصة لفقدان 13 مليون نقطة IQ و59,300 حالة إعاقة فكرية، بتكلفة مليار سنويًا. كان التعرض للمواد الكيميائية المسببة للاضطرابات الهرمونية مرتبطًا بفرصة للتسبب في 316 حالة ASD بتكلفة مليون سنويًا، وفرصة للتسبب في 19,300-31,200 حالة ADHD بتكلفة مليار سنويًا. خلص المؤلفون إلى أن التعرض للمواد الكيميائية المسببة للاضطرابات الهرمونية يسهم على الأرجح بشكل كبير في العجز السلوكي العصبي والتكاليف المرتبطة به.

تشير الزيادة في معدلات هذه الاضطرابات إلى أن عوامل نمط الحياة والتعرضات الكيميائية من المحتمل أن تكون مساهمات، مما يجعل اختبار DNT أداة أساسية لتحديد وتخفيف الأسباب البيئية المحتملة. إن نقص البيانات الشاملة حول التأثيرات السمية العصبية لمعظم المواد الكيميائية، بما في ذلك تلك الموجودة في الملوثات البيئية والمواد الكيميائية الصناعية والأدوية والمنتجات الاستهلاكية،
ومضافات الطعام، يبرز الحاجة الملحة لاستراتيجيات اختبار DNT موثوقة. ومع ذلك، لا يوجد متطلب قانوني لتقديم بيانات DNT لمعظم المواد الكيميائية. وبالتالي، لا توجد بيانات على الإطلاق حول من جميع المواد الكيميائية التي يتعرض لها البشر.

علم الوبائيات معقد بنفس القدر. بناءً على ذلك، خلصت مراجعة موثوقة للمجال إلى أن 14 مادة فقط تم تصنيفها بشكل كافٍ كمسممات عصبية تنموية بشرية (غرانجيان ولاندريغان، 2014). لا يمكننا تتبع ASD أو غيرها من الاضطرابات التنموية العصبية إلى هذه المواد فقط، لذا هناك بالتأكيد المزيد، وهذا هو ما يتعلق به اختبار DNT. يمكن لاختبار DNT تحديد التفاعلات البيئية والوراثية التي قد تؤدي إلى هذه الحالات وبالتالي يمكن أن يوجه اللوائح لحماية الصحة العامة.

تناول مقالنا لعام 2014 (سميرنوفا وآخرون، 2014) القضية الملحة لاختبار DNT. وأكد على القيود الموجودة في الدراسات التقليدية المعتمدة على الحيوانات. سلط المقال الضوء على الزيادة في حدوث الاضطرابات التنموية العصبية والوعي العام بتأثيرات هذه الحالات الاجتماعية والاقتصادية الكبيرة. كما أشار إلى التحديات التي تواجهها الدراسات الوبائية في إقامة علاقات سببية بين التعرضات البيئية والاضطرابات التنموية العصبية، بسبب الصعوبات في تصميم الدراسات، وأخذ العينات البيولوجية، ومقاييس التعرض. استكشف المقال الحركة نحو طرق تقييم DNT البديلة، التي بدأت من خلال ورش العمل والمؤتمرات الدولية التي نظمتها مجموعات وخبراء مؤسسات. كان هذا الجهد يهدف إلى تحديد الأساليب البديلة الواعدة، مثل استخدام مسارات النتائج السلبية (AOPs) (ليست وآخرون، 2017) واستراتيجيات الاختبار المتكاملة (ITS) (هارتونغ وآخرون، 2013a؛ روفيدا وآخرون، 2015)، لتعزيز القدرة التنبؤية والملاءمة لاختبار DNT. أكد المقال على الحاجة إلى طرق بيولوجية وتقنية مبتكرة للتغلب على قيود نماذج الاختبار الحالية. على الرغم من التقدم المحرز حتى ذلك الحين، إلا أنه اعترف بالتحديات المستمرة في التحقق من صحة ودمج هذه الأساليب الجديدة في الأطر التنظيمية. دعا المقال إلى استمرار الابتكار والتعاون والتقييم الاستراتيجي لتحسين جودة وكفاءة اختبار DNT، بهدف حماية صحة الإنسان بشكل أفضل دون الاعتماد على اختبار الحيوانات.

تعتبر حالة DNT توضيحًا يكشف عن مدى صعوبة اختبار المخاطر المعقدة في نماذج الحيوانات. يتم تناول بعض المخاوف المتعلقة بـ DNT في دراسة الجيلين OECD Test Guideline (TG) 416، التي تعتبر الدراسة الأكثر تحديدًا للسمية التنموية والتناسلية (DART) في الحيوانات (OECD، 2001). نظرًا للتأثير المحتمل للمواد الكيميائية على تطوير الدماغ البشري، كانت تطوير واعتماد OECD TG 426 (OECD، 2007) وإرشادات اختبار السمية التناسلية الممتدة للجيل الواحد 443 (OECD، 2018) معالم مهمة في تطور اختبار DNT. تم تقييم كل من TG 426 وTG 443 بشكل نقدي وتحسينهما لضمان أنهما يعكسان أفضل العلوم المتاحة لتقييم إمكانية DNT في تقييم مخاطر الصحة العامة باستخدام الحيوانات. تؤكد الإرشادات على أهمية مراعاة الطبيعة المعقدة للتطور العصبي-
والحاجة إلى مجموعة متنوعة من طرق الاختبار لمعالجة جوانب مختلفة من DNT (ماكريس وآخرون، 2009؛ آرتس وآخرون، 2023).

توفر توجيهات منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية TG 426 إطارًا لإجراء دراسات DNT في الجسم الحي. تم تصميم الإرشادات لتحديد المواد الكيميائية التي قد تؤثر على الجهاز العصبي أثناء التطور، وتوصيف أي تغييرات ناتجة عن المواد الكيميائية وتقدير مستويات الجرعة للاستخدامات التنظيمية. تشمل نقاط نهاية محددة لتقييم التأثيرات الوظيفية والسلوكية والمورفولوجية على الجهاز العصبي، مع اختبارات إضافية للنسل المعرض في الرحم وأثناء الرضاعة المبكرة (ماكريس وآخرون، 2009). ومع ذلك، لا يمكن قياس النتائج السلبية البشرية النموذجية مثل انخفاض القدرات اللغوية، سلوك طيف التوحد أو انخفاض درجات الذكاء بشكل واقعي. بدلاً من ذلك، تقيس بعض نقاط النهاية التي ليست خصائص نموذجية للأمراض البشرية مثل سلوك العناية المتغيرة، تفضيلات الضوء والظلام المتغيرة، ردود الفعل على الشوارب، تأخر فتح العين، إلخ. لم يتم التحقق رسميًا من صحة هذه الاختبارات في تجارب الحلقة وهي مكلفة وتستغرق وقتًا طويلاً. في دراسة واحدة، يتم استخدام حوالي 1200 جرو من الجرذان، وتستمر الجزء التجريبي من الدراسة حوالي ثلاثة أشهر. يستغرق تقييم البيانات (مثل قراءة علم الأمراض) حوالي عامين، مع وصول التكاليف الإجمالية إلى حوالي مليون لكل مادة. قد لا تكون حساسية الاختبارات كافية لاكتشاف التأثيرات العصبية السامة الدقيقة التي قد تكون ذات صلة بصحة الإنسان.

توسع توجيهات منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية TG 443، المعروفة أيضًا بدراسة سمية الإنجاب من جيل واحد الممتدة، على الإرشادات السابقة من خلال تضمين تقييمات التأثيرات الإنجابية والتطورية ضمن دراسة واحدة (مور وآخرون، 2016). يسمح بفحص أجيال متعددة ويشمل وحدات اختيارية لتقييم DNT والسمية المناعية. تهدف هذه الإرشادات إلى توفير فهم أكثر شمولاً للمخاطر المحتملة للإنجاب والتطور لمادة ما مع استخدام عدد أقل من الحيوانات مقارنة بالدراسات التقليدية من جيلين (OECD TG 416). في الممارسة الفعلية، لا يحتفظ العدد المخفض من الحيوانات المطلوبة حقًا (انظر أدناه).

إن الصلة العلمية لدراسات DNT على الحيوانات بتأثيرات صحة الإنسان مشكوك فيها (سميرنوفا وآخرون، 2014):

الاختلافات بين الأنواع: تؤثر الاختلافات بين الأنواع بين البشر والحيوانات المستخدمة في اختبار DNT مثل الجرذان أو الفئران على استقراء البيانات من الحيوانات إلى البشر، حيث يمكن أن تختلف آليات التطور العصبي والاستجابات للمواد السامة بشكل كبير بين الأنواع. الدماغ البشري هو أكثر أعضائنا تعقيدًا، وتكرار تطوره في نماذج حيوانية يمثل تحديًا بطبيعته.

التنوع الجيني: قيد آخر هو عدم قدرة النماذج الحيوانية على عكس الاختلافات الجينية والوراثية بين الأفراد الموجودة في السكان البشر. يمكن أن تؤثر هذه الاختلافات على القابلية للسموم العصبية، وعادةً ما تفتقر النماذج الحيوانية المعتمدة على سلالات متزاوجة إلى هذا التنوع.

تفسير سلوكي ونسجي: من الصعب تفسير التأثيرات السلوكية في الحيوانات. قد لا تمثل الاختبارات السلوكية في الحيوانات بدقة السلوكيات البشرية المعقدة أو الوظائف الإدراكية التي قد تتأثر بالسموم العصبية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنشأ آثار محتملة في القياسات النسيجية المورفومترية، ولا تكون المعايير لقياسات الملاحظة دائمًا واضحة، مما يؤدي إلى عدم اليقين في تقييم البيانات النسيجية.

بالإضافة إلى المخاوف العلمية، فإن المخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الحيوانات في البحث كبيرة وقد أدت إلى دعوات لتقليل وتحسين واستبدال اختبار الحيوانات. علاوة على ذلك، فإن تكلفة واستهلاك الوقت والجهد لاختبارات DNT المعتمدة على الحيوانات تعيق الفحص الروتيني للمواد الكيميائية. وهذا يؤدي إلى بقاء العديد من المواد الكيميائية المحتملة DNT غير محددة بسبب عدم جدوى اختبارها جميعًا باستخدام الإرشادات الحالية المعتمدة على الحيوانات.

يجب أيضًا مراعاة الجوانب الاقتصادية (ميغس وآخرون، 2018): كان من المتوقع أن يقلل TG 443، الذي يحتوي على وحدة DNT يمكن تفعيلها أو أن تكون جزءًا من الروتين اعتمادًا على المتطلبات التنظيمية، من تكاليف دراسات TG 416 (شيفلرز وآخرون، 2015). ومع ذلك، أظهر تحليل تم تكليفه من قبل الوكالة الأوروبية للمواد الكيميائية أن السعر العالمي المتوسط لـ TG 416 هو 285,842 يورو (المتوسط الأوروبي هو 318,295 يورو)، بينما يبلغ السعر المتوسط لـ TG 443 للدراسة الأساسية (بدون الجيل الثاني ومجموعات إضافية) ، ومع الجيل الثاني ، أي، أكثر من TG 416. مع المجموعات الإضافية، يرتفع السعر إلى لمجموعة DNT أو لمجموعة السمية المناعية؛ بما في ذلك كلا المجموعتين وتكاليف الجيل الثاني . كما تم دحض التوقع بأن TG 443 سيوفر بشكل كبير في عدد الحيوانات (نايت وآخرون، 2023؛ روفيدا وآخرون، 2023): بينما استخدمت TG 416 في تسجيلات REACH في المتوسط 2,590 حيوانًا (3,098 مع دراسات تحديد نطاق الجرعة (DRF))، استخدمت TG 443 1,318 (1,826 مع DRF) ومع الجيل الثاني 2,226 (2,734 مع DRF)، أي تقليل ولكن فقط
للدراسة الأساسية. مدة اختبار TG 443 مقارنة بـ TG 416 هي ميزة طالما لم يتم تفعيل الجيل الثاني.

باختصار، بينما قدم اختبار DNT المعتمد على الحيوانات بيانات حاسمة للقرارات التنظيمية الفردية، فإن القيود قد دفعت إلى تطوير استراتيجيات اختبار بديلة تكون أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة وذات صلة بالبشر. ومع ذلك، فإن الغياب الأولي للبدائل لاختبار الحيوانات شكل تحديًا هائلًا.

تمت كتابة مقالتنا الأولى حول DNT في هذه السلسلة (سميرنوفا وآخرون، 2014) بالتزامن مع اجتماع DNT-4 في فيلادلفيا. ستوضح الملخص التالي لكيفية وصولنا إلى فيلادلفيا التطور الاستراتيجي الفريد لاستبدال اختبار الحيوانات. بدأ كل شيء مع ألان غولدبرغ، في ذلك الوقت مدير CAAT، الذي اقترب من توماس هارتونغ، في ذلك الوقت رئيس المركز الأوروبي للتحقق من الطرق البديلة (ECVAM)، في عام 2004، قائلاً: “توماس، يجب أن نفعل شيئًا حيال ذلك.” وقد أثار هذا فريقًا متزايدًا من المتعاونين الذين يعملون معًا في هذا الجهد. قال ألان غولدبرغ: “اخترت DNT كموضوع لـ TestSmart لأنه لم تكن هناك متطلبات محددة لـ DNT، لذا لم نكن مضطرين للمطابقة مع نهج في الجسم الحي.” كانت أهم قرار استراتيجي هو الانخراط مع الوكالات التنظيمية

: وكالة حماية البيئة الأمريكية (US EPA) منذ البداية، ولاحقًا الهيئة الأوروبية لسلامة الغذاء (EFSA) ومنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD) (الشكل 2).

بدأ النقاش في أسبن حوالي عام 2003 مع باميلا لين، ألان غولدبرغ، وكيفن كروفتون يتحدثون عن الحاجة إلى اختبار DNT (لين وآخرون، 2005). بدأت ساندرا كوك، آنا بال-برايس، تشانترا إيسكس، وهيلينا هوغبرغ العمل على هذا الموضوع في ECVAM في نفس الوقت تقريبًا (هوغبرغ وآخرون، 2010، 2011؛ بالبرايس وآخرون، 2010). مع مرور الوقت، تم تطوير مجموعة متنوعة من الاختبارات وجلبت عائلة متزايدة من الباحثين بما في ذلك بيل مندي، إلين فريتشي، مارسيل ليست، تيم شافر، والعديد من الآخرين. عندما انتقل توماس هارتونغ، إروين فان فليت، وهيلينا هوغبرغ إلى CAAT في عام 2009، بدأوا مختبرات تركز على DNT وعقدوا ورش عمل حول DNT. تم تلخيص سلسلة ورش العمل والمؤتمرات التي تم تنظيمها بشكل مشترك من قبل CAAT وECVAM وUS EPA في ما يلي.

في ECVAM، تم تنظيم الورشة الأولى كجزء من التعاون بين CAAT وECVAM وCEFIC (صناعة الكيمياء في أوروبا) في الفترة من 19 إلى 21 أبريل 2005، في إيسبرا، إيطاليا. المقال الذي كتبه كوك وآخرون (2007) يتناول ورشة العمل الأولى. كان الهدف من ورشة العمل هو تحديد وتصنيف الطرق المختبرية التي يمكن أن تتنبأ وتحدد مخاطر DNT. كانت المناقشات تركز على علم DNT، بما في ذلك النماذج التي يمكن أن تلتقط الآليات والعمليات الحرجة، والسياسة والاستراتيجية لدمج الطرق البديلة في الأطر التنظيمية. وقد أوضح التقرير التوصيات والأولويات للعمل المستقبلي، مع التأكيد على الحاجة إلى نماذج DNT المختبرية عالية الإنتاجية والتحقق التنظيمي منها. كما أبرز أهمية تحديد الاختبارات المختبرية التي يمكن أن تتنبأ بفعالية بمخاطر DNT، والدور الحاسم للفهم الآلي في تطوير هذه الاختبارات، والحاجة إلى نهج تعاوني بين العلماء والمنظمين وأصحاب المصلحة لدمج هذه الطرق في استراتيجيات تقييم المخاطر.

لقد ناقشنا بالفعل في هذه الورقة حول ورشة العمل لعام 2005 أن خلايا الجذع الجنينية قد تكون إمكانية لتأهيل الفحوصات. كان ذلك قبل عام من تطوير ياماناكا لخلايا الجذع متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) وكان لا يزال يمثل معضلة أخلاقية. كما كنا بحاجة إلى تحديد ما هي النقاط النهائية والجوانب المتعلقة بتطور الأعصاب التي يجب نمذجتها في هذه الثقافات. تم التركيز على عدد من الأحداث الرئيسية، التي شعرنا أنه يجب قياسها لنمذجة أو تقييم DNT.

كان هناك سؤال آخر حول أي نوع من نماذج الخلايا سيكون مناسبًا – ما مدى تعقيده، وما مدى بساطته للسماح بمرور كافٍ؟ كانت هناك حجج مؤيدة ومعارضة لخطوط الخلايا البسيطة، والأنظمة الدقيقة المعقدة (MPS)، والكائنات الأقل إحساسًا، والأساليب الحاسوبية الناشئة. في ECVAM، ولاحقًا في CAAT، بدأنا نركز على النماذج ثلاثية الأبعاد، أي الكتل، التي شعرنا أنها تمثل توازنًا جيدًا بين التعقيد ومرور البيانات. نشر هونيجر وآخرون (1979) في مجلة Nature نموذج إعادة تجميع الأجنة.
خلايا دماغ الجرذان، التي اعتمدناها بنجاح. وقد قادنا ذلك إلى الورقة الأولى التي تصف استخدام التسجيل الكهربائي الفيزيائي لتقييم تأثيرات السموم العصبية (فان فليت وآخرون، 2007)، وإلى الورقة الأولى حول تقييم تأثيرات السموم العصبية باستخدام الميتابولوميات (فان فليت وآخرون، 2008). ومؤخراً، سمح لنا ذلك بمعالجة الإمكانية السامة العصبية لمثبطات اللهب (هوغبرغ وآخرون، 2021).

بالنسبة للكثيرين، بدا أن الدعوة إلى جهد منسق لمعالجة التحديات العلمية والتنظيمية مستحيلة في ذلك الوقت، لكنها بدأت في تقسيم التحدي الهائل إلى خطوات قابلة للإدارة وأدت في النهاية إلى توجيهات منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD، 2023).

عُقد الاجتماع الدولي الأول حول DNT، TestSmart DNT-1، في رستون، فيرجينيا، في عام 2006. كان الهدف الرئيسي منه هو جمع أصحاب المصلحة (مثل الصناعة، والأوساط الأكاديمية، والجهات التنظيمية) لتحديد المخاوف المتعلقة بالعلم والسياسة ومناقشة كيفية تطوير منهجيات اختبار بديلة (Lein et al., 2007). ناقشت الورقة الناتجة الحاجة إلى تطوير منهجيات بديلة للاختبارات التقليدية المعتمدة على الحيوانات في DNT وأكدت على التعاون بين CAAT ووكالة حماية البيئة الأمريكية وبرنامج السموم الوطني نحو إنشاء TestSmart DNT – الذي يهدف إلى تعزيز نماذج DNT البديلة. ركزت هذه المبادرات على تحديد وترتيب أولويات المواد الكيميائية التي تشكل مخاطر DNT، ودمج طرق DNT البديلة في اتخاذ القرارات التنظيمية، واستكشاف الإمكانيات لتقليل أو تحسين أو استبدال استخدام الحيوانات في اختبارات DNT.

لقد عكس التقدم من ورشة العمل في عام 2005 إلى المؤتمر في عام 2006 تقدمًا كبيرًا في مجال اختبار DNT: بينما ركز كوك وآخرون (2007) على المناقشات الأولية والإطار المفاهيمي لدمج الطرق في المختبر في الممارسات التنظيمية، أبرز لاين وآخرون (2007) التعاونات النشطة والمبادرات المحددة مثل TestSmart DNT، التي تهدف إلى التنفيذ العملي لهذه الطرق البديلة. وقد شكلت هذه الانتقالة خطوة من التخطيط النظري والاستراتيجي إلى خطوات قابلة للتنفيذ نحو التحقق والقبول التنظيمي، وأظهرت التزامًا متزايدًا بتقليل اختبار الحيوانات من خلال طرق اختبار DNT في المختبر القوية علميًا.

في عام 2008، قامت TestSmart DNT-2 في ريستون، فيرجينيا، مرة أخرى، بتقييم التقدم المحرز في تطوير بدائل DNT، وأعادت تقييم الأولويات والتوصيات التي تم وضعها في DNT-1، وأقامت طرقًا لاستخدام بيانات in vitro في اتخاذ القرارات. أنتج الاجتماع وثيقة تحتوي على توصيات حول كيفية تطوير طرق بديلة لـ DNT من أجل فحص وترتيب أولويات المواد الكيميائية (كروفتون وآخرون، 2011)، والتي تضمنت:

الخلايا/الكائنات الحية المناسبة، وتقيس النقاط النهائية الميزات التنموية ذات الصلة.
2. يجب إثبات القدرة على قياس نقطة النهاية المستهدفة بدقة وبدقة من خلال استخدام مجموعة من المركبات التي تُسمى “ضوابط محددة لنقطة النهاية” أو “مركبات أدوات”. يجب أن تعكس نقطة النهاية المقاسة العملية العصبية التنموية المستهدفة.
3. يجب تحديد النطاق الديناميكي لنقطة نهاية DNT لتحديد مدى التغير القابل للقياس عن قيم التحكم.
4. يجب أن يتم تحديد علاقات التركيز-الاستجابة، ويفضل اختبار ما لا يقل عن خمسة تركيزات على نطاق واسع. هذا أمر حاسم لمقارنة حساسية الطرق المختلفة.
5. يجب اختبار المواد الكيميائية الضابطة الإيجابية والسلبية التي من المعروف أنها تؤثر بشكل موثوق أو لا تؤثر على نقطة النهاية المقاسة لـ DNT من خلال آليات معروفة.
6. يجب اختبار مجموعات التدريب الأولية من المواد الكيميائية، بما في ذلك تلك المعروفة بأنها تثير أو لا تثير استجابات DNT بناءً على بيانات in vitro. هذا يقيم قدرة الطريقة على فحص أعداد معتدلة من المواد الكيميائية.
7. يجب بعد ذلك فحص مجموعات أكبر من المواد الكيميائية، بما في ذلك تلك المعروفة بأنها تسبب أو لا تسبب آثار DNT في الجسم الحي. هذا يُظهر قدرة الطريقة على اختبار أعداد أكبر من المواد الكيميائية.
8. يجب تحليل حساسية الطريقة وخصوصيتها وقدرتها التنبؤية في تحديد إمكانيات DNT للمواد الكيميائية استنادًا إلى هذه المجموعات المرجعية من المواد الكيميائية.
باختصار، كانت التوصيات تركز على إظهار الصلة والموثوقية والحساسية ومعدل الإنتاجية لطرق DNT البديلة باستخدام اختبارات نهاية محددة جيدًا ومجموعات اختبار كيميائية مرجعية كإطار لتطوير اختبارات DNT بديلة على مستوى الفحص. كان الهدف هو إثبات ملاءمة الطرق للفحص وتحديد أولويات عدد كبير من المواد الكيميائية. كانت توصيات DNT-2 تهدف إلى تسهيل الانتقال من المناقشات المفاهيمية إلى تطوير واستخدام الاختبارات العملية لأغراض تنظيمية. كان لهذه الاعتبارات والخبرة من مجال DNT تأثير مهم على تطوير مفاهيم أوسع لتطوير طرق الاختبار في المختبر ولأساليب التحقق الجديدة لمثل هذه الاختبارات (Leist et al., 2010, 2012; van Thriel et al., 2012).

عُقدت DNT-3 في فاريزي، إيطاليا، في عام 2011 وحققت تقدمًا كبيرًا منذ DNT-2 في تطبيق اختبارات DNT البديلة (بال-برايس، 2012). استندت DNT-3 إلى التوصيات من كروفتون وآخرين (2011) وأظهرت تقدمًا في عدة مجالات رئيسية:

استنادًا إلى الأعمال الرائدة التي تم مناقشتها أعلاه، قدمت ورقتنا في عام 2014 (سميرنوفا وآخرون، 2014) عدة تقدمات مفاهيمية رئيسية في تطوير أساليب بديلة لاختبار تأثيرات التطور العصبي ووفرت منظورًا مستقبليًا حول مستقبل اختبار تأثيرات التطور العصبي.

أولاً وقبل كل شيء، أكدنا على الحاجة الملحة لأساليب أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة وغنية بالمعلومات الميكانيكية لمعالجة نقص بيانات تأثيرات التطور العصبي لمعظم المواد الكيميائية المتداولة. وقد استند ذلك إلى المناقشات في الأوراق السابقة، التي سلطت الضوء على قيود نماذج اختبار تأثيرات التطور العصبي الحالية المعتمدة على الحيوانات، بما في ذلك تكلفتها العالية، وانخفاض إنتاجيتها، وموثوقيتها المشكوك فيها بالنسبة لنتائج الصحة البشرية. جادلنا بأن تطوير بدائل أرخص وأسرع وأكثر تنبؤًا ليس فقط ضرورة علمية ولكن أيضًا ضرورة أخلاقية، نظرًا للأعداد الكبيرة من الحيوانات المستخدمة في الدراسات التنظيمية لاختبار تأثيرات التطور العصبي.

ثانيًا، ناقشت الورقة مفهوم AOPs ودورها المركزي في توجيه تطوير ITS لاختبار تأثيرات التطور العصبي. توفر AOPs إطارًا منظمًا لربط الأحداث المبدئية الجزيئية (MIEs) بالنتائج السلبية (AO) على مستوى الكائن الحي أو السكان، عبر سلسلة من الأحداث الرئيسية (KEs) على المستويات الخلوية والأنسجة والأعضاء. من خلال رسم خريطة للمناظر الطبيعية لـ AOPs المعروفة أو المحتملة ذات الصلة باختبار تأثيرات التطور العصبي، يمكن للباحثين تحديد المسارات والعمليات الحاسمة التي يجب استهدافها بواسطة طرق الاختبار البديلة. هذا يعزز النهج الميكانيكي الذي دعا إليه كروفتون وآخرون (2011) ويوفر أساسًا منطقيًا لتصميم
وتفسير الفحوصات المختبرية وفي السيليكو من حيث صلتها بالنتائج في الكائنات الحية.

ثالثًا، سلطنا الضوء على التأثير التحويلي للتقدم التكنولوجي الأخير على تطوير نماذج بديلة لاختبار تأثيرات التطور العصبي. شملت هذه استخدام نماذج عصبية مشتقة من خلايا جذعية بشرية، والتي تقدم منصة أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ونوعًا محددًا لدراسة العمليات التطورية العصبية وتأثيراتها بواسطة المواد الكيميائية. سمحت التقدمات في تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، مثل الأعضاء الدماغية، الآن بإعادة إنشاء التفاعلات المعقدة على مستوى الأنسجة في المختبر، مما يربط الفجوة بين النماذج التقليدية ثنائية الأبعاد والكائنات السليمة. كما أن تقنيات الفحص عالية الإنتاجية (HTS)، مثل التصوير الآلي ومصفوفات متعددة الأقطاب، مكنت الآن من التقييم السريع والكمي للأحداث الرئيسية في التطور العصبي، مثل نمو المحاور، وتكوين المشابك، وتشكيل الشبكات. هذه الاختراقات التكنولوجية، التي كانت لا تزال في مراحلها الأولى عندما تم نشر الأوراق السابقة، قد وسعت بشكل كبير مجموعة الأدوات المتاحة لاختبار تأثيرات التطور العصبي البديلة.

استنادًا إلى هذه التقدمات، اقترحنا إطارًا مفاهيميًا لربط أنظمة الاختبار المختبرية بنمط ظاهري داخلي من الاتصال الوظيفي أو الهيكلي المضطرب في الدماغ. تم الافتراض والتأكيد على أن جميع تأثيرات اختبار تأثيرات التطور العصبي في النهاية نتجت عن اضطراب على الأقل في عملية تطورية عصبية رئيسية واحدة (KNDP)، مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والهجرة، والتغليظ. اعترف هذا النهج العملي بأن فهمنا الحالي لسلسلة الأحداث الكاملة التي تربط MIEs بـ AOs في الدماغ النامي كان (وما زال) محدودًا. كما توقع استراتيجيات الاختبار التي يتم مناقشتها حاليًا والتي تركز أكثر على تحديد أعلى تركيز/جرعة غير سامة (نمط ظاهري داخلي بدون سمية) بدلاً من تحديد نوع AO بالضبط (مثل، نقص الانتباه مقابل اضطراب اللغة). من خلال التركيز على مجموعة أساسية من العمليات التطورية العصبية المعروفة بأنها حساسة للتأثيرات الكيميائية وحرجة لتطور الدماغ السليم، يمكن للباحثين تطوير مجموعة من الفحوصات المناسبة لتغطية المسارات الرئيسية لاختبار تأثيرات التطور العصبي. قدم هذا الإطار خريطة طريق لتطوير الفحوصات والتحقق من صحتها في غياب AOPs كاملة.

كانت قضية أخرى مهمة تم تناولها في عام 2014 هي تحدي تعريف السلبية في سياق نماذج اختبار تأثيرات التطور العصبي البديلة. بينما تُستخدم النقاط النهائية العليا، مثل التغيرات في السلوك أو الوظيفة الإدراكية، عادةً لتعريف التأثيرات السلبية في الدراسات الحيوانية التنظيمية، ستكون هذه النتائج المعقدة صعبة التكرار في المختبر. ناقشنا الحاجة إلى وضع معايير واضحة للتمييز بين الاستجابات التكيفية والسلبية على المستوى الخلوي والجزيئي، مع الأخذ في الاعتبار عوامل مثل الحجم، والمدة، وقابلية عكس التأثيرات. كانت هذه المناقشة مدفوعة جدًا بمناقشاتنا المتزامنة حول مسارات السمية (كليينسانغ وآخرون، 2014) مقابل مسارات الدفاع (هارتونغ وآخرون، 2012) في سياق مرونة الأنظمة البيولوجية (سميرنوفا وآخرون، 2015ب). كما سلطنا الضوء على أهمية مراعاة الصلة البيولوجية للتغيرات الملحوظة، بدلاً من الاعتماد فقط على الأهمية الإحصائية. بنيت هذه المناقشة الدقيقة حول السلبية على الأعمال السابقة (بلاوبور وآخرون، 2012) وأكدت على الحاجة إلى تفسير دقيق ومرتبط بالسياق لنتائج اختبارات تأثيرات التطور العصبي البديلة.

أخيرًا، أكدنا على عدة عوامل رئيسية يجب مراعاتها عند تصميم وتفسير نماذج اختبار تأثيرات التطور العصبي البديلة. تشمل هذه الاختلافات المحتملة بين الأنواع في العمليات التطورية العصبية وقابلية التأثر الكيميائي، مما يبرز الحاجة إلى نماذج ذات صلة بالبشر، وأهمية مراعاة الآليات غير المباشرة لاختبار تأثيرات التطور العصبي، مثل التغيرات في إشارات هرمون الغدة الدرقية أو وظيفة المشيمة، والتي قد لا يتم التقاطها بواسطة النماذج التي تركز فقط على التأثيرات المباشرة على الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، سلطنا الضوء على الدور الحاسم لتوقيت التعرض، نظرًا للطبيعة الديناميكية للتطور العصبي ووجود نوافذ حرجة من الضعف. هذه الاعتبارات، على الرغم من أنها ليست جديدة تمامًا، تم إعطاؤها أهمية أكبر في الورقة، مما يعكس نهجًا أكثر دقة ووعيًا بيولوجيًا لاختبار تأثيرات التطور العصبي البديلة.

في الختام، تلخصت ورقة 2014 تقدمًا مفهوميًا كبيرًا في مجال اختبار DNT البديل، بناءً على الأسس التي وضعتها المنشورات السابقة. من خلال دمج أحدث الفهم العلمي للتطور العصبي مع التقدم التكنولوجي في النمذجة في المختبر وفي السيليكو، قدمنا منظورًا شاملًا ومستقبليًا حول التحديات والفرص في هذا المجال. لقد صغنا رؤية لنموذج جديد من علم السموم التنبؤية، استنادًا إلى فهم آلي للمسارات الأساسية التي تكمن وراء DNT وتأثيرها بواسطة المواد الكيميائية. مدفوعين بحدود النماذج البديلة الحالية، قدمنا خارطة طريق للبحث والتطوير المستقبلي، مع التأكيد على الحاجة إلى نهج متعدد التخصصات وتعاوني. وبالتالي، كانت الورقة بمثابة تجميع قيم لأحدث ما توصلت إليه الأبحاث في عام 2014 ونقطة إرشادية للاتجاه المستقبلي لاختبارات DNT البديلة.

عُقدت DNT-4 في فيلادلفيا، بنسلفانيا، في عام 2014. جمعت الاجتماع مجموعة متنوعة من أصحاب المصلحة (الأوساط الأكاديمية، الصناعة، والهيئات التنظيمية) من جميع أنحاء العالم (آسيا، كندا، أوروبا، والولايات المتحدة)، الذين ناقشوا الخطوات التالية المطلوبة لدفع اختبارات DNT في المختبر إلى الأمام. استنادًا إلى التجارب من الاجتماعات السابقة لـ DNT، شمل تنسيق الاجتماع عروضًا علمية تلتها مجموعات نقاش أصغر حيث تم مناقشة مواضيع محددة. يلخص ما يلي المناقشات في DNT-4. لا تعكس بالضرورة جميع آراء المشاركين، والبيانات الختامية هي تأملاتنا الخاصة حول الاجتماع. نظرًا لأن مواضيع مشابهة تم مناقشتها في عدة مجموعات نقاش، تم تنظيم التقرير بناءً على البرنامج الأولي للاجتماع.

شرحت الجلسة الأولى إطار AOP وقدم أمثلة على كيفية استخدامه لتقييم DNT. قدم العرض الرئيسي من قبل الدكتور كيفن كروفتون (وكالة حماية البيئة الأمريكية، قدمه الدكتور ويليام مندي، وكالة حماية البيئة الأمريكية) أهمية إطار AOP لربط أبحاث DNT بالاحتياجات التنظيمية. شرحت الدكتورة آنا بال-برايس، المفوضية الأوروبية، مفهوم AOPs المطبق على تقييم DNT. قدمت الدكتورة إلين فريتشي، معهد لايبنيز للأبحاث في الطب البيئي، والدكتورة

باميلا لين، جامعة كاليفورنيا ديفيس، أمثلة عملية حول كيفية أن البيانات في المختبر والبيانات الوبائية يمكن أن تُفيد AOPs.

إطار AOP هو أداة لدمج المعرفة الموجودة حول الربط بين MIE و AO على مستوى الفرد أو السكان (أنكلي وآخرون، 2010). يغطي AOP المسار بالكامل بما في ذلك الخصائص الكيميائية، MIE، الاستجابة الخلوية، استجابة الأعضاء، استجابة الكائنات الحية، وأخيرًا استجابة السكان. لن يكون اختبار أو دراسة واحدة قادرة على التقاط هذا المسار بالكامل. ومع ذلك، فإن دمج البيانات من عدة اختبارات DNT، بما في ذلك نماذج مختلفة (مثل الخلايا والأنواع غير الثديية) ونقاط النهاية لعمليات تطوير مختلفة (مثل التكاثر، التمايز، والتغليظ) مع البيانات الموجودة في vivo والبيانات من الدراسات الوبائية يمكن أن يساعد في تقليل عدم اليقين وتقديم توقع أفضل للسمية. يجب التأكيد على أن AOPs غير متحيزة كيميائيًا، مما يعني أن أي مادة كيميائية تؤثر على MIE بقوة ومدة كافية سيكون لها تأثير على سلسلة KEs التالية المحددة في AOP. الميزة في هذا النهج هي أنه ليس من الضروري تحديد جميع العناصر في AOP قبل أن يصبح المفهوم مفيدًا (بال-برايس وميك، 2017). من خلال تجميع جميع المعلومات الموجودة، يمكن تحديد فجوات البيانات للتركيز على جهود توليد بيانات وطرق مفيدة. ستوفر AOPs لـ DNT الثقة بأن التغيرات الخلوية يمكن أن تؤدي إلى آثار DNT في البشر وستزيد من اليقين من اختبارات in vitro للمقيمين في المخاطر والهيئات التنظيمية لاتخاذ القرارات.

حاليًا، تم تطوير عدد قليل فقط من AOPs لـ DNT وفقًا لوثيقة إرشادات منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (بال-برايس وآخرون، 2015a)، ولكن يمكن بناء المزيد من AOPs بمجرد الحصول على المزيد من البيانات. يواجه إطار AOP تحديات خاصة لتقييم السمية العصبية و DNT: أولاً، هناك نقص في المعرفة الأساسية حول الفيزيولوجيا المرضية للأمراض العصبية و MIEs و KEs الأساسية. علاوة على ذلك، هناك فهم ضئيل للعمليات التعويضية في الجهاز العصبي، مثل التوازن والمرونة. من المحتمل أن تعقد تعقيدات تطوير الجهاز العصبي المركزي شبكة من AOPs بدلاً من AOPs الخطية المقترحة. ومع ذلك، بينما يستغرق بناء AOPs وقتًا، يجب ألا تعيق عدم اكتمال AOP استخدامه.

من المحتمل أن تلعب تفاعلات الجينات والبيئة دورًا حاسمًا في حالة العديد من الأمراض العصبية التنموية. بينما يعود الارتفاع في انتشار ASD جزئيًا إلى زيادة معايير التشخيص، لا يمكن أن يُعزى بالكامل إلى استبدال التشخيص (هيرتس بيكوتو وديلويتش، 2009) والأسباب الوراثية؛ تشير عدد متزايد من الدراسات إلى أن العوامل البيئية تساهم في هذه الزيادة. لقد أظهرت عدة جينات متورطة في ASD وغيرها من الاضطرابات العصبية التنموية أنها عرضة للتأثيرات البيئية (بيساه ولين، 2008). تعتبر النماذج في المختبر مفضلة لتقييم هذه التفاعلات بين الجينات والبيئة وكيف يمكن أن تؤثر على التطور العصبي على المستوى الخلوي. يمكن بعد ذلك ربط التأثير الضار على المستوى الخلوي بالتأثيرات الضارة في المرضى الذين يعانون من اضطرابات تطويرية لبناء الثقة في AOP. على سبيل المثال، أظهرت الجينات المتورطة في تشكيل المشابك وإزالتها أنها تتأثر بالتعرض البيئي، وقد أظهرت الدراسات الوبائية
أن العديد من الأطفال المصابين بـ ASD لديهم زيادة في الاتصال في الدوائر المحلية للقشرة (كيون وآخرون، 2013). يمكن أن يكون هذا النهج لربط التأثيرات الخلوية بنتيجة المرض مفيدًا للمسؤولين ويظهر استخدام بيانات in vitro لتقييم المخاطر.

توسعت مجموعة نقاش “علم نماذج DNT و AOPs” في هذا الموضوع. كانت الاجتماعات السابقة لـ DNT قد حددت بالفعل عدة نماذج واعدة لدراسات DNT، مثل خطوط الخلايا، الثقافات الأولية، الثقافات المتجمعة ثلاثية الأبعاد، وزيبرا فيش، . إيلجانس، ودروسوفيلا (كوكي وآخرون، 2007؛ لين وآخرون، 2007). في DNT-4، ناقشت هذه المجموعة المزيد من المزايا والقيود لهذه النماذج مع التركيز على أي نافذة من التطور العصبي تغطيها وما إذا كانت وكيف يمكن أن تؤثر التباينات الجينية على نقاط نهاية DNT في المختبر. تم الاستنتاج أن نماذج بديلة مختلفة مناسبة لمراحل مختلفة من التطور العصبي. تم اقتراح أن تكون نماذج الخلايا الأكثر ملاءمة للمراحل المبكرة هي خطوط خلايا سابقة وخلايا جذعية (مثل، الخلايا الجذعية الجنينية و iPSCs) مع أنواع غير ثديية مثل C. إيلجانس وزيبرا فيش. بعض هذه النماذج، مثل iPSCs والأنواع غير الثديية، يمكن أن تغطي أيضًا المراحل اللاحقة من التطور بينما تعتبر الثقافات الأولية ذات صلة بشكل رئيسي للفترات اللاحقة. تم مناقشة أن الأنواع المختلفة لديها أطر زمنية تطورية متباينة، سواء في المختبر أو في الجسم الحي، على سبيل المثال، تتطور خلايا القوارض أسرع من خلايا البشر، ولدى زيبرا فيش وقت تطور أقصر من الفئران. يمكن أن يكون التطور الأقصر ميزة لأنه يقصر الوقت التجريبي. ومع ذلك، ليس من الواضح كيف يمكن أن تختلف الأنواع في الحساسية للاضطرابات البيئية. وقد أفادت العديد من الدراسات المعتمدة على الخلايا بوجود اختلافات بين الأنواع في الاستجابة لمركبات مختلفة؛ ومع ذلك، كانت هناك مخاوف بين المشاركين من أن هذه التأثيرات قد تكون آثارًا زائفة. خاصة في المرحلة المبكرة من التطور، شعرت المجموعة أن الاختلافات قد تكون كبيرة، بينما يمكن مقارنة المراحل اللاحقة بسهولة أكبر بين النماذج. وقد تم الإشارة إلى أن هذه التحديات لا تتعلق فقط بالاختلافات بين الأنواع ولكن أيضًا بالاختلافات بين الخلايا من متبرعين مختلفين. قد تعتمد هذه الاختلافات على متى تم أخذ الخلايا وعلى الخلفية الجينية. من المعروف جيدًا أن الجينات تلعب دورًا في حساسية الأفراد للتعرض للمواد الكيميائية والأدوية، ومن المتوقع لذلك أن تؤثر الجينات على نقاط نهاية DNT في المختبر. نظرًا لأن السكان البشر متنوعون ويتضمنون مجموعات فرعية معرضة، يمكن اعتبار ذلك ميزة. لقد تم استكشاف التباينات الجينية لفترة طويلة في الكائنات الحية الأبسط مثل C. إيلجانس وزيبرا فيش (نيشيمورا وآخرون، 2015). ومع ذلك، مع الاستخدام الأخير لـ iPSCs، يتم دراسة الاختلافات بين الأفراد بشكل متزايد أيضًا في خلايا البشر (باميس وآخرون، 2017).

تم تحديد أن خلايا البشر ستكون مفضلة في دراسات DNT، حيث سيتجنب ذلك الاختلافات بين الأنواع. ومع ذلك، هناك نقص هائل في البيانات ذات الصلة حول تعرض البشر وتأثيرات DNT، بينما تتوفر بيانات القوارض في الجسم الحي. لذلك، يمكن أن تعمل مقارنة البيانات من خلايا القوارض مع بيانات القوارض في الجسم الحي كجسر لاستقراء البيانات حول خلايا البشر إلى الوضع البشري (ماس وآخرون، 2023؛ الغرابي وآخرون، 2023). ومع ذلك، يجب أن يتم تصنيف النماذج بناءً على النضج كدالة لـ

أيام في المختبر (DIV) ومرتبطة بالمرحلة التطورية في الجسم الحي. ولكن هل 7 DIV قابلة للمقارنة مع 7 أيام في الجسم الحي؟ تم مناقشة أن قياسات العلامات المحددة يمكن أن تساهم في تحديد المرحلة التطورية للنموذج، على سبيل المثال، miRNA المحددة، وmRNAs و/أو البروتينات.

كانت استنتاجات هذه المجموعة المنفصلة هي أن النماذج البديلة تحتاج إلى أن تكون موصوفة بشكل جيد لتكون مفيدة في أي دراسة سمية، بما في ذلك DNT. غالبًا ما تفتقر النماذج إلى معلومات حول القدرة الأيضية، وفهم أنواع الخلايا المختلفة، والارتباط بالوضع في الجسم الحي. ومع ذلك، أظهرت العديد من النماذج كفاءة كبيرة وهي مفيدة لقياس العديد من العمليات التطورية مثل التمايز، والتكاثر، والهجرة، والبقاء. يبدو أن القدرة التنبؤية في الجسم الحي (القوارض) لمجموعة فرعية من المواد الكيميائية جيدة، ومع ذلك، يجب اختبار المزيد من المواد الكيميائية لفهم الإمكانات الحقيقية بالكامل (انظر أدناه لمناقشة أعمق). لفهم الصلة بالوضع البشري بشكل أفضل، يمكن أن تستفيد مجتمع DNT من التفاعل مع المجتمع السريري لربط السمية بـ، على سبيل المثال، سيناريوهات التعرض، والبيانات البيولوجية الموجودة، والآليات المرضية.

في هذه الجلسة، تم تقديم أساليب مختلفة لتقييم DNT باستخدام أدوات الأوميكس. قدمت الدكتورة جينيفر فريمان، جامعة بوردو، بعض الأمثلة باستخدام زيبرا فيش، ووصفت الدكتورة لينا سميرنوفا استخدام نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد في المختبر. أبلغ الدكتور ميلو دينغمانس، جامعة أوترخت، عن كيفية دمج بيانات متعددة من مشروع DENAMIC الممول من المفوضية الأوروبية. .

تشمل فوائد استخدام الأنواع غير الثديية، مثل زيبرا فيش وC. إيلجانس، لتقييم DNT أنها غير مكلفة، وسريعة، وقابلة للتعديل الجيني، وتسمح بدراسات الكائن الحي والسلوك. يمكن دمج زيبرا فيش مع الأساليب النسخية والوراثية لتحديد آليات DNT للمواد الكيميائية (لي وفريمان، 2014). يشمل مشروع DENAMIC نماذج في المختبر، وزيبرا فيش، ونماذج في الجسم الحي، ومجموعات بشرية، ويطبق النسخ الجيني، والبروتيوميات، وملفات الناقلات العصبية، وmiRNA لتحديد العلامات البيولوجية للاضطرابات التطورية العصبية. التركيز على الخلطات، ويتم دمج البيانات بهدف فهم آليات تفاعلات الجرعات المنخفضة والاضطرابات التطورية العصبية.

تشمل فوائد استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر زيادة تفاعلات الخلايا مع بعضها البعض وتمثيل أفضل لتعقيد الدماغ في الجسم الحي. تم تقييم أنواع نماذج بشرية وقوارض أحادية أو متعددة الخلايا لميزاتها وعيوبها. يتم دمج النماذج مع النسخ الجيني، والميتابولوميات، وملفات miRNA لتحديد مسارات السمية بعد التعرض الكيميائي التي قد تؤدي إلى آثار سلبية على الدماغ النامي (سميرنوفا وآخرون، 2015a).

سوف تولد استخدام أساليب الأوميكس معلومات عالية المحتوى لفهم أفضل لآليات المواد الكيميائية كما هو في الرؤية لعلم السموم في القرن (كرويسكي وآخرون، 2020). ومع ذلك، قد يؤدي توليد بيانات ضخمة إلى تحديات جديدة وتم مناقشتها في المجموعة المنفصلة حول التقنيات.

وصف الكلمة الرئيسية لمارسيل ليست استخدام خلايا جذعية بشرية مع نقاط نهاية النسخ الجيني. تم إثبات أن نماذج التنبؤ الإحصائية يمكن أن تحدد تغييرات النسخ الجيني المميزة لمجموعات فرعية من المواد السامة DNT. قد تكون التعرضات القصيرة للسموم أكثر فائدة لتحديد أنماط العمل، بينما تؤدي التعرضات الأطول لنماذج خلايا جذعية متمايزة إلى تغييرات وراثية تؤثر على مسار تمايز الخلايا ولها آثار دائمة تبقى حتى بعد غسل الأدوية. كان الاستنتاج هو أن أنماط النسخ الجيني، المسجلة عند التعرضات الكيميائية غير السامة، تسمح بتصنيف المواد الكيميائية، وبالتالي، التنبؤ بالمخاطر.

وصف المتحدثون من الحكومة الأمريكية الأساليب الحالية للفحص لـ DNT في NIEHS من قبل الدكتورة مامتة بهل وفي US EPA من قبل الدكتور ويليام مندي والدكتور تيموثي شافر. نظرًا لأن عدد المواد الكيميائية التي تفتقر إلى بيانات DNT مرتفع جدًا لاختبارها بأساليب تقليدية في الجسم الحي، يعمل البرنامج الوطني للسمية في NIEHS على استراتيجيات لفحص وترتيب الأولويات للمركبات لاختبار DNT في الجسم الحي. تم تطوير قائمة تضم 80 مركبًا واختبارها من قبل المتعاونين باستخدام أنظمة خلوية متنوعة مثل الخلايا الأولية، وخلايا ESC، وiPSCs، وخطوط الخلايا التي تحتوي على كل من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، وعلى خلايا غير عصبية، مثل خلايا القلب. تم تضمين نماذج بديلة مثل الديدان الخيطية وزيبرا فيش أيضًا. يعتمد ترتيب الأولويات على نماذج تحليل البيانات المختلفة.

برنامج الاختبار عالي الإنتاجية يشمل ToxCast (700 اختبار وأكثر من 2000 مادة كيميائية تم اختبارها) وTox21 (بالتعاون مع NTP وFDA وNCATS، حيث يتم فحص أكثر من 10,000 مادة كيميائية). علاوة على ذلك، يقوم مختبر الأبحاث الوطنية للصحة وتأثيرات البيئة/ToxCast بتطوير اختبارات لنقاط نهاية أكثر تعقيدًا بما في ذلك DNT. تم تطوير اختبارات EPA لـ DNT بما يتماشى مع إطار AOP مع اختبارات جزيئية عالية الإنتاجية، مثل قنوات الأيونات، المستقبلات، الإنزيمات؛ بالنسبة لـ MIEs، التكاثر، التمايز، نمو المحاور العصبية، تكوين المشابك، الهجرة، والموت المبرمج؛ مصفوفة متعددة الأقطاب لـ KEs، واختبار سلوك سمك الزرد لـ AO. تم تطوير قائمة بالمواد الكيميائية المرجعية الإيجابية والسلبية.

لكي تكون الاختبارات البديلة مفيدة، يجب تطبيقها في إطار تنظيمي. ومع ذلك، فإن الهيئات التنظيمية المختلفة لديها متطلبات واحتياجات مختلفة. في هذه الجلسة، قدم الدكتور ويليام سليكر من NCTR، FDA، والدكتورة آنا لوويت من قسم تأثيرات الصحة، US EPA، وجهتي نظر من وكالتين تنظيميتين حول استخدام الطرق البديلة لتقييم DNT.

في حالة تنظيم الأدوية في FDA، تم وصف التحدي في استخدام البيانات الميكانيكية فقط هو أن الأدوية ليست متطابقة تمامًا من الناحية الصيدلانية. في هذه الحالة، قد تشير البيانات إلى مخاطر مشابهة، لكن “هامش الأمان” قد لا يكون هو نفسه. ومع ذلك، يمكن أن تكون البيانات الميكانيكية مفيدة ولا تزال توفر مع التجارب الحية فهمًا أفضل لتأثيرات DNT.

التنظيم في US EPA أكثر مرونة، ويمكن استخدام بيانات in vitro عندما يكون هناك معرفة من AOP لدعم القراءة المتقاطعة للمواد المشابهة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام بيانات in vitro في تقييم وزن الأدلة لتحديد احتياجات البيانات أو لمراجعة مبررات الإعفاء. تدعم US EPA مبادئ 3Rs في برنامجها التنظيمي. في حالة DNT، منحت US EPA 8 إعفاءات وطلبت دراسة واحدة بين 8 ديسمبر 2011 و11 أبريل 2014. تم مناقشة عدة اعتبارات لتصميم دراسة in vitro لتلبية الاستخدام التنظيمي بما في ذلك أنواع الخلايا، وجود/عدم وجود مصل، المادة الكيميائية الأصلية مقابل المستقلب، وتركيزات الاختبار. علاوة على ذلك، هناك معايير مختلفة تناسب الغرض اعتمادًا على الاستخدام المقصود، مثل الفحص والتصنيف مقابل استبدال إرشادات in vivo أو اختبار واحد مقابل مجموعة اختبارات.

ناقش الدكتور توماس هارتونغ استخدام ITS (هارتونغ وآخرون، 2013a) لتقييم DNT. ITS هو خوارزمية لدمج نتائج الاختبار (المختلفة) و، ربما، معلومات غير اختبارية (بيانات موجودة، استنتاجات in silico من البيانات الموجودة أو النمذجة) لتقديم نتيجة اختبار مجمعة. غالبًا ما سيكون لديهم نقاط قرار مؤقتة يمكن عندها النظر في مزيد من اللبنات الأساسية. يجب مراعاة عدة جوانب، على سبيل المثال المرونة في دمج مكونات ITS، نطاق التطبيق، والكفاءة من حيث التكلفة، الوقت، والصعوبات التقنية.

وصفت الجلسة الأخيرة من الاجتماع تقنيات متطورة لاختبار DNT قدمها أصحاب المصلحة من الحكومة والأوساط الأكاديمية. وصفت الدكتورة أندريا سايلر من المعهد الفيدرالي الألماني لتقييم المخاطر (BfR) مشروعًا مشتركًا تم تمويله من قبل وزارة البحث والتعليم الألمانية (BMBF) بهدف تطوير اختبارات معيارية قائمة على الخلايا للتنبؤ لاختبار DNT. استخدمت الدكتورة نيشا سايبس من US EPA تعدين الأدبيات لتحديد MIEs في إطار AOP لفتحة الشفة. يمكن تطبيق هذه البيانات المعلوماتية لتطوير نماذج أنسجة افتراضية متعددة الخلايا، مثل إغلاق الأنبوب العصبي في الجنين الافتراضي، والتي تستند إلى نماذج على مستوى الخلايا مدفوعة بالشبكات البيولوجية والقواعد التي يمكن استخدامها للتسمم التنبؤي. تم تقديم توصيف شامل للخلايا الجذعية البشرية iPSCs المزروعة في 3D من قبل الدكتور ديفيد باميس من جامعة جونز هوبكنز. تسمح خلايا iPSCs البشرية بدراسة المرضى ذوي الخلفيات الجينية المختلفة ويمكن أن تستكشف ما إذا كانت بعض الجينات تعبر عن حساسية للتعرض الكيميائي. قام الدكتور لوك ستوبيني من جامعة العلوم التطبيقية في جنيف بالتحقيق في وظيفة خلايا ESCs وiPSCs ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفات متعددة الأقطاب المختلفة. تم تقييم تأثيرات التعرض للمواد الكيميائية بشكل أكبر من خلال دراسات التعبير الجيني للمستقبلات وعلم الأيض للناقلات العصبية لتطوير اختبار in vitro. تم تعزيز النماذج ثلاثية الأبعاد بشكل أكبر من خلال دمج وحيدات النوى لدراسة الالتهاب العصبي ودمجها مع ثقافات أعضاء أخرى في منصة رقاقة وحاجز الدم في الدماغ. أخيرًا، ناقش الدكتور كيث تشينغ من كلية الطب بجامعة بن ستايت تقنية تصوير جديدة في سمك الزرد الكامل. يمكن أن تكشف التقنية عالية الإنتاجية عن التغيرات في أي نوع من الخلايا بدقة خلوية (أبعاد الفوكسل من ميكرون) وتجعل من الممكن تحديد وتوصيف تقريبًا كل عضو، نسيج، ونوع خلية يساهم في بنية الأنسجة الرخوة، بما في ذلك الهياكل المحددة مثل المسارات العصبية والأوعية.

انتهى الاجتماع بنقاش جماعي ونقاش عام للجنة التوجيهية التي أدارها الدكتور آلان غولدبرغ. تم تحديد عدة تحديات وقيود مع الأساليب الحالية.

إطار AOP الجديد نسبيًا لا يزال غير ناضج بما يكفي لاستخدامه في القرارات التنظيمية، ولكن سيكون من المهم فهم كيفية ربط الأحداث الخلوية بـ AOs. التحديات الرئيسية مع AOPs هي فهم العلاقات بين الأحداث والحصول على بيانات كمية. لتحقيق ذلك، هناك حاجة إلى نماذج وتقنيات مختلفة. قد تكون بعض النماذج الجديدة القائمة على الخلايا البشرية (مثل iPSCs) والتقنيات (مثل الأوميكس وmiRNA) أدوات مفيدة، خاصة عند ربطها بالدراسات الوبائية. ومع ذلك، يجب أن تكون النماذج موصوفة بشكل جيد جدًا.

هناك حاجة لتسريع اختبار المواد الكيميائية في الاختبارات التي تم تطويرها، وفهم البيانات من الاختبارات عالية المحتوى، وربط التأثيرات الخلوية بـ AOs. لا يمكن تحديد التنبؤ والتفسير دون فحص المزيد من المركبات. لا تزال القيود الرئيسية للاختبارات الحالية لـ DNT هي نفسها كما في DNT-2 و-3: نقص في توليد البيانات.

لهذا، هناك حاجة إلى مواد كيميائية مرجعية، وهو أمر صعب حيث أن هناك بيانات DNT في vivo محدودة لمعظم المواد الكيميائية. بعد تحديد واختبار المواد الكيميائية المرجعية، يجب أن يكون هناك اختيار للاختبارات لبناء مجموعة وفي النهاية ITS. سيكون من الضروري جمع البيانات المولدة والموجودة في قاعدة بيانات مشتركة. علاوة على ذلك، هناك حاجة إلى برنامج سياسة قوي يمكن أن يؤثر على منظمات التمويل (كلاهما في الاتحاد الأوروبي والولايات المتحدة) لدعم تطوير الاختبارات وفحص المواد الكيميائية. تم اقتراح إنشاء أمانة DNT تشمل مختلف أصحاب المصلحة من أجزاء مختلفة من العالم كمسار للمضي قدمًا.

يبدو أن هناك تغييرًا في عقلية المنظمين، مع خطوة أولى للاستفادة من اختبارات in vitro المدمجة مع اختبارات in vivo المعدلة لتقييم المخاطر. ومع ذلك، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن الهيئات التنظيمية المختلفة لديها احتياجات مختلفة. سيكون من الضروري أن يتم إشراكهم خلال تطوير الاختبارات. لإثبات أن اختبارات in vitro مفيدة، نحتاج إلى توليد المزيد من البيانات، والتحقق من صحة الاختبارات، وربط البيانات المولدة بـ AOs في البشر.

لقد غذت ثورة التكنولوجيا الحيوية بوضوح اختبار DNT: استخدام خلايا الجذعية، وتطوير الثقافات العضوية، والأساليب عالية المحتوى قد ساهمت بشكل كبير في تطوير طرق اختبار بديلة لـ DNT من خلال توفير أنظمة أكثر صلة بالبشر وغنية بالمعلومات الميكانيكية يمكن أن تقلل الاعتماد على اختبار الحيوانات (غروت وآخرون، 2013).

لقد أحدثت توفر خلايا الجذع البشرية، وخاصة خلايا iPSCs البشرية، ثورة في مجال اختبار DNT من خلال توفير منهجيات جديدة أكثر صلة بعلم الأحياء البشري. يمكن تمايز خلايا iPSCs إلى أنواع مختلفة من الخلايا في الجهازين العصبي المركزي والمحيطي، مما يمكّن من نمذجة مراحل مختلفة من تطور الدماغ وتقييم سمية المواد الكيميائية خلال هذه المراحل (يامادا وآخرون، 2019؛ كوبولاك وآخرون، 2020).

دراسات الجينات والبيئة باستخدام خلايا المرضى: تسهل الخلايا الجذعية المستحثة (iPSCs) دراسة تفاعلات الجينات والبيئة من خلال استخدام خلايا من مرضى يعانون من اضطرابات تطورية (إيلييفا وآخرون، 2018؛ روسو وآخرون، 2019؛ ويغشيد وآخرون، 2021؛ فيلا وآخرون، 2021؛ سانتوس وآخرون، 2023؛ كيلباتريك وآخرون، 2023). توفر هذه الطريقة رؤى حول ما إذا كانت بعض الخلفيات الجينية تمنح حساسية متزايدة للعوامل البيئية الضاغطة. هذا النوع من البحث ضروري لفهم التفاعل المعقد بين الاستعدادات الجينية والعوامل البيئية في تطور الاضطرابات العصبية.

هندسة الجينات مع جينات المخاطر: لقد سمح ظهور تقنيات تحرير الجينات مثل CRISPR/Cas9 بإدخال أو تصحيح الطفرات في الخلايا الجذعية المستحثة (iPSCs). وهذا يمكّن من دراسة جينات المخاطر المحددة في بيئة مسيطر عليها ومراقبة آثارها على التطور العصبي: على سبيل المثال، أظهرت دراستنا السابقة تآزرًا محتملاً بين طفرة في جين التوحد عالي المخاطر CHD8 والتعرض لمبيد الحشرات العضوي كلوربيريفوس في نموذج دماغ ثلاثي الأبعاد مشتق من iPSC (Modafferi et al., 2021). من خلال هندسة iPSCs مع جينات المخاطر المعروفة للحالات العصبية، يمكن للعلماء تحليل المسارات التي تساهم من خلالها هذه الجينات في المرض وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة.
“الخزعة الحية” ونمذجة الأمراض: يمكن اعتبار الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات “خزعة حية” لحالة المريض، حيث إنها تلتقط التركيب الجيني للمريض ويمكن تمايزها إلى أنواع خلايا ذات صلة بالمرض، مما يوفر منصة لدراسة آليات المرض والعلاجات المحتملة (سميرنوفا وهارتونغ، 2024).

الطب الشخصي وعلم السموم: إن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة من الخلايا الجسدية في اختبار السموم العصبية يمهد الطريق للطب الشخصي وعلم السموم. من خلال توليد الخلايا الجذعية المستحثة من المرضى الأفراد، يصبح من الممكن إنشاء نماذج شخصية للمرض وتوقع استجابات الأفراد للأدوية والسموم البيئية (Fritsche et al.، 2018). يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى علاجات أكثر تخصيصًا وفعالية مع آثار جانبية أقل، بالإضافة إلى تطوير أدوية أكثر أمانًا واستهدافًا.

التحديات والاتجاهات المستقبلية: على الرغم من هذه التقدمات، لا تزال هناك تحديات لاستخدام خلايا الجذع البشرية في اختبار DNT. تشمل هذه التحديات الحاجة إلى تحسين الطرق لتمييز الخلايا الجذعية المستحثة (iPSCs) إلى خلايا عصبية وخلايا دعامية ناضجة ووظيفية بالكامل، وتطوير بروتوكولات موحدة لاختبار السمية، ودمج هذه الطرق الجديدة في الأطر التنظيمية (Fritsche et al., 2018; Yamada et al., 2019).

مع تقدم التكنولوجيا، من المتوقع أن تصبح نماذج الخلايا الجذعية البشرية أدوات مهمة بشكل متزايد لتقييم سلامة المواد الكيميائية والأدوية، مما يقلل في النهاية من الاعتماد على اختبار الحيوانات ويحسن نتائج الصحة البشرية.

تعتبر الثقافات العضوية نماذج معقدة في المختبر تحافظ على أو تعيد بناء الهيكلية والتعقيد متعدد الخلايا للأنسجة الأصلية. نحن نرى في ذلك تغييرًا ثوريًا (هارتونغ وتساتساكيس، 2021) في تحقيق ثقافات خلايا بشرية ذات صلة. يمكن أن تحاكي هذه الثقافات، في حالة DNT، العناصر الرئيسية كما-
تتعلق جوانب التطور العصبي البشري ويمكن استخدامها لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية التي تعتبر أساسية لفهم السموم العصبية، مثل التمايز، التكاثر، الهجرة، ونمو المحاور العصبية. من خلال اختبار تأثير المواد الكيميائية على هذه الأنشطة البيولوجية، يمكننا تحديد المواد السامة المحتملة. إن الهندسة الحيوية لنظم الأعضاء المصغرة هي مهمة مهمة للغاية.

لقد نظمنا ثلاث ورش عمل كبيرة مع قادة الرأي من جميع أنحاء العالم (ماركس وآخرون، 2016، 2020، وفي الإعداد). أدت الثانية إلى ورقة علمية حول أنظمة الأعضاء البشرية لتطوير الأدوية (روث وآخرون، 2021). ومن هذا، تم تطوير سلسلة من قمم MPS العالمية والجمعية الدولية لـ MPS. في عام 2022 في نيو أورلينز، من بين 655 مسجلاً، جاء 65 من إدارة الغذاء والدواء، مما يظهر الصدى الهائل لهذا الموضوع مع الوكالة. التقى هناك 430 شخصًا شخصيًا، وهو ما تضاعف إلى 1300 مشارك في برلين 2023، ومن المتوقع أعداد مماثلة في سياتل في يونيو 2024.

عملنا الخاص قادنا إلى إنسانية الأعضاء الدماغية (هوجبرغ وآخرون، 2013)، التي نُشرت بعد فترة وجيزة من أول نموذج مشتق من الخلايا الجذعية المستحثة (لانكستر وآخرون، 2013) للأعضاء الدماغية الأولى. في عام 2016، في مؤتمر AAAS، أظهرنا أخيرًا كيف يمكننا إنتاجها بكميات كبيرة (باميس وآخرون، 2017). منذ ذلك الحين، استخدمنا هذا النهج لعدد من نماذج الأمراض. هذه النماذج نشطة كهربائيًا بشكل تلقائي، وتشمل معظم خلايا الدماغ التي نعرفها باستثناء الخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن إضافتها. وهذا يشمل جميع أنواع الخلايا العصبية التي بحثنا عنها، بالإضافة إلى الخلايا النجمية، والخلايا الدبقية قليلة التغصن، حتى بنسب معقولة – النموذج القياسي يحتوي على حوالي الخلايا الدبقية، وقد قمنا للتو بتطوير بروتوكولات لزيادتها إلى مستويات فسيولوجية من (موراليس بانتوجا وآخرون، 2023ب). واحدة من الميزات الرئيسية هي الميالين، مع حوالي من المحاور التي يتم إميلائها (باميس وآخرون، 2017؛ تشيسنوت وآخرون، 2021أ، ب؛ روميرو وآخرون، 2023). يمكن رؤية الهياكل الجميلة للأوليغوديندروسيت التي تلتف حول المحاور، وهو ما يعد سمة فريدة، لأن عددًا قليلاً جدًا من النماذج البشرية حتى الآن تظهر الإميلاء. استخدمنا هذا النموذج لدراسة السموم العصبية، حيث قمنا بتقييم المبيدات الحشرية مثل الروتينون (باميس وآخرون، 2018) والكلوربيريفوس (مودافيري وآخرون، 2021)، ولكن أيضًا مضاد الاكتئاب باروكستين (تشونغ وآخرون، 2020)، الذي كان موضوع نقاش لمدة حوالي 20 عامًا كونه قد يساهم في الاضطرابات النمائية العصبية. لم تُغلق المناقشة، لكننا تمكنا من إظهار أن التركيزات ذات الصلة سريريًا تعطل تطور الدماغ في نظامنا التجريبي.

واحدة من الأفكار الرئيسية هي أن هذه الأعضاء الدماغية تظهر جميع الآليات التي حددناها سابقًا على أنها حاسمة لتسمم الجهاز العصبي. هل هذه، ربما، إمكانية لاستبدال مجموعة الاختبارات الواسعة بشيء يجمع كل هذه الفحوصات؟ لأنه يمكننا ملاحظة جوانب من التمايز العصبي، والتغليظ، ونمو المحاور العصبية، وتكوين المشابك، وهجرة الخلايا الدبقية، والجلوس، والشبكة العصبية من خلال الفيزيولوجيا الكهربائية في نموذج واحد، يبدو أنه من الممكن دمج الفحوصات المختلفة. تمر الأعضاء الدماغية على الأقل بمرحلة حاسمة من التطور، تعكس حاليًا حوالي خمسة أشهر من تطور الجنين، وربما أكثر إذا دفعناها فقط نحو ذلك. لذا، يمكننا على الأرجح ملاحظة الكثير من الآليات ذات الصلة بتسمم الجهاز العصبي في إعداد واحد. قد يكون هذا أكثر وعدًا من تطوير العديد من الفحوصات المختلفة، والتي لا يمكن لأي مختبر أن يمتلكها جميعًا في نفس الوقت من أجل
نفس المادة. كانت هذه نقطة البداية لمشروع تم تمويله من قبل وكالة حماية البيئة ، أعلن عندما قررت وكالة حماية البيئة في عام 2019 الانتقال بعيدًا عن اختبار الحيوانات بـ يهدف المشروع إلى تطوير “قوس قزح” مصغر من جينات التقارير الفلورية المهندسة في هذه الأعضاء الدماغية بحيث يمكن دراسة جميع هذه الآليات في نفس الوقت بطريقة غير تدخّلية (روميرو وآخرون، 2023). لقد قمنا بتطوير أقطاب كهربائية على شكل قشرة تحيط بالأعضاء الدماغية، مما يسمح بإجراء علم كهربائية ثلاثي الأبعاد حولها (هوانغ وآخرون، 2022).

خط عمل آخر هو استخدام الأعضاء الدماغية لدراسة تفاعلات الجين والبيئة (Butera et al., 2023; Suciu et al., 2023a). لا يمكننا تفسير الزيادة الهائلة في اضطراب طيف التوحد (جدول 2) بناءً فقط على الجينوم، ونشتبه في وجود مكون بيئي. فرضيتنا هي أن جينًا عرضة يلتقي بتعرض كيميائي في وقت حساس يساهم في تطوير اضطراب طيف التوحد. في Modafferi et al. (2021)، أظهرنا مثل هذه العلاقة لأول مرة: CHD8، وهو جين معروف بأنه عامل خطر للتوحد، والكلوربيريفوس، وهي مادة لها بعض المخاطر على الأقل عند التركيزات والجرعات العالية، تتفاعل بشكل متآزر. وقد أدى هذا النتيجة الآن إلى إنشاء مركز تميز NIH للتوحد. حيث نتابع في المجموع 175,000 طفل في 18 مركز شريك للبحث عن مثل هذه التفاعلات بين الجينات والبيئة، ونحن نتحقق من هذه الأزواج تجريبيًا في أنظمة الأعضاء الدماغية كجزء ثانٍ مستمر من المشروع.

التحديات والاتجاهات المستقبلية: على الرغم من أن النماذج الأكثر تعقيدًا لديها القدرة على تعزيز اختبار DNT، إلا أن هناك بعض التحديات التي يجب أخذها في الاعتبار قبل استخدامها في التطبيقات التنظيمية (هوغبرغ وسيرنوفا، 2022). تتمثل القيود الرئيسية في عدم وجود معيارية للبروتوكولات وانخفاض القابلية للتكرار. علاوة على ذلك، فإن الإنتاجية لهذه النماذج لا تزال منخفضة مقارنة بالطرق البسيطة التي تم تطويرها سابقًا. وغالبًا ما يتم تمديد وقت الثقافة وقد يكون مكلفًا، مما يجعل هذه النماذج، حتى اليوم، أكثر فائدة كطريقة متابعة لمجموعة صغيرة من المركبات ذات الأولوية التي تم تحديدها في نهج الفحص الأولي.

عند أخذها معًا، يمكن أن تدعم الثقافات العضوية ونظم النمذجة الدقيقة (MPS) كاختبارات مكملة أو متوازية للبطارية الحالية من الاختبارات لتقييم تأثيرات السموم العصبية (DNT) ترجمة التأثيرات الميكانيكية في المختبر إلى نتائج السموم العصبية في الكائنات الحية. بمجرد أن تتمكن هذه النماذج من إثبات أنها تتبع معايير الجاهزية للتطبيق التنظيمي (BalPrice et al., 2018a)، سيكون الوقت قد حان لتنقيح البطارية الحالية من اختبارات السموم العصبية في المختبر (DNT IVB).

لقد حولت طرق الفحص عالي المحتوى (HCS) (فان فليت وآخرون، 2014) بشكل كبير اختبار DNT من خلال تقديم نهج أكثر دقة وكفاءة وشمولية لتقييم تأثيرات المواد الكيميائية على التطور العصبي. تستفيد هذه الطرق من التصوير الآلي والتحليل لقياس عدة معايير بيولوجية داخل الخلايا، مما يوفر قفزة عميقة في القدرة على تقييم النقاط النهائية الوظيفية الحيوية لاختبار DNT، مثل نمو المحاور والفيزيولوجيا الكهربائية.

زيادة الكفاءة والإنتاجية: تتيح طرق HCS المعالجة السريعة والفعالة لعدد معتدل إلى كبير من المواد الكيميائية، وهو أمر أساسي لتطوير استراتيجيات اختبار DNT عالية الإنتاجية. هذه القدرة ضرورية نظرًا للعدد الهائل من المواد الكيميائية في البيئة التي لم يتم اختبارها من حيث السمية العصبية بسبب الطبيعة المستهلكة للوقت والموارد لاختبارات DNT في الكائنات الحية.

التحليل متعدد المعلمات: واحدة من النقاط القوية الرئيسية في HCS هي قدرته على قياس عدة معلمات في نفس الوقت ضمن نفس الاختبار، مما يوفر فهماً أكثر شمولاً للتأثيرات السامة على الأعصاب. تتيح هذه القدرة على التعدد تقييم جوانب مختلفة من صحة الخلايا العصبية، بما في ذلك بقاء الخلايا، ونمو الزوائد العصبية، ووظيفة المشابك، ومسارات الإشارات الخلوية، ضمن تجربة واحدة (Li وXia، 2019).

تحسين الحساسية والنوعية: الطبيعة الآلية لنظام الفحص عالي المحتوى، جنبًا إلى جنب مع خوارزميات تحليل الصور المتقدمة، يمكن أن تعزز من حساسية ونوعية اختبارات السموم العصبية. يمكن أن تكشف الطرق عالية المحتوى عن تغييرات دقيقة في شكل ووظيفة الخلايا العصبية التي قد تشير إلى السمية العصبية، حتى عند جرعات منخفضة من المواد الكيميائية (شموك وآخرون، 2017؛ بيرسون وهومبرغ، 2016). هذه الحساسية حاسمة لتحديد المواد السامة العصبية المحتملة التي قد لا تنتج سمية ظاهرة ولكن يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التطور العصبي والوظيفة.

تطبيق على النماذج المعقدة: تتوافق طرق HCS مع النماذج المعقدة في المختبر، بما في ذلك ثقافات الأعضاء ثلاثية الأبعاد والنماذج العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة من الإنسان (Fritsche et al., 2018). هذه النماذج المتقدمة تحاكي بشكل أقرب تطور الدماغ البشري والأمراض، مما يعزز من أهمية اختبار DNT لصحة الإنسان. تسمح الطرق عالية المحتوى بالتحليل التفصيلي لهذه النماذج المعقدة، مما يوفر رؤى حول آليات السمية العصبية وإمكانية حدوث اضطرابات في النمو (Schmuck et al., 2017).

التحديات والاتجاهات المستقبلية: على الرغم من مزايا نظام الفحص عالي المحتوى (HCS) في اختبار السمية العصبية (DNT)، لا تزال هناك تحديات قائمة. تشمل هذه الحاجة إلى بروتوكولات موحدة والتحقق من صحة طرق HCS لقبولها من قبل الجهات التنظيمية. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب تعقيدات البيانات الناتجة عن الطرق عالية المحتوى أدوات معلوماتية حيوية متطورة للتحليل والتفسير (Li وXia، 2019). إن دمج HCS مع التقنيات الناشئة، مثل التعلم الآلي (ML) والذكاء الاصطناعي (AI)، يحمل وعدًا في معالجة هذه التحديات. يمكن أن تعزز هذه التقنيات تحليل مجموعات البيانات المعقدة، وتحسن القدرة التنبؤية لاختبار السمية العصبية، وتساعد في تحديد المواد السامة العصبية الجديدة (Schmuck وآخرون، 2017).

في الختام، لقد أحدثت طرق HCS ثورة في اختبار DNT من خلال توفير نهج أكثر كفاءة وحساسية وشمولية لتقييم الإمكانات السمية العصبية للمواد الكيميائية. مع استمرار تطور هذه الطرق واندماجها مع الأدوات الحاسوبية المتقدمة، ستلعب دورًا متزايد الأهمية في حماية صحة الإنسان من الآثار الضارة للمواد الكيميائية البيئية.

مفهوم “الخصائص الرئيسية” خصائص المواد الكيميائية وغيرها من العوامل التي تمنح خطرًا محتملاً، تم تطويرها لأول مرة للمواد المسرطنة وكانت تستند إلى خصائص المسرطنات البشرية المعروفة كما صنفتها الوكالة الدولية لبحوث السرطان (IARC). تم تطبيق هذه الخصائص الرئيسية للمسرطنات في تقييم المسرطنات المتنوعة وتستخدم الآن كأساس لتقييم البيانات الميكانيكية في IARC. مؤخرًا، تم وصف الخصائص الرئيسية للسموم التناسلية للذكور والإناث (Arzuaga et al., 2019; Luderer et al., 2019) وللكيميائيات المسببة للاضطرابات الهرمونية (La Merrill et al., 2020; Cediel-Ulloa et al., 2022)، وتتم تطوير خصائص لمجالات سمية أخرى. مجموعة عمل (سمية) عصبية اجتمعوا في جامعة كاليفورنيا في ديفيس في 17-18 سبتمبر 2019، لتطوير معايير رئيسية لـ DNT. ترأست الاجتماع باميلا لين من جامعة كاليفورنيا في ديفيس وتوماس هارتونغ من جامعة جونز هوبكنز، وكان الاجتماع مستضافًا من قبل مارتن سميث (جامعة كاليفورنيا في بيركلي) ولورين زيس (OEHHA، CalEPA). قامت المجموعة بمراجعة الأدبيات وتطوير 12 سمة رئيسية، مع الأخذ في الاعتبار السمية العصبية خلال فترة التطور وفي مراحل الحياة اللاحقة. وهم حاليًا يقومون بتنقيح السمات الرئيسية في سلسلة من المكالمات الهاتفية المتابعة ويعدون مخطوطة للنشر.

لقد حولت الذكاء الاصطناعي بشكل كبير اختبار DNT، حيث قدمت أساليب مبتكرة لفهم وتوقع التأثيرات العصبية السامة للمواد الكيميائية والأدوية. هذه التحولات واضحة في عدة مجالات رئيسية، بما في ذلك تحسين النماذج التنبؤية، والتكامل مع الأنظمة البيولوجية المعقدة، وتحسين تحليل البيانات وتفسيرها.

نماذج تنبؤية محسّنة: لقد كانت الذكاء الاصطناعي، وخاصة التعلم الآلي، أداة حيوية في تطوير نماذج تنبؤية لاختبار DNT في سياق مشروع ONTOX الجاري (فينكن وآخرون، 2021، انظر أدناه). يمكن لهذه النماذج تحليل مجموعات بيانات ضخمة، وتحديد الأنماط والعلاقات التي قد لا تكون واضحة باستخدام طرق التحليل التقليدية. على سبيل المثال، أظهرت دراسة استخدام التعلم الآلي للتنبؤ بالسمية العصبية في المختبر الناتجة عن الجسيمات النانوية، مما يبرز إمكانيات الأساليب غير الاختبارية في تقييم المخاطر (فورخي ومورفي، 2020). من خلال الاستفادة من ميزات مثل جرعة التعرض، والمدة، ونوع الخلايا، يمكن لنماذج الذكاء الاصطناعي تقديم فهم أكثر دقة لمخاطر السمية العصبية.

التكامل مع الأنظمة البيولوجية المعقدة: قدرة الذكاء الاصطناعي على التعامل مع البيانات المعقدة وعالية الأبعاد تجعلها مناسبة بشكل خاص للتكامل مع الأنظمة البيولوجية المتقدمة المستخدمة في اختبار DNT، مثل الهياكل العصبية المشتقة من خلايا iPSC البشرية (شوارز وآخرون، 2015). يمكن لهذه الأنظمة نمذجة تطور الأعصاب البشرية بدقة أكبر من النماذج الحيوانية، لكنها تولد كميات كبيرة من البيانات التي قد تكون صعبة التحليل. يمكن للذكاء الاصطناعي معالجة هذه البيانات وتفسيرها، وتحديد المؤشرات الرئيسية للسمية العصبية و
تعزيز صلة اختبار DNT بصحة الإنسان. لقد ناقشنا سابقًا فرص نمذجة MPS من خلال الأساليب الحسابية (سميرنوفا وآخرون، 2018).

تحسين تحليل البيانات وتفسيرها: أصبحت HCS، التي تولد كميات كبيرة من البيانات حول استجابات الخلايا للمواد الكيميائية، حجر الزاوية في اختبار DNT الحديث (شافر، 2019). يمكن لخوارزميات الذكاء الاصطناعي تحليل هذه البيانات بكفاءة، واستخراج رؤى ذات مغزى حول التأثيرات السامة العصبية. على سبيل المثال، تم استخدام الذكاء الاصطناعي لرسم خريطة الاعتلال العصبي الناتج عن الأدوية من خلال تتبع بروتينات الحركة في الموقع، مما يجمع بين بيانات التصوير وML لتقييم أكثر دقة للسمية العصبية (ي وآخرون، 2021).

التحديات والاتجاهات المستقبلية: على الرغم من هذه التقدمات، لا تزال هناك تحديات في تطبيق الذكاء الاصطناعي على اختبار DNT. تشمل هذه الحاجة إلى مجموعات بيانات كبيرة وعالية الجودة لتدريب نماذج الذكاء الاصطناعي، وتفسير التنبؤات التي ينتجها الذكاء الاصطناعي، ودمج أساليب الذكاء الاصطناعي في الأطر التنظيمية (فريتشي وآخرون، 2017). سيتطلب معالجة هذه التحديات استمرار التعاون بين علماء السموم، وعلماء البيانات، والهيئات التنظيمية.

يمتلك الذكاء الاصطناعي القدرة على إحداث ثورة في اختبار DNT من خلال تعزيز دقة التنبؤ بتقييمات السمية العصبية، وتمكين دمج البيانات البيولوجية المعقدة، وتحسين كفاءة تحليل البيانات. مع استمرار تطور تقنيات الذكاء الاصطناعي، ستلعب دورًا متزايد الأهمية في تحديد المخاطر السامة العصبية وحماية صحة الإنسان.

مشروع EU ONTOX (فينكن وآخرون، 2021)، الممول من هورايزون 2020، في طليعة الاستفادة من الذكاء الاصطناعي لاختبار DNT (بجانب سمية الكبد والكلى) وتقييم المخاطر الكيميائية الأوسع دون استخدام اختبار الحيوانات. من خلال التركيز على تطوير منهجيات جديدة غير حيوانية (NAMs) وتقييم المخاطر الاحتمالية، يهدف ONTOX إلى التوافق مع -مبادئ اختبار السمية في القرن. جانب رئيسي من المشروع يتضمن معالجة قبول وتحقق الذكاء الاصطناعي في تقييم المخاطر، كما تم تسليط الضوء عليه خلال الاجتماع الأول لشبكة أصحاب المصلحة في ONTOX الذي عقد في مارس 2023 (دييمار وآخرون، 2024). جمع هذا الاجتماع بين مختلف أصحاب المصلحة، بما في ذلك السلطات التنظيمية، والشركات، والأوساط الأكاديمية، والمنظمات غير الحكومية، لمناقشة التحديات والفرص المرتبطة بتنفيذ NAMs المدفوعة بالذكاء الاصطناعي وتقييم المخاطر الاحتمالية. وأكدت المناقشات على الحاجة إلى بناء القدرات، والاستدامة، وقبول التنظيم لتقنيات الذكاء الاصطناعي في سياق ضمان سلامة المستهلك وتقدم منهجيات تقييم المخاطر الكيميائية. تمثل جهود مشروع ONTOX لدمج الذكاء الاصطناعي في اختبار DNT وتقييم المخاطر الكيميائية خطوة كبيرة نحو تقليل الاعتماد على اختبار الحيوانات مع تعزيز دقة وكفاءة تقييمات السمية (دييمار وآخرون، 2024).

باختصار، لقد مكنت هذه الأدوات البيوتكنولوجية المتقدمة من إنشاء نماذج أكثر صلة وكفاءة في المختبر لاختبار DNT. لديها القدرة على تقديم رؤى آلية حول كيفية تأثير المواد الكيميائية على تطور الأعصاب، وهو أمر

حاسم لتطوير ITS التي يمكن أن تقلل في النهاية من الحاجة إلى اختبار الحيوانات.

أوضح التقرير التوافقي حول مستقبل اختبار السمية النظامية الخالية من الحيوانات، الذي نتج عن ورش عمل خبراء نظمتها CAAT-Europe، استراتيجية عامة لأساليب الاختبار الخالية من الحيوانات (باسكيتير وآخرون، 2012؛ ليست وآخرون، 2014). تم إبلاغ هذه الاستراتيجية برؤية المجلس الوطني للبحوث في الولايات المتحدة لاختبار السمية في القرن (NRC، 2007)، الذي دعا إلى التحول نحو طرق غير حيوانية أكثر صلة بالإنسان.

وضعت المناقشات والتوصيات المبكرة لاختبار السمية النظامية الخالية من الحيوانات الأساس لتطوير ITS. تم تصور هذه الاستراتيجيات لتوفير تقدير أكثر فعالية لاحتياجات المعلومات التنظيمية مقارنة بالاختبارات المستقلة. تم تصميم ITS لدمج مصادر المعلومات المختلفة، بما في ذلك الاختبارات في المختبر، والنماذج الحاسوبية، وبيانات المراقبة البيولوجية البشرية، للتنبؤ بسمية المواد. يتم تسهيل هذا التكامل بواسطة أدوات حسابية مثل الشبكات البايزية وML. الشبكات البايزية هي نماذج احتمالية يمكن أن تجمع البيانات من مصادر مختلفة وتأخذ في الاعتبار عدم اليقين، مما يوفر نهجًا منظمًا لدمج الأدلة وإجراء التنبؤات. من ناحية أخرى، يمكن لـ ML تحليل مجموعات بيانات كبيرة لتحديد الميزات التي تتنبأ بنتائج السمية، مما يحسن دقة وكفاءة التنبؤات السمية.

تكمن وعد ITS في قدرتها على تقريب المعلومات التي يمكن الحصول عليها بخلاف ذلك من اختبار الحيوانات، ولكن بطريقة أكثر صلة بالإنسان وأخلاقية. من خلال الاستفادة من الأدوات الناشئة لدمج البيانات، يمكن لـ ITS تقديم تقييم أكثر شمولاً للمواد السامة المحتملة، مع مراعاة عوامل مختلفة مثل السمية الحركية، واختبار المخاطر، ورسم خريطة المعلومات على طول AOPs (ليست وآخرون، 2014).

يمثل تطوير ITS تقدمًا كبيرًا في مجال علم السموم، يهدف إلى تقليل الاعتماد على اختبار الحيوانات مع تلبية المتطلبات التنظيمية لتقييم السلامة. مع استمرار تطور هذه الاستراتيجيات، من المتوقع أن تصبح جزءًا لا يتجزأ من المشهد التنظيمي، مما يوفر نهجًا أكثر كفاءة ومسؤولية أخلاقية لاختبار السمية.

أصبح مفهوم AOPs (ويلت، 2018) حجر الزاوية في التصميم العقلاني لـ ITS لاختبار DNT. هذه الإطار ضروري في تحديد الأهداف والآليات المحددة التي تعتبر حاسمة في تطوير التأثيرات السامة العصبية، مما يسهل
تطوير استراتيجيات الاختبار التي تكون أكثر إبلاغًا آليًا وأكثر تنبؤًا بنتائج صحة الإنسان.

أهمية AOPs في تصميم ITS لاختبار DNT: تقدم AOPs نهجًا منظمًا لفهم الآليات المعقدة التي تكمن وراء DNT، مما يمكّن الباحثين من تحديد العمليات البيولوجية المحددة التي يمكن استهدافها للاختبار. من خلال رسم خريطة تسلسل الأحداث التي تؤدي إلى نتائج سلبية في التطور العصبي، تساعد AOPs في تحديد العلامات الحيوية والنقاط النهائية ذات الصلة التي يمكن دمجها في ITS (هيرنانديز-جيريز وآخرون، 2021؛ ويلت، 2018). هذا الفهم الآلي أمر حاسم لتطوير الاختبارات التي لا تكون حساسة فقط للتأثيرات السامة العصبية المحددة ولكن أيضًا ذات صلة بصحة الإنسان.

تسهيل استراتيجيات الاختبار المستندة إلى الآلية: ساهم تحديد KEs والأهداف داخل AOPs الخاصة بـ DNT بشكل كبير في تطوير استراتيجيات اختبار أكثر إبلاغًا آليًا. على سبيل المثال، طورت لجنة EFSA للمنتجات الزراعية وحمايتها ومخلفاتها دراسات حالة مستندة إلى AOPs لتحديد مخاطر DNT لمبيدات الآفات مثل ديلتامثرين وفلوبينسيت (هيرنانديز-جيريز وآخرون، 2021). من خلال التركيز على KEs المحددة التي تم تحديدها في AOPs، مثل التغيرات في تكاثر الأعصاب، والتمايز، والتشابك العصبي، يمكن لهذه الاستراتيجيات التنبؤ بدقة أكبر بإمكانية تسبب المواد الكيميائية في DNT.

تعزيز القدرة التنبؤية باستخدام الأدوات الناشئة لدمج البيانات: لقد عزز دمج الأدوات الناشئة لتحليل البيانات، مثل الشبكات البايزية وتعلم الآلة، القدرة التنبؤية لنظم الاختبار البديلة (ITS) لاختبار المواد السامة. على سبيل المثال، تتيح الشبكات البايزية الكمية الاحتمالية لوزن الأدلة عبر مصادر بيانات مختلفة، بما في ذلك الاختبارات المخبرية والنماذج الحاسوبية، ضمن إطار عمل AOP. يمكن لخوارزميات تعلم الآلة تحليل مجموعات بيانات معقدة من اختبارات الفحص عالية الإنتاجية لتحديد الأنماط والتنبؤ بالنتائج بناءً على العناصر الأساسية المحددة (Zhang et al., 2023). تمكّن هذه الأدوات الحاسوبية من دمج أنواع بيانات متنوعة، مما يحسن قدرة نظم الاختبار البديلة على تقريب احتياجات المعلومات التنظيمية بشكل فعال.

الخاتمة: يمثل تطوير وتطبيق مسارات التأثيرات السامة (AOPs) في تصميم نظم النقل الذكية (ITS) لاختبار التأثيرات السامة على النمو (DNT) تقدمًا كبيرًا في مجال علم السموم. ومع ذلك، فإن مسارات التأثيرات السامة المتاحة حاليًا لاختبار DNT قليلة نسبيًا: البيانات المستخرجة من AOP-Wiki. في 24 مارس 2024، قم بإدراج ثمانية AOPs (#6، #12، #13، #17، #31، #54، #499، #500)، من بينها خمسة مدعومة من قبل مجموعة العمل المعنية بالصحة والبيئة التابعة لمنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية. سيتطلب الأمر جهدًا مجتمعيًا لتوسيع هذا، لدمجه في شبكة (Pistollato et al., 2020; Sachana et al., 2021b; Spînu et al., 2022; Pitzer et al., 2023)، ولجعله أساسًا لاستراتيجية الاختبار. من خلال توفير إطار هيكلي لفهم الأساس الميكانيكي للسمية العصبية، يمكن أن تسهل AOPs تطوير استراتيجيات اختبار ليست فقط أكثر اطلاعًا على البيولوجيا الأساسية ولكن أيضًا أكثر توقعًا لنتائج صحة الإنسان. إن دمج أدوات الحوسبة المتقدمة لتحليل البيانات يعزز بشكل أكبر قدرة ITS على توفير…

تقييمات شاملة وموثوقة للمواد السامة المحتملة، مع التوجه نحو تقييمات سمية أكثر فعالية وملاءمة للبشر.

مثل مؤتمر 2014 نقطة تحول نحو الانخراط التنظيمي. هنا، نود أن نبرز مشاركة الوكالات التنظيمية (EPA، EFSA، OECD) وتطوير الوثائق الإرشادية التي نشأت من هذه التعاونات. بالتوازي مع احتضان الوكالات للتطورات التكنولوجية، تطورت المفاهيم المتعلقة بمعالجة DNT بشكل أكبر مع هذه المناقشة، متجهة أكثر نحو التنفيذ والاستخدام التنظيمي (Bal-Price et al.، 2018b).

شبكة أصحاب المصلحة الدولية (ISTNET)، التي أقيمت في عام 2014 في زيورخ، سويسرا، ساعدت في تحديد كيفية إدخال جميع التطورات التقنية في سياق تنظيمي. تم رعاية ورشة العمل من قبل EPAA (الشراكة الأوروبية للبدائل لاختبار الحيوانات)، وCAAT، وSCAHT (المركز السويسري لعلم السموم البشرية التطبيقي).

اجتمعت ISTNET (كروفتون وآخرون، 2014؛ بال-برايس وآخرون، 2015ب) للتركيز على مفهوم AOPs كأداة واعدة لتعزيز تطوير أنظمة الاختبار المتوافقة مع الاحتياجات التنظيمية. اعتُبرت AOPs حاسمة لتجميع أنظمة الاختبار التنبؤية لـ DNT. تم توضيح نهج تدريجي لاختبار DNT القائم على AOP، بدءًا من AOPs غير المكتملة لتجميع المركبات والتركيز على KEs للتطور العصبي. شملت الخطوات التالية تطبيق مفهوم AOP على اختبار DNT التنظيمي، واستخدام تقاطعات AOP لتطوير اقتصادي للاختبارات الفرز، والانتقال من الأوصاف النوعية إلى نمذجة الشبكات الكمية.

كما أبرز التقرير أهمية التواصل والنقاشات بين أصحاب المصلحة – المنظمين، والصناعة، والأوساط الأكاديمية – لتحديد خارطة طريق مدفوعة بالاحتياجات التنظيمية لنظام النقل الذكي (ITS) للمواد السامة. وقد اعترف التقرير بحدود طرق الاختبار الحالية المعتمدة على الحيوانات، داعياً إلى استخدام أساليب النمذجة في المختبر/أو النمذجة الحاسوبية لتوفير بيانات ذات قيمة مضافة للأغراض التنظيمية. ومن المتوقع أن تقلل هذه الأساليب من اختبار الحيوانات، وتخفض التكاليف، وتزيد من كفاءة الاختبار من خلال استخدام الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لتقدير المخاطر البيئية على صحة الإنسان.

اختتم اجتماع ISTNET بأن الأساليب البديلة مثل طرق الاختبار في المختبر، والعلاقات الكمية بين التركيب والنشاط (QSARs)، والقراءة المتبادلة، وتطبيق مفاهيم KNDP وAOP وأنماط السمية النهائية يمكن أن تلبي المتطلبات التنظيمية لاختبار DNT. كان التركيز الرئيسي للاجتماع هو زيادة استخدام مصادر البيانات البديلة في تقييم مخاطر DNT وقرارات إدارة المخاطر.

باختصار، قدمت المقالة التي كتبها بال-برايس وآخرون (2015ب) مفاهيم اختبار DNT من خلال تعزيز استخدام AOPs لتوجيه تطوير أنظمة الاختبار المتكاملة، داعيةً إلى دمج الاختبارات في المختبر.
وإدخال الأساليب الحاسوبية في الأطر التنظيمية، مع التأكيد على الحاجة إلى نهج تعاوني بين أصحاب المصلحة لمعالجة التحديات في اختبار السموم العصبية.

لعبت ورشة العمل دورًا محوريًا في دمج EFSA وOECD في تطوير استراتيجيات اختبار السمية النظامية الخالية من الحيوانات، بما في ذلك اختبار DNT. وضعت هذه المناقشات الأساس للأنشطة المستقبلية التي تهدف إلى دمج ITS المعتمدة على AOP في عمليات اتخاذ القرار التنظيمي لتقييم سلامة المواد الكيميائية. كانت مساهمات EFSA وOECD في هذه الأنشطة كبيرة، حيث قدمت خبرة علمية ووجهات نظر تنظيمية ضرورية لقبول وتنفيذ استراتيجيات الاختبار الخالية من الحيوانات. ساعدت أنشطتهم في تقدم مجال اختبار DNT من خلال تعزيز تطوير استراتيجيات اختبار أكثر توقعًا وكفاءة ومسؤولية أخلاقية تعكس بشكل أفضل نتائج صحة الإنسان: كانت EFSA وOECD نشطتين في تعزيز مجال اختبار DNT، مثل تطوير طرق اختبار غير حيوانية وIATA لـ DNT. قامت OECD بتنسيق الجهود الدولية لتعزيز اختبار DNT، معترفًة بالاستخدام التاريخي المحدود لإرشادات اختبار DNT في vivo. أدت ورش العمل على مدار العقد الماضي إلى توافق بين أصحاب المصلحة حول الحاجة إلى بطارية اختبار DNT تعتمد على نقاط النهاية في vitro واختبارات الأنواع البديلة. بدأت OECD أنشطة محددة، بما في ذلك تجميع طرق DNT المتاحة في vitro، وتشكيل بطارية اختبار DNT، وتوليد مجموعة مرجعية من المواد الكيميائية للاختبار، وتطوير وثيقة إرشادية من OECD تتضمن دراسات حالة IATA (Sachana et al., 2019). كانت هذه الدراسات تهدف إلى تقييم قابلية تطبيق DNT IVB (Blum et al., 2023) في تقييم المخاطر التنظيمية للمبيدات. شمل النهج مراجعات منهجية للأدبيات، واستنباط المعرفة من الخبراء، وتحليل الشبكات البايزية لدمج الأدلة ضمن إطار AOP.

ورشة العمل التي نظمتها منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية/الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية حول تأثيرات المواد الكيميائية على التطور العصبي في أكتوبر 2016 (فريتشه وآخرون، 2017) حققت تقدمًا كبيرًا نحو تعزيز استخدام طرق الاختبار البديلة غير الحيوانية لأغراض تنظيمية. ومن النقاط الرئيسية التي تم التوصل إلى توافق بشأنها من قبل مجموعة متنوعة من أصحاب المصلحة الدوليين ما يلي:

تقدم المراجعة التي أجراها شميت وآخرون (2016) نظرة شاملة على التقدم والإمكانات التقنية في اختبار السمية العصبية واختبار التطور العصبي في المختبر، مع التأكيد على الحاجة الملحة لطرق اختبار بديلة بسبب التحديات في استقراء بيانات الحيوانات إلى البشر والقدرة المحدودة لاختبارات الحيوانات لتغطية جميع المواد التي تتطلب التقييم. تناقش الورقة منصات خلوية مختلفة تستخدم في اختبار السمية العصبية، بدءًا من خطوط خلايا الحيوانات والبشر إلى خلايا جذعية بشرية متقدمة ونماذج الأعضاء على شريحة، مع تسليط الضوء على مزاياها وقيودها. تغطي الورقة النقاط النهائية الشائعة لاختبار السمية العصبية، بما في ذلك حيوية الخلايا، ونمو المحاور العصبية، والوظيفة المشبكية، والخصائص الكهربية، من بين أمور أخرى. علاوة على ذلك، تستكشف الطرق التحليلية مثل التصوير عالي المحتوى والشاشات الكهربية لتقييم هذه النقاط النهائية. تؤكد المراجعة على أهمية دمج نماذج خلوية متعددة ونقاط نهائية لالتقاط تعقيد التأثيرات السامة العصبية وتدعو إلى تطوير طرق ITS وmulti-omics لتحسين نماذج التنبؤ لتقييم إمكانيات الخطر الكيميائي. تسهم هذه الدراسة بشكل كبير في هذا المجال من خلال توضيح الحالة الحالية، والتحديات، والاتجاهات المستقبلية لاختبار السمية العصبية واختبار التطور العصبي في المختبر، وتعزيز التحول نحو طرق اختبار أكثر صلة بالبشر، وكفاءة، وأخلاقية.

تناولت ورشة العمل والورقة الناتجة عنها التي أعدها أشكنر وآخرون (2017) الفجوة الحرجة في المعلومات المتعلقة بخطر DNT الذي تسببه المواد الكيميائية الصناعية والبيئية. مع إدراك أن أساليب الاختبار المستقبلية ستشمل على الأرجح مجموعة من الاختبارات البديلة والمكملة، ركزت الورقة على الجيل الأول من اختبارات DNT البديلة التي تستهدف العمليات العصبية الأساسية، مثل تمايز الخلايا العصبية، وهجرة خلايا السلف، أو تشكيل الشبكات العصبية. هذه العمليات حاسمة لأنها تلتقط المواد السامة ذات الأهداف وأنماط العمل المتنوعة ويمكن ربطها بالأنماط السلبية السامة، وهي التغيرات في الاتصال العصبي التي تؤدي إلى عجز وظيفي عصبي لدى البشر. عرّفت ورشة العمل التي أدت إلى المراجعة معايير اختيار الضوابط الإيجابية/السلبية، وأعدت توصيات لاستخدامها، وبدأت في إعداد دليل للمواد الكيميائية المرجعية. تم تحديد أكثر من 50 مركب تحكم محدد لنقاط النهاية من أجل تحسين تقني أولي للاختبارات، وتم اقتراح مجموعة إضافية من 33 مادة كيميائية، تعتبر سموم DNT مباشرة، لتطوير اختبارات إضافية.

قمنا بعد ذلك بتقييم جاهزية الاختبار في ورشة عمل لاحقة وطورنا قائمة بالمركبات المرجعية: يقدم بال-برايس وآخرون (2018أ) تقدمًا مفاهيميًا كبيرًا من خلال توفير إطار لتقييم جاهزية NAMs لاختبار DNT لأغراض تنظيمية. مجموعة من معايير الجاهزية ونظام تسجيل لت-
تم تقديم تقييم جاهزية اختبارات DNT الفردية في المختبر وكذلك مجموعة اختبارات DNT في المختبر (DNT IVB) لمختلف التطبيقات التنظيمية. يتيح ذلك تقييمًا كميًا لحالة تطوير الاختبارات وما هو العمل الإضافي المطلوب لزيادة الثقة التنظيمية في هذه الطرق البديلة. يوفر النهج الموضح نموذجًا لتقييم الطرق البديلة في مجالات أخرى من علم السموم. تشمل العناصر الرئيسية: 1) تحديد معايير الجاهزية بناءً على الحاجة التنظيمية وسياق الاستخدام، 2) تسجيل كمي لجاهزية الاختبار بناءً على معايير محددة متعددة، 3) تقييم مجموعة الاختبارات ككل من حيث التغطية البيولوجية، والأداء التنبؤي، والجاهزية العامة للاستخدامات التنظيمية المختلفة، و4) استخدام دراسات حالة لإظهار كيفية تطبيق الطرق البديلة في IATA. يسمح هذا الإطار بتقييم شفاف وموضوعي للطرق البديلة لتسهيل قبولها واستخدامها في التنظيم. بينما لا يزال هناك حاجة لمزيد من العمل للتحقق الكامل من DNT IVB (Juberg et al.، 2023)، كانت الاستراتيجية المقدمة خطوة مهمة إلى الأمام في تعزيز استخدام الطرق البديلة لاختبار السلامة.

عقدت وكالة حماية البيئة الأمريكية اجتماعًا عامًا للّجنة الاستشارية العلمية الخاصة بقانون مكافحة الآفات الفيدرالي (FIFRA) في الفترة من 15 إلى 17 سبتمبر 2020، لمراجعة استخدام النماذج البديلة (NAMs) لاشتقاق عوامل الاستقراء وتقييم تأثيرات التطور العصبي (DNT) على تقييم مخاطر الصحة البشرية. تشمل النقاط الرئيسية :

ج. تأثير التغيرات النظامية الناتجة عن المواد الكيميائية (مثل الالتهاب، مستويات الأكسجين وتوزيعها)
د. تأثير العوامل الأمومية (عدوى الأم، الهرمونات، خلل في وظائف الأعضاء، سلامة المشيمة)
بالإضافة إلى ذلك، تم ذكر أن الاختبارات في المختبر:
أ. ستقتصر قدرتهم على اكتشاف العمليات التكيفية أو التعويضية.
ب. لا تأخذ في الاعتبار التفاعلات الخلوية الحرجة المطلوبة خلال تطور الأعصاب.
ج. يواجهون صعوبة في التمييز بين المركبات النشطة عصبيًا والمركبات السامة عصبيًا.
لا تعكس التنوع الجيني البشري عند استخدام خطوط خلايا بشرية من إنسان واحد.

تم إنشاء مجموعة خبراء من منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD) لاختبار DNT في المختبر في عام 2017. وكانت نتيجة ذلك اقتراح لتطوير، في جوهره، IATA. تسميها منظمة التعاون والتنمية الاقتصادية IATA – وقد أطلقنا عليها مؤخرًا اسم invivitrosi – مدمجة بين in vitro و in vivo و in silico (Caloni et al.، 2022).

كانت مساهمة مهمة تقريرًا تم تكليفه من قبل EFSA: يقدم كروفتون وموندي (2021) إرشادات حول تفسير واستخدام البيانات الناتجة عن الاختبارات المدرجة حاليًا في DNT IVB لأغراض تنظيمية. يحتوي تقريرهم على النقاط الرئيسية التالية:

يأخذ الفحص دورًا متزايد الأهمية في DNT، مدفوعًا، على سبيل المثال، من خلال برامج الفحص وتحديد الأولويات الكبيرة من وكالة حماية البيئة الأمريكية أو NTP/NIEHS، ومن خلال توفر المزيد من الاختبارات عالية الإنتاجية الأفضل والأكثر موثوقية في الخلايا، والأورغانويد، والأعضاء البسيطة-
أنظمة. الفحص هو تخصص علمي تم تطويره في اكتشاف الأدوية، وتم جمع الكثير من الخبرة التي تم دمجها في ثقافة الفحص وأفضل الممارسات ضمن تخصص علم الأدوية. في علم السموم، تم اعتماد التكنولوجيا وتكييفها، لكن الثقافة متأخرة. غالبًا ما يكون التمييز بين نتيجة الفحص وسمية محتملة غير واضح ويحتاج إلى مزيد من التوضيح للاستخدام الفعال لهذا النهج في اختبار DNT. المصطلحات الصيدلانية هي كما يلي: تنتج الشاشات “إيجابيات أولية” في الاختبار المعني. بعد تأكيدها في ظروف أكثر تحكمًا، يمكن أن تُسمى “إيجابيات مؤكدة”. يجب تصفيتها، على سبيل المثال، من أجل العيوب الفنية، أو التأثيرات الثانوية بسبب السمية الخلوية. في العديد من الشاشات الصيدلانية، يؤدي ذلك إلى القضاء على من الفحص، ولا تبقى سوى القليل من “الإيجابيات الحقيقية”. عادةً ما يتم اختبار هؤلاء الناجين في اختبارات ثانوية أخرى. إذا نجوا من هذه الخطوة، يمكن للمرء أن يتحدث عن نتائج اختبار مثيرة للاهتمام ويمكن للمرء أن يضع فرضية بأن هذه هي مواد سامة محتملة (انظر الشكل 3).

تحتاج هذه الفرضية بعد ذلك إلى مزيد من التقييم لتسمية المركبات “نتائج سمية ذات صلة”. التقييم هو عملية إما تدحض الفرضية أو تجمع الأدلة التي تزيد من احتمالية صحة الفرضية. العوامل المهمة في ذلك هي التشابه مع مواد سامة معروفة أخرى أو آلية معروفة تغذي AOP، بالإضافة إلى سلوك السمية المحتمل الذي من المحتمل أن يؤدي إلى شغل الهدف عند التعرضات ذات الصلة. في غياب حجة تشابه هيكلي قوية أو احتمالية آلية، غالبًا ما يكون من الصعب تقييم الأهمية ويتطلب اختبارات DNT ذات صلة وتنبؤية للغاية. تستند المنشورات النموذجية لهذه العملية إلى اختبار هجرة القمة العصبية وثنائي الفينيل متعدد الكلور كإيجابيات أولية (Nyffeler et al., 2018) أو اختبار نمو النيريت (Krug et al., 2013b) والبربيرين كمركب إيجابي (Suciu et al., 2023b). مثال حديث جدًا هو فحص 1800 مركب ToxCast للسمية على الأليغودينروسايت النامية. كانت التوصيفات الشاملة للإيجابيات والمتابعة السمية ضرورية لتوصيف، على سبيل المثال، المركبات الأمفيفيلية القائمة على الأمين الرباعي كفئة جديدة من المواد السامة المحتملة DNT (Cohn et al., 2024).

أحد التحديات الرئيسية هو الحاجة إلى مزيد من التحقق من صحة طرق DNT البديلة. بينما تم تطوير عدد كبير من النماذج في المختبر وفي السيليكو وأظهرت أنها مؤشرات واعدة لـ DNT، لم تخضع معظم هذه الطرق بعد لعملية التحقق الصارمة المطلوبة لقبولها التنظيمي. تتضمن التحقق التقليدي إثبات القابلية للتكرار، والتنبؤ، والأهمية لطريقة الاختبار لغرضها المقصود، عادةً من خلال سلسلة من الدراسات بين المختبرات باستخدام بروتوكول موحد ومجموعة من المواد الكيميائية المرجعية المتنوعة. يمكن أن تكون هذه العملية مستهلكة للوقت والموارد، وتتطلب التعاون بين عدة أصحاب مصلحة، بما في ذلك مطوري طرق الاختبار، وهيئات التحقق، والوكالات التنظيمية. إن مفهوم التحقق هذا قديم، حيث تم تطويره لنقاط النهاية البسيطة ولطرق تتنبأ بمفردها (أي، واحد لواحد) بمثل هذه النقاط. بالنسبة للطرق التي هي جزء من بطارية اختبار، تتطلب مبادئ الأهمية والتنبؤ

إعادة التعريف، واستخدام مجموعات مرجعية من المواد الكيميائية هو فقط ذو فائدة محدودة. بالنسبة لـ DNT، فإن العدد الإجمالي للمواد الكيميائية المرجعية صغير جدًا بالنسبة لنهج الأهمية الكلاسيكي مع نموذج التنبؤ الإحصائي (Mundy et al., 2015). والأهم من ذلك، أن القليل من المواد الكيميائية المرجعية المعروفة بتأثيرات DNT على البشر أو الحيوانات ليست موصوفة جيدًا لآليتها وطريقة عملها. لذلك، لا يمكن استخدامها تقريبًا للاختبارات الآلية أو اختبارات KNDP.

لتسهيل التحقق من صحة طرق DNT البديلة، هناك حاجة إلى إطار عمل واضح قائم على التوافق يحدد الخطوات والمعايير الرئيسية لإثبات الصلاحية العلمية والتنظيمية لهذه الطرق. يجب أن يأخذ هذا الإطار في الاعتبار
التحديات والفرص المحددة المرتبطة باختبار DNT، مثل تعقيد العمليات العصبية التنموية، وأهمية مراعاة اختلافات الأنواع (Baumann et al., 2016) وتوقيت التعرض، والحاجة إلى بطارية من الاختبارات التكميلية التي تغطي أوضاع عمل مختلفة. الوثيقة المحدثة مؤخرًا من اللجنة التنسيقية بين الوكالات بشأن التحقق من صحة الطرق البديلة (ICCVAM)، “التحقق، التأهيل، والقبول التنظيمي للطرق الجديدة” يصف استراتيجية تحقق أكثر مرونة وملاءمة للغرض مع التركيز على دمج النتائج من عدة نماذج بدلاً من الاستبدال واحد لواحد. يتم وصف DNT كنموذج نقطة نهائية حيث ستكون مثل هذه الاستراتيجية.

من المهم ونأمل أن يسرع ذلك العملية. الجهود المبذولة لتنفيذ مثل هذا الإطار مستمرة، كما يتضح من عمل مجموعة الخبراء في DNT التابعة لمنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية وورش العمل التعاونية التي نظمتها CAAT و ICCVAM و ECVAM وغيرهم من المعنيين. من المحتمل أن يحتاج المفهوم إلى مراجعة أكثر جذرية لبعض الاختبارات، أي عدم الاعتماد على المواد الكيميائية المرجعية التقليدية على الإطلاق، بل بدلاً من ذلك على مفاهيم التحقق الميكانيكي (هارتونغ وآخرون، 2013ب).

تتمثل إحدى التحديات الأخرى في دمج التقنيات الجديدة، مثل HTS، والنهج الأومي، والنمذجة الحاسوبية، في استراتيجيات اختبار DNT التنظيمية. بينما تقدم هذه التقنيات إمكانية إجراء اختبارات أسرع وأكثر كفاءة وتوفير معلومات آلية، فإن تطبيقها في سياق تنظيمي يثير العديد من القضايا المتعلقة بجودة البيانات وقابلية التفسير والأهمية. على سبيل المثال، قد تولد اختبارات HTS كميات كبيرة من البيانات حول تأثيرات المواد الكيميائية على نقاط نهاية جزيئية أو خلوية محددة، لكن العلاقة بين هذه التأثيرات والنتائج السلبية في الدماغ النامي قد لا تكون دائمًا واضحة. وبالمثل، يمكن أن توفر النهج الأومي، مثل النسخ الجيني (Krug et al., 2013a; Rempel et al., 2015) والميتابولوميات (Modafferi et al., 2021)، ثروة من المعلومات حول المسارات والعمليات البيولوجية التي تتأثر بالتعرض للمواد الكيميائية، لكن تحويل هذه المعلومات إلى قرارات تنظيمية قابلة للتنفيذ قد يتطلب خطوات إضافية، مثل تطوير AOPs الكمية وتحديد العتبات للتأثيرات الضارة.

لمعالجة هذه التحديات، هناك حاجة إلى حوار مستمر وتعاون بين مطوري التقنيات الجديدة، والوكالات التنظيمية المسؤولة عن تنفيذ متطلبات اختبار DNT، والمجتمع العلمي الأوسع. يجب أن يهدف هذا الحوار إلى تحديد الاحتياجات الأساسية للبيانات ومعايير اتخاذ القرار لاختبار DNT التنظيمي، وتطوير خارطة طريق للتكامل التدريجي للطرق البديلة والتقنيات الجديدة في الأطر التنظيمية. قد يتضمن ذلك تطوير استراتيجيات اختبار متعددة المستويات تجمع بين الأساليب في المختبر، وفي الحاسوب، وفي الكائنات الحية بطريقة توازن بين الحاجة إلى الكفاءة والتنبؤ مع متطلبات اليقين التنظيمي وحماية صحة الإنسان.

عند النظر إلى المستقبل، هناك أيضًا فرص كبيرة لتحسين القدرة التنبؤية وكفاءة اختبار DNT من خلال التقدم في تكامل البيانات والتعلم الآلي. إحدى الطرق الواعدة هي تطوير أنظمة المعلومات الذكية التي تجمع بين أنواع متعددة من البيانات، مثل نتائج الاختبارات في المختبر، والخصائص الفيزيائية والكيميائية، والتنبؤات الحاسوبية، لتوفير تقييم أكثر شمولاً وموثوقية لإمكانات DNT. من خلال الاستفادة من نقاط القوة في تدفقات البيانات المختلفة وأخذ الشكوك والقيود المرتبطة بكل منها في الاعتبار، يمكن أن توفر أنظمة المعلومات الذكية وسيلة أكثر دقة وكفاءة لتحديد أولويات المواد الكيميائية للاختبار الإضافي وإبلاغ القرارات التنظيمية.

يمكن تسهيل تطوير أنظمة النقل الذكية لاختبار المواد الكيميائية غير السامة من خلال التقدم في التعلم الآلي والذكاء الاصطناعي (كلاينستراور وهارتونغ، 2024)، والتي تقدم أدوات قوية لدمج وتحليل مجموعات البيانات الكبيرة والمعقدة. يمكن تدريب خوارزميات التعلم الآلي، مثل الغابات العشوائية، وآلات الدعم الناقل، والشبكات العصبية العميقة، على البيانات السابقة-
استخدام بيانات DNT لتحديد الأنماط والعلاقات التي قد لا تكون واضحة من التحليلات الإحصائية التقليدية. يمكن بعد ذلك استخدام هذه النماذج للتنبؤ بإمكانات DNT للمواد الكيميائية الجديدة بناءً على تشابهها الهيكلي والبيولوجي مع السموم المعروفة، أو لتحديد أكثر التركيبات المعلوماتية من الاختبارات والنقاط النهائية في سياق تنظيمي معين.

مع توافر المزيد من البيانات من طرق اختبار DNT البديلة ومصادر أخرى، مثل برامج الفحص عالية الإنتاجية والبحوث الأكاديمية، ستزداد الفرص لتحسين وتطوير ITS باستخدام أساليب التعلم الآلي. قد يتضمن ذلك التحديث المستمر للنماذج التنبؤية مع توليد بيانات جديدة، وتحديد مؤشرات حيوية جديدة ونقاط نهاية تكون أكثر تنبؤًا بالنتائج، وتطوير أطر اتخاذ قرارات أكثر تعقيدًا تأخذ في الاعتبار خطوط الأدلة المتعددة ومصادر عدم اليقين.

ومع ذلك، لتحقيق هذه الفرص بالكامل، هناك حاجة إلى مزيد من التوحيد والتنسيق في طرق اختبار DNT وممارسات الإبلاغ عن البيانات. يشمل ذلك تطوير أنطولوجيات وصيغ بيانات مشتركة لوصف العمليات والنقاط النهائية المتعلقة بالنمو العصبي، وإقامة معايير الحد الأدنى للإبلاغ عن دراسات DNT في المختبر وفي الحاسوب، وإنشاء قواعد بيانات مركزية ومتاحة للجمهور لتخزين ومشاركة بيانات DNT. الجهود المبذولة لتعزيز هذا التوحيد والتنسيق جارية بالفعل، كما يتضح من عمل مجموعة المشورة الموسعة لمنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية (OECD) حول الفحص الجزيئي والتوكسينوميات (EAGMST). والمشاريع التعاونية الممولة من برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي.

في الختام، بينما تم إحراز تقدم كبير في تطوير أساليب بديلة لاختبار DNT، لا تزال هناك تحديات مهمة يجب معالجتها من حيث التحقق من صحة الطرق، وقبول الجهات التنظيمية، ودمج البيانات. في الوقت نفسه، هناك فرص مثيرة للاستفادة من التقدم في التعلم الآلي والذكاء الاصطناعي لتحسين القدرة التنبؤية وكفاءة اختبار DNT، ولدعم تطوير استراتيجيات تنظيمية أكثر فعالية وموثوقية علمياً لحماية صحة الإنسان. من خلال العمل معاً لمعالجة هذه التحديات والفرص، يمكن للمجتمعات العلمية والتنظيمية المساعدة في ضمان تحقيق وعد اختبار DNT البديل بشكل كامل، وأن يتم تقييم سلامة المواد الكيميائية بطريقة صارمة وفعالة وتعكس أفضل العلوم المتاحة.

تنفيذ استراتيجيات اختبار متقدمة لـ DNT في السياقات التنظيمية والبحثية يواجه عدة تحديات. بينما تقدم ITS نهجًا واعدًا لتقريب احتياجات المعلومات التنظيمية بشكل أكثر فعالية، فإن اعتمادها يعيقه عوامل متعددة. واحدة من التحديات الرئيسية هي تعقيد DNT نفسه، مع وجود العديد من KEs والأهداف التي يجب تغطيتها بواسطة اللبنات الأساسية لـ ITS. يعتمد تصميم ITS بشكل مثالي على الآليات المعروفة لتأثيرات الصحة، مثل AOPs، ولكن العدد القليل من الدراسات التي تؤدي إلى قرارات تنظيمية في DNT يحد من هذا النهج.

علاوة على ذلك، فإن دمج الأدوات الناشئة لدمج البيانات، بما في ذلك الشبكات البايزية، وأدوات التعلم الآلي، وتحليل الحساسية، أمر ضروري للتحسين المستمر لأنظمة النقل الذكية. ومع ذلك، فإن التطبيق العملي لهذه الأدوات في سياق تنظيمي لا يزال في مراحله الأولى، وهناك حاجة إلى مزيد من التطوير والتحقق من صحة هذه الأساليب. بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون الأطر التنظيمية الحالية مجهزة بالكامل لاستيعاب الأساليب الجديدة التي تمثلها أنظمة النقل الذكية وطرق تقييم المخاطر، مما يتطلب تحديثات وتعديلات على الإرشادات والممارسات الحالية.

تمتد التحديات إلى ضمان جودة الاختبارات غير الحيوانية، حيث تعتبر ممارسات زراعة الخلايا الجيدة (GCCP) (باميس وآخرون، 2022) ومفهوم “التحقق الميكانيكي” (هارتونغ وآخرون، 2013ب) حاسمة لضمان موثوقية النتائج. ومع ذلك، فإن وضع هذه المعايير الجودة والحصول على قبول واسع يمكن أن يكون عملية بطيئة ومعقدة. علاوة على ذلك، تتطلب تفسير نتائج دراسات DNT قدرًا كبيرًا من الخبرة، وهناك مرونة كبيرة في تصميم الدراسة، مما يقدم مصادر محتملة للتباين.

باختصار، بينما يتم تطوير استراتيجيات قائمة على المسارات لاختبار DNT، تواجه تنفيذ هذه الاستراتيجيات المتقدمة تحديات تتعلق بتعقيد DNT، والحاجة إلى مزيد من التطوير والتحقق من أدوات دمج البيانات، وتكييف الأطر التنظيمية، وإرساء معايير الجودة للاختبارات غير الحيوانية.

إمكانات التقنيات المتقدمة في اختبار تأثيرات المواد السامة على النمو العصبي تمتد إلى ما هو أبعد من مجرد استبدال نماذج الحيوانات؛ فهي تفتح آفاقًا جديدة لفهم تعقيدات الاضطرابات النمائية العصبية وعلم السموم كما هو متصور في مشروع التعرض البشري (هارتونغ، 2023ب). إن دمج الثقافات العضوية، والخلايا الجذعية، والأساليب عالية المحتوى، والنمذجة الحاسوبية يوفر نهجًا أكثر دقة وملاءمة للبشر لدراسة تأثيرات المواد الكيميائية البيئية على النمو العصبي. تمكن هذه التقنيات الباحثين من استكشاف الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تأثيرات المواد السامة على النمو العصبي، مما يوفر رؤى حول مسببات الاضطرابات مثل اضطراب طيف التوحد واضطراب نقص الانتباه مع فرط النشاط. علاوة على ذلك، فإن تطوير مسارات التأثيرات المعروفة (AOPs) وأنظمة الاختبار البديلة (ITS) استنادًا إلى هذه التقنيات يسهل تقييمًا أكثر منهجية وتنبؤية لمخاطر المواد الكيميائية. من خلال استغلال قوة تكنولوجيا القرن، فإن مجال السموميات مستعد لتحقيق تقدم كبير في حماية الصحة العامة، وتقليل الاعتماد على اختبار الحيوانات، وكشف المعرفة الجديدة حول العمليات المعقدة التي تحكم تطور الأعصاب واضطرابها بسبب العوامل البيئية (سميرنوفا وآخرون، 2014).

لدينا مشاكل هائلة في إيجاد فرضية التعرض لجميع هذه الأمراض. لدينا أيضًا مشاكل هائلة في إيجاد فرضية وراثية لجميعها. قد يكون التفسير لذلك بسيطًا جدًا: تفاعل الجين مع البيئة. واحدة من أكبر القيود في مجموعة الاختبارات الحالية هي عدم أخذ تنوع السكان في الاعتبار حيث أن الخلايا من المحتمل أن تكون من متبرعين ذوي تطور نموذجي. لذلك، سيكون من المثير للاهتمام تضمين اختبارات باستخدام خلايا من خلفيات وراثية مختلفة، مثل خلايا من أطفال مصابين بالتوحد، لزيادة إمكانية تقييم تفاعلات الجينات مع هذه التعرضات.

تعد الذكاء الاصطناعي، بما في ذلك استخدام نماذج اللغة الكبيرة وعلم السموم التنبؤية، بوعد لتعزيز استراتيجيات اختبار DNT. في ON-

TOX، أحد الأهداف الثلاثة هو DNT، الذي يجلب الكثير من العناصر المهمة جدًا إلى النقاش. الأول هو استغلال نماذج اللغة الكبيرة من أجل استخراج جميع المعلومات المتاحة. أحد الأهداف الأكثر أهمية هو أن يتم إتاحة بيانات مجتمع DNT لدينا للاستخراج. يجب جمع البيانات، وتوضيحها ببيانات وصفية، بحيث يمكن فعليًا إدخالها في هذه النماذج. الجزء الثاني الذي تتناوله ONTOX هو أساسًا استخدام النموذج الأساسي للعلاقات بين الهيكل والنشاط القائم على القراءة المتبادلة لدخول هذه النقاط النهائية الإضافية. يجب ألا يتم ذلك في عزلة مثل QSAR، حيث ستستخدم بيانات DNT للتنبؤ بـ DNT، بل يجب أن تشمل كل ما نعرفه عن الروابط بين هذه المواد الكيميائية. على سبيل المثال، أدى الجمع البسيط لبعض البيانات حول نشاط مستقبلات الأندروجين إلى تنبؤات دقيقة بالمواد (غير منشورة)؛ إضافة بيانات السرطان من تسجيلات REACH أو بيانات السمية التناسلية من REACH لحوالي 1000 مادة كانت تم التنبؤ به بشكل صحيح. لذا، هناك الكثير من الوعد في دمج بيانات DNT في نماذج أساسية كبيرة للتنبؤ بالسمية. وأخيرًا، تساعدنا الذكاء الاصطناعي في فهم ما يساهم في المعلومات الصحيحة. ما هي مصادر المعلومات المهمة – تدفقات الأدلة؟ سيساعد ذلك في تحديد الأولويات للاختبارات التي يمكن أن تخبرنا بقيمة المعلومات الحية وما يمكن أن يميز بين المعلومات القيمة والأقل قيمة (هارتونغ، 2023أ). هذا يسمح بنوع من تحليل الحساسية، ويمكن حتى استخدامه لتوليد معلومات اقتصادية، حيث يمكنك أن تسأل عما إذا كان من المجدي إجراء اختبار معين وما إذا كانت نتائجه ستغير حقًا التقييم العام لأننا نعرف ما إذا كان هذا الاختبار ذو قيمة معلومات عالية أو منخفضة. لا يمكننا المبالغة في تقدير ما ستقدمه لنا دمج المعرفة بواسطة الذكاء الاصطناعي في هذه اللحظة. قد ننتهي بقبولها كرفيق طيار ونستقبل توجيهاتها لدفع التطوير الإضافي لبطارية DNT.

مفهوم الذكاء العضوي (OI) وإمكاناته في تعزيز فهمنا للتطور العصبي وعلم السموم يستحق بعض الاعتبار في هذا السياق. لقد قدمنا فكرة أشكال بسيطة من الذاكرة والتعلم كأقصى وظيفة لأعضاء الدماغ العضوية (Smirnova et al., 2023a,b). يجمع هذا بين التقنيات، أي الأعضاء العضوية والذكاء الاصطناعي؛ في الأساس نحن نحاول التحدث إلى عضو دماغي عضوي من خلال الذكاء الاصطناعي. هذا ممكن لأن الأعضاء العضوية نشطة كهربائيًا وقابلة للاستقبال. يعد الذكاء العضوي، كنوع من الذكاء في طبق، بدراسة المواد السامة والإصلاحات المحتملة من خلال العمل على الأعضاء العضوية للدماغ من مواد المرضى. نحن نشكل مجتمعًا حول هذا (Morales Pantoja et al., 2023a; Hartung et al., 2023)، والذي يتضمن مناقشات أخلاقية مهمة (Hartung et al., 2024).

تلخيص تأثير التطوير الاستراتيجي للبدائل لاختبار الحيوانات لتقييم السمية العصبية، لقد استفاد هذا المجال بشكل كبير من الجهود التعاونية بين الباحثين والجهات التنظيمية وأصحاب المصلحة في الصناعة. لقد شهد العقدان الماضيان تقدمًا ملحوظًا في فهمنا العلمي للعمليات العصبية التنموية والآليات التي يمكن أن تتداخل بها المواد الكيميائية مع هذه العمليات لتسبب آثارًا ضارة. هذه المعرفة
تم الاستفادة منها لتطوير مجموعة واسعة من طرق الاختبار البديلة، بما في ذلك نماذج زراعة الخلايا في المختبر، ونماذج الحيوانات غير الثديية، والنهج الحاسوبية التي تقدم إمكانية تقييم أسرع وأكثر كفاءة ومعلوماتية من الناحية الميكانيكية لإمكانية التأثيرات السامة على التطور العصبي.

لقد تم دفع تطوير هذه الطرق البديلة من خلال الاعتراف بحدود نماذج الاختبار التقليدية المعتمدة على الحيوانات، والتي تتطلب موارد كبيرة، وتستغرق وقتًا طويلاً، وقد لا تكون دائمًا تنبؤية لنتائج الصحة البشرية. من خلال التركيز على الأحداث الرئيسية والمسارات التي تكمن وراء التطور العصبي وتأثره بالمواد الكيميائية، تمتلك الطرق البديلة القدرة على تقديم تقييم أكثر استهدافًا وملاءمة لإمكانات السموم العصبية، مع تقليل الاعتماد على اختبار الحيوانات. يمثل هذا التحول نحو نموذج اختبار قائم على الآليات وأكثر صلة بالبشر تقدمًا كبيرًا في مجال اختبار السموم العصبية ويعكس اتجاهًا أوسع في علم السموم نحو استخدام طرق بديلة تتماشى مع مبادئ الـ 3 Rs.

يمتد تأثير هذا التطور الاستراتيجي إلى ما هو أبعد من الأبعاد العلمية والأخلاقية. من خلال توفير وسائل أكثر سرعة وكفاءة لتقييم إمكانيات التأثيرات السلبية على النمو العصبي، تمتلك الطرق البديلة القدرة على تسريع وتيرة تقييم سلامة المواد الكيميائية بشكل كبير ودعم اتخاذ قرارات تنظيمية أكثر فعالية. هذا أمر مهم بشكل خاص نظرًا للعدد الكبير من المواد الكيميائية المتداولة التي لم يتم اختبارها من حيث إمكانيات التأثيرات السلبية على النمو العصبي والاعتراف المتزايد بأهمية حماية الدماغ النامي من التعرض للمواد الكيميائية البيئية. من خلال تمكين تحديد أولويات المواد الكيميائية لمزيد من الاختبار وتوفير تقييم أكثر شمولاً وموثوقية لإمكانيات التأثيرات السلبية على النمو العصبي، يمكن أن تساعد الطرق البديلة في ضمان أن تكون القرارات التنظيمية مبنية على أفضل العلوم المتاحة وأن تكون واقية لصحة الإنسان.

لقد كان تطوير طرق بديلة لاختبار DNT جهدًا تعاونيًا، حيث شارك فيه باحثون من الأوساط الأكاديمية والحكومة والصناعة، بالإضافة إلى الوكالات التنظيمية وأصحاب المصلحة الآخرين. كانت هذه التعاونات ضرورية لضمان أن الطرق المطورة ليست فقط صالحة علميًا وذات صلة، ولكن أيضًا عملية وقابلة للتنفيذ ضمن سياق تنظيمي. كان إنشاء الشبكات والمنتديات لتبادل المعرفة والأفكار، مثل مجموعة عمل DNT وسلسلة مؤتمرات DNT التي نظمتها CAAT وشركاؤها، أمرًا حاسمًا في تعزيز هذا التعاون ودفع المجال إلى الأمام.

عند النظر إلى الوراء على مدى السنوات الثماني عشرة الماضية، حقق مجال اختبار DNT تقدمًا ملحوظًا. في عام 2006، عندما تم عقد أول مؤتمر DNT، كان المجال يعتمد بشكل كبير على طرق الاختبار المعتمدة على الحيوانات، مع وجود بدائل قليلة متاحة. كانت المناقشات في ذلك المؤتمر تركز على الحاجة إلى طرق اختبار أسرع وأكثر كفاءة، وإمكانية استخدام نماذج في المختبر وغير الثدييات لتلبية هذه الحاجة. على مر السنوات التالية، تم تطوير وتقييم مجموعة من الطرق البديلة، culminating in the publication of a comprehensive review by Bal-Price et al. (2012) that identified a number of promising in vitro and alternative animal models for DNT testing.

شهدت الفترة من 2014 حتى الآن تسارعًا سريعًا في تطوير وتطبيق الطرق البديلة
لاختبار DNT، مدفوعة جزئيًا بالتقدم في علم الخلايا الجذعية، وتحرير الجينوم، والفحص عالي الإنتاجية، والنمذجة الحاسوبية. كان إنشاء مجموعة خبراء DNT التابعة لمنظمة التعاون والتنمية الاقتصادية في عام 2017 ونشر “التوصيات الأولية لتقييم البيانات من بطارية اختبار DNT في المختبر” (OECD، 2023) بمثابة معالم مهمة في قبول الطرق البديلة من قبل الجهات التنظيمية.

على الرغم من هذه التقدمات، لا يزال هناك الكثير من العمل الذي يتعين القيام به لتحقيق الإمكانات الكاملة للطرق البديلة لاختبار DNT. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحسين هذه الطرق والتحقق من صحتها، لإثبات موثوقيتها وملاءمتها لعملية اتخاذ القرار التنظيمي، ودمجها في استراتيجيات الاختبار التي توفر تقييمًا شاملاً وفعالًا لإمكانات DNT. سيكون التعاون المستمر بين الباحثين والجهات التنظيمية وأصحاب المصلحة في الصناعة أمرًا أساسيًا لمعالجة هذه التحديات ودفع المجال نحو نموذج اختبار أكثر توقعًا وأخلاقيًا.

في الختام، يمثل التطوير الاستراتيجي للبدائل لاختبار الحيوانات من أجل DNT على مدى السنوات الثماني عشرة الماضية تقدمًا كبيرًا في مجال السموم، وهو ما تم دفعه من خلال الابتكار العلمي، والحاجة التنظيمية، والالتزام بأساليب اختبار أكثر صلة بالبشر وأخلاقية. على الرغم من أن التحديات الكبيرة لا تزال قائمة، فإن التقدم الذي تم إحرازه حتى الآن هو شهادة على التفاني والتعاون من العديد من أصحاب المصلحة المشاركين في هذا الجهد. من خلال الاستمرار في العمل معًا لتحسين والتحقق من صحة الطرق البديلة لاختبار DNT، يمكننا التقدم نحو مستقبل يتم فيه تقييم سلامة المواد الكيميائية بطريقة علمية صارمة وأخلاقية، وتحمي حقًا صحة أكثر الفئات ضعفًا لدينا. ما شهدناه على مدى العقدين الماضيين هو ثورة علمية. للمرة الأولى، أدى مثال على تطوير استراتيجي من قبل مجتمع إلى تطوير استراتيجية اختبار جديدة تمامًا في نهجها. إنها استراتيجية اختبار تتكون من مكونات مختلفة، تعتمد على الآلية، وقد خضعت لعملية توافق دولي. هذه كلها معايير يجب أن نطبقها على المزيد من المجالات، خاصة على التجارب الحيوانية. ستؤدي مجموعة هذه التقنيات المدمرة إلى أكثر بكثير من مجرد استبدال اختبارات الحيوانات. يمكننا القيام بأشياء لم نحلم بها عندما بدأنا. التحدي الآن هو التنفيذ!

Algharably, E. A., Di Consiglio, E., Testai, E. et al. (2023). Prediction of in vivo prenatal chlorpyrifos exposure leading to developmental neurotoxicity in humans based on in vitro toxicity data by quantitative in vitro-in vivo extrapolation. Front Pharmacol 14, 1136174. doi:10.3389/fphar.2023.1136174
Ankley, G. T., Bennett, R. S., Erickson, R. J. et al. (2010). Adverse outcome pathways: A conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment. Environ Toxicol Chem 29, 730-741. doi:10.1002/etc. 34
Arts, J. H. E., Faulhammer, F., Schneider, S. et al. (2023). Investigations on learning and memory function in extended one-generation reproductive toxicity studies – When considered needed and based on what? Crit Rev Toxicol 53, 372-384. doi:10. 1080/10408444.2023.2236134

Arzuaga, X., Smith, M. T., Gibbons, C. F. et al. (2019). Proposed key characteristics of male reproductive toxicants as an approach for organizing and evaluating mechanistic evidence in human health hazard assessments. Environ Health Perspect 127, 065001. doi:10.1289/ehp5045

Aschner, M., Ceccatelli, S., Daneshian, M. et al. (2017). Selection of reference compounds for characterization and development of alternative methods for developmental neurotoxicity (DNT) testing. ALTEX 34, 49-74. doi:10.14573/altex. 1604201
Bal-Price, A., Hogberg, H. T., Buzanska, L. et al. (2010). In vitro developmental neurotoxicity (DNT) testing: Relevant models and endpoints. Neurotoxicology 31, 545-554. doi:10.1016/j. neuro.2009.11.006
Bal-Price, A. K., Coecke, S., Costa, L. et al. (2012). Advancing the science of developmental neurotoxicity (DNT): Testing for better safety evaluation. ALTEX 29, 202-215. doi:10.14573/ altex.2012.2.202
Bal-Price, A., Crofton, K. M., Sachana, M. et al. (2015a). Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol 45, 83-91. doi:10.3109/10408444.2014.981331
Bal-Price, A., Crofton, K. M., Leist, M. et al. (2015b). International STakeholder NETwork (ISTNET): Creating a developmental neurotoxicity (DNT) testing road map for regulatory purposes. Arch Toxicol 89, 269-287. doi:10.1007/s00204-015-1464-2
Bal-Price, A. and Meek, M. E. (2017). Adverse outcome pathways: Application to enhance mechanistic understanding of neurotoxicity. Pharmacol Ther 179, 84-95. doi:10.1016/j. pharmthera.2017.05.006
Bal-Price, A., Hogberg, H. T., Crofton, K. M. et al. (2018a). t workshop report: Recommendation on test readiness criteria for new approach methods in toxicology: Exemplified for developmental neurotoxicity. ALTEX 35, 306-352. doi:10.14573/ altex. 1712081
Bal-Price, A., Pistollato, F., Sachana, M. et al. (2018b). Strategies to improve the regulatory assessment of developmental neurotoxicity (DNT) using in vitro methods. Toxicol Appl Pharmacol 354, 7-18. doi:10.1016/j.taap.2018.02.008
Basketter, D. A., Clewell, H., Kimber, I., et al. (2012). A roadmap for the development of alternative (non-animal) methods for systemic toxicity testing. ALTEX 29, 3-89. doi: 10.14573/altex. 2012.1.003

Baumann, J., Gassmann, K., Masjosthusmann, S. et al. (2016). Comparative human and rat neurospheres reveal species differences in chemical effects on neurodevelopmental key events. Arch Toxicol 90, 1415-1427. doi:10.1007/s00204-015-1568-8
Bellanger, M., Demeneix, B. A., Grandjean, P. et al. (2015). Neurobehavioral deficits, diseases, and associated costs of exposure to endocrine-disrupting chemicals in the European Union. J Clin Endocrinol Metab 100, 1256-1266. doi:10.1210/ jc.2014-4323
Blaauboer, B. J., Boekelheide, K., Clewell, H. J. et al. (2012). The use of biomarkers of toxicity for integrating in vitro hazard estimates into risk assessment for humans. ALTEX 29, 411-425. doi:10.14573/altex.2012.4.411
Blum, J., Masjosthusmann, S., Bartmann, K. et al. (2023). Establishment of a human cell-based in vitro battery to assess developmental neurotoxicity hazard of chemicals. Chemosphere

311, 137035. doi:10.1016/j.chemosphere.2022.137035
Boyle, J., Yeter, D., Aschner, M. et al. (2021). Estimated IQ points and lifetime earnings lost to early childhood blood lead levels in the United States. Sci Total Environ 778, 146307. doi:10.1016/j. scitotenv.2021.146307
Butera, A., Smirnova, L., Ferrando-May, E. et al. (2023). Deconvoluting gene and environment interactions to develop “epigenetic score meter” of disease. EMBO Mol Med 15, e18208. doi:10.15252/emmm. 202318208
Caloni, F., De Angelis, I. and Hartung, T. (2022). Replacement of animal testing by integrated approaches to testing and assessment (IATA): A call for in vivitrosi. Arch Toxicol 96, 1935-1950. doi:10.1007/s00204-022-03299-x
Cediel-Ulloa, A., Lupu, D. L., Johansson, Y. et al. (2022). Impact of endocrine disrupting chemicals on neurodevelopment: The need for better testing strategies for endocrine disruption-induced developmental neurotoxicity. Expert Rev Endocrinol Metab 17, 131-141. doi:10.1080/17446651.2022.2044788
Chesnut, M., Hartung, T., Hogberg, H. T. et al. (2021a). Human oligodendrocytes and myelin in vitro to evaluate developmental neurotoxicity. Int J Mol Sci 22, 7929. doi:10.3390/ ijms22157929
Chesnut, M., Paschoud, H., Repond, C. et al. (2021b). Human 3D iPSC-derived brain model to study chemical-induced myelin disruption. Int J Mol Sci 22, 9473. doi:10.3390/ijms22179473
Coecke, S., Goldberg, A. M., Allen, S. et al. (2007). Workgroup report: Incorporating in vitro alternative methods for developmental neurotoxicity into international hazard and risk assessment strategies. Environ Health Perspect 115, 924-931. doi:10.1289/ ehp. 9427
Cohn, E. F., Clayton, B. L. L., Madhavan, M. et al. (2024). Pervasive environmental chemicals impair oligodendrocyte development. Nat Neurosci, online ahead of print. doi:10.1038/s41593-024-01599-2
Crofton, K. M., Mundy, W. R., Lein, P. J. et al. (2011). Developmental neurotoxicity testing: Recommendations for developing alternative methods for the screening and prioritization of chemicals. ALTEX 28, 9-15. doi:10.14573/altex.2011.1.009
Crofton, K., Fritsche, E., Ylikomi, T. and Bal-Price, A. (2014). International STakeholder NETwork (ISTNET) for creating a developmental neurotoxicity testing (DNT) roadmap for regulatory purposes. ALTEX 31, 223-224. doi:10.14573/altex. 1402121
Crofton, K. M. and Mundy, W. R. (2021). External scientific report on the interpretation of data from the developmental neurotoxicity in vitro testing assays for use in integrated approaches for testing and assessment. EFSA Support Publ 18, 6924E. doi:10.2903/ sp.efsa.2021.en-6924
Diemar, M. G., Vinken, M., Teunis, M. et al. (2024). Report of the First ONTOX stakeholder network meeting: Digging under the surface of ONTOX together with the stakeholders. Altern Lab Anim 52, 117-131. doi:10.1177/02611929231225730
Fritsche, E., Crofton, K. M., Hernandez, A. F. et al. (2017). OECD/ EFSA workshop on developmental neurotoxicity (DNT): The use of non-animal test methods for regulatory purposes. ALTEX 34, 311-315. doi:10.14573/altex. 1701171
Fritsche, E., Barenys, M., Klose, J. et al. (2018). Current availability of stem cell-based in vitro methods for developmental neu-
rotoxicity (DNT) testing. Toxicol Sci 165, 21-30. doi:10.1093/ toxsci/kfy178
Furxhi, I. and Murphy, F. (2020). Predicting in vitro neurotoxicity induced by nanoparticles using machine learning. Int J Mol Sci 21, 5280. doi:10.3390/ijms21155280
Gaylord, A., Osborne, G., Ghassabian, A. et al. (2020). Trends in neurodevelopmental disability burden due to early life chemical exposure in the USA from 2001 to 2016: A population-based disease burden and cost analysis. Mol Cell Endocrinol 502, 110666. doi:10.1016/j.mce.2019.110666
Grandjean, P. and Landrigan, P. J. (2006). Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. Lancet 368, 2167-2178. doi:10.1016/S0140-6736(06)69665-7
Grandjean, P. and Landrigan, P. J. (2014). Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol 13, 330-338. doi:10.1016/S1474-4422(13)70278-3
Groot, M. W. G. M., Westerink, R. H. S. and Dingemans, M. M. L. (2013). Don’t judge a neuron only by its cover: Neuronal function in in vitro developmental neurotoxicity testing. Toxicol Sci 132, 1-7. doi:10.1093/toxsci/kfs269
Hartung, T., van Vliet, E., Jaworska, J. et al. (2012). Systems toxicology. ALTEX 29, 119-128. doi:10.14573/altex.2012.2.119
Hartung, T., Luechtefeld, T., Maertens, A. et al. (2013a). Integrated testing strategies for safety assessments. ALTEX 30, 3-18. doi:10.14573/altex.2013.1.003
Hartung, T., Stephens, M. and Hoffmann, S. (2013b). Mechanistic validation. ALTEX 30, 119-130. doi:10.14573/altex.2013.2.119
Hartung, T. and Tsatsakis, A. M. (2021). The state of the scientific revolution in toxicology. ALTEX 38, 379-386. doi:10.14573/ altex. 2106101
Hartung, T. (2023a). ToxAIcology – The evolving role of artificial intelligence in advancing toxicology and modernizing regulatory science. ALTEX 40, 559-570. doi:10.14573/altex. 2309191
Hartung, T. (2023b). A call for a human exposome project. ALTEX 40, 4-33. doi:10.14573/altex. 2301061
Hartung, T., Smirnova, L., Morales Pantoja, I. E. et al. (2023). The Baltimore declaration toward the exploration of organoid intelligence. Front Sci 1, 1017235. doi:10.3389/fsci.2023.1017235
Hartung, T., Morales Pantoja, I. E. and Smirnova, L. (2024). Brain organoids and organoid intelligence (OI) from ethical, legal, and social points of view. Front Artif Intell 6, 1307613. doi:10.3389/ frai.2023.1307613
Hernández-Jerez, A. F., Adriaanse, P. I., Aldrich, A. P. et al. (2021). Development of integrated approaches to testing and assessment (IATA) case studies on developmental neurotoxicity (DNT) risk assessment. EFSA J 19, e06599. doi:10.2903/j.efsa.2021.6599
Hertz-Picciotto, I. and Delwiche, L. (2009). The rise in autism and the role of age at diagnosis. Epidemiology 20, 84-90. doi:10.1097/ ede.0b013e3181902d15
Hogberg, H. T., Kinsner-Ovaskainen, A., Coecke, S. et al. (2010). mRNA expression is a relevant tool to identify developmental neurotoxicants using an in vitro approach. Toxicol Sci 113, 95115. doi:10.1093/toxsci/kfp175

Hogberg, H. T., Sobanski, T., Novellino, A. et al. (2011). Application of micro-electrode arrays (MEAs) as an emerging technology for developmental neurotoxicity: Evaluation of domoic acid-induced effects in primary cultures of rat cortical neurons.

Neurotoxicology 32, 158-168. doi:10.1016/j.neuro.2010.10.007
Hogberg, H. T., Bressler, J., Christian, K. M. et al. (2013). Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther 4, S4. doi:10.1186/scrt365
Hogberg, H. T., de Cássia da Silveira e Sá, R., Kleensang, A. et al. (2021). Organophosphorus flame retardants are developmental neurotoxicants in a rat primary BrainSphere in vitro model. Arch Toxicol 95, 207-228. doi:10.1007/s00204-020-02903-2
Hogberg, H. T. and Smirnova, L. (2022). The future of 3D brain cultures in developmental neurotoxicity testing. Front Toxicol 4, 808620. doi:10.3389/ftox.2022.808620

Honegger, P., Lenoir, D. and Favrod, P. (1979). Growth and differentiation of aggregating fetal brain cells in a serum-free defined medium. Nature 282, 305-308. doi:10.1038/282305a0
Huang, Q., Tang, B., Romero, J. C. et al. (2022). Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids. Sci Adv 8, eabq5031. doi:10.1126/sciadv.abq5031
Ilieva, M., Fex Svenningsen, Å., Thorsen, M. et al. (2018). Psychiatry in a dish: Stem cells and brain organoids modeling autism spectrum disorders. Biol Psychiatry 83, 558-568. doi:10.1016/j. biopsych.2017.11.011
Juberg, D. R., Fox, D. A., Forcelli, P. A. et al. (2023). A perspective on in vitro developmental neurotoxicity test assay results: An expert panel review. Regul Toxicol Pharmacol 143, 105444. doi:10.1016/j.yrtph.2023.105444
Keown, C., Shih, P., Nair, A. et al. (2013). Local functional overconnectivity in posterior brain regions is associated with symptom severity in autism spectrum disorders. Cell Rep 5, 567-572. doi:10.1016/j.celrep.2013.10.003
Kilpatrick, S., Irwin, C. and Singh, K. K. (2023). Human pluripotent stem cell (hPSC) and organoid models of autism: Opportunities and limitations. Transl Psychiatry 13, 217. doi:10.1038/ s41398-023-02510-6
Kleensang, A., Maertens, A., Rosenberg, M. et al. (2014). Pathways of toxicity. ALTEX 31, 53-61. doi:10.14573/altex. 1309261
Kleinstreuer, N. and Hartung, T. (2024). Artificial intelligence (AI) – It’s the end of the tox as we know it (and I feel fine) – AI for predictive toxicology. Arch Toxicol 98, 735-754. doi:10.1007/ s00204-023-03666-2
Knight, J., Hartung, T. and Rovida, C. (2023). 4.2 million and counting… the animal toll for REACH systemic toxicity studies. ALTEX 40, 389-407. doi:10.14573/altex. 2303201
Kobolak, J., Teglasi, A., Bellak, T. et al. (2020). Human induced pluripotent stem cell-derived 3D-neurospheres are suitable for neurotoxicity screening. Cells 9, 1122. doi:10.3390/cells9051122
Krewski, D., Andersen, M., Tyshenko, M. G. et al. (2020). Toxicity testing in the century: Progress in the past decade and future perspectives. Arch Toxicol 94, 1-58. doi:10.1007/s00204-019-02613-4
Krug, A. K., Kolde, R., Gaspar, J. A. et al. (2013a). Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: A transcriptomics approach. Arch Toxicol 87, 123-143. doi:10.1007/s00204-012-0967-3
Krug, A. K., Balmer, N. V., Matt, F. et al. (2013b). Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol 87, 2215-2231. doi:10.1007/ s00204-013-1072-y

Kuehn, B. M. (2010). Increased risk of ADHD associated with early exposure to pesticides, PCBs. JAMA 304, 27-28. doi:10.1001/ jama.2010.860
La Merrill, M. A., Vandenberg, L. N., Smith, M. T. et al. (2020). Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol 16, 45-57. doi:10.1038/s41574-019-0273-8
Lancaster, M., Renner, M., Martin, C. A. et al. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379. doi:10.1038/nature12517
Landrigan, P. J. (2010). What causes autism? Exploring the environmental contribution. Curr Opin Pediatr 22, 219-225. doi:10.1097/mop.0b013e328336eb9a
Lee, J. and Freeman, J. L. (2014). Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity assessment: The application of the zebrafish in defining the effects of arsenic, methylmercury, or lead on early neurodevelopment. Toxics 2, 464-495. doi:10.3390/toxics 2030464
Lein, P., Silbergeld, E., Locke, P. et al. (2005). In vitro and other alternative approaches to developmental neurotoxicity testing (DNT). Environ Toxicol Pharmacol 19, 735-744. doi:10.1016/j. etap.2004.12.035
Lein, P., Locke, P. and Goldberg, A. (2007). Meeting report: Alternatives for developmental neurotoxicity testing. Environ Health Perspect 115, 764-768. doi:10.1289/ehp. 9841
Leist, M., Efremova, L. and Karreman, C. (2010). Food for thought … considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX 27, 309-317. doi:10.14573/ altex.2010.4.309
Leist, M., Hasiwa, N., Daneshian, M. et al. (2012). Validation and quality control of replacement alternatives – Current status and future challenges. Toxicol Res 1, 8-22. doi:10.1039/c2tx20011b
Leist, M., Hasiwa, N., Rovida, C. et al. (2014). Consensus report on the future of animal-free systemic toxicity testing. ALTEX 31, 341-356. doi:10.14573/altex. 1406091
Leist, M., Ghallab, A., Graepel, R. et al. (2017). Adverse outcome pathways: Opportunities, limitations and open questions. Arch Toxicol 91, 3477-3505. doi:10.1007/s00204-017-2045-3
Li, S. and Xia, M. (2019). Review of high-content screening applications in toxicology. Arch Toxicol 93, 3387-3396. doi:10.1007/ s00204-019-02593-5
Luderer, U., Eskenazi, B., Hauser, R. et al. (2019). Proposed key characteristics of female reproductive toxicants as an approach for organizing and evaluating mechanistic data in hazard assessment. Environ Health Perspect 127, 075001. doi:10.1289/ehp4971
Maass, C., Schaller, S., Dallmann, A. et al. (2023). Considering developmental neurotoxicity in vitro data for human health risk assessment using physiologically-based kinetic modeling: Deltamethrin case study. Toxicol Sci 192, 59-70. doi:10.1093/toxsci/ kfad007
Maenner, M. J., Warren, Z., Williams, A. R. et al. (2023). Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years – Autism and developmental disabilities monitoring network, 11 Sites, United States, 2020. MMWR Surveill Summ 72, 1-14. doi:10.15585/mmwr.ss7202a1
Makris, S. L., Raffaele, K., Allen, S. et al. (2009). A retrospective performance assessment of the developmental neurotoxicity
study in support of OECD test guideline 426. Environ Health Perspect 117, 17-25. doi:10.1289/ehp. 11447
Marx, U., Andersson, T. B., Bahinski, A. et al. (2016). Biologyinspired microphysiological system approaches to solve the prediction dilemma of substance testing. ALTEX 33, 272-321. doi:10.14573/altex. 1603161
Marx, U., Akabane, T., Andersson, T. et al. (2020). Biologyinspired microphysiological systems to advance patient benefit and animal welfare in drug development. ALTEX 37, 365-394. doi:10.14573/altex. 2001241
Meigs, L., Smirnova, L., Rovida, C. et al. (2018). Animal testing and its alternatives – The most important omics is economics. ALTEX 35, 275-305. doi:10.14573/altex. 1807041
Modafferi, S., Zhong, X., Kleensang, A. et al. (2021). Gene-environment interactions in developmental neurotoxicity: A case study of synergy between chlorpyrifos and CHD8 knockout in human BrainSpheres. Environ Health Perspect 129, 77001. doi:10.1289/ehp8580
Moore, N. P., Beekhuijzen, M., Boogaard, P. J. et al. (2016). Guidance on the selection of cohorts for the extended one-generation reproduction toxicity study (OECD test guideline 443). Regul Toxicol Pharmacol 80, 32-40. doi:10.1016/j.yrtph.2016.05.036
Morales Pantoja, I. E., Smirnova, L., Muotri, A. R. et al. (2023a). First organoid intelligence (OI) workshop to form an OI community. Front ArtifIntell 6, 1116870. doi:10.3389/frai.2023.1116870
Morales Pantoja, I. E., Ding, L., Leite, P. E. C. et al. (2023b). A novel approach to increase glial cell populations in brain microphysiological systems. Adv Biol, e2300198. Online ahead of print. doi:10.1002/adbi. 202300198
Mundy, W. R., Padilla, S., Breier, J. M. et al. (2015). Expanding the test set: Chemicals with potential to disrupt mammalian brain development. Neurotoxicol Teratol 52, 25-35. doi:10.1016/j.ntt. 2015.10.001

Nishimura, Y., Murakami, S., Ashikawa, Y. et al. (2015). Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenit Anom (Kyoto) 55, 1-16. doi:10.1111/cga. 12079
NRC – National Research Council (2007). Toxicity Testing in the Century: A Vision and a Strategy. Washington, DC, USA: The National Academies Press.. doi:10.17226/11970
Nyffeler, J., Chovancova, P., Dolde, X. et al. (2018). A structure-activity relationship linking non-planar PCBs to functional deficits of neural crest cells: New roles for connexins. Arch Toxicol 92, 1225-1247. doi:10.1007/s00204-017-2125-4
OECD (2001). Test No. 416: Two-Generation Reproduction Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris, doi:10.1787/9789264070868-en
OECD (2007). Test No. 426: Developmental Neurotoxicity Study. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris. doi:10.1787/9789264067394-en
OECD (2018). Test No. 443: Extended One-Generation Reproductive Toxicity Study. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris. doi:10. 1787/9789264185371-en
OECD (2023). Initial Recommendations on Evaluation of Data from the Developmental Neurotoxicity (DNT) In-Vitro Testing Battery. Series on Testing and Assessment No. 377. https://one. oecd.org/document/ENV/CBC/MONO(2023)13/en/pdf

Pamies, D., Bal-Price, A., Simeonov, A. et al. (2017). Good cell culture practice for stem cells and stem-cell-derived models. ALTEX 34, 95-132. doi:10.14573/altex. 1607121
Pamies, D., Block, K., Lau, P. et al. (2018). Rotenone exerts developmental neurotoxicity in a human brain spheroid model. Toxicol Appl Pharmacol 354, 101-114. doi:10.1016/j. taap.2018.02.003
Pamies. D., Leist, M., Coecke, S. et al. (2022). Guidance document on good cell and tissue culture practice 2.0 (GCCP 2.0). ALTEX 39, 30-70. doi:10.14573/altex. 2111011
Persson, M. and Hornberg, J. J. (2016). Advances in predictive toxicology for discovery safety through high content screening. Chem Res Toxicol 29, 1998-2007. doi:10.1021/acs. chemrestox.6b00248
Pessah, I. N. and Lein, P. J. (2008). Evidence for environmental susceptibility in autism – What we need to know about gene x environment interactions. In A. Zimmerman (ed.), Autism: Current Theories and Evidence (409-428). Humana Press.
Pistollato, F., de Gyves, E. M., Carpi, D. et al. (2020). Assessment of developmental neurotoxicity induced by chemical mixtures using an adverse outcome pathway concept. Environ Health 19, 23. doi:10.1186/s12940-020-00578-x

Pitzer, E. M., Shafer, T. J. and Herr, D. W. (2023). Identification of neurotoxicology (NT)/developmental neurotoxicology (DNT) adverse outcome pathways and key event linkages with in vitro DNT screening assays. Neurotoxicology 99, 184-194. doi:10.1016/j.neuro.2023.10.007
Rempel, E., Hoelting, L., Waldmann, T. et al. (2015). A transcrip-tome-based classifier to identify developmental toxicants by stem cell testing: Design, validation and optimization for histone deacetylase inhibitors. Arch Toxicol 89, 1599-1618. doi:10.1007/ s00204-015-1573-y
Rice, D. and Barone, S. Jr. (2000). Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: Evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect 108, Suppl 3, 511-533. doi:10.1289/ehp.00108s3511
Rodier, P. M. (1995). Developing brain as a target of toxicity. Environ Health Perspect 103, Suppl 6, 73-76. doi:10.1289/ ehp.95103s673
Romero, J. C., Berlinicke, C., Chow, S. et al. (2023). Oligodendrogenesis and myelination tracing in a CRISPR/Cas9-engineered brain microphysiological system. Front Cell Neurosci 16, 1094291. doi:10.3389/fncel.2022.1094291

Rossignol, D., Genuis, S. and Frye, R. (2014). Environmental toxicants and autism spectrum disorders: A systematic review. Transl Psychiatry 4, e360. doi:10.1038/tp.2014.4
Roth, A. and MPS-WS Berlin 2019 (2021). Human microphysiological systems for drug development. Science 373, 1304-1306. doi:10.1126/science.abc3734
Rovida, C., Alépée, N., Api, A. M. et al. (2015). Integrated testing strategies (ITS) for safety assessment. ALTEX 32, 25-40. doi:10.14573/altex. 1411011
Rovida, C., Busquet, F., Leist, M. et al. (2023). REACH outnumbered! The future of REACH and animal numbers. ALTEX 40, 367-388. doi:10.14573/altex. 2307121
Russo, F. B., Brito, A., de Freitas, A. M. et al. (2019). The use of iPSC technology for modeling autism spectrum disorders.

Neurobiol Dis 130, 104483. doi:10.1016/j.nbd.2019.104483
Sachana, M., Bal-Price, A., Crofton, K. M. etal. (2019). International regulatory and scientific effort for improved developmental neurotoxicity testing. Toxicol Sci 167, 45-57. doi:10.1093/toxsci/ kfy211
Sachana, M., Shafer, T. J. and Terron, A. (2021a). Toward a better testing paradigm for developmental neurotoxicity: OECD efforts and regulatory considerations. Biology 10, 86. doi:10.3390/ biology10020086
Sachana, M., Willett, C., Pistollato, F. et al. (2021b). The potential of mechanistic information organised within the AOP framework to increase regulatory uptake of the developmental neurotoxicity (DNT) in vitro battery of assays. Reprod Toxicol 103, 159-170. doi:10.1016/j.reprotox.2021.06.006
Sagiv, S. K., Thurston, S. W., Bellinger, D. C. et al. (2010). Prenatal organochlorine exposure and behaviors associated with attention deficit hyperactivity disorder in school-aged children. Epidemiol 171, 593-601. doi:10.1093/aje/kwp427
Santos, J. L. S., Araújo, C. A., Rocha, C. A. G. et al. (2023). Modeling autism spectrum disorders with induced pluripotent stem cell-derived brain organoids. Biomolecules 13, 260. doi:10.3390/biom13020260
Schiffelers, M. W. A., Blaauboer, B. J., Bakker, W. E. et al. (2015). Regulatory acceptance and use of the extended one generation reproductive toxicity study within Europe. Regul Toxicol Pharmacol 71, 114-124. doi:10.1016/j.yrtph.2014.10.012
Schmidt, B. Z., Lehmann, M., Gutbier, S. et al. (2016). In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: An overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch Toxicol 91, 1-33. doi:10.1007/s00204-016-1805-9
Schmuck, M. R., Temme, T., Dach, K. et al. (2017). Omnisphero: A high-content image analysis (HCA) approach for phenotypic developmental neurotoxicity (DNT) screenings of organoid neurosphere cultures in vitro. Arch Toxicol 91, 2017-2028. doi:10.1007/s00204-016-1852-2
Schwartz, M. P., Hou, Z., Propson, N. E. et al. (2015). Human pluripotent stem cell-derived neural constructs for predicting neural toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 12516-12521. doi:10.1073/pnas. 1516645112
Shafer, T. J. (2019). Application of microelectrode array approaches to neurotoxicity testing and screening. Adv Neurobiol 22, 275297. doi:10.1007/978-3-030-11135-9_12

Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M. et al. (2014). Developmental neurotoxicity – Challenges in the century and in vitro opportunities. ALTEX 31, 129-156. doi:10.14573/altex. 1403271
Smirnova, L., Seiler, A. E. M. and Luch, A. (2015a). microRNA profiling as tool for developmental neurotoxicity testing (DNT). Curr Protoc Toxicol 64, 20.9.1-22. doi:10.1002/0471140856. tx2009s64
Smirnova, L., Harris, G., Leist, M. et al. (2015b). Cellular resilience. ALTEX 32, 247-260. doi:10.14573/altex. 1509271
Smirnova, L., Kleinstreuer, N., Corvi, R. et al. (2018). 3S – Systematic, systemic, and systems biology and toxicology. ALTEX 35, 139-162. doi:10.14573/altex. 1804051
Smirnova, L., Caffo, B. S., Gracias, D. H. et al. (2023a). Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and
intelligence-in-a-dish. Front Sci 1, 1017235. doi:10.3389/ fsci.2023.1017235
Smirnova, L., Morales Pantoja, I. E. and Hartung, T. (2023b). Organoid Intelligence (OI) – The ultimate functionality of a brain microphysiological system. ALTEX 40, 191-203. doi:10.14573/ altex. 2303261
Smirnova, L. and Hartung, T. (2024). The promise and potential of brain organoids. Adv Healthc Mater, e2302745. Online ahead of print. doi:10.1002/adhm. 202302745
Spînu, N., Cronin, M. T. D., Lao, J. et al. (2022). Probabilistic modelling of developmental neurotoxicity based on a simplified adverse outcome pathway network. Comput Toxicol 21, 100206. doi:10.1016/j.comtox.2021.100206
Suciu, I., Pamies, D., Peruzzo, R. et al. (2023a). GxE interactions as a basis for toxicological uncertainty. Arch Toxicol 97, 2035-2049. doi:10.1007/s00204-023-03500-9
Suciu, I., Delp, J., Gutbier, S. et al. (2023b). Definition of the neu-rotoxicity-associated metabolic signature triggered by berberine and other respiratory chain inhibitors. Antioxidants 13, 49. doi:10.3390/antiox13010049
US EPA (1998). Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.6300 Developmental Neurotoxicity Study. https://nepis.epa.gov/exe/ zypdf.cgi/p100irwo.pdf?dockey=p100irwo.pdf
van Thriel, C., Westerink, R. H., Beste, C. et al. (2012). Translating neurobehavioural endpoints of developmental neurotoxicity tests into in vitro assays and readouts. Neurotoxicology 33, 911-924. doi:10.1016/j.neuro.2011.10.002
van Vliet, E., Stoppini, L., Balestrino, M. et al. (2007). Electrophysiological recording of re-aggregating brain cell cultures on mul-ti-electrode arrays to detect acute neurotoxic effects. Neurotoxicology 28, 1136-1146. doi:10.1016/j.neuro.2007.06.004
van Vliet, E., Morath, S., Linge, J. et al. (2008). A novel in vitro metabolomics approach for neurotoxicity testing, proof of principle for methyl mercury chloride and caffeine. Neurotoxicology 29, 1-12. doi:10.1016/j.neuro.2007.09.007
van Vliet, E., Daneshian, M., Beilmann, M. et al. (2014). Current approaches and future role of high content imaging in safety sciences and drug discovery. ALTEX 31, 479-493. doi:10.14573/ altex. 1405271
Villa, C., Combi, R., Conconi, D. et al. (2021). Patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and cerebral organoids for drug screening and development in autism spectrum disorder: Opportunities and challenges. Pharmaceutics 13, 280. doi:10.3390/pharmaceutics13020280
Vinken, M., Benfenati, E., Busquet, F. et al. (2021). Safer chemicals using less animals: Kick-off of the European ONTOX project. Toxicology 458, 152846. doi:10.1016/j.tox.2021.152846
Wegscheid, M. L., Anastasaki, C., Hartigan, K. A. et al. (2021). Patient-derived iPSC-cerebral organoid modeling of the 17 q 11.2 microdeletion syndrome establishes CRLF3 as a critical regulator of neurogenesis. Cell Rep 36, 109315. doi:10.1016/j. celrep.2021.109315
Willett, C. E. (2018). The use of adverse outcome pathways (AOPs) to support chemical safety decisions within the context of inte-
grated approaches to testing and assessment (IATA). In H. Kojima, T. Seidle and H. Spielmann (eds), Alternatives to Animal Testing (83-90). Singapore: Springer. doi:10.1007/978-981-13-2447-5_11
Yamada, S., Hirano, Y., Kurosawa, O. et al. (2019). Evaluation of developmental neurotoxicity using neural differentiation potency in human iPS cells. Proc Annu Meet Jpn Pharmacol Soc 92. https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpssuppl/92/0/92_3-P-127/_ pdf
Yi, Z., Gao, H., Ji, X. et al. (2021). Mapping drug-induced neuropathy through in-situ motor protein tracking and machine learning. J Am Chem Soc 143, 14907-14915. doi:10.1021/ jacs.1c07312
Zablotsky, B., Black, L. I., Maenner, M. J. et al. (2019). Prevalence and trends of developmental disabilities among children in the US: 2009-2017. Pediatrics 144, e20190811. doi:10.1542/ peds.2019-0811
Zhang, L., Li, M., Zhang, D. et al. (2023). Developmental neurotoxicity (DNT) QSAR combination prediction model establishment and structural characteristics interpretation. Toxicol Res 13, tfad116. doi:10.1093/toxres/tfad116
Zhong, X., Harris, G., Smirnova, L. et al. (2020). Antidepressant paroxetine exerts developmental neurotoxicity in an iPSCderived 3D human brain model. Front Cell Neurosci 14, 25. doi:10.3389/fncel.2020.00025

T. H. و H. T. H. هما مخترعان مسميان في براءة اختراع من جامعة جونز هوبكنز حول إنتاج الأدمغة الصغيرة (المعروفة أيضًا باسم BrainSpheres)، والتي تم ترخيصها لشركة AxoSim، نيو أورلينز، لويزيانا، الولايات المتحدة الأمريكية. T. H. و L. S. هما مستشاران لشركة AxoSim، نيو أورلينز، و T. H. هو أيضًا مستشار لمجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) وكان حتى وقت قريب مستشارًا لشركة أسترازينيكا حول طرق زراعة الخلايا المتقدمة.

لم يتم إنتاج بيانات جديدة لهذه المخطوطة.

يقر المؤلفون بالتمويل من وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA) منحة EPA-STAR (R83950501)، و BMBF (161 L 0243 B، 016LW0146K)، وشبكة دمج التقدم في علم الجينوم والعلوم البيئية لتسريع البحث القابل للتنفيذ في ASD (GEARS) (R01ES034554)؛ Ladd-Acosta، Volk)، وأرض بادن-فورتمبيرغ (NAM_ACCEPT). تم أيضًا تلقي تمويل من EFSA، برنامج أفق الاتحاد الأوروبي 2020 للبحث والابتكار بموجب اتفاقيات المنح رقم 964537 (RISK-HUNT3R)، رقم 964518 (ToxFree)، رقم 963845 (ONTOX)، رقم 101057014 (PARC)، ومنحة اكتشاف من جامعة جونز هوبكنز ومنحة SURPASS من جامعة جونز هوبكنز.

“The chief function of the body is to carry the brain around.”
Thomas A. Edison (1847-1931)
“I may not have gone where I intended to go,
but I think I have ended up where I needed to be.”
Douglas Adams (1952-2001)

Received March 28, 2024;
Epub April 6, 2024;
© The Authors, 2024.
Correspondence:
Thomas Hartung, MD, PhD, Center for Alternatives to Animal Testing (CAAT), Johns Hopkins University, 615 N Wolfe St., Baltimore, MD, 21205, USA
(THartun1 @jhu.edu)

ALTEX 41(2), 152-178. doi:10.14573/altex. 2403281

Developmental neurotoxicity (DNT) testing predicts the hazard of exposure to chemicals to human brain development. Comprehensive advanced non-animal testing strategies using cutting-edge technology can now replace animal-based approaches to assess this complex hazard. These strategies can assess large numbers of chemicals more accurately and efficiently than the animal-based approach. Recent OECD test guidance has formalized this battery of in vitro test methods for DNT, marking a pivotal achievement in the field. The shift towards non-animal testing reflects both a commitment to animal welfare and a growing recognition of the economic and public health impacts associated with impaired cognitive function caused by chemical exposures. These innovations ultimately contribute to safer chemical management and better protection of human health, especially during the vulnerable stages of brain development.

Our 2014 article in this Food for Thought … series, “Developmental neurotoxicity – Challenges in the century and in vitro opportunities” analyzed the state of the art and emerging opportunities of developmental neurotoxicity (DNT) testing (Smirnova et al., 2014). Much progress has been made since then. Here, we will relate the strategic development of the field from having no alternative to animal testing for DNT to the recent establishment of the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) “Initial Recommendations on Evaluation of Data from the Developmental Neurotoxicity (DNT) In Vitro Testing Battery” (OECD, 2023) over 18 years.

DNT is a major public health concern in the context of autism spectrum disorder (ASD), attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), and other neurodevelopmental delays (Tab. 1). The developing brain is more vulnerable to environmental perturbations than the mature brain due to pharmacokinetic factors, immature defense mechanisms, and the complex processes of neurodevelopment (e.g., proliferation, migration, and differentiation) (Rice and Barone, 2000; Rodier, 1995). These processes take place in strictly controlled timeframes over several years and create different windows of vulnerability. Interference with developmental processes by, e.g., chemical exposure, can contribute to neurodevelopmental disorders such as ASD, ADHD, and intellectual disabilities (Kuehn, 2010; Sagiv et al., 2010; Grandjean and Landrigan, 2004; Landrigan, 2010, Rossignol et al., 2014). However, very few substances have been identified as developmental neurotoxicants due to the general lack of toxicity information on chemicals (Grandjean and Landrigan, 2006, 2014) (Fig. 1), and current animal testing strategies for DNT have several limitations (US EPA, 1998; OECD, 2007): They are costly ($1.4 million per substance), time consuming (about two years), and require large numbers of animals ( ). In addition, there are justifiable scientific concerns as to the relevance of these studies for human health (see Section 2).

DNT testing is crucial in the context of public health due to the increasing incidence and public awareness of neurodevelopmental disorders such as ASD; the latest data from 2023 suggest that in the US 1 in 36 children of 8 years old is now diagnosed with ASD (Maenner et al., 2023) (Tab. ). Similarly, from 2009 to 2017, there was a significant increase in the prevalence of ADHD among US children aged 3-17 years (increasing 8.5% to 9.5% according to the National Health Interview Survey, which is a nationally representative survey of the civilian noninstitutionalized population (Zablotsky et al., 2019)) and other conditions that affect cognitive and behavioral development in children. These disorders have significant societal and economic impacts, including lost productiv-

ity and the need for lifelong care, which can amount to millions of dollars per case.

Endocrine disruption, especially of the thyroid hormone system, is considered one of the contributors to DNT. Gaylord et al. (2020) analyzed National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) data from 2001-2016 to assess the neurodevelopmental disability burden and associated costs due to early life exposure to polybrominated diphenyl ethers (PBDEs), organophosphates, methylmercury, and lead in the United States. PBDE exposure in utero contributed the most to intellectual disability (ID) burden, resulting in 162 million intelligence quotient (IQ) points lost and 738,000 ID cases, followed by lead, organophosphates, and methylmercury. From 2001 to 2016, IQ loss attributable to PBDEs, methylmercury, and lead decreased or remained stagnant, while organophosphate-attributable IQ loss increased. The overall cost of ID cases decreased from billion annually in 2001-2002 to about billion annually in 2015-2016, largely due to reductions in PBDE and lead exposures. The authors noted that while these trends generally show benefits from chemical regulation, the increased use of potentially harmful substitutions for phased-out chemicals is concerning. Boyle et al. (2021) estimated that early childhood lead exposure in the US from 1999-2010 resulted in

a loss of about billion annually. Lead exposure of African American infants had the greatest economic impact, with an average loss of per child, accounting for billion) of the total losses despite comprising only of the population. Notably, 74% of the total economic burden was attributed to blood lead levels below , highlighting the substantial consequences of even low-level lead exposure in early life.

Bellanger et al. (2015) estimated the neurodevelopmental disability burden and costs attributable to PBDE, organophosphate, and other EDC exposures in the European Union. An expert panel evaluated epidemiological and toxicological evidence contributing to IQ loss, intellectual disability, ASD, and ADHD. PBDE exposure was associated with a probability of 873,000 lost IQ points and 3,290 intellectual disability cases, costing
€9.59 billion annually. Organophosphate exposure had a probability of 13 million lost IQ points and 59,300 intellectual disability cases, at billion annually. EDC exposure had a probability of causing 316 ASD cases at million annually, and a probability of causing 19,300-31,200 ADHD cases at billion annually. The authors concluded that EDC exposure likely contributes substantially to neurobehavioral deficits and associated costs.

The rising rates of these disorders suggest that lifestyle factors and chemical exposures are likely contributors, making DNT testing an essential tool for identifying and mitigating potential environmental causes. The lack of comprehensive data on the neurotoxic effects of most chemicals, including those found in environmental pollutants, industrial chemicals, drugs, consumer products,
and food additives, underscores the urgent need for reliable DNT testing strategies. However, there is no legal requirement to provide DNT data for most chemicals. Thus, there is no data at all on of all chemicals that humans are exposed to.

Epidemiology is equally complex. On this basis, an authoritative review of the field concluded that only 14 substances have been sufficiently characterized as human developmental neurotoxicants (Grandjean and Landrigan, 2014). We cannot trace ASD or other neurodevelopmental disorders back to just these substances, so there are certainly more, and this is what DNT testing is about. DNT testing can identify environmental and genetic interactions that may lead to these conditions and can thus inform regulations for protecting public health.

Our 2014 article (Smirnova et al., 2014) delved into the pressing issue of DNT testing. It underscored the limitations inherent in traditional animal-based studies. The article highlighted the increasing incidence and public awareness of neurodevelopmental disorders and the significant societal and economic impacts these conditions entail. It also pointed out the challenges faced by epidemiological studies in establishing causal relationships between environmental exposures and neurodevelopmental disorders, due to difficulties in study design, biosampling, and exposure metrics. The article explored the movement towards alternative DNT assessment methods, initiated through international workshops and conferences by expert groups and institutions. This effort aimed to identify promising alternative approaches, such as the use of adverse outcome pathways (AOPs) (Leist et al., 2017) and integrated testing strategies (ITS) (Hartung et al., 2013a; Rovida et al., 2015), to enhance the predictivity and relevance of DNT testing. The article emphasized the need for innovative biotechnological and computational methods to overcome the limitations of current testing paradigms. Despite the progress made until then, it acknowledged the ongoing challenges in validating and integrating these new approaches into regulatory frameworks. The article called for continued innovation, collaboration, and strategic evaluation to improve the quality and efficiency of DNT testing, ultimately aiming for better protection of human health without relying on animal testing.

The case of DNT is a revealing illustration of how difficult testing for complex hazards in animal models is. Some DNT concerns are covered in the two-generation study OECD Test Guideline (TG) 416, considered the most definitive study for developmental and reproductive toxicity (DART) in animals (OECD, 2001). Due to the potential impact of chemicals on human brain development, the development and adoption of OECD TG 426 (OECD, 2007) and the extended one-generation reproductive toxicity test guideline 443 (OECD, 2018) were significant milestones in the evolution of DNT testing. Both TG 426 and TG 443 have been subject to critical evaluation and refinement to ensure that they reflect the best available science for assessing DNT potential in human health risk assessment using animals. The guidelines emphasize the importance of considering the complex nature of neurodevel-
opment and the need for a variety of test methods to address different aspects of DNT (Makris et al., 2009; Arts et al., 2023).

OECD TG 426 provides a framework for conducting in vivo DNT studies. The guideline is designed to identify chemicals that may affect the nervous system during development, characterizing any chemical-induced alterations and estimating dose levels for regulatory uses. It includes specific endpoints to evaluate functional, behavioral, and morphological effects on the nervous system, with additional testing of offspring exposed in utero and during early lactation (Makris et al., 2009). However, it cannot realistically measure typical human adverse outcomes such as reduced language capacities, autism spectrum behavior or reduced IQ scores. Instead, it measures some endpoints that are not typical characteristics of human pathologies like altered grooming behavior, altered light-dark preferences, whisker reflexes, delayed eye opening, etc. These guideline tests were not formally validated in ring trials and are both costly and time-consuming. For a single study, approximately 1,200 rat pups are used, and the experimental part of the study lasts about three months. Data evaluation (e.g., pathology reading) takes about two years, with overall costs reaching around million per substance. The sensitivity of the tests may not be sufficient to detect subtle neurotoxic effects that could be relevant to human health.

OECD TG 443, also known as the extended one-generation reproductive toxicity study, expands upon previous guidelines by including assessments of reproductive and developmental effects within a single study (Moore et al., 2016). It allows for the examination of multiple generations and includes optional modules to assess DNT and immunotoxicity. This guideline aims to provide a more comprehensive understanding of a substance’s potential reproductive and developmental hazards while using fewer animals than traditional two-generation studies (OECD TG 416). In actual practice, the reduced number of animals needed does not really hold (see below).

The scientific relevance of animal DNT studies to human health effects is questionable (Smirnova et al., 2014):

Interspecies differences: The interspecies differences between humans and the animals used in DNT testing such as rats or mice affect the extrapolation of data from animals to humans, as the mechanisms of neural development and the responses to toxic substances can vary significantly between species. The human brain is our most complex organ, and replicating its development in animal models is inherently challenging.

Genetic variability: Another limitation is the inability of animal models to reflect the inter-individual genetic and epigenetic differences found in human populations. These differences can influence susceptibility to neurotoxicants, and animal models based on inbred strains typically lack this variability.

Behavioral and histological interpretation: Interpreting behavioral effects in animals is difficult. Behavioral tests in animals may not accurately represent the complex human behaviors or cognitive functions that could be affected by neurotoxicants. Additionally, potential artifacts in morphometric neuropathological measures can arise, and criteria for observation measures are not always clear, leading to uncertainty in the evaluation of histological data.

In addition to the scientific concerns, ethical concerns regarding the use of animals in research are significant and have led to calls for the reduction, refinement, and replacement of animal testing. Moreover, the expense and time- and labor-intensity of animalbased DNT tests is prohibitive for routine chemical screening. This results in many potential DNT chemicals remaining unidentified due to the impracticality of testing them all using current animal-based guidelines.

Economic aspects (Meigs et al., 2018) also need to be considered: TG 443, which has a DNT module that can be triggered or be part of routine depending on regulatory requirements, was expected to reduce the costs of TG 416 studies (Schiffelers et al., 2015). However, an analysis commissioned by the European Chemicals Agency showed that the worldwide average price for TG 416 is €285,842 (European average is €318,295), while for TG 443 the average price for the basic study (without second generation and extra cohorts) is , and with second generation , i.e., more than TG 416 . With extra cohorts, the price increases to for the DNT cohort or for the immunotoxicity cohort; including both cohorts and the second generation costs . The expectation that TG 443 would save drastically on animal numbers has also been disproven (Knight et al., 2023; Rovida et al., 2023): While TG 416 in REACH registrations used on average 2,590 animals ( 3,098 with dose range finding studies (DRF)), TG 443 used 1,318 ( 1,826 with DRF) and with second generation 2,226 ( 2,734 with DRF), i.e. a reduction but only
for the basic study. Test duration of TG 443 compared to TG 416 is an advantage as long as the second generation is not triggered.

In summary, while animal-based DNT testing has provided critical data for individual regulatory decisions, the limitations have urged the development of alternative testing strategies that are more efficient, cost-effective, and human-relevant. However, the initial absence of alternatives to animal testing posed an enormous challenge.

Our first article on DNT in this series (Smirnova et al., 2014) was written in conjunction with the DNT-4 meeting in Philadelphia. The following summary of how we got to Philadelphia shall illustrate the unique strategic development to replace animal testing. It all started with Alan Goldberg, at the time Director of CAAT, approaching Thomas Hartung, at the time Head of the European Center for Validation of Alternative Methods (ECVAM), in 2004, saying, “Thomas, we have to do something about this.” This sparked an ever-growing team of collaborators working together in this endeavor. Alan Goldberg stated, “I chose DNT as the topic for TestSmart as there were no specific requirements for DNT, so we did not have to match against an in vivo approach.” The most important strategic decision was the engagement of regulatory

agencies: The US Environmental Protection Agency (US EPA) from the very beginning, and later the European Food Safety Authority (EFSA) and the OECD (Fig. 2).

The discussion started in Aspen around 2003 with Pamela Lein, Alan Goldberg, and Kevin Crofton talking about the need for DNT testing (Lein et al., 2005). Sandra Coecke, Anna Bal-Price, Chantra Eskes, and Helena Hogberg started working on this topic at ECVAM around the same time (Hogberg et al., 2010, 2011; BalPrice et al., 2010). Over time, a variety of assays were developed and brought in a growing “family” of researchers including Bill Mundy, Ellen Fritsche, Marcel Leist, Tim Shafer, and many others. When Thomas Hartung, Erwin van Vliet, and Helena Hogberg moved to CAAT in 2009, they started up laboratories focusing on DNT and held DNT workshops. The series of workshops and conferences co-organized by CAAT, ECVAM, and US EPA is summarized in the following.

At ECVAM, the first workshop was organized as a collaboration between CAAT, ECVAM, and CEFIC (the chemical industry in Europe) on April 19-21, 2005, in Ispra, Italy. The article by Coecke et al. (2007) reports on the first workshop. The goal of the workshop was to identify and catalog in vitro methods that could predict and identify DNT hazards. Discussions focused on the science of DNT, including models that could capture critical mechanisms and processes, and policy and strategy for integrating alternative methods into regulatory frameworks. The report outlined recommendations and priorities for future work, emphasizing the need for high-throughput in vitro DNT models and their regulatory validation. It highlighted the importance of identifying in vitro tests that can effectively predict DNT hazards, the critical role of mechanistic understanding in developing these tests, and the need for a collaborative approach of scientists, regulators, and stakeholders to integrate these methods into risk assessment strategies.

Already in this paper on the 2005 workshop, we discussed that embryonic stem cells might be a possibility to humanize the assays. This was a year before Yamanaka developed induced pluripotent stem cells (iPSCs) and was then still an ethical dilemma. We also needed to determine what endpoints and aspects of neural development would need to be modeled in these cultures. The focus was placed on a number of key events, which we felt should be measured to model or assess DNT.

A further question was which type of cell model would be appropriate – how complex would it need to be, and how simple could it be to allow sufficient throughput? There were arguments for and against simple cell lines, complex microphysiological systems (MPS), less sentient organisms, and emerging computational methods. At ECVAM, and later at CAAT, we started to focus on 3D models, i.e., aggregates, which we felt was a good trade-off between complexity and throughput. Honegger et al. (1979) had published in Nature the model of reaggregating fetal
rat brain cells, which we successfully adopted. It led us to the first paper describing the use of electrophysiological recording for DNT (van Vliet et al., 2007), and to the first paper on the assessment of DNT using metabolomics (van Vliet et al., 2008). More recently, it allowed us to address the DNT potential of flame retardants (Hogberg et al., 2021).

For many, the call for a concerted effort to address scientific and regulatory challenges sounded impossible at the time, but it started to break down the Herculean challenge into manageable steps and ultimately led to the OECD guidance (OECD, 2023).

The first international DNT meeting, TestSmart DNT-1, took place in Reston, VA, in 2006. Its primary objective was to bring together stakeholders (e.g., industry, academia and regulators) to identify concerns relating to science and policy and discuss how to develop alternative testing methodologies (Lein et al., 2007). The resulting paper discussed the need for developing alternative methodologies to traditional animal-based DNT testing and emphasized the collaboration between CAAT, the U.S. EPA, and the National Toxicology Program towards creating TestSmart DNT – aimed at fostering alternative DNT models. These initiatives focused on identifying and prioritizing chemicals posing DNT risks, integrating alternative DNT methods into regulatory decision-making, and exploring possibilities for reducing, refining, or replacing animal use in DNT testing.

The progress from the 2005 workshop to the 2006 conference already reflected significant advances in the field of DNT testing: While Coecke et al. (2007) focused on the initial discussions and the conceptual framework for incorporating in vitro methods into regulatory practices, Lein et al. (2007) highlighted active collaborations and specific initiatives like TestSmart DNT, aimed at the practical implementation of these alternative methods. This transition marked a move from theoretical and strategic planning to actionable steps towards validation and regulatory acceptance and demonstrated an increased commitment to reducing animal testing through scientifically robust in vitro DNT testing methods.

In 2008, TestSmart DNT-2 in Reston, VA, again, assessed the progress made in developing DNT alternatives, reassessed the priorities and recommendations set at DNT-1, and established ways to use in vitro data in decision-making. The meeting produced a document with recommendations on how to develop alternative DNT methods for screening and prioritization of chemicals (Crofton et al., 2011), which included:

appropriate cells/organisms, and the endpoints measure relevant developmental features.
2. The ability to correctly and accurately measure the intended DNT endpoint must be demonstrated by the use of a set of compounds termed “endpoint-specific controls” or “tool compounds”. The measured endpoint should reflect the intended neurodevelopmental process.
3. The dynamic range of the DNT endpoint should be characterized to determine the measurable extent of change from control values.
4. Concentration-response relationships should be characterized, ideally testing at least five concentrations over a wide range. This is critical for comparing the sensitivity of different methods.
5. Positive and negative control chemicals should be tested that are known to reliably affect or not affect the measured DNT endpoint by known mechanisms.
6. Initial training sets of chemicals should be tested, including those known to elicit or not elicit DNT responses based on in vitro data. This evaluates the method’s ability to screen moderate numbers of chemicals.
7. Larger testing sets of chemicals should then be screened, including those known to cause or not cause DNT effects in vivo. This demonstrates the method’s ability to test larger chemical numbers.
8. The method’s sensitivity, specificity and predictivity in identifying chemicals’ DNT potential should be analyzed based on these reference chemical sets.
In summary, the recommendations focused on demonstrating the relevance, reliability, sensitivity, and throughput of alternative DNT methods using well-characterized endpoint assays and reference chemical testing sets as a framework for developing screening level alternative DNT tests. The goal was to establish the methods’ fitness for screening and prioritizing large numbers of chemicals. The DNT-2 recommendations aimed to facilitate a transition from conceptual discussions to practical assay development and use for regulatory purposes. These considerations and experience from the DNT field had an important impact on the development of broader concepts for in vitro test method development and for novel validation approaches of such assays (Leist et al., 2010, 2012; van Thriel et al., 2012).

DNT-3 was held in Varese, Italy, in 2011 and concluded substantial progress since DNT-2 in applying alternative DNT tests (Bal-Price, 2012). DNT-3 built upon the recommendations from Crofton et al. (2011) and showed progress in several key areas:

Building upon the seminal works discussed above, our 2014 paper (Smirnova et al., 2014) presented several key conceptual advances in the development of alternative approaches for DNT testing and provided a forward-looking perspective on the future of DNT testing.

First and foremost, we emphasized the pressing need for more efficient, cost-effective, and mechanistically informative methods to address the paucity of DNT data for the vast majority of chemicals in commerce. This built upon the discussions in the previous papers, which highlighted the limitations of current animal-based DNT testing paradigms, including their high cost, low throughput, and questionable relevance to human health outcomes. We argued that the development of cheaper, faster, and more predictive alternatives is not only a scientific imperative but also an ethical one, given the large numbers of animals used in regulatory DNT studies.

Secondly, the paper discussed the concept of AOPs and their central role in guiding the development of ITS for DNT. AOPs provide a structured framework for linking molecular initiating events (MIEs) to adverse outcomes (AO) at the organism or population level, via a series of key events (KEs) at the cellular, tissue, and organ levels. By mapping the landscape of known or putative AOPs relevant to DNT, researchers can identify critical pathways and processes that should be targeted by alternative test methods. This advances the mechanistic approach advocated by Crofton et al. (2011) and provides a rational basis for designing
and interpreting in vitro and in silico assays in terms of their relevance to in vivo outcomes.

Thirdly, we highlighted the transformative impact of recent technological advances on the development of alternative DNT models. These included the use of human stem cell-derived neural models, which offer a more physiologically relevant and speciesspecific platform for studying neurodevelopmental processes and their perturbation by chemicals. Advances in 3D cell culture techniques, such as brain organoids, now allowed the recreation of complex tissue-level interactions in vitro, bridging the gap between traditional 2D models and intact organisms. High-throughput screening (HTS) technologies, such as automated imaging and multi-electrode arrays, now enabled the rapid and quantitative assessment of key neurodevelopmental events, such as neurite outgrowth, synaptogenesis, and network formation. These technological breakthroughs, which were still in their infancy when the earlier papers were published, had greatly expanded the toolkit available for alternative DNT testing.

Building on these advances, we proposed a conceptual framework for linking in vitro test systems to an endophenotype of disturbed functional or structural connectivity in the brain. It was postulated and assumed that all DNT effects eventually resulted from the disturbance of at least one key neurodevelopmental process (KNDP), such as cell proliferation, differentiation, migration, and myelination. This pragmatic approach acknowledged that our current understanding of the complete chain of events linking MIEs to AOs in the developing brain was (and is) still limited. It also anticipated currently discussed test strategies that focus more on determining the highest non-toxic (no toxicity endophenotype) concentration/dose than on exactly defining the type of AO (e.g., attention deficit vs language disturbance). By focusing on a core set of well-characterized neurodevelopmental processes known to be sensitive to chemical perturbation and critical for proper brain development, researchers could develop a battery of fit-for-purpose assays to cover the main pathways of DNT. This framework provided a roadmap for assay development and validation in the absence of complete AOPs.

Another important issue tackled in 2014 was the challenge of defining adversity in the context of alternative DNT models. While apical endpoints, such as changes in behavior or cognitive function, are typically used to define adverse effects in regulatory animal studies, these complex outcomes would be difficult to recapitulate in vitro. We discussed the need to establish clear criteria for distinguishing between adaptive and adverse responses at the cellular and molecular level, taking into account factors such as the magnitude, duration, and reversibility of the effects. This discussion was very much driven by our concomitant discussions on pathways of toxicity (Kleensang et al., 2014) versus pathways of defense (Hartung et al., 2012) in the context of the resilience of biological systems (Smirnova et al., 2015b). We also highlighted the importance of considering the biological relevance of the observed changes, rather than relying solely on statistical significance. This nuanced discussion of adversity built upon the earlier works (Blaauboer et al., 2012) and underscored the need for a careful and context-dependent interpretation of alternative DNT assay results.

Finally, we emphasized several key factors that should be considered when designing and interpreting alternative DNT models. These include potential interspecies differences in neurodevelopmental processes and chemical susceptibility, which underscore the need for human-relevant models, and the importance of considering indirect mechanisms of DNT, such as alterations in thyroid hormone signaling or placental function, which may not be captured by models focused solely on direct effects on neural cells. Additionally, we highlighted the critical role of exposure timing, given the dynamic nature of neurodevelopment and the existence of critical windows of vulnerability. These considerations, while not entirely new, were given greater prominence in the paper, reflecting a more nuanced and biologically informed approach to alternative DNT testing.

In conclusion, the 2014 paper summarized a significant conceptual advance in the field of alternative DNT testing, building upon the groundwork laid by earlier publications. By integrating the latest scientific understanding of neurodevelopment with technological advances in in vitro and in silico modeling, we provided a comprehensive and forward-looking perspective on the challenges and opportunities in this field. We articulated a vision for a new paradigm of predictive toxicology, based on a mechanistic understanding of the pathways underlying DNT and their perturbation by chemicals. Driven by the limitations of current alternative models, we offered a roadmap for future research and development, emphasizing the need for a multi-disciplinary and collaborative approach. As such, the paper served as a valuable synthesis of the state-of-the-art in 2014 and a guidepost for the future direction of alternative DNT testing.

DNT-4 was held in Philadelphia, PA, in 2014. The meeting brought together diverse stakeholders (academia, industry, and regulatory bodies) from around the globe (Asia, Canada, Europe, and US), who discussed the next steps required to move in vitro DNT tests forward. Based on experiences from previous DNT meetings, the meeting format included scientific presentations followed by smaller breakout groups in which specific topics were discussed. The following summarizes the discussions at DNT-4. It does not necessarily reflect all opinions of the participants, and the concluding statements are our own reflections of the meeting. As similar topics were discussed in several breakout groups, the report has been organized based on the initial meeting program.

The first session explained the AOP framework and gave examples on how it could be used for DNT assessment. The keynote presentation by Dr Kevin Crofton (US EPA, presented by Dr William Mundy, US EPA) described the critical importance of the AOP framework to link DNT research to regulatory needs. Dr Anna Bal-Price, European Commission, further explained the concept of AOPs applied to DNT evaluation. Dr Ellen Fritsche, IUF – Leibniz Research Institute of Environmental Medicine, and Dr

Pamela Lein, University of California Davis, gave practical examples of how in vitro and epidemiological data can inform AOPs.

The AOP framework is a tool to combine existing knowledge concerning the linkage between a MIE and an AO at the individual or population level (Ankley et al., 2010). The AOP covers the whole pathway including chemical properties, MIE, cellular response, organ response, organism response, and finally the population response . One test or study alone will not be able to capture this whole pathway. However, combining data from several DNT tests, including different models (e.g., cells and non-mammalian species) and endpoints for different developmental processes (e.g., proliferation, differentiation, and myelination) with existing in vivo data and data from epidemiological studies can help to reduce the uncertainty and give a better toxicity prediction. It should be emphasized that AOPs are chemical agnostic, meaning that any chemical that perturbs the MIE with sufficient potency and duration will have an effect on the following chain of KEs identified in the AOP. The advantage with this approach is that not all elements in the AOP need to be identified before the concept can be useful (Bal-Price and Meek, 2017). By assembling all existing information, data gaps can be identified to focus efforts on generating useful data and methods. DNT AOPs will provide confidence that cellular changes can lead to DNT effects in humans and will increase the certainty of in vitro tests for risk assessors and regulators to make decisions.

Currently, only a few AOPs for DNT have been developed according to the OECD guidance document (Bal-Price et al., 2015a), but more AOPs can be built once more data is obtained. The AOP framework faces special challenges for neurotoxicity and DNT assessment: Firstly, there is a lack of basic knowledge on the pathophysiology of neurological diseases and the underlying MIEs and KEs. Moreover, there is little understanding of compensatory processes in the nervous system, such as homeostasis and resilience. The complexity of the development of the central nervous system will likely construct a network of AOPs instead of the suggested linear AOPs. However, while it takes time to build AOPs, the incompleteness of an AOP should not impede its use.

It is likely that gene-environment interactions play a crucial role in the case of many neurodevelopmental diseases. While the increase in ASD prevalence is partly due to increased diagnostic criteria, it cannot be fully attributed to diagnostic substitution (HertzPicciotto and Delwiche, 2009) and genetic causes; an increasing number of studies suggest that environmental factors contribute to this increase. Several genes involved in ASD and other neurodevelopmental disorders have been shown to be susceptible to environmental perturbation (Pessah and Lein, 2008). In vitro models are preferable to evaluate these gene and environmental interactions and how they might affect neurodevelopment at the cellular level. The adverse effect on the cellular level can then be linked to adverse effects in patients with developmental disorders to build confidence in the AOP. For example, genes involved in synapse formation and elimination have been shown to be disturbed by environmental exposure, and epidemiological studies have shown
that many children with ASD have increased connectivity in local circuits of the cortex (Keown et al., 2013). Such an approach to associate cellular effects with disease outcome could be informative for regulators and demonstrate the use of in vitro data for risk assessment.

A breakout group “Science of DNT Models and AOPs” elaborated further on this topic. The previous DNT meetings had already identified several promising models for DNT studies, e.g., cell lines, primary cultures, 3D aggregating cultures, zebrafish, . elegans, and drosophila (Coecke et al., 2007; Lein et al., 2007). At DNT-4 this breakout group deliberated further advantages and limitations of these models with a focus on what window of neurodevelopment they cover and whether and how genetic variation can influence DNT endpoints in vitro. It was concluded that different alternative models are suitable for various stages of neurodevelopment. Suggested as the most fitting cell models for earlier stages were precursor cell lines and stem cells (e.g., embryonic and iPSCs) together with non-mammalian species such as C. elegans and zebrafish. Some of these models, like iPSCs and the non-mammalian species, can also cover the later stages of development while primary cultures are mainly relevant for the later periods. It was further discussed that different species have divergent developmental time frames, both in vitro and in vivo, e.g., rodent cells develop faster than human cells, and zebrafish have shorter developing time than mice. Shorter development can be an advantage as it shortens the experimental time. However, it is unclear how species might differ in sensitivity to environmental perturbations. Several cell-based studies have reported species differences in response to various compounds; however, there were concerns among the participants that these effects could be artifacts. Especially in the early stage of development the group felt that differences could be large, while the later stages could be more easily compared among the models. It was remarked that these challenges do not only concern differences between species but differences between cells from different donors. Such differences may depend on when the cells are taken and on the genetic background. It is well known that genetics play a role in the sensitivity of individuals to exposure to chemicals and drugs, and it is therefore to be expected that genetics will influence DNT endpoints in vitro. As the human population is heterogenetic and includes vulnerable subgroups, this can be seen as an advantage. Genetic variations have long been explored in simpler organisms such as C. elegans and zebrafish (Nishimura et al., 2015). However, with the recent use of iPSCs, interindividual differences are increasingly studied also in human cells (Pamies et al., 2017).

It was specified that human cells would be preferred in DNT studies, as this would avoid species differences. However, there is a tremendous dearth of relevant data on human exposure and DNT effects, while in vivo rodent data is available. Therefore, correlating data from rodent cells with rodent in vivo data can act as a bridge to extrapolate data on human cells to the human situation (Maass et al., 2023; Algharably et al., 2023). Nevertheless, models need to be characterized based on maturation as a function of

days in vitro (DIV) and associated with the developmental stage in vivo. But is 7 DIV comparable to 7 days in vivo? It was discussed that measurements of specific markers could contribute to identifying the developmental stage of the model, e.g., specific miRNA, mRNAs and/or proteins.

The conclusion of this breakout group was that alternative models need to be well characterized to be useful in any toxicity study, including DNT. Often models lack information about metabolic capacity, understanding of different cell types, and association to the in vivo situation. However, many models have shown great competence and are useful for measurement of several developmental processes such as differentiation, proliferation, migration, and survival. The in vivo (rodent) predictability for a subset of chemicals seems to be good, however, many more chemicals need to be tested to fully understand the real potential (see below for deeper discussion). To better understand the relevance to the human situation, the DNT community could benefit by interacting with the clinical community to correlate toxicity to, e.g., exposure scenarios, existing biomarkers, and pathological mechanisms.

In this session, different approaches to evaluate DNT using omics tools were presented. Dr Jennifer Freeman, Purdue University, gave some examples using the zebrafish, and Dr Lena Smirnova described the use of 3D in vitro brain models. Dr Milou Dingemans, Utrecht University, informed how to integrate multiple data from the European Commission-funded project DENAMIC .

The benefits of using non-mammalian species, such as zebrafish and C. elegans, for DNT assessment include that they are inexpensive, fast, amenable to genetic modifications, and allow whole organism and behavior studies. Zebrafish can be combined with transcriptomic and epigenomic approaches to identify DNT mechanisms for chemicals (Lee and Freeman, 2014). The DENAMIC project includes in vitro, zebrafish, in vivo models, and human cohorts, and applies transcriptomics, proteomics, neurotransmitter profiles, and miRNA to identify biomarkers for neurodevelopmental disorders. The focus is on mixtures, and the data is integrated with the aim to understand mechanisms of the interactions of low doses and neurodevelopmental disorders.

The benefit of using 3D in vitro models include increased cellcell interactions and better representation of the complexity of the in vivo brain. Different single or multi-cellular human and rodent model types were evaluated for their advantages and disadvantages. The models are combined with transcriptomics, metabolomics, and miRNA profiles to identify pathways of toxicity after chemical exposure that may lead to adverse effects on the developing brain (Smirnova et al., 2015a).

The use of omics approaches will generate high-content information to better understand the mechanisms of chemicals as in the vision for toxicology in the century (Krewski et al., 2020). However, the generation of massive data might lead to new challenges and was discussed in the breakout group on techniques.

The keynote by Marcel Leist described the use of human ESCs combined with transcriptomics endpoints. It was demonstrated that statistical prediction models could identify signature transcriptome changes for subgroups of DNT toxicants. Short toxicant exposures may be more useful to identify modes-of-action, while longer exposures of differentiating stem cell models lead to epigenetic changes that affect the differentiation track of the cells and have permanent effects that remain even after drug washout. The conclusion was that transcriptome patterns, recorded at noncytotoxic chemical exposures, allow chemical classification and, therefore, hazard prediction.

Speakers from US government described current screening approaches for DNT at NIEHS by Dr Mamta Behl and at US EPA by Dr William Mundy and Dr Timothy Shafer. As the number of chemicals that lack DNT data is too high to test with traditional in vivo approaches, the National Toxicology Program at NIEHS is working on strategies to screen and prioritize compounds for in vivo DNT testing. A list of 80 compounds was developed and tested by collaborators using various cell systems such as primary, ESC, iPSCs, and cell lines containing both neurons and astrocytes, and on non-neuronal cells, e.g., cardiomyocytes. Alternative models such as nematode and zebrafish were also included. The prioritization is based on various data analysis models.

The high-throughput testing program includes ToxCast ( 700 assays and over 2000 chemicals tested) and Tox21 (in partnership with NTP, FDA and NCATS, screening more than 10,000 chemicals). Moreover, National Health and Environmental Effects Research Laboratory/ToxCast are developing assays for more complex endpoints including DNT. EPA assays for DNT were developed in line with the AOP framework with high-throughput molecular assays, e.g., ion channels, receptors, enzymes; for MIEs, proliferation, differentiation, neurite outgrowth, synaptogenesis, migration, and apoptosis; multi electrode array for KEs, and a zebrafish behavior assay for AO. A list of positive and negative reference chemicals has been developed.

For the alternative assays to be useful, they need to be applied in a regulatory framework. However, different regulatory bodies have different requirements and needs. In this session Dr William Slikker from NCTR, FDA, and Dr Anna Lowit from Health Effects Division, US EPA, gave two regulatory agencies’ perspectives on the use of alternative methods for DNT assessment.

In the case of drug regulation at FDA, it was described that the challenge with only using mechanistic data is that drugs are not entirely pharmacologically identical. In this case, the data may suggest similar risk, but the “safety margin” may not be the same. However, mechanistic data can still be helpful and together with in vivo experiments provide a better understanding of the DNT effects.

The regulation at US EPA is more flexible, and the use of in vitro data when there is knowledge from an AOP can be used to support read-across for similar compounds. Furthermore, in vitro data can be used in a weight of evidence evaluation to determine data needs or to review a waiver justification. The US EPA supports the 3Rs in their regulatory program. In the case of DNT, US EPA granted 8 waivers and requested 1 study between December 8, 2011, and April 11, 2014. Several in vitro study design considerations to satisfy regulatory use were discussed including cell types, presence/absence of serum, parent chemical vs. metabolite, and test concentrations. Furthermore, there are different fit for purpose criteria depending on the intended use, e.g., screening and prioritization vs replacement of in vivo guideline or single assay vs test battery.

Dr Thomas Hartung discussed the use of ITS (Hartung et al., 2013a) for DNT assessment. An ITS is an algorithm to combine (different) test result(s) and, possibly, non-test information (existing data, in silico extrapolations from existing data or modeling) to give a combined test result. They often will have interim decision points at which further building blocks may be considered. Several aspects should be considered, for example flexibility in combining components of the ITS, the applicability domain, and efficiency in terms of cost, time, and technical difficulties.

The last session of the meeting described cutting-edge technologies for DNT presented by stakeholders from government and academia. Dr Andrea Seiler from the German Federal Institute for Risk Assessment (BfR) described a joint project funded by the German Ministry for Research and Education (BMBF) with the goal to develop standardized predictive cell-based in vitro assays for DNT testing. Dr Nisha Sipes from US EPA used literature mining to identify MIEs in an AOP framework for cleft palate. Such informatic data can be applied to develop multicellular virtual-tissue models, e.g., neural tube closure in the virtual embryo, that are based on cell-level models driven by biological networks and rules that can be used for predictive toxicology. Extensive characterization of human iPSCs cultured in 3D was presented by Dr David Pamies from Johns Hopkins University. Human iPSCs allow the study of patients with different genetic backgrounds and can explore whether certain genes convey sensitivity to chemical exposure. Dr Luc Stoppini from the University of Applied Sciences Geneva investigated the functionality of 3D ESCs and iPSCs using various multielectrode arrays. Effects of exposure to chemicals were further evaluated with receptor gene expression studies and metabolomics for neurotransmitters to develop an in vitro assay. The 3D models were further enhanced by incorporation of monocytes to study neuroinflammation and combined with other organ cultures in a chip platform and blood brain barrier. Finally, Dr Keith Cheng from Penn State College of Medicine discussed a novel imaging technology in whole zebrafish. The high-throughput technique can detect changes in any cell type at cell resolution (voxel dimensions of micron) and makes it possible to identify and characterize virtually every organ, tissue, and cell type contributing to soft tissue architecture, including specific structures such as nerve tracts and vessels.

The meeting ended with a panel and plenary discussion of the steering committee moderated by Dr Alan Goldberg. Several challenges and limitations with current approaches were identified.

The relatively new AOP framework is still not mature enough to use for regulatory decisions, but it will be important to understand how to link cellular events to AOs. The major challenges with the AOPs are to understand the relationships between the events and to get quantitative data. To achieve this, different models and technologies are needed. Some of the new human cell-based models (e.g., iPSCs) and technologies (e.g., omics and miRNA) might be useful tools, particularly when linked to epidemiological studies. However, the models need to be very well characterized.

There is a need to accelerate chemical testing in the assays that have been developed, make sense of the data from high-content assays, and link cellular effects to AOs. Prediction and interpretation cannot be determined without screening more compounds. The major limitation of current DNT tests is still the same as at DNT-2 and -3: lack of data generation.

For this, reference chemicals are needed, which is challenging as there is limited DNT in vivo data for most chemicals. After identification and testing of reference chemicals there should be a selection of tests to build a battery and eventually an ITS. To collect the generated and existing data in a common database will be essential. Furthermore, a strong policy program that can influence funding organizations (both in EU and US) to support assay development and chemical screening is needed. Establishment of a DNT secretariat including different stakeholders from various parts of the world was suggested as a path forward.

There seems to be a change in the mindset of regulators, with a first step to make use of in vitro tests combined with revised in vivo testing for risk assessment. However, it should be kept in mind that different regulatory bodies have different needs. It will be crucial to have them involved during test development. To demonstrate that in vitro tests are useful we need to generate more data, validate the tests, and link the generated data to AOs in humans.

The biotech revolution has clearly fueled DNT testing: the use of stem cells, the development of organotypic cultures, and highcontent methods have significantly contributed to the development of alternative testing methods for DNT by providing more human-relevant and mechanistically informative systems that can reduce reliance on animal testing (Groot et al., 2013).

The availability of human stem cells, particularly human iPSCs, has revolutionized the field of DNT testing by providing new methodologies that are more relevant to human biology. iPSCs can be differentiated into various cell types of the central and peripheral nervous systems, enabling the modeling of different stages of brain development and the assessment of chemical toxicity during these stages (Yamada et al., 2019; Kobolak et al., 2020).

Gene-environment studies using patient cells: iPSCs facilitate the study of gene-environment interactions by using cells from patients with developmental disorders (Ilieva et al., 2018; Russo et al., 2019; Wegscheid et al., 2021; Villa et al., 2021; Santos et al., 2023; Kilpatrick et al., 2023). This approach provides insight into whether certain genetic backgrounds confer increased sensitivity to environmental stressors. This kind of research is crucial for understanding the complex interplay between genetic predispositions and environmental factors in the development of neurological disorders.

Gene engineering with risk genes: The advent of gene-editing technologies like CRISPR/Cas9 has allowed to introduce or correct mutations in iPSCs. This enables the study of specific risk genes in a controlled environment and the observation of their effects on neurodevelopment: For instance, our earlier study demonstrated a potential synergy between a mutation in the high-risk autism gene CHD8 and exposure to the organophosphate pesticide chlorpyrifos in an iPSC-derived 3D brain model (Modafferi et al., 2021). By engineering iPSCs with known risk genes for neurological conditions, scientists can dissect the pathways through which these genes contribute to disease and identify potential therapeutic targets.
“Living biopsy” and disease modeling: iPSCs can be considered a “living biopsy” of a patient’s condition, as they capture the patient’s genetic makeup and can be differentiated into disease-relevant cell types, providing a platform for studying disease mechanisms and potential treatments (Smirnova and Hartung, 2024).

Personalized medicine and toxicology: The use of iPSCs in DNT testing paves the way for personalized medicine and toxicology. By generating iPSCs from individual patients, it is possible to create personalized models of disease and predict individual responses to drugs and environmental toxicants (Fritsche et al., 2018). This approach could lead to more tailored and effective treatments with fewer side effects, as well as safer and more targeted drug development.

Challenges and future directions: Despite these advances, challenges remain for the use of human stem cells for DNT testing. These include the need for improved methods to differentiate iPSCs into fully mature and functional neurons and glia, the development of standardized protocols for toxicity testing, and the integration of these new methods into regulatory frameworks (Fritsche et al., 2018; Yamada et al., 2019).

As the technology progresses, it is expected that human stem cell-based models will become increasingly important tools for assessing the safety of chemicals and drugs, ultimately reducing the reliance on animal testing and improving human health outcomes.

Organotypic cultures are complex in vitro models that maintain or reconstruct the architecture and multi-cellular complexity of the original tissue. We see this as a revolutionary change (Hartung and Tsatsakis, 2021) in achieving relevant human cell cultures. These cultures can, in the case of DNT, mimic key as-
pects of human neurodevelopment and can be used to study the basic biological processes that are fundamental to understanding DNT, such as differentiation, proliferation, migration, and neurite growth. By testing the disturbance of these biological activities by chemicals, we can identify potential neurotoxicants. The bioengineering of MPS is an enormously important task.

We have organized three large workshops with opinion leaders from all over the world (Marx et al., 2016, 2020, and in preparation). The second one led to a Science paper on human MPS for drug development (Roth et al., 2021). Out of this, also, developed a series of MPS World Summits and the international MPS society. In 2022 in New Orleans, out of 655 registrants, 65 came from the FDA, showing the enormous resonance of this topic with the agency. 430 people met there in person, which was tripled to 1300 participants in Berlin 2023, and similar numbers are expected for Seattle in June 2024.

Our own work led us to humanize brain organoids (Hogberg et al., 2013), published shortly after the first iPSC-derived model (Lancaster et al., 2013) of the first brain organoids. In 2016, at AAAS, we finally showed how we can mass-produce them (Pamies et al., 2017). Since then, we have been using this approach for a number of disease models. These models are spontaneously electrophysiologically active, and they include most of the brain cells we know except for microglia, which can be added. This includes all types of neurons we looked for, as well as astrocytes, oligodendrocytes, even in reasonable proportions – the standard model has about glial cells, and we have just developed protocols to increase them to physiological levels of (Morales Pantoja et al., 2023b). One of the key features is myelination, with about of the axons being myelinated (Pamies et al., 2017; Chesnut et al., 2021a,b; Romero et al., 2023). One can see the beautiful structures of oligodendrocytes wrapping themselves around the axons, which is a quite unique feature, because very few human models to date show myelination. We used this model for DNT, assessing pesticides such as rotenone (Pamies et al., 2018) and chlorpyrifos (Modafferi et al., 2021), but also the antidepressant paroxetine (Zhong et al., 2020), which has been under debate for about 20 years as possibly contributing to neurodevelopmental disorders. The discussion was not closed, but we could show that clinically relevant concentrations disturb brain development in our experimental system.

One of the key ideas is that these brain organoids show all of the mechanisms we have identified before as critical for DNT. Is this, perhaps, a possibility to replace the extensive battery of tests with something that combines all of these assays? Because we observe aspects of neurodifferentiation, myelination, neurite outgrowth, synaptogenesis, glial migration, and gliosis, and the neural network through electrophysiology in a single model, it appears possible to multiplex the different assays. The brain organoids undergo at least a critical phase of development, reflecting currently about five months of embryo development, possibly even more if we only drive them towards this. So, we can probably observe a lot of DNT-relevant mechanisms in a single set-up. This may be more promising than developing a lot of different assays, which no lab can have all at the same time for the
same substance. This was the starting point for a project funded by the EPA , announced when the EPA in 2019 decided to move out of animal testing by . The project aims to develop a mini “brainbow” of fluorescent reporter genes engineered into these brain organoids so that, noninvasively, all of these mechanisms can be studied at the same time (Romero et al., 2023). We have developed shell electrodes that embrace the brain organoids, allowing 3D electrophysiology around them (Huang et al., 2022).

Another line of work is to use brain organoids to study gene-environment interactions (Butera et al., 2023; Suciu et al., 2023a). We cannot explain the enormous increase in ASD (Tab. 2) based only on genomics and suspect there is an environmental component. Our hypothesis is that a susceptible genome meeting chemical exposure at a vulnerable time contributes to the development of ASD. In Modafferi et al. (2021), we showed such a pair for the first time: CHD8, a known risk gene for autism, and chlorpyrifos, a substance with some liabilities at least at high concentrations and doses, synergize. This result has now led to the creation of an NIH Autism Center of Excellence , where we are following in total 175,000 children in 18 partner centers to look for such gene-environment interactions, and we are verifying these pairs experimentally in brain organoid systems as a second ongoing part of the project.

Challenges and future directions: Though more complex models have the potential to enhance DNT testing, there are some challenges to consider before their use in regulatory applications (Hogberg and Smirnova, 2022). The major limitations are lack of standardization of protocols and lower reproducibility. Moreover, the throughput of such models is still low compared to the simple methods previously developed. The culture time is often extended and can be costly, making such models, as of today, more useful as a follow-up method for a small set of prioritized compounds identified in an initial screening approach.

Taken together, organotypic cultures and MPS as complementary or orthogonal assays for the current screening battery of assays for DNT can support the translation of in vitro mechanistic effects to in vivo DNT outcomes. Once these models can demonstrate that they follow the readiness criteria for regulatory application (BalPrice et al., 2018a) it will be time to refine the current DNT in vitro test battery (DNT IVB).

High-content screening (HCS) methods (van Vliet et al., 2014) have significantly transformed DNT testing by introducing a more nuanced, efficient, and comprehensive approach to evaluating the effects of chemicals on neural development. These methods leverage automated imaging and analysis to measure multiple biological parameters within cells, offering a profound leap in the ability to assess functional endpoints critical for DNT testing, such as neurite outgrowth and electrophysiology.

Enhanced efficiency and throughput: HCS methods enable the rapid and efficient processing of moderate to large numbers of chemicals, essential for the development of high-throughput DNT testing strategies. This capability is crucial given the vast number of chemicals in the environment that have not been tested for neurotoxicity due to the time-consuming and resource-intensive nature of in vivo DNT testing.

Multiparametric analysis: One of the key strengths of HCS is its ability to simultaneously measure multiple parameters within the same assay, providing a more comprehensive understanding of neurotoxic effects. This multiplexing capability allows the assessment of various aspects of neuronal health, including cell viability, neurite outgrowth, synaptic function, and cellular signaling pathways, within a single experiment (Li and Xia, 2019).

Improved sensitivity and specificity: The automated nature of HCS, combined with advanced image analysis algorithms, can enhance the sensitivity and specificity of DNT testing. High-content methods can detect subtle changes in neuronal morphology and function that may be indicative of neurotoxicity, even at low doses of chemicals (Schmuck et al., 2017; Persson and Homberg, 2016). This sensitivity is critical for identifying potential neurotoxicants that may not produce overt toxicity but could still have significant impacts on neural development and function.

Application to complex models: HCS methods are compatible with complex in vitro models, including 3D organoid cultures and human iPSC-derived neuronal models (Fritsche et al., 2018). These advanced models more closely mimic human neural development and disease, enhancing the relevance of DNT testing to human health. High-content methods allow the detailed analysis of these complex models, providing insights into the mechanisms of neurotoxicity and the potential for developmental disorders (Schmuck et al., 2017).

Challenges and future directions: Despite the advantages of HCS in DNT testing, challenges remain. These include the need for standardized protocols and validation of HCS methods for regulatory acceptance. Additionally, the complexity of data generated by high-content methods requires sophisticated bioinformatics tools for analysis and interpretation ( Li and Xia, 2019). The integration of HCS with emerging technologies, such as machine learning (ML) and artificial intelligence (AI), holds promise for addressing these challenges. These technologies can enhance the analysis of complex datasets, improve the predictive power of DNT testing, and facilitate the identification of novel neurotoxicants (Schmuck et al., 2017).

In conclusion, HCS methods have revolutionized DNT testing by providing a more efficient, sensitive, and comprehensive approach to evaluating the neurotoxic potential of chemicals. As these methods continue to evolve and integrate with advanced computational tools, they will play an increasingly important role in protecting human health from the adverse effects of environmental chemicals.

The concept of “key characteristics” , properties of chemicals and other agents that confer potential hazard, was first developed for carcinogens and was based on properties of known human carcinogens as classified by the International Agency for Research on Cancer (IARC). These key characteristics of carcinogens were applied in the evaluation of diverse carcinogens and are now used as the basis for the evaluation of mechanistic data at IARC. Recently, the key characteristics of male and female reproductive toxicants (Arzuaga et al., 2019; Luderer et al., 2019) and of endocrine disrupting chemicals (La Merrill et al., 2020; Cediel-Ulloa et al., 2022) were described, and those for other toxicant areas are in development. A (developmental) neurotoxicity working group met at UC Davis on September 17-18, 2019, to develop key criteria for DNT. Pamela Lein, UC Davis, and Thomas Hartung, Johns Hopkins, co-chaired the meeting which was hosted by Martyn Smith (UC Berkeley) and Lauren Zeise (OEHHA, CalEPA). The group examined the literature and developed 12 key characteristics, considering neurotoxicity both during development and in later life. They are currently refining the key characteristics in a series of follow-up teleconference calls and preparing a manuscript for publication.

AI has significantly transformed DNT testing, offering innovative approaches to understanding and predicting the neurotoxic effects of chemicals and drugs. This transformation is evident in several key areas, including the enhancement of predictive models, the integration with complex biological systems, and the improvement of data analysis and interpretation.

Enhanced predictive models: AI, particularly ML, has been instrumental in developing predictive models for DNT testing in the context of the ongoing ONTOX project (Vinken et al., 2021, see below). These models can analyze vast datasets, identifying patterns and relationships that may not be apparent using traditional analysis methods. For instance, a study demonstrated the use of ML to predict in vitro neurotoxicity induced by nanoparticles, highlighting the potential of non-testing approaches in hazard assessment (Furxhi and Murphy, 2020). By leveraging features such as exposure dose, duration, and cell type, AI models can provide a more nuanced understanding of neurotoxicity risks.

Integration with complex biological systems: AI’s ability to handle complex, high-dimensional data makes it particularly suited to integrating with advanced biological systems used in DNT testing, such as human iPSC-derived neural constructs (Schwartz et al., 2015). These systems can model human neurodevelopment more accurately than animal models, but they generate large amounts of data that can be challenging to analyze. AI can process and interpret this data, identifying key indicators of neurotoxicity and
enhancing the relevance of DNT testing to human health. We have discussed earlier the opportunities of modeling MPS by computational approaches (Smirnova et al., 2018).

Improvement of data analysis and interpretation: HCS, which generate large volumes of data on cellular responses to chemicals, have become a cornerstone of modern DNT testing (Shafer, 2019). AI algorithms can analyze these data efficiently, extracting meaningful insights on neurotoxic effects. For example, AI has been used to map drug-induced neuropathy through in situ motor protein tracking, combining imaging data with ML for a more accurate assessment of neurotoxicity (Yi et al., 2021).

Challenges and future directions: Despite these advances, challenges remain in the application of AI to DNT testing. These include the need for large, high-quality datasets for training AI models, the interpretation of AI-generated predictions, and the integration of AI approaches into regulatory frameworks (Fritsche et al., 2017). Addressing these challenges will require continued collaboration between toxicologists, data scientists, and regulatory bodies.

AI has the potential to revolutionize DNT testing by enhancing the predictive accuracy of neurotoxicity assessments, enabling the integration of complex biological data, and improving the efficiency of data analysis. As AI technologies continue to evolve, they will play an increasingly important role in identifying neurotoxic risks and protecting human health.

The EU ONTOX project (Vinken et al., 2021), funded by Horizon 2020, is at the forefront of leveraging AI for DNT testing (beside liver and kidney toxicity) and broader chemical risk assessments without the use of animal testing. By focusing on the development of non-animal new approach methodologies (NAMs) and probabilistic risk assessment, ONTOX aims to align with -century toxicity testing principles. A key aspect of the project involves addressing the acceptance and validation of AI in risk assessment, as highlighted during the first ONTOX Stakeholder Network Meeting held in March 2023 (Diemar et al., 2024). This meeting brought together various stakeholders, including regulatory authorities, companies, academia, and non-governmental organizations, to discuss the challenges and opportunities associated with implementing AI-driven NAMs and probabilistic risk assessment. The discussions underscored the need for capacity building, sustainability, and regulatory acceptance of AI technologies in the context of ensuring consumer safety and advancing chemical risk assessment methodologies. The ONTOX project’s efforts to integrate AI into DNT testing and chemical risk assessment represent a significant step towards reducing reliance on animal testing while enhancing the accuracy and efficiency of toxicity evaluations (Diemar et al., 2024).

In summary, these advanced biotechnological tools have enabled the creation of more relevant and efficient in vitro models for DNT testing. They have the potential to provide mechanistic insights into how chemicals affect neurodevelopment, which is

crucial for the development of ITS that can ultimately reduce the need for animal testing.

The consensus report on the future of animal-free systemic toxicity testing, which emerged from expert workshops convened by CAAT-Europe, outlined a general strategy for animal-free test approaches (Basketter et al., 2012; Leist et al., 2014). This strategy was informed by the US National Research Council’s vision for toxicity testing in the century (NRC, 2007), which advocated for a shift towards more human-relevant, non-animal methods.

The early discussions and recommendations for animal-free systemic toxicity testing laid the groundwork for the development of ITS. These strategies were envisioned to provide a more effective approximation of regulatory information needs than standalone assays. ITS are designed to integrate various information sources, including in vitro assays, in silico models, and human biomonitoring data, to predict the toxicity of substances. This integration is facilitated by computational tools such as Bayesian networks and ML. Bayesian networks are probabilistic models that can combine data from different sources and account for uncertainties, providing a structured approach to integrating evidence and making predictions. ML, on the other hand, can analyze large datasets to identify features that are predictive of toxicity outcomes, improving the accuracy and efficiency of toxicity predictions.

The promise of ITS lies in their ability to approximate the information that would otherwise be obtained from animal testing, but in a more human-relevant and ethical manner. By leveraging emerging tools for data integration, ITS can provide a more comprehensive assessment of potential toxicants, considering various factors such as toxicokinetics, hazard testing, and the mapping of information along AOPs (Leist et al., 2014).

The development of ITS represents a significant advance in the field of toxicology, aiming to reduce the reliance on animal testing while still meeting the regulatory requirements for safety assessment. As these strategies continue to evolve, they are expected to become an integral part of the regulatory landscape, providing a more efficient and ethically responsible approach to toxicity testing.

The concept of AOPs (Willet, 2018) has become a cornerstone in the rational design of ITS for DNT testing. This framework is instrumental in identifying specific targets and mechanisms that are critical in the development of neurotoxic effects, thereby fa-
cilitating the development of testing strategies that are both more mechanistically informed and more predictive of human health outcomes.

Importance of AOPs in ITS design for DNT testing: AOPs offer a structured approach to understanding the complex mechanisms underlying DNT, enabling researchers to pinpoint specific biological processes that can be targeted for testing. By mapping out the sequence of events that leads to adverse neurodevelopmental outcomes, AOPs help in identifying relevant biomarkers and endpoints that can be incorporated into ITS (Hernández-Jerez yet al., 2021; Willet, 2018). This mechanistic understanding is crucial for developing assays that are not only sensitive to specific neurotoxic effects but also relevant to human health.

Facilitating mechanistically informed testing strategies: The identification of KEs and targets within DNT AOPs has significantly contributed to the development of more mechanistically informed testing strategies. For instance, the EFSA Panel on Plant Protection Products and their Residues developed AOP-informed IATA case studies for the DNT hazard identification of pesticides like deltamethrin and flufenacet (Hernández-Jerez et al., 2021). By focusing on specific KEs identified in the AOPs, such as alterations in neural proliferation, differentiation, and synaptogenesis, these strategies can more accurately predict the potential for chemicals to cause DNT.

Enhancing predictivity with emerging tools for data integration: The integration of emerging tools for data analysis, such as Bayesian networks and ML, has further enhanced the predictivity of ITS for DNT testing. Bayesian networks, for example, allow for the probabilistic quantification of the weight of evidence across different data sources, including in vitro assays and in silico models, within the AOP framework. ML algorithms can analyze complex datasets from high-throughput screening assays to identify patterns and predict outcomes based on identified KEs (Zhang et al., 2023). These computational tools enable the integration of diverse data types, improving the ability of ITS to approximate regulatory information needs effectively.

Conclusion: The development and application of AOPs in the design of ITS for DNT testing represents a significant advance in the field of toxicology. The currently available AOPs for DNT, however, are relatively few: Data retrieved from AOP-Wiki on 24 Mar 2024 list eight AOPs (#6, #12, #13, #17, #31, #54, #499, #500), of which five are endorsed by OECD’s WPHA/WNT . It will take a community effort to expand this, to combine it to a network (Pistollato et al., 2020; Sachana et al., 2021b; Spînu et al., 2022; Pitzer et al., 2023), and to make it the basis of a testing strategy. By providing a structured framework to understand the mechanistic basis of neurotoxicity, AOPs can facilitate the development of testing strategies that are not only more informed by the underlying biology but also more predictive of human health outcomes. The integration of advanced computational tools for data analysis further enhances the capacity of ITS to provide com-

prehensive and reliable assessments of potential neurotoxicants, moving towards more effective and human-relevant toxicological evaluations.

The 2014 conference represented a turning point toward regulatory engagement. Here, we wish to highlight the involvement of regulatory agencies (EPA, EFSA, OECD) and the development of the guidance documents that emerged from these collaborations. In parallel to agencies embracing the technological developments, the concepts for tackling DNT developed further with this discussion, moving more toward implementation and regulatory use (Bal-Price et al., 2018b).

The International STakeholder NETwork (ISTNET), which took place in 2014 in Zurich, Switzerland, helped to define how to bring all the technical developments into a regulatory context. The workshop was sponsored by EPAA (The European Partnership for Alternatives to Animal Testing), CAAT, and SCAHT (Swiss Centre for Applied Human Toxicology).

The ISTNET meeting (Crofton et al., 2014; Bal-Price et al., 2015b) focused on the concept of AOPs as a promising tool to promote the development of test systems aligned with regulatory needs. AOPs were considered crucial for assembling predictive ITS for DNT. A stepwise approach to AOP-based DNT testing was outlined, starting with incomplete AOPs for compound grouping and focusing on KEs of neurodevelopment. The next steps included applying the AOP concept to regulatory DNT testing, using AOP intersections for economic development of screening assays, and transitioning from qualitative descriptions to quantitative network modeling.

The report also highlighted the importance of communication and discussions between stakeholders – regulators, industry, and academia – to define a regulatory need-driven roadmap for an ITS for DNT. It acknowledged the limitations of current animal-based test methods, advocating for in vitro/in silico modeling approaches to provide value-added data for regulatory purposes. These approaches were expected to reduce animal testing, lower costs, and increase testing efficiency by using HTS to estimate environmental hazards to human health.

The ISTNET meeting concluded that alternative approaches such as in vitro test methods, quantitative structure-activity relationships (QSARs), read-across, and the application of the concepts of KNDP, AOP, and toxicity endophenotypes could meet regulatory requirements for DNT testing. The main focus of the meeting was increasing the use of alternative data sources in DNT risk assessment and risk management decisions.

In summary, the article by Bal-Price et al. (2015b) advanced the concepts of DNT testing by promoting the use of AOPs to guide the development of ITSs, advocating for the integration of in vitro
and in silico methods into regulatory frameworks, and emphasizing the need for a collaborative approach among stakeholders to address the challenges in DNT testing.

The workshop played a pivotal role in integrating EFSA and the OECD into the development of animal-free systemic toxicity testing strategies, including DNT testing. These discussions laid the groundwork for future activities aimed at integrating AOP-based ITS into regulatory decision-making processes for chemical safety assessment. The contributions of EFSA and OECD to these activities have been significant, providing scientific expertise and regulatory perspectives that are essential for the acceptance and implementation of animal-free testing strategies. Their activities have helped to advance the field of DNT testing by promoting the development of more predictive, efficient, and ethically responsible testing strategies that better reflect human health outcomes: EFSA and the OECD have been actively involved in advancing the field of DNT testing, such as the development of non-animal test methods and IATA for DNT. The OECD has coordinated international efforts to enhance DNT testing, acknowledging the limited historical use of in vivo DNT test guidelines. Workshops over the past decade have led to a consensus among stakeholders on the need for a DNT testing battery based on in vitro endpoints and alternative species assays. The OECD initiated specific activities, including collating available DNT in vitro methods, forming a DNT testing battery, generating a reference set of chemicals for testing, and developing an OECD guidance document including IATA case studies (Sachana et al., 2019). These case studies aimed to assess the applicability of the DNT IVB (Blum et al., 2023) in the regulatory risk assessment of pesticides. The approach included systematic literature reviews, expert knowledge elicitation, and Bayesian network analysis to integrate evidence within the AOP framework.

The OECD/EFSA workshop on DNT in October 2016 (Fritsche et al., 2017) made significant progress towards advancing the use of alternative, non-animal test methods for regulatory purposes. Key points of consensus reached by the diverse group of international stakeholders included:

The review by Schmidt et al. (2016) presents a comprehensive overview of the progress and technical possibilities in in vitro neurotoxicity and DNT screening, emphasizing the urgent need for alternative testing methods due to challenges in extrapolating animal data to humans and the limited capacity of animal testing to cover all substances requiring evaluation. The paper discusses various cellular platforms used in neurotoxicity testing, ranging from animal and human cell lines to advanced human hiPSCs and organ-on-a-chip models, highlighting their respective advantages and limitations. It covers common endpoints of neurotoxicity testing, including cell viability, neurite outgrowth, synaptic function, and electrophysiological properties, among others. Furthermore, it explores analytical methods such as high-content imaging and electrophysiological screens to assess these endpoints. The review underscores the importance of integrating multiple cellular models and endpoints to capture the complexity of neurotoxic effects and advocates for the development of ITS and multi-omics approaches to improve prediction models for assessing chemical hazard potential. This work contributes significantly to the field by outlining the current state, challenges, and future directions for in vitro neurotoxicity and DNT screening, promoting the shift towards more human-relevant, efficient, and ethical testing methods.

The workshop and resulting paper by Aschner et al. (2017) addressed the critical gap in information regarding the DNT hazard posed by industrial and environmental chemicals. Recognizing that future testing approaches will likely involve a battery of alternative and complementary tests, the paper focused on the first generation of alternative DNT tests that target fundamental neurodevelopmental processes, such as neuronal differentiation, precursor cell migration, or neuronal network formation. These processes are crucial as they capture toxicants with diverse targets and modes of action and can be linked to toxicity endophenotypes, which are alterations in neural connectivity leading to neurofunctional deficits in humans. The workshop that led to the review defined criteria for selecting positive/negative controls, prepared recommendations for their use, and initiated the setup of a directory of reference chemicals. Over 50 endpoint-specific control compounds were identified for initial technical optimization of tests, and an additional set of 33 chemicals, considered direct DNT toxicants, was proposed for further test development.

We next assessed test readiness in a subsequent workshop and developed a list of reference compounds: Bal-Price et al. (2018a) presents a major conceptual advance in providing a framework to evaluate the readiness of NAMs for DNT testing for regulatory purposes. A set of readiness criteria and a scoring system to as-
sess the readiness of individual DNT in vitro assays as well as the overall DNT in vitro battery (DNT IVB) for various regulatory applications were put forward. This allows a quantitative assessment of the status of assay development and what further work is needed to increase regulatory confidence in these alternative methods. The approach outlined provides a role model for evaluating alternative methods in other fields of toxicology. Key elements include: 1) defining readiness criteria based on the regulatory need and context of use, 2) quantitative scoring of assay readiness based on multiple defined criteria, 3) evaluating the battery of assays as a whole in terms of biological coverage, predictive performance, and overall readiness for different regulatory uses, and 4) using case studies to demonstrate how the alternative methods can be applied in an IATA. This framework allows a transparent and objective evaluation of NAMs to facilitate their regulatory acceptance and use. While more work is needed to fully validate the DNT IVB (Juberg et al., 2023), the strategy presented was an important step forward in advancing the use of alternative methods for safety testing.

The US EPA held a public meeting of the FIFRA Scientific Advisory Panel on September 15-17, 2020, to review the use of NAMs to derive extrapolation factors and evaluate DNT for human health risk assessment . Key points included :

c. The influence of chemical-induced systemic changes (e.g., inflammation, oxygen levels and distribution)
d. The influence of maternal factors (maternal infection, hormonal, organ system dysfunction, placenta integrity)
In addition, it was stated that the in vitro assays:
a. Will be limited in their ability to detect adaptive or compensatory processes.
b. Do not account for critical cell-cell interactions required during neurodevelopment.
c. Have difficulty distinguishing between neuroactive and neurotoxic compounds.
d. Do not reflect human genetic diversity when using human cell lines from one human.”

An OECD expert group for in vitro DNT testing was created in 2017. The outcome of this was the proposal to develop, in essence, an IATA. The OECD calls it an IATA – we recently called it invivitrosi – in vitro, in vivo, and in silico combined (Caloni et al., 2022).

An important contribution was a report commissioned by EFSA: Crofton and Mundy (2021) provide guidance on the interpretation and use of data generated from assays currently included in the DNT IVB for regulatory purposes. Their report has the following key points:

Screening takes an increasingly larger role in DNT, driven, e.g., by large screening and prioritization programs of the US EPA or the NTP/NIEHS, and by the availability of more, better, and more robust high-throughput assays in cells, organoids, and simple organ-
isms. Screening is a scientific discipline developed in drug discovery, and a lot of experience has been collected that was incorporated into a screening culture and best practices within the discipline of pharmacology. In toxicology, the technology has been adopted and adapted, but the culture is lagging behind. Often, the distinction between a screen hit and a potential toxicant is not clear and needs further clarification for efficient use of this approach for DNT testing. The pharmacological terminology is as follows: screens produce “preliminary positives” in the respective assay. After a confirmation under more controlled conditions, they can be called “confirmed positives”. They need to be filtered, e.g., for technical artifacts, or secondary effects due to cytotoxicity. In many pharmacological screens this eliminates of the screen, and only few “true positives” remain. These survivors are usually further tested in secondary assays. If they survive this step, then one can talk of potentially interesting assay hits and one can formulate the hypothesis that these are potential toxicants (see Fig. 3).

This hypothesis then needs to be further evaluated to call compounds “relevant toxicological hits”. The evaluation is a process that either disproves the hypothesis or gathers evidence that increases the plausibility of the hypothesis to be true. Important factors in this are similarity to other well-known toxicants or a known mechanism that feeds into an AOP, in addition to toxicokinetic behavior likely to lead to target occupancy at relevant exposures. In the absence of a strong structural similarity argument or mechanistic plausibility, the relevance is often hard to evaluate and requires extremely relevant and predictive DNT assays. Exemplary publications of this process are based on a neural crest migration assay and polychlorinated biphenyls as preliminary hits (Nyffeler et al., 2018) or a neurite outgrowth assay (Krug et al., 2013b) and berberine as hit compound (Suciu et al., 2023b). A very recent example is a screen of 1800 ToxCast compounds for toxicity to developing oligodendrocytes. The extensive hit characterization and toxicological follow-up was necessary to profile, e.g., quaternary amine-based amphiphilic compounds as a new class of potential DNT toxicants (Cohn et al., 2024).

One of the primary challenges is the need for further validation of alternative DNT methods. While a large number of in vitro and in silico models have been developed and shown to be promising predictors of DNT, most of these methods have not yet undergone the rigorous validation process required for regulatory acceptance. Traditional validation involves demonstrating the reproducibility, predictivity, and relevance of a test method for its intended purpose, typically through a series of inter-laboratory studies using a standardized protocol and a set of diverse reference chemicals. This process can be time-consuming and resource-intensive, requiring collaboration among multiple stakeholders, including test method developers, validation bodies, and regulatory agencies. This concept of validation is outdated, as it was developed for simple endpoints and for methods that by themselves (i.e., one-to-one) predict such endpoints. For methods that are part of a test battery, the principles of relevance and predictivity require a

re-definition, and the use of reference sets of chemicals is only of limited use. For DNT, the overall number of reference chemicals is too small for a classical relevance approach with a statistical prediction model (Mundy et al., 2015). More importantly, also the few reference chemicals with known DNT effects in humans or animals are mostly not well characterized for their mechanism and their mode of action. They can therefore hardly be used for mechanistic assays or KNDP assays.

To facilitate the validation of alternative DNT methods, there is a need for a clear and consensus-based framework that outlines the key steps and criteria for establishing the scientific and regulatory validity of these methods. This framework should take into
account the specific challenges and opportunities associated with DNT testing, such as the complexity of neurodevelopmental processes, the importance of considering species differences (Baumann et al., 2016) and exposure timing, and the need for a battery of complementary assays that cover different modes of action. The recently updated document by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM), “Validation, Qualification, and Regulatory Acceptance of New Approach Methodologies” describes a more flexible, fit-forpurpose validation strategy with emphasis on integrating results from multiple NAMs rather than one-to-one replacement. DNT is described as one endpoint example where such a strategy will be

important and hopefully speed up the process. Efforts to implement such a framework are ongoing, as exemplified by the work of the OECD’s DNT Expert Group and the collaborative workshops organized by CAAT, ICCVAM, ECVAM, and other stakeholders. Possibly, the concept needs to be even more radically revised for some assays, i.e., not relying at all on classical reference chemicals but rather on mechanistic validation concepts (Hartung et al., 2013b).

Another challenge is the integration of new technologies, such as HTS, omics approaches, and computational modeling, into regulatory DNT testing strategies. While these technologies offer the potential for more rapid, efficient, and mechanistically informative testing, their application in a regulatory context raises several issues related to data quality, interpretability, and relevance. For example, HTS assays may generate large amounts of data on the effects of chemicals on specific molecular or cellular endpoints, but the relationship between these effects and AOs in the developing brain may not always be clear. Similarly, omics approaches, such as transcriptomics (Krug et al., 2013a; Rempel et al., 2015) and metabolomics (Modafferi et al., 2021), can provide a wealth of information on the biological pathways and processes perturbed by chemical exposure, but translating this information into actionable regulatory decisions may require additional steps, such as the development of quantitative AOPs and the establishment of thresholds for adverse effects.

To address these challenges, there is a need for ongoing dialogue and collaboration between the developers of new technologies, the regulatory agencies responsible for implementing DNT testing requirements, and the broader scientific community. This dialogue should aim to identify the key data needs and decisionmaking criteria for regulatory DNT testing, and to develop a roadmap for the progressive integration of alternative methods and new technologies into regulatory frameworks. This may involve the development of tiered testing strategies that combine in vitro, in silico, and in vivo approaches in a way that balances the need for efficiency and predictivity with the requirements for regulatory certainty and human health protection.

Looking ahead, there are also significant opportunities for improving the predictivity and efficiency of DNT testing through advances in data integration and ML. One promising approach is the development of ITS that combine multiple types of data, such as in vitro assay results, physicochemical properties, and in silico predictions, to provide a more comprehensive and reliable assessment of DNT potential. By leveraging the strengths of different data streams and taking into account the uncertainties and limitations associated with each, ITS can potentially provide a more accurate and efficient means of prioritizing chemicals for further testing and informing regulatory decisions.

The development of ITS for DNT testing can be facilitated by advances in ML and AI (Kleinstreuer and Hartung, 2024), which offer powerful tools for integrating and analyzing large and complex datasets. ML algorithms, such as random forests, support vector machines, and deep neural networks, can be trained on ex-
isting DNT data to identify patterns and relationships that may not be apparent from traditional statistical analyses. These models can then be used to predict the DNT potential of new chemicals based on their structural and biological similarity to known toxicants, or to identify the most informative combinations of assays and endpoints for a given regulatory context.

As more data become available from alternative DNT testing methods and other sources, such as high-throughput screening programs and academic research, there will be increasing opportunities to refine and optimize ITS using ML approaches. This could involve the continuous updating of predictive models as new data are generated, the identification of novel biomarkers and endpoints that are more predictive of AOs, and the development of more sophisticated decision-making frameworks that take into account multiple lines of evidence and sources of uncertainty.

To fully realize these opportunities, however, there is a need for greater standardization and harmonization of DNT testing methods and data reporting practices. This includes the development of common ontologies and data formats for describing neurodevelopmental processes and endpoints, the establishment of minimum reporting standards for in vitro and in silico DNT studies, and the creation of centralized and publicly accessible databases for storing and sharing DNT data. Efforts to promote such standardization and harmonization are already underway, as exemplified by the work of the OECD’s Extended Advisory Group on Molecular Screening and Toxicogenomics (EAGMST) and the collaborative projects funded by the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program.

In conclusion, while significant progress has been made in developing alternative approaches for DNT testing, there remain important challenges to be addressed in terms of method validation, regulatory acceptance, and data integration. At the same time, there are exciting opportunities for leveraging advances in ML and AI to improve the predictivity and efficiency of DNT testing, and to support the development of more effective and scientifically sound regulatory strategies for protecting human health. By working together to address these challenges and opportunities, the scientific and regulatory communities can help to ensure that the promise of alternative DNT testing is fully realized, and that the safety of chemicals is assessed in a way that is both rigorous and efficient and that reflects the best available science.

Implementing advanced testing strategies for DNT in regulatory and research contexts presents several challenges. While ITS offer a promising approach to approximate regulatory information needs more effectively, their adoption is hindered by various factors. One of the main challenges is the complexity of DNT itself, with a multitude of KEs and targets that need to be covered by the building blocks of an ITS. The design of ITS is ideally based on established mechanisms of health effects, such as AOPs, but the small number of studies leading to regulatory decisions in DNT limits this approach.

Moreover, the integration of emerging tools for data integration, including Bayesian networks, ML tools, and sensitivity analysis, is essential for the continuous optimization of ITS. However, the practical application of these tools in a regulatory context is still in its infancy, and there is a need for further development and validation of these methods. Additionally, the current regulatory frameworks may not be fully equipped to accommodate the novel approaches that ITS and AOPs represent, requiring updates and adaptations to existing guidelines and practices.

The challenges extend to the quality assurance of non-animal tests, where Good Cell Culture Practices (GCCP) (Pamies et al., 2022) and the concept of “mechanistic validation” (Hartung et al., 2013b) are critical to ensure the reliability of the results. However, establishing these quality standards and gaining widespread acceptance can be a slow and complex process. Furthermore, the interpretation of DNT study results requires a substantial amount of expertise, and there is considerable flexibility in the study design, which introduces potential sources of variability.

In summary, while the strategic development of pathway-based approaches to DNT testing is underway, the implementation of these advanced strategies faces challenges related to the complexity of DNT, the need for further development and validation of data integration tools, the adaptation of regulatory frameworks, and the establishment of quality standards for non-animal tests.

The potential of advanced technologies in DNT testing extends far beyond merely replacing animal models; it opens new avenues for understanding the intricacies of neurodevelopmental disorders and toxicology as envisioned in a human exposome project (Hartung, 2023b). The integration of organotypic cultures, stem cells, highcontent methods, and computational modeling offers a more nuanced and human-relevant approach to studying the effects of environmental chemicals on neurodevelopment. These technologies enable researchers to explore the cellular and molecular mechanisms underlying DNT, providing insights into the etiology of disorders such as ASD and ADHD. Furthermore, the development of AOPs and ITS based on these technologies facilitates a more systematic and predictive assessment of chemical risks. By harnessing the power of -century technologies, the field of toxicology is poised to make significant strides in protecting public health, reducing reliance on animal testing, and uncovering new knowledge about the complex processes that govern neurodevelopment and its disruption by environmental factors (Smirnova et al., 2014).

We have tremendous problems to find an exposure hypothesis for all these diseases. We also have tremendous problems to find a genetic hypothesis for all of them. The explanation for this may be very simple: gene-environment interaction. One of the biggest limitations of the current test battery is the lack of consideration of population variability as the cells are likely from typically developed donors. Therefore, it would be interesting to include assays with cells from different genetic backgrounds, e.g., from autistic children, to increase the possibility to assess gene interactions with these exposures.

AI, including the use of large language models and predictive toxicology, promises to enhance DNT testing strategies. In ON-

TOX, one of the three targets is DNT, which brings a lot of very important elements into the discussion. The first is exploiting large language models in order to extract all of the available information. One of the most important goals is for the data from our DNT community to be made available for extraction. The data need to be brought together, annotated with metadata, so that it is possible to actually feed them into these models. The second part that ONTOX is addressing is essentially using the foundational model of read-across-based structure-activity relationships to enter these additional endpoints. This shall not be done in isolation like a QSAR, where DNT data would be used to predict DNT, but shall include everything we know about the connections among these chemicals. For example, simple addition of some data on androgen receptor activity led to accurate predictions of substances (unpublished); the addition of cancer data from REACH registrations or reproductive toxicity data from REACH for about 1000 substance was correctly predicted. So, there is a lot of promise in integrating DNT data into large foundational models for predictive toxicology. And finally, AI is helping us to understand what is contributing to the correct information. What are the important information sources – the evidence streams? This will help to prioritize assays that can tell us what the value of the in vivo information is and that can distinguish between valuable and less valuable information (Hartung, 2023a). This allows a type of sensitivity analysis, and can even be used to generate economic information, where you can ask whether it is worthwhile to do a certain assay and whether its results will really change the overall assessment because we know whether this assay is of high or low information value. We cannot overestimate at this moment, what integration of knowledge by AI will give us. We may end up accepting it as a copilot and receive its guidance to drive the further development of the DNT battery.

The concept of organoid intelligence (OI) and its potential to advance our understanding of neurodevelopment and toxicology is worth some consideration in this context. We have introduced the idea of simple forms of memory and learning as the ultimate functionality of brain organoids (Smirnova et al., 2023a,b). This combines technologies, i.e., the organoids and AI; essentially we are trying to talk to a brain organoid through AI. This is possible because organoids are electrophysiologically active and receptive. OI, as a type of intelligence-in-a-dish, promises to study toxicants and possible repairs by working on brain organoids from patient material. We are forming a community around this (Morales Pantoja et al., 2023a; Hartung et al., 2023), which includes important ethical discussions (Hartung et al., 2024).

Summarizing the impact of the strategic development of alternatives to animal testing for DNT, this field has benefited tremendously from the collaborative efforts of researchers, regulators, and industry stakeholders. The past two decades have seen a remarkable advance in our scientific understanding of neurodevelopmental processes and the mechanisms by which chemicals can interfere with these processes to cause AOs. This knowledge
has been leveraged to develop a wide range of alternative testing methods, including in vitro cell culture models, non-mammalian animal models, and computational approaches that offer the potential for a more rapid, efficient, and mechanistically informative assessment of DNT potential.

The development of these alternative methods has been driven by a recognition of the limitations of traditional animal-based testing paradigms, which are resource-intensive, time-consuming, and may not always be predictive of human health outcomes. By focusing on the key events and pathways that underlie neurodevelopment and its perturbation by chemicals, alternative methods have the potential to provide a more targeted and relevant assessment of DNT potential, while also reducing the reliance on animal testing. This shift towards a more mechanistically based and human-relevant testing paradigm represents a major advance in the field of DNT testing and reflects a broader trend in toxicology towards the use of alternative methods that are in line with the principles of the 3 Rs.

The impact of this strategic development extends beyond scientific and ethical dimensions. By providing more rapid and efficient means of assessing DNT potential, alternative methods have the potential to significantly accelerate the pace of chemical safety assessment and support more effective regulatory decision-making. This is particularly important given the large number of chemicals in commerce that have not been tested for DNT potential and the growing recognition of the importance of protecting the developing brain from environmental chemical exposures. By enabling the prioritization of chemicals for further testing and providing a more comprehensive and reliable assessment of DNT potential, alternative methods can help to ensure that regulatory decisions are based on the best available science and are protective of human health.

The development of alternative methods for DNT testing has been a collaborative effort, involving contributions from researchers in academia, government, and industry, as well as from regulatory agencies and other stakeholders. This collaboration has been essential for ensuring that the methods developed are not only scientifically valid and relevant, but also practical and implementable within a regulatory context. The establishment of networks and forums for the exchange of knowledge and ideas, such as the DNT Workgroup and the series of DNT conferences organized by CAAT and its partners, has been crucial in fostering this collaboration and driving the field forward.

Looking back over the past 18 years, the field of DNT testing has made remarkable progress. In 2006, when the first DNT conference was held, the field was heavily reliant on animal-based testing methods, with few alternatives available. The discussions at that conference focused on the need for more rapid and efficient testing methods, and the potential for in vitro and non-mammalian models to fill this need. Over the subsequent years, a range of alternative methods was developed and evaluated, culminating in the publication of a comprehensive review by Bal-Price et al. (2012) that identified a number of promising in vitro and alternative animal models for DNT testing.

The period from 2014 to the present has seen a rapid acceleration in the development and application of alternative methods
for DNT testing, driven in part by advances in stem cell biology, genome editing, high-throughput screening, and computational modeling. The establishment of the OECD DNT Expert Group in 2017 and the publication of the OECD’s “Initial Recommendations on Evaluation of Data from the Developmental Neurotoxicity (DNT) In Vitro Testing Battery” (OECD, 2023) marked important milestones in the regulatory acceptance of alternative methods.

Despite these advances, however, much work remains to be done to fully realize the potential of alternative methods for DNT testing. Further research is needed to optimize and validate these methods, to demonstrate their reliability and relevance for regulatory decision-making, and to integrate them into testing strategies that provide a comprehensive and efficient assessment of DNT potential. Continued collaboration among researchers, regulators, and industry stakeholders will be essential for addressing these challenges and advancing the field towards a more predictive and ethical testing paradigm.

In conclusion, the strategic development of alternatives to animal testing for DNT over the past 18 years represents a major advancement in the field of toxicology, one that has been driven by scientific innovation, regulatory need, and a commitment to more human-relevant and ethical testing approaches. While significant challenges remain, the progress made to date is a testament to the dedication and collaboration of the many stakeholders involved in this effort. By continuing to work together to refine and validate alternative methods for DNT testing, we can move towards a future in which the safety of chemicals is assessed in a way that is both scientifically rigorous and ethically sound, and that truly protects the health of our most vulnerable populations. What we have seen over the last two decades is a scientific revolution. For the first time, an example of a strategic development by a community led to the development of a testing strategy that is completely novel in its approach. It is a testing strategy composed of different components, it is mechanism-based, and it has undergone an international consensus process. These are all criteria we should apply to more areas, especially to animal experimentation. The combination of these disruptive technologies will lead us to far more than just replacing animal tests. We can do things we did not dream of when we started out. The challenge now is implementation!

Algharably, E. A., Di Consiglio, E., Testai, E. et al. (2023). Prediction of in vivo prenatal chlorpyrifos exposure leading to developmental neurotoxicity in humans based on in vitro toxicity data by quantitative in vitro-in vivo extrapolation. Front Pharmacol 14, 1136174. doi:10.3389/fphar.2023.1136174
Ankley, G. T., Bennett, R. S., Erickson, R. J. et al. (2010). Adverse outcome pathways: A conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment. Environ Toxicol Chem 29, 730-741. doi:10.1002/etc. 34
Arts, J. H. E., Faulhammer, F., Schneider, S. et al. (2023). Investigations on learning and memory function in extended one-generation reproductive toxicity studies – When considered needed and based on what? Crit Rev Toxicol 53, 372-384. doi:10. 1080/10408444.2023.2236134

Arzuaga, X., Smith, M. T., Gibbons, C. F. et al. (2019). Proposed key characteristics of male reproductive toxicants as an approach for organizing and evaluating mechanistic evidence in human health hazard assessments. Environ Health Perspect 127, 065001. doi:10.1289/ehp5045

Aschner, M., Ceccatelli, S., Daneshian, M. et al. (2017). Selection of reference compounds for characterization and development of alternative methods for developmental neurotoxicity (DNT) testing. ALTEX 34, 49-74. doi:10.14573/altex. 1604201
Bal-Price, A., Hogberg, H. T., Buzanska, L. et al. (2010). In vitro developmental neurotoxicity (DNT) testing: Relevant models and endpoints. Neurotoxicology 31, 545-554. doi:10.1016/j. neuro.2009.11.006
Bal-Price, A. K., Coecke, S., Costa, L. et al. (2012). Advancing the science of developmental neurotoxicity (DNT): Testing for better safety evaluation. ALTEX 29, 202-215. doi:10.14573/ altex.2012.2.202
Bal-Price, A., Crofton, K. M., Sachana, M. et al. (2015a). Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol 45, 83-91. doi:10.3109/10408444.2014.981331
Bal-Price, A., Crofton, K. M., Leist, M. et al. (2015b). International STakeholder NETwork (ISTNET): Creating a developmental neurotoxicity (DNT) testing road map for regulatory purposes. Arch Toxicol 89, 269-287. doi:10.1007/s00204-015-1464-2
Bal-Price, A. and Meek, M. E. (2017). Adverse outcome pathways: Application to enhance mechanistic understanding of neurotoxicity. Pharmacol Ther 179, 84-95. doi:10.1016/j. pharmthera.2017.05.006
Bal-Price, A., Hogberg, H. T., Crofton, K. M. et al. (2018a). t workshop report: Recommendation on test readiness criteria for new approach methods in toxicology: Exemplified for developmental neurotoxicity. ALTEX 35, 306-352. doi:10.14573/ altex. 1712081
Bal-Price, A., Pistollato, F., Sachana, M. et al. (2018b). Strategies to improve the regulatory assessment of developmental neurotoxicity (DNT) using in vitro methods. Toxicol Appl Pharmacol 354, 7-18. doi:10.1016/j.taap.2018.02.008
Basketter, D. A., Clewell, H., Kimber, I., et al. (2012). A roadmap for the development of alternative (non-animal) methods for systemic toxicity testing. ALTEX 29, 3-89. doi: 10.14573/altex. 2012.1.003

Baumann, J., Gassmann, K., Masjosthusmann, S. et al. (2016). Comparative human and rat neurospheres reveal species differences in chemical effects on neurodevelopmental key events. Arch Toxicol 90, 1415-1427. doi:10.1007/s00204-015-1568-8
Bellanger, M., Demeneix, B. A., Grandjean, P. et al. (2015). Neurobehavioral deficits, diseases, and associated costs of exposure to endocrine-disrupting chemicals in the European Union. J Clin Endocrinol Metab 100, 1256-1266. doi:10.1210/ jc.2014-4323
Blaauboer, B. J., Boekelheide, K., Clewell, H. J. et al. (2012). The use of biomarkers of toxicity for integrating in vitro hazard estimates into risk assessment for humans. ALTEX 29, 411-425. doi:10.14573/altex.2012.4.411
Blum, J., Masjosthusmann, S., Bartmann, K. et al. (2023). Establishment of a human cell-based in vitro battery to assess developmental neurotoxicity hazard of chemicals. Chemosphere

311, 137035. doi:10.1016/j.chemosphere.2022.137035
Boyle, J., Yeter, D., Aschner, M. et al. (2021). Estimated IQ points and lifetime earnings lost to early childhood blood lead levels in the United States. Sci Total Environ 778, 146307. doi:10.1016/j. scitotenv.2021.146307
Butera, A., Smirnova, L., Ferrando-May, E. et al. (2023). Deconvoluting gene and environment interactions to develop “epigenetic score meter” of disease. EMBO Mol Med 15, e18208. doi:10.15252/emmm. 202318208
Caloni, F., De Angelis, I. and Hartung, T. (2022). Replacement of animal testing by integrated approaches to testing and assessment (IATA): A call for in vivitrosi. Arch Toxicol 96, 1935-1950. doi:10.1007/s00204-022-03299-x
Cediel-Ulloa, A., Lupu, D. L., Johansson, Y. et al. (2022). Impact of endocrine disrupting chemicals on neurodevelopment: The need for better testing strategies for endocrine disruption-induced developmental neurotoxicity. Expert Rev Endocrinol Metab 17, 131-141. doi:10.1080/17446651.2022.2044788
Chesnut, M., Hartung, T., Hogberg, H. T. et al. (2021a). Human oligodendrocytes and myelin in vitro to evaluate developmental neurotoxicity. Int J Mol Sci 22, 7929. doi:10.3390/ ijms22157929
Chesnut, M., Paschoud, H., Repond, C. et al. (2021b). Human 3D iPSC-derived brain model to study chemical-induced myelin disruption. Int J Mol Sci 22, 9473. doi:10.3390/ijms22179473
Coecke, S., Goldberg, A. M., Allen, S. et al. (2007). Workgroup report: Incorporating in vitro alternative methods for developmental neurotoxicity into international hazard and risk assessment strategies. Environ Health Perspect 115, 924-931. doi:10.1289/ ehp. 9427
Cohn, E. F., Clayton, B. L. L., Madhavan, M. et al. (2024). Pervasive environmental chemicals impair oligodendrocyte development. Nat Neurosci, online ahead of print. doi:10.1038/s41593-024-01599-2
Crofton, K. M., Mundy, W. R., Lein, P. J. et al. (2011). Developmental neurotoxicity testing: Recommendations for developing alternative methods for the screening and prioritization of chemicals. ALTEX 28, 9-15. doi:10.14573/altex.2011.1.009
Crofton, K., Fritsche, E., Ylikomi, T. and Bal-Price, A. (2014). International STakeholder NETwork (ISTNET) for creating a developmental neurotoxicity testing (DNT) roadmap for regulatory purposes. ALTEX 31, 223-224. doi:10.14573/altex. 1402121
Crofton, K. M. and Mundy, W. R. (2021). External scientific report on the interpretation of data from the developmental neurotoxicity in vitro testing assays for use in integrated approaches for testing and assessment. EFSA Support Publ 18, 6924E. doi:10.2903/ sp.efsa.2021.en-6924
Diemar, M. G., Vinken, M., Teunis, M. et al. (2024). Report of the First ONTOX stakeholder network meeting: Digging under the surface of ONTOX together with the stakeholders. Altern Lab Anim 52, 117-131. doi:10.1177/02611929231225730
Fritsche, E., Crofton, K. M., Hernandez, A. F. et al. (2017). OECD/ EFSA workshop on developmental neurotoxicity (DNT): The use of non-animal test methods for regulatory purposes. ALTEX 34, 311-315. doi:10.14573/altex. 1701171
Fritsche, E., Barenys, M., Klose, J. et al. (2018). Current availability of stem cell-based in vitro methods for developmental neu-
rotoxicity (DNT) testing. Toxicol Sci 165, 21-30. doi:10.1093/ toxsci/kfy178
Furxhi, I. and Murphy, F. (2020). Predicting in vitro neurotoxicity induced by nanoparticles using machine learning. Int J Mol Sci 21, 5280. doi:10.3390/ijms21155280
Gaylord, A., Osborne, G., Ghassabian, A. et al. (2020). Trends in neurodevelopmental disability burden due to early life chemical exposure in the USA from 2001 to 2016: A population-based disease burden and cost analysis. Mol Cell Endocrinol 502, 110666. doi:10.1016/j.mce.2019.110666
Grandjean, P. and Landrigan, P. J. (2006). Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. Lancet 368, 2167-2178. doi:10.1016/S0140-6736(06)69665-7
Grandjean, P. and Landrigan, P. J. (2014). Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol 13, 330-338. doi:10.1016/S1474-4422(13)70278-3
Groot, M. W. G. M., Westerink, R. H. S. and Dingemans, M. M. L. (2013). Don’t judge a neuron only by its cover: Neuronal function in in vitro developmental neurotoxicity testing. Toxicol Sci 132, 1-7. doi:10.1093/toxsci/kfs269
Hartung, T., van Vliet, E., Jaworska, J. et al. (2012). Systems toxicology. ALTEX 29, 119-128. doi:10.14573/altex.2012.2.119
Hartung, T., Luechtefeld, T., Maertens, A. et al. (2013a). Integrated testing strategies for safety assessments. ALTEX 30, 3-18. doi:10.14573/altex.2013.1.003
Hartung, T., Stephens, M. and Hoffmann, S. (2013b). Mechanistic validation. ALTEX 30, 119-130. doi:10.14573/altex.2013.2.119
Hartung, T. and Tsatsakis, A. M. (2021). The state of the scientific revolution in toxicology. ALTEX 38, 379-386. doi:10.14573/ altex. 2106101
Hartung, T. (2023a). ToxAIcology – The evolving role of artificial intelligence in advancing toxicology and modernizing regulatory science. ALTEX 40, 559-570. doi:10.14573/altex. 2309191
Hartung, T. (2023b). A call for a human exposome project. ALTEX 40, 4-33. doi:10.14573/altex. 2301061
Hartung, T., Smirnova, L., Morales Pantoja, I. E. et al. (2023). The Baltimore declaration toward the exploration of organoid intelligence. Front Sci 1, 1017235. doi:10.3389/fsci.2023.1017235
Hartung, T., Morales Pantoja, I. E. and Smirnova, L. (2024). Brain organoids and organoid intelligence (OI) from ethical, legal, and social points of view. Front Artif Intell 6, 1307613. doi:10.3389/ frai.2023.1307613
Hernández-Jerez, A. F., Adriaanse, P. I., Aldrich, A. P. et al. (2021). Development of integrated approaches to testing and assessment (IATA) case studies on developmental neurotoxicity (DNT) risk assessment. EFSA J 19, e06599. doi:10.2903/j.efsa.2021.6599
Hertz-Picciotto, I. and Delwiche, L. (2009). The rise in autism and the role of age at diagnosis. Epidemiology 20, 84-90. doi:10.1097/ ede.0b013e3181902d15
Hogberg, H. T., Kinsner-Ovaskainen, A., Coecke, S. et al. (2010). mRNA expression is a relevant tool to identify developmental neurotoxicants using an in vitro approach. Toxicol Sci 113, 95115. doi:10.1093/toxsci/kfp175

Hogberg, H. T., Sobanski, T., Novellino, A. et al. (2011). Application of micro-electrode arrays (MEAs) as an emerging technology for developmental neurotoxicity: Evaluation of domoic acid-induced effects in primary cultures of rat cortical neurons.

Neurotoxicology 32, 158-168. doi:10.1016/j.neuro.2010.10.007
Hogberg, H. T., Bressler, J., Christian, K. M. et al. (2013). Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther 4, S4. doi:10.1186/scrt365
Hogberg, H. T., de Cássia da Silveira e Sá, R., Kleensang, A. et al. (2021). Organophosphorus flame retardants are developmental neurotoxicants in a rat primary BrainSphere in vitro model. Arch Toxicol 95, 207-228. doi:10.1007/s00204-020-02903-2
Hogberg, H. T. and Smirnova, L. (2022). The future of 3D brain cultures in developmental neurotoxicity testing. Front Toxicol 4, 808620. doi:10.3389/ftox.2022.808620

Honegger, P., Lenoir, D. and Favrod, P. (1979). Growth and differentiation of aggregating fetal brain cells in a serum-free defined medium. Nature 282, 305-308. doi:10.1038/282305a0
Huang, Q., Tang, B., Romero, J. C. et al. (2022). Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids. Sci Adv 8, eabq5031. doi:10.1126/sciadv.abq5031
Ilieva, M., Fex Svenningsen, Å., Thorsen, M. et al. (2018). Psychiatry in a dish: Stem cells and brain organoids modeling autism spectrum disorders. Biol Psychiatry 83, 558-568. doi:10.1016/j. biopsych.2017.11.011
Juberg, D. R., Fox, D. A., Forcelli, P. A. et al. (2023). A perspective on in vitro developmental neurotoxicity test assay results: An expert panel review. Regul Toxicol Pharmacol 143, 105444. doi:10.1016/j.yrtph.2023.105444
Keown, C., Shih, P., Nair, A. et al. (2013). Local functional overconnectivity in posterior brain regions is associated with symptom severity in autism spectrum disorders. Cell Rep 5, 567-572. doi:10.1016/j.celrep.2013.10.003
Kilpatrick, S., Irwin, C. and Singh, K. K. (2023). Human pluripotent stem cell (hPSC) and organoid models of autism: Opportunities and limitations. Transl Psychiatry 13, 217. doi:10.1038/ s41398-023-02510-6
Kleensang, A., Maertens, A., Rosenberg, M. et al. (2014). Pathways of toxicity. ALTEX 31, 53-61. doi:10.14573/altex. 1309261
Kleinstreuer, N. and Hartung, T. (2024). Artificial intelligence (AI) – It’s the end of the tox as we know it (and I feel fine) – AI for predictive toxicology. Arch Toxicol 98, 735-754. doi:10.1007/ s00204-023-03666-2
Knight, J., Hartung, T. and Rovida, C. (2023). 4.2 million and counting… the animal toll for REACH systemic toxicity studies. ALTEX 40, 389-407. doi:10.14573/altex. 2303201
Kobolak, J., Teglasi, A., Bellak, T. et al. (2020). Human induced pluripotent stem cell-derived 3D-neurospheres are suitable for neurotoxicity screening. Cells 9, 1122. doi:10.3390/cells9051122
Krewski, D., Andersen, M., Tyshenko, M. G. et al. (2020). Toxicity testing in the century: Progress in the past decade and future perspectives. Arch Toxicol 94, 1-58. doi:10.1007/s00204-019-02613-4
Krug, A. K., Kolde, R., Gaspar, J. A. et al. (2013a). Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: A transcriptomics approach. Arch Toxicol 87, 123-143. doi:10.1007/s00204-012-0967-3
Krug, A. K., Balmer, N. V., Matt, F. et al. (2013b). Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol 87, 2215-2231. doi:10.1007/ s00204-013-1072-y

Kuehn, B. M. (2010). Increased risk of ADHD associated with early exposure to pesticides, PCBs. JAMA 304, 27-28. doi:10.1001/ jama.2010.860
La Merrill, M. A., Vandenberg, L. N., Smith, M. T. et al. (2020). Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol 16, 45-57. doi:10.1038/s41574-019-0273-8
Lancaster, M., Renner, M., Martin, C. A. et al. (2013). Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 501, 373-379. doi:10.1038/nature12517
Landrigan, P. J. (2010). What causes autism? Exploring the environmental contribution. Curr Opin Pediatr 22, 219-225. doi:10.1097/mop.0b013e328336eb9a
Lee, J. and Freeman, J. L. (2014). Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity assessment: The application of the zebrafish in defining the effects of arsenic, methylmercury, or lead on early neurodevelopment. Toxics 2, 464-495. doi:10.3390/toxics 2030464
Lein, P., Silbergeld, E., Locke, P. et al. (2005). In vitro and other alternative approaches to developmental neurotoxicity testing (DNT). Environ Toxicol Pharmacol 19, 735-744. doi:10.1016/j. etap.2004.12.035
Lein, P., Locke, P. and Goldberg, A. (2007). Meeting report: Alternatives for developmental neurotoxicity testing. Environ Health Perspect 115, 764-768. doi:10.1289/ehp. 9841
Leist, M., Efremova, L. and Karreman, C. (2010). Food for thought … considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX 27, 309-317. doi:10.14573/ altex.2010.4.309
Leist, M., Hasiwa, N., Daneshian, M. et al. (2012). Validation and quality control of replacement alternatives – Current status and future challenges. Toxicol Res 1, 8-22. doi:10.1039/c2tx20011b
Leist, M., Hasiwa, N., Rovida, C. et al. (2014). Consensus report on the future of animal-free systemic toxicity testing. ALTEX 31, 341-356. doi:10.14573/altex. 1406091
Leist, M., Ghallab, A., Graepel, R. et al. (2017). Adverse outcome pathways: Opportunities, limitations and open questions. Arch Toxicol 91, 3477-3505. doi:10.1007/s00204-017-2045-3
Li, S. and Xia, M. (2019). Review of high-content screening applications in toxicology. Arch Toxicol 93, 3387-3396. doi:10.1007/ s00204-019-02593-5
Luderer, U., Eskenazi, B., Hauser, R. et al. (2019). Proposed key characteristics of female reproductive toxicants as an approach for organizing and evaluating mechanistic data in hazard assessment. Environ Health Perspect 127, 075001. doi:10.1289/ehp4971
Maass, C., Schaller, S., Dallmann, A. et al. (2023). Considering developmental neurotoxicity in vitro data for human health risk assessment using physiologically-based kinetic modeling: Deltamethrin case study. Toxicol Sci 192, 59-70. doi:10.1093/toxsci/ kfad007
Maenner, M. J., Warren, Z., Williams, A. R. et al. (2023). Prevalence and characteristics of autism spectrum disorder among children aged 8 years – Autism and developmental disabilities monitoring network, 11 Sites, United States, 2020. MMWR Surveill Summ 72, 1-14. doi:10.15585/mmwr.ss7202a1
Makris, S. L., Raffaele, K., Allen, S. et al. (2009). A retrospective performance assessment of the developmental neurotoxicity
study in support of OECD test guideline 426. Environ Health Perspect 117, 17-25. doi:10.1289/ehp. 11447
Marx, U., Andersson, T. B., Bahinski, A. et al. (2016). Biologyinspired microphysiological system approaches to solve the prediction dilemma of substance testing. ALTEX 33, 272-321. doi:10.14573/altex. 1603161
Marx, U., Akabane, T., Andersson, T. et al. (2020). Biologyinspired microphysiological systems to advance patient benefit and animal welfare in drug development. ALTEX 37, 365-394. doi:10.14573/altex. 2001241
Meigs, L., Smirnova, L., Rovida, C. et al. (2018). Animal testing and its alternatives – The most important omics is economics. ALTEX 35, 275-305. doi:10.14573/altex. 1807041
Modafferi, S., Zhong, X., Kleensang, A. et al. (2021). Gene-environment interactions in developmental neurotoxicity: A case study of synergy between chlorpyrifos and CHD8 knockout in human BrainSpheres. Environ Health Perspect 129, 77001. doi:10.1289/ehp8580
Moore, N. P., Beekhuijzen, M., Boogaard, P. J. et al. (2016). Guidance on the selection of cohorts for the extended one-generation reproduction toxicity study (OECD test guideline 443). Regul Toxicol Pharmacol 80, 32-40. doi:10.1016/j.yrtph.2016.05.036
Morales Pantoja, I. E., Smirnova, L., Muotri, A. R. et al. (2023a). First organoid intelligence (OI) workshop to form an OI community. Front ArtifIntell 6, 1116870. doi:10.3389/frai.2023.1116870
Morales Pantoja, I. E., Ding, L., Leite, P. E. C. et al. (2023b). A novel approach to increase glial cell populations in brain microphysiological systems. Adv Biol, e2300198. Online ahead of print. doi:10.1002/adbi. 202300198
Mundy, W. R., Padilla, S., Breier, J. M. et al. (2015). Expanding the test set: Chemicals with potential to disrupt mammalian brain development. Neurotoxicol Teratol 52, 25-35. doi:10.1016/j.ntt. 2015.10.001

Nishimura, Y., Murakami, S., Ashikawa, Y. et al. (2015). Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenit Anom (Kyoto) 55, 1-16. doi:10.1111/cga. 12079
NRC – National Research Council (2007). Toxicity Testing in the Century: A Vision and a Strategy. Washington, DC, USA: The National Academies Press.. doi:10.17226/11970
Nyffeler, J., Chovancova, P., Dolde, X. et al. (2018). A structure-activity relationship linking non-planar PCBs to functional deficits of neural crest cells: New roles for connexins. Arch Toxicol 92, 1225-1247. doi:10.1007/s00204-017-2125-4
OECD (2001). Test No. 416: Two-Generation Reproduction Toxicity. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris, doi:10.1787/9789264070868-en
OECD (2007). Test No. 426: Developmental Neurotoxicity Study. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris. doi:10.1787/9789264067394-en
OECD (2018). Test No. 443: Extended One-Generation Reproductive Toxicity Study. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. OECD Publishing, Paris. doi:10. 1787/9789264185371-en
OECD (2023). Initial Recommendations on Evaluation of Data from the Developmental Neurotoxicity (DNT) In-Vitro Testing Battery. Series on Testing and Assessment No. 377. https://one. oecd.org/document/ENV/CBC/MONO(2023)13/en/pdf

Pamies, D., Bal-Price, A., Simeonov, A. et al. (2017). Good cell culture practice for stem cells and stem-cell-derived models. ALTEX 34, 95-132. doi:10.14573/altex. 1607121
Pamies, D., Block, K., Lau, P. et al. (2018). Rotenone exerts developmental neurotoxicity in a human brain spheroid model. Toxicol Appl Pharmacol 354, 101-114. doi:10.1016/j. taap.2018.02.003
Pamies. D., Leist, M., Coecke, S. et al. (2022). Guidance document on good cell and tissue culture practice 2.0 (GCCP 2.0). ALTEX 39, 30-70. doi:10.14573/altex. 2111011
Persson, M. and Hornberg, J. J. (2016). Advances in predictive toxicology for discovery safety through high content screening. Chem Res Toxicol 29, 1998-2007. doi:10.1021/acs. chemrestox.6b00248
Pessah, I. N. and Lein, P. J. (2008). Evidence for environmental susceptibility in autism – What we need to know about gene x environment interactions. In A. Zimmerman (ed.), Autism: Current Theories and Evidence (409-428). Humana Press.
Pistollato, F., de Gyves, E. M., Carpi, D. et al. (2020). Assessment of developmental neurotoxicity induced by chemical mixtures using an adverse outcome pathway concept. Environ Health 19, 23. doi:10.1186/s12940-020-00578-x

Pitzer, E. M., Shafer, T. J. and Herr, D. W. (2023). Identification of neurotoxicology (NT)/developmental neurotoxicology (DNT) adverse outcome pathways and key event linkages with in vitro DNT screening assays. Neurotoxicology 99, 184-194. doi:10.1016/j.neuro.2023.10.007
Rempel, E., Hoelting, L., Waldmann, T. et al. (2015). A transcrip-tome-based classifier to identify developmental toxicants by stem cell testing: Design, validation and optimization for histone deacetylase inhibitors. Arch Toxicol 89, 1599-1618. doi:10.1007/ s00204-015-1573-y
Rice, D. and Barone, S. Jr. (2000). Critical periods of vulnerability for the developing nervous system: Evidence from humans and animal models. Environ Health Perspect 108, Suppl 3, 511-533. doi:10.1289/ehp.00108s3511
Rodier, P. M. (1995). Developing brain as a target of toxicity. Environ Health Perspect 103, Suppl 6, 73-76. doi:10.1289/ ehp.95103s673
Romero, J. C., Berlinicke, C., Chow, S. et al. (2023). Oligodendrogenesis and myelination tracing in a CRISPR/Cas9-engineered brain microphysiological system. Front Cell Neurosci 16, 1094291. doi:10.3389/fncel.2022.1094291

Rossignol, D., Genuis, S. and Frye, R. (2014). Environmental toxicants and autism spectrum disorders: A systematic review. Transl Psychiatry 4, e360. doi:10.1038/tp.2014.4
Roth, A. and MPS-WS Berlin 2019 (2021). Human microphysiological systems for drug development. Science 373, 1304-1306. doi:10.1126/science.abc3734
Rovida, C., Alépée, N., Api, A. M. et al. (2015). Integrated testing strategies (ITS) for safety assessment. ALTEX 32, 25-40. doi:10.14573/altex. 1411011
Rovida, C., Busquet, F., Leist, M. et al. (2023). REACH outnumbered! The future of REACH and animal numbers. ALTEX 40, 367-388. doi:10.14573/altex. 2307121
Russo, F. B., Brito, A., de Freitas, A. M. et al. (2019). The use of iPSC technology for modeling autism spectrum disorders.

Neurobiol Dis 130, 104483. doi:10.1016/j.nbd.2019.104483
Sachana, M., Bal-Price, A., Crofton, K. M. etal. (2019). International regulatory and scientific effort for improved developmental neurotoxicity testing. Toxicol Sci 167, 45-57. doi:10.1093/toxsci/ kfy211
Sachana, M., Shafer, T. J. and Terron, A. (2021a). Toward a better testing paradigm for developmental neurotoxicity: OECD efforts and regulatory considerations. Biology 10, 86. doi:10.3390/ biology10020086
Sachana, M., Willett, C., Pistollato, F. et al. (2021b). The potential of mechanistic information organised within the AOP framework to increase regulatory uptake of the developmental neurotoxicity (DNT) in vitro battery of assays. Reprod Toxicol 103, 159-170. doi:10.1016/j.reprotox.2021.06.006
Sagiv, S. K., Thurston, S. W., Bellinger, D. C. et al. (2010). Prenatal organochlorine exposure and behaviors associated with attention deficit hyperactivity disorder in school-aged children. Epidemiol 171, 593-601. doi:10.1093/aje/kwp427
Santos, J. L. S., Araújo, C. A., Rocha, C. A. G. et al. (2023). Modeling autism spectrum disorders with induced pluripotent stem cell-derived brain organoids. Biomolecules 13, 260. doi:10.3390/biom13020260
Schiffelers, M. W. A., Blaauboer, B. J., Bakker, W. E. et al. (2015). Regulatory acceptance and use of the extended one generation reproductive toxicity study within Europe. Regul Toxicol Pharmacol 71, 114-124. doi:10.1016/j.yrtph.2014.10.012
Schmidt, B. Z., Lehmann, M., Gutbier, S. et al. (2016). In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: An overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch Toxicol 91, 1-33. doi:10.1007/s00204-016-1805-9
Schmuck, M. R., Temme, T., Dach, K. et al. (2017). Omnisphero: A high-content image analysis (HCA) approach for phenotypic developmental neurotoxicity (DNT) screenings of organoid neurosphere cultures in vitro. Arch Toxicol 91, 2017-2028. doi:10.1007/s00204-016-1852-2
Schwartz, M. P., Hou, Z., Propson, N. E. et al. (2015). Human pluripotent stem cell-derived neural constructs for predicting neural toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 12516-12521. doi:10.1073/pnas. 1516645112
Shafer, T. J. (2019). Application of microelectrode array approaches to neurotoxicity testing and screening. Adv Neurobiol 22, 275297. doi:10.1007/978-3-030-11135-9_12

Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M. et al. (2014). Developmental neurotoxicity – Challenges in the century and in vitro opportunities. ALTEX 31, 129-156. doi:10.14573/altex. 1403271
Smirnova, L., Seiler, A. E. M. and Luch, A. (2015a). microRNA profiling as tool for developmental neurotoxicity testing (DNT). Curr Protoc Toxicol 64, 20.9.1-22. doi:10.1002/0471140856. tx2009s64
Smirnova, L., Harris, G., Leist, M. et al. (2015b). Cellular resilience. ALTEX 32, 247-260. doi:10.14573/altex. 1509271
Smirnova, L., Kleinstreuer, N., Corvi, R. et al. (2018). 3S – Systematic, systemic, and systems biology and toxicology. ALTEX 35, 139-162. doi:10.14573/altex. 1804051
Smirnova, L., Caffo, B. S., Gracias, D. H. et al. (2023a). Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and
intelligence-in-a-dish. Front Sci 1, 1017235. doi:10.3389/ fsci.2023.1017235
Smirnova, L., Morales Pantoja, I. E. and Hartung, T. (2023b). Organoid Intelligence (OI) – The ultimate functionality of a brain microphysiological system. ALTEX 40, 191-203. doi:10.14573/ altex. 2303261
Smirnova, L. and Hartung, T. (2024). The promise and potential of brain organoids. Adv Healthc Mater, e2302745. Online ahead of print. doi:10.1002/adhm. 202302745
Spînu, N., Cronin, M. T. D., Lao, J. et al. (2022). Probabilistic modelling of developmental neurotoxicity based on a simplified adverse outcome pathway network. Comput Toxicol 21, 100206. doi:10.1016/j.comtox.2021.100206
Suciu, I., Pamies, D., Peruzzo, R. et al. (2023a). GxE interactions as a basis for toxicological uncertainty. Arch Toxicol 97, 2035-2049. doi:10.1007/s00204-023-03500-9
Suciu, I., Delp, J., Gutbier, S. et al. (2023b). Definition of the neu-rotoxicity-associated metabolic signature triggered by berberine and other respiratory chain inhibitors. Antioxidants 13, 49. doi:10.3390/antiox13010049
US EPA (1998). Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.6300 Developmental Neurotoxicity Study. https://nepis.epa.gov/exe/ zypdf.cgi/p100irwo.pdf?dockey=p100irwo.pdf
van Thriel, C., Westerink, R. H., Beste, C. et al. (2012). Translating neurobehavioural endpoints of developmental neurotoxicity tests into in vitro assays and readouts. Neurotoxicology 33, 911-924. doi:10.1016/j.neuro.2011.10.002
van Vliet, E., Stoppini, L., Balestrino, M. et al. (2007). Electrophysiological recording of re-aggregating brain cell cultures on mul-ti-electrode arrays to detect acute neurotoxic effects. Neurotoxicology 28, 1136-1146. doi:10.1016/j.neuro.2007.06.004
van Vliet, E., Morath, S., Linge, J. et al. (2008). A novel in vitro metabolomics approach for neurotoxicity testing, proof of principle for methyl mercury chloride and caffeine. Neurotoxicology 29, 1-12. doi:10.1016/j.neuro.2007.09.007
van Vliet, E., Daneshian, M., Beilmann, M. et al. (2014). Current approaches and future role of high content imaging in safety sciences and drug discovery. ALTEX 31, 479-493. doi:10.14573/ altex. 1405271
Villa, C., Combi, R., Conconi, D. et al. (2021). Patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and cerebral organoids for drug screening and development in autism spectrum disorder: Opportunities and challenges. Pharmaceutics 13, 280. doi:10.3390/pharmaceutics13020280
Vinken, M., Benfenati, E., Busquet, F. et al. (2021). Safer chemicals using less animals: Kick-off of the European ONTOX project. Toxicology 458, 152846. doi:10.1016/j.tox.2021.152846
Wegscheid, M. L., Anastasaki, C., Hartigan, K. A. et al. (2021). Patient-derived iPSC-cerebral organoid modeling of the 17 q 11.2 microdeletion syndrome establishes CRLF3 as a critical regulator of neurogenesis. Cell Rep 36, 109315. doi:10.1016/j. celrep.2021.109315
Willett, C. E. (2018). The use of adverse outcome pathways (AOPs) to support chemical safety decisions within the context of inte-
grated approaches to testing and assessment (IATA). In H. Kojima, T. Seidle and H. Spielmann (eds), Alternatives to Animal Testing (83-90). Singapore: Springer. doi:10.1007/978-981-13-2447-5_11
Yamada, S., Hirano, Y., Kurosawa, O. et al. (2019). Evaluation of developmental neurotoxicity using neural differentiation potency in human iPS cells. Proc Annu Meet Jpn Pharmacol Soc 92. https://www.jstage.jst.go.jp/article/jpssuppl/92/0/92_3-P-127/_ pdf
Yi, Z., Gao, H., Ji, X. et al. (2021). Mapping drug-induced neuropathy through in-situ motor protein tracking and machine learning. J Am Chem Soc 143, 14907-14915. doi:10.1021/ jacs.1c07312
Zablotsky, B., Black, L. I., Maenner, M. J. et al. (2019). Prevalence and trends of developmental disabilities among children in the US: 2009-2017. Pediatrics 144, e20190811. doi:10.1542/ peds.2019-0811
Zhang, L., Li, M., Zhang, D. et al. (2023). Developmental neurotoxicity (DNT) QSAR combination prediction model establishment and structural characteristics interpretation. Toxicol Res 13, tfad116. doi:10.1093/toxres/tfad116
Zhong, X., Harris, G., Smirnova, L. et al. (2020). Antidepressant paroxetine exerts developmental neurotoxicity in an iPSCderived 3D human brain model. Front Cell Neurosci 14, 25. doi:10.3389/fncel.2020.00025

T. H. and H. T. H. are named inventors on a patent by Johns Hopkins University on the production of mini-brains (also called BrainSpheres), which is licensed to AxoSim, New Orleans, LA, USA. T. H. and L. S. are consultants for AxoSim, New Orleans, and T. H. is also a consultant for the American Type Culture Collection (ATCC) and was until recently for AstraZeneca on advanced cell culture methods.

No novel data was produced for this manuscript.

The authors acknowledge funding from the US Environmental Protection Agency (EPA) EPA-STAR grant (R83950501), the BMBF ( 161 L 0243 B , 016LW0146K), the Combining advances in Genomics and Environmental science to accelerate Actionable Research in ASD (GEARS) Network (R01ES034554); Ladd-Acosta, Volk), and the Land Baden-Württemberg (NAM_ ACCEPT). Funding was also received from EFSA, the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreements No. 964537 (RISK-HUNT3R), No. 964518 ToxFree), No. 963845 (ONTOX), No. 101057014 (PARC), and a Johns Hopkins Discovery award and a Johns Hopkins SURPASS award.