لكي تتعايش مع الميكروبات المقيمة فيها، يجب أن يكون لدى المضيف إحساس لتعديل سلوكه استجابةً لها. في الأمعاء، يوجه إحساس المغذيات الذي يتم نقله إلى الدماغ عبر دوائر عصبية ظهارية الخيارات الشهية.. ومع ذلك، لا يزال هناك شعور يسمح للمضيف بالاستجابة في الوقت الحقيقي للمؤثرات الناشئة من الميكروبات المعوية المقيمة. هنا نوضح أنه في قولون الفأر، يعتبر نمط الميكروبات الشائع الفلاجيلين – وهو سمة موحدة عبر الفصائل-يحفز مستقبلات Toll-like 5 (TLR5) في خلايا الأعصاب الكولونية الموصوفة بواسطة الببتيد YY (PYY). يؤدي هذا التحفيز إلى إفراز PYY على خلايا الأعصاب الحسية NPY2R لتنظيم التغذية. الفئران التي تفتقر إلى TLR5 في هذه الخلايا تأكل أكثر وتكتسب وزناً أكبر من الفئران الضابطة. وجدنا أن الفلاجيلين لا يؤثر على العصب مباشرة. بدلاً من ذلك، يحفز الفلاجيلين خلايا الأعصاب من تجويف القولون لتقليل التغذية من خلال دائرة عصبية حسية بين الأمعاء والدماغ. علاوة على ذلك، يقلل الفلاجيلين من التغذية بشكل مستقل عن الاستجابات المناعية أو التغيرات الأيضية أو وجود ميكروبات الأمعاء. هذه الحاسة تمكن المضيف من تعديل سلوكه استجابةً لنمط جزيئي من ميكروباته المقيمة. نحن نسمي هذه الحاسة عند واجهة الميكروبات والدماغ الحاسة العصبية الحيوية..
كل كائن حي يفسر العالم من خلال حواسه – بيئته الخاصةعلى الرغم من أن الحواس الخمس الكلاسيكية قد تم دراستها بشكل مكثف، إلا أن الأدلة الناشئة قد أثبتت الأساس العصبي لحاسة الأمعاء، وهي حاسة تقوم بتقييم المحفزات التي تنشأ من تجويف الأمعاء بشكل مستمر.تعتبر العناصر الغذائية، والتمدد، والميكروبات من أبرز المحفزات التي يواجهها الأمعاء. في الأمعاء الدقيقة، توجد خلايا عصبية ظهارية تُعرف باسم خلايا النيوروبود.الكشف السريع عن العناصر الغذائية ونقل المعلومات الحسية، عبر العصب الحائر، للتأثير على اختيارات الحيوان الغذائية في الوقت الحقيقيتشير الأدلة المتزايدة إلى أن الميكروبات المعوية، التي تكون الأكثر وفرة في القولونتعديل سلوك التغذية بشكل كبير، ربما من خلال العوامل العصبية المعدلةإشارات المناعةوالمسارات العصب vagal. ومع ذلك، لا يزال غير معروف الدائرة العصبية المباشرة التي من خلالها يفسر المضيف المعلومات الحسية الميكروبية لتعديل تغذيته.
في القولون، تشكل الخلايا العصبية الحجاجية دوائر عصبية مع خلايا النيوروبود، المميزة بواسطة النواقل العصبية.. هذه، وغيرها من خلايا الظهارة القولونية، تتعرض باستمرار للميكروبات، التي يمكن التعرف عليها من خلال أنماط جزيئية مثل الفلاجيلين، المعروفة جماعياً باسم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات. الفلاجيلين هو مكون هيكلي لأحد ثلاثة عضيات قديمة جداً، السوط.وبروتين محفوظ عبر الفصائل البكتيريةالذي ينشط مستقبل التعرف على الأنماط TLR5 (المراجع 36، 37). يؤدي حذف Tlr5 في جميع خلايا الظهارة المعوية للفئران إلى السمنة، والالتهاب الأيضي، والتهاب القولون التلقائي.علاوة على ذلك، تشير الأدلة من خطوط خلايا الأمعاء الخالدة إلى أن مستقبلات Toll-like قد يتم التعبير عنها بواسطة خلايا الظهارة الحسية المتخصصة، بما في ذلك تلك التي تفرز البروتين المحفز للشعور بالشبع.هنا حددنا أن سلوك التغذية يتم تنظيمه بواسطة نمط حسي غير معترف به سابقًا بين الأمعاء والدماغ لأنماط الميكروبات. نحن نسمي هذه الحاسة، عند واجهة الكائنات الحية الدقيقة والدماغ، الحاسة العصبية الحيوية.
تعبّر خلايا PYY عن Tlr5
في الأمعاء، تتوزع خلايا الظهارة الحسية بين خلايا الظهارة الأخرى بنسبة أقل من 1 في 1000 (مرجع 39). وتشمل سلالتين رئيسيتين: تلك التي تعبر عن السيروتونين والمادة P، وتلك التي
الشكل 1 | غياب مستقبل التعرف على الأنماط الميكروبية TLR5 في خلايا PYY المعلّمة في القولون يزيد من تناول الطعام. أ، قولون الفأر مع خلايا PYY المعلّمة بـ GFP تم لفه طوليًا (القولون القريب في المركز)؛ تمثيلي لـالفئران. الصورة المرفقة: عرض مكبر للمنطقة المحددة يظهر خلية واحدة من PYY-GFP مع عملية قمية تصل إلى التجويف ونتوء عصبي يمتد نحو قاعدة الكريبت. DAPI، 4’، 6-diamidino-2-phenylindole. قضبان القياس،مخطط البركان للتعبير الجيني لمستقبلات التعرف على الأنماط الميكروبية في خلايا PYY-GFP الظهارية وخلايا غير GFP بواسطة تسلسل RNA. بالمقارنة مع خلايا غير GFP، فإن خلايا PYY-GFP غنية بجين مستقبل التعرف على الأنماط. ( فئران؛ معدلة بواسطة DESeq2 مع اختبار ذو طرفين -اختبار). ج، التهجين الفلوري في الموقع لـ في خلايا PYY-GFP. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. اليسار: التعبير الإقليمي لـ Tlr5 في خلايا PYY-GFP (الفئران، كل نقطة تمثل 50 خلية). n.d.، لم يتم الكشف عنها (لا توجد خلايا تعبر عن Tlr5). Dist. بعيد؛ Duo.، الاثني عشر؛ Jej.، الصائم؛ Ile.، اللفائفي؛ Prox.، قريب. اليمين، خلية موسومة بـ PYY (خضراء) تعبر عن (أحمر) في القولون البعيد؛ ممثل لـ فئران. شريط القياس،. الخط المتقطع الأبيض يمثل حدود الخلايا المعلمة بـ PYY. د، اليسار، الحذف الجيني لـ Tlr5 بشكل حصري في خلايا موسومة بـ PYY تسبب زيادة في الوزن في ذكور وإناث الفئران (ذكور (M) Pyyتي إل آر 5الفئران، الوزن الابتدائيتيلرتحكم الأشقاء في القمامة:الفئران، الوزن الابتدائي; الإناث (F) تي إل آر 5الفئران، الوزن الابتدائيتيلرتحكم الأشقاء في القمامة:الفئران، الوزن الابتدائيتفاعل النمط الجيني مع الزمن من خلال تحليل التباين ذي القياسات المتكررة (ANOVA) مع اختبار توكي للفرق المعنوية. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط. على اليمين، زادت مدة الوجبة في الإناث وحجم الوجبة في الذكور والإناث بشكل ملحوظ في Pyy.; تلر فئران (Tlrذكور:وجباتفئران؛ 5Pyyتيلرذكور:وجباتفئران؛ Tlrإناث:وجباتفئران؛تيلرإناث:وجباتفئران؛تجارب مستقلة؛ بواسطة تحليل التباين ثنائي الاتجاه مع اختبار توكي HSD بعد ذلك؛ التأثير الرئيسي للجينوتيب والجنس على حجم الوجبة ومدة الوجبة مع تفاعل النمط الجيني مع الجنس). لم تُلاحظ أي تغييرات في تكرار الوجبات (انظر البيانات الموسعة الشكل 5 لمزيد من التحليلات). تمثل الرسوم البيانية الصندوقية نطاق الربع؛ تشير الخطوط البيضاء إلى الوسيط؛ تمتد الشعيرات إلى أبعد نقطة فوق الربع الثالث أو تحت الربع الأول ضمننطاق الربيع الربعي. تعبّر عن عدة نواقل عصبية بما في ذلك الكوليسيستوكينين (CCK) والببتيد الشبيه بالجلوكاجون 1 (GLP-1) وPYYيتم التعبير عن هذه الببتيدات العصبية بعد التعبير عن عامل النسخ Neurod1 (المرجع 42). في مناطق مختلفة من الأمعاء، تفضل الخلايا المعلّمة بـ Neurod1 التعبير عن نواقل عصبية محددة. على سبيل المثال، يسود CCK في الأمعاء الدقيقة القريبة، بينما يكون PYY غنيًا في اللفائفي البعيد والقولون. (الشكل 1أ). القولون هو موطن غني بالميكروباتباستخدام فئران تقريرية تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) المدفوع بواسطة محفزات CCK و PYY، قمنا بتسلسل النسخ الجينية لخلايا الظهارة من الأمعاء الدقيقة والقولون (الشكل البياني الموسع 1). في كل جزء، قمنا بمقارنة النسخ الجينية لخلايا الظهارة الحسية مع تلك الخاصة بخلايا الظهارة المجاورة لها لتحديد المستقبلات الغنية التي تكشف عن الإشارات الميكروبية، بما في ذلك نواتج التخمر الغذائي، والمواد الأيضية، والأنماط..
تم إثراء كل من خلايا CCK-GFP في الأمعاء الدقيقة القريبة وخلايا PYY-GFP في اللفائفي والقولون بشكل كبير في الجينات التي تشفر مستقبلات نواتج الميكروبات، مثل Ffar1 وFfar2 وGpbar1 وGpr119.فئران“; الشكل البياني الموسع 1). ومع ذلك، كانت خلايا PYYGFP فقط هي التي أظهرت زيادة ملحوظة في الجينات الخاصة بمستقبلات التعرف على الأنماط، وكان الأكثر بروزًا هو ( فئران“; الشكل 1ب). TLR5 يكتشف الفلاجيليننمط ميكروبي شائع، مرتبط تقليديًا بالدفاع المناعي للمضيف وتحمل الكائنات الحية الدقيقة المتعايشة. تم تأكيد التعبير القوي لـ Tlr5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY باستخدام تقنية الهجين في الموقع. بشكل عام، زادت التوطين المشترك بشكل ملحوظ منفي اللفائفي إلىفي القولون البعيد (فئران، 50 خلية لكل قطاع؛، الشكل 1ج)، حيث تكون كثافة الخلايا المعلّمة بـ PYY هي الأعلى (“; الشكل البياني الموسع 2a). لم يتم التعبير عن Tlr 5 في خلايا الدماغ المعلّمة بـ PYYأو خلايا القولون المعلّمة بالسيروتونين؛ في الواقع، كان Tlr5 معبرًا عنه بشكل رئيسي في
الخلايا المعلمة بـ PYY في اللفائفي والقولونالفئران؛ الشكل البياني الممتد 2ب-ح).
TLR5 في خلايا PYY ينظم التغذية
لتحديد دور TLR5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY، قمنا بتربية Pyycre؛ Tlrالفئران. في هذه الفئران، تم حذف Tlr5 من جميع الخلايا المعلّمة بـ PYY (الفئران؛ الشكل الإضافي 3أ). أظهرت الدراسات أن حذف جين Tlr5 بشكل عالمي في الفئران يسبب خللاً في الأيض، والتهاباً، وسمنة.علاوة على ذلك، عندما يتم إزالة TLR5 من جميع خلايا الظهارة المعوية، تستمر كل من الخلل الأيضي والالتهاب.. ومع ذلك، وجدنا أنه عندما يتم إزالة TLR5 بشكل محدد في الخلايا المعلّمة بـ PYY، لا تظهر الفئران أي دليل على خلل استقلابي أو التهاب (الشكل 3 من البيانات الموسعة).
مقارنةً بالتحكم من نفس القمامة،كانت الفئران تتمتع بتحمل طبيعي للجلوكوز الفموي، ومستوى سكر الدم أثناء الصيامفئران; الشكل البياني الممتد 3ب، ج)، ووزن وسادة الدهون (فئرانالشكل 3d من البيانات الموسعة). Pyyتيلرلم تُظهر الفئران أيضًا أي تغيير في مستويات السيروم من النواقل العصبية الأيضية GLP-1 و PYY بعد ساعة واحدة من تناول الطعام، مما يشير إلى أن مستويات الهرمونات المعوية في الدورة الدموية لم تكن مختلفة عن تلك الموجودة في الفئران المتطابقة.فئران; الشكل البياني الموسع 3e). علاوة على ذلك، لم تظهر هذه الفئران أي علامات على التهاب القولون التلقائي وأظهرت طول قولون ووزن وحجم طحال طبيعيين (فئران؛ الشكل التوضيحي الممتد 3f-h). كانت مستويات علامات الالتهاب مثل الميالوبيروكسيداز القولوني والليبوكالين-2 البرازي غير متغيرة بينالفئران والشهاداتفئران; الشكل البياني الموسع 3i). علاوة على ذلك، لم تكن هناك اختلافات نسيجية في القولون، بما في ذلك عمق الكرابت وكثافة الخلايا الحسية (فئران; الشكل البياني الموسع. )، ظلت تعبير جينات TLR في الخلايا الظهارية دون تغيير ( فئران; الشكل البياني الموسع 3م)، ولم تُلاحظ أي تغييرات في الوصلات الضيقة (فئران؛ الشكل البياني الموسع 3n) فيتيلرالفئران مقارنةً بالتحكم من نفس القمامة.
من الجدير بالذكر أنه عندما يتم إزالة TLR5 بشكل محدد في الخلايا المعلّمة بـ PYY، تأكل الفئران أكثر وتكتسب وزناً أكبر.فئران“; الشكل 1d، الشكل الإضافي 3o-p والجدول التكميلي 1). حيث يُعرف أن TLR5 يُحفز استجابات المناعة بشكل تقليدي من خلال التنشيط داخل الخلايا لعامل تمايز النخاع 88 (MyD88)قمنا بتربية; الفئران لتحديد تأثير إزالة MyD88 في الخلايا المعلّمة بـ PYY. وجدنا أنه، مقارنةً بالأشقاء،لم تُظهر الفئران زيادة في اكتساب الوزن أو تناول الطعامفئران; الشكل 4 من البيانات الموسعة). لذلك، بغض النظر عن الإشارات المناعية التقليدية، أو خلل التمثيل الغذائي، أو الالتهاب، ينظم TLR5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY زيادة وزن الجسم. علاوة على ذلك، قمنا بإجراء تحليل نمط الوجبات لتحديد كمية وتكرار وتوقيت تناول الطعام. قمنا بتحسين نظام سلوكي آلي في قفص المنزل يسجل تناول الطعام بدقة تصل إلى 0.01 جرام مع دقة زمنية تبلغ 1 ثانية (الشكل البياني الممتد 5a). كل من الذكور والإناث; أكلت الفئران وجبات أكبر بكثير مقارنةً بمجموعة التحكم من نفس السلالة (الذكور: الفئران؛ الإناث:فئران؛“; الشكل 1د والشكل الإضافي 5ب، ج). علاوة على ذلك، الإناثكما أن الفئران تناولت وجبات أطول من الفئران المماثلة في المجموعة.؛ الشكل 1d والشكل الإضافي 5d-g)، مما يكشف أن طول وحجم الوجبات يتم تعديلهما بواسطة TLR5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY.
تستخدم خلايا PYY TLR5 لاستشعار الفلاجيلين
الليغاند المعروف لـ TLR5 هو الفلاجيلين. على الرغم من أن النماذج النسخية تشير إلى أن النظام الغذائي يؤثر على الإشارات الميكروبية.، من غير الواضح ما إذا كانت كمية الفلاجيلين القولوني تتغير مع التغذية. باستخدام اختبار قائم على الخلايا، وجدنا أن مستويات الفلاجيلين النسبية في البراز أعلى بشكل ملحوظ في الفئران التي تم إطعامها مقارنة بالفئران الصائمة (فئران; الشكل 2أ). هذه الاستجابة غير متغيرة في فئران (فئران ؛ الشكل 2أ)، مما يشير إلى أن مستويات الفلاجيلين في القولون مستقلة عن تعبير Tlr5 في الخلايا المعلمة بـ PYY. وبالتالي، فإن التغذية ترتبط بزيادة الفلاجيلين في القولون.
أكد التحليل بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي (qRT-PCR) تعبير Tlr1-Tlr5 في خلايا PYY-GFP القولونية؛ ومع ذلك، مقارنة بمستويات التعبير في الخلايا الظهارية المجاورة، أظهر فقط تعبير Tlr5 غنىً ملحوظًا في الخلايا المعلّمة بـ PYY.فئران; الشكل 2ب). لتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا تستجيب للروابط لمستقبلات Toll-like، قمنا بتسجيل نشاط الكالسيوم داخل الخلايا من خلايا القولون المعلّمة بـ PYY. قمنا بتربية فأر يتم فيه التعبير عن خلايا موسومة بـ PYY للبروتين SALSA6F. يسمح هذا البروتين المدمج، الذي يربط بين tdTomato و GCaMP6f، بفرز الخلايا الأولية بناءً على فلورستها الحمراء، وتسجيل نشاط الكالسيوم داخل الخلايا مع تجنب سمية صبغات مؤشرات الكالسيوم.. من بين كلتم تصوير خلايا Salsa6f، ولم تستجب أي منها لجزيء الربط TLR4 الليبوسكريد. خلايا من 3 فئران؛ الشكل 2ج)، استجاب لمستقبل TLR3 اللجند بولي (I:C) خلايا من 4 فئران؛ الشكل 2ج) و استجاب لمستقبل TLR5 الليغاند فلاجيلين خلايا من 5 فئران؛ الشكل 2ج). كانت استجابات الكالسيوم تجاه البوليمر (I:C) غير متغيرة في وجود مثبط TLR5 TH1020 (خلايا من 3 فئران،؛ الشكل 2د، هـ)، لكن الاستجابات للفلجيلين كانت مخففة بشكل ملحوظ (خلايا من 3 فئران،;الشكل 2د، هـ)، مما يدل على أن تنشيط الخلايا المعلّمة بـ PYY بواسطة الفلاجيلين يتطلب TLR5. تم تأكيد نتائج مماثلة باستخدام فئران NeuroD1-Cre;Salsa6f (البيانات الموسعة الشكل 6أ، ب). ثم قمنا بتحديد ما إذا كان تنشيط الخلايا المعلّمة بـ PYY بواسطة روابط TLR يؤدي إلى إفراز PYY. على الرغم من أن البوليمر (I:C)لم يحفز إفراز PYY من الكرِبتات القولونية المفصولة مقارنةً بالحلول العازلةفئران; الشكل البياني الموسع 6c)، الفلاجيلين ( ) حفز إفرازًا كبيرًا من PYY ( فئران; الشكل التوضيحي الممتد 6c). تم قمع هذا الإفراز بشكل ملحوظ في الكرُوب القولونية من الفئران التي تفتقر إلى TLR5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY (فئران“;الشكل 2f). لذلك، فإن الخلايا المعلّمة بـ PYY تستشعر الفلاجيلين باستخدام TLR5 وتنقله عن طريق إفراز PYY – المعروف بأنه محفز للشعور بالشبع..
تتصل خلايا PYY بالعصبونات الحجاجية
بجانب الوظائف الدموية لبروتين PYY المعويتظهر الأعمال الحديثة الإشارات المحلية الباركرينية والتماثلية على العصب المبهمفي السابق، أظهرت تتبعات داء الكلب أحادية المشبك أن الخلايا المعلّمة بـ PYY في القولون تشكّل اتصالات مشبكية مع الخلايا العصبية الحجاجية. تُعرف هذه الخلايا باسم خلايا النيوروبود، حيث تقوم بنقل الإشارات الحسية إلى الجهاز العصبي بسرعة وبشكل مباشر.. مقارنة بالخلايا الظهارية المجاورة، فإن الخلايا المعلّمة بـ PYY غنية بشكل ملحوظ في الجينات التي تشفر بروتينات متورطة في الإشارات المشبكية، وتشكيل المشابك، والنقل العصبي.فئران; الشكل 2g والشكل الإضافي 7a، b). بالإضافة إلى ذلك، يتصل حوالي واحد من كل خمسة خلايا موسومة بـ PYY بالعصبونات المحيطية الموسومة بـ PGP9.5 في اللفائفي والقولون. الخلايا لكل قطاع؛ الشكل 2h والشكل 7c من البيانات الموسعة). لتأكيد أن الخلايا المعلّمة بـ PYY متصلة وظيفيًا بالعصب المبهم، قمنا بدمج علم البصريات الضوئية اللمعية مع علم الفيزيولوجيا الكهربائية للعصب المبهم العنقي في الجسم الحي. قمنا بتربية فأر Pyycre;ChR2 حيث تعبر الخلايا المعلّمة بـ PYY عن قنوات الرودوبسين-2 (ChR2)، وهو أوبسين يتم تنشيطه بواسطة الضوء (الشكل التوضيحي الممتد 7d، e). في ; فئران ChR2، مجموعة التحكم تم تطبيق تحفيز ضوئي على تجويف القولون ولم ينشط العصب المبهم العنقي، ولكن-أدى التحفيز الضوئي إلى زيادة سريعة وملحوظة في معدل إطلاق العصب الحائرفئران; الشكل 2i). بلغت ذروة إطلاق العصب الحائر خلال ثوانٍ من -تحفيز ضوئي، مما يوضح أن الخلايا المعلمة بـ PYY تنشط مباشرة العصب المبهم. هذه النتائج تؤسس دائرة مباشرة بين الخلايا المعلمة بـ PYY والعصب المبهم للإشارة السريعة بين القولون والدماغ الخلفي، حيث ينتهي العصب المبهم الوارد..
الشكل 2 | الخلايا المعلمة بـ PYY تستشعر الفلاجيلين الميكروبي من خلال TLR5. أ، تركيز الفلاجيلين في البراز النسبي منفئران وتحكم أشقاء القمامة بعد صيام لمدة 16 ساعة أو تغذية حرة. لا توجد اختلافات عبر الجينات. زادت التغذية من مستوى الفلاجيلين في البراز.فئران؛* بواسطة تحليل التباين ذي القياسات المتكررة مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد ذلك). ب، خريطة حرارية (فئران؛ معدلة بواسطة DESeq2 مع اختبار ذو طرفين -اختبارات؛القيم في الشكل البياني الموسع 1؛ اليسار) و qRT-PCR (غير PYYفئران؛فئران؛* بواسطة تحليل التباين المتكرر ANOVA مع اختبار توكي HSD بعد ذلك؛ اليمين) من تعبير جين TLR في خلايا الظهارة القولونية غير GFP و PYY-GFP. ج، استجابات الكالسيوم المختارة من ; خلايا القولون Salsa6f إلى poly(I:C) ( خلايا، الفئران)، الليببوليسكاريد (LPS؛ خلايا، الفئران) و الفلاجيلين ( خلايا، ). يشير الشريط الرمادي إلى تسريب لمدة 30 ثانية. د، استجابات الكالسيوم للبولي (I:C) والفلاجيلين قبل (صلب) وبعد (منقوط) مثبط TLR5 TH1020. e، قياس استجابة الكالسيوم. تم تقليل الاستجابات فقط للفلجيلين، وليس للبوليمر (I:C)، (البوليمر (I:C): الخلايا؛ الفلاجيلين: خلايا؛ بواسطة الأزواج ذو طرفين-اختبار). NS، غير ذي دلالة. ف، زراعة أحادية الطبقة من الظهارة القولونية منفئران وأقران القمامة الذين تم تحفيزهم بمحلول مخفف،الفلاجيلين وفورسكولين (F) (I؛ التحكم الإيجابي (ctrl)). تم قياس تركيز PYY في lysates الخلوية والسوائل الفائضة باستخدام اختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم. حفز الفلاجيلين إفراز PYY في Tlrsflfl ولكن ليس الثقافات ( فئران؛ بواسطة تحليل التباين ذي القياسات المتكررة مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد ذلك). ج، خريطة حرارية للتعبير الجيني المشبكي في خلايا القولون غير GFP و PYY-GFP (فئران؛ معدلة بواسطة DESeq2 مع اختبار ذو طرفين -اختبارات،القيم في الشكل البياني الموسع 1). ح، نسيج القولون PYY-GFP ملون مناعياً لـ PGP9.5 (أحمر). تمثيلي لـالفئران؛ المناطق المقاسة في الشكل التوضيحي الإضافي 7. قضبان القياس،. أنا، اليسار: استجابات العصب الحائر للتسريب داخل القولون و التحفيز بواسطة و الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) في“; فئران ChR2 (الفئران). اليمين: قياس استجابة العصب الحائر القصوى (فئران؛*باستخدام اختبار ويلكوكسون ذو الذيلين مع مقارنات غير معلمية). تمثل أشرطة الخطأ والتظليل الانحراف المعياري المتوسط.
يتم نقل الفلاجيلين إلى الخلايا العصبية المبهمة
ثم قمنا بتسجيل نشاط العصب المبهم العنقي استجابةً لتروية القولون بالفلاغيلين. كانت الإينتراليبيد بمثابة التحكم الإيجابي.فئران“; الشكل البياني الموسع 7f، g). ضخ الفلاجيلين ) من خلال القولون أدى إلى زيادة كبيرة في معدل إطلاق العصب الحائر داخل ثواني ( فئران; الشكل 3أ). لتحديد ما إذا كانت الخلية المعلّمة بـ PYY ضرورية لنقل الفلاجيلين اللمعي إلى العصب المبهم، قمنا بتربية فأر Pyycre;Halo. في هذه الفئران، تعبر الخلايا المعلّمة بـ PYY عن بروتين كبت الضوء البصري هالورودوبسين (البيانات الموسعة الشكل 7ح)، وهو قناة أنيونية تقوم بزيادة الاستقطاب في الخلايا استجابةً لـضوء. تحكم-تحفيز ضوئي مطبق على
الشكل 3 | دوائر PYY-العصب الحائر تنقل الفلاجلين القولوني. أ، اليسار، استجابات العصب الحائر لتروية القولون بمحلول PBS أوالفلاجلين في الفئران من النوع البريالفئران). صحيح، قياس استجابة الذروة للفلجيلين (فئران؛*بواسطة اختبار مزدوج الذيل المقترن-اختبار). ب، استجابات العصب الحائر الأيسر لتروية القولون الداخلي بمحلول فوسفات البفر (PBS) والفلاجيلين مع التزامن-LED أو -تحفيز LED في; فئران هالو ( الفئران). صحيح، قياس الاستجابة القصوى للعصب المبهم للفلجيلين (فئران؛*باستخدام اختبار ويلكوكسون الموقّع ذو الطرفين مع مقارنات غير معلمية باستخدام طريقة ويلكوكسون). ج، الاستجابات العصب vagal لتروية القولون الداخلي بالفلاغيلين في Pyy; فئران Tlr5 flfl (الفئران) وتحكم الأشقاء في القمامةالفئران؛ للتquantification، انظر الشكل 8 من البيانات الموسعة). د، التهجين الفلوري في الموقع لمستقبل PYY Y2R (المشفر بواسطة Npy2r) في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في العقدة الظهرية للعصب المبهم. تمثيلي لـالعقد. قضبان القياس،. e، استجابات العصب الحائر الأيسر لتروية القولون الداخلي بمحلول PBS أوالفلاجلين قبل و
بعد الإيصال داخل الصفاق لمثبط Y2R (Y2Ri) BIIE-0246الفئران). صحيح، قياس الاستجابة القصوى للعصب المبهم للفلاغيلين مع وبدون إضافة مثبط Y2R BIIE-0246 ( فئران؛* بواسطة اختبار كروسكال-واليس مع مقارنات غير معلمية باستخدام طريقة ويلكوكسون). ف، تصوير الكالسيوم في الجسم الحي لخلية العقدة المبهمة الإيجابية لـ Npy2r استجابةً لتروية القولون بالفلجيلين (فئرانالخلايا العصبية). إجمالي من NPY2Rتستجيب الخلايا لـالفلجيلين، اليسار، تصوير الكالسيوم في الجسم الحي لخلية العقدة المبهمة استجابةً لتروية القولون إما بالإنتراليبيد ( ) أو الفلاجيلين ( ). الخلايا العصبيةالفئران. صحيح، عدد الخلايا العصبية المستجيبة لكل محفز (فئرانالخلايا العصبية). تمثل الخطوط المتقطعة الرمادية في خرائط الحرارة بداية ونهاية التروية. تمثل أشرطة الخطأ والتظليل الانحراف المعياري للمتوسط. تم تعديل الرسوم البيانية في (f) بإذن من المرجع 3، AAAS. لم يؤثر حجم القولون على نشاط العصب المبهم استجابةً للفلجيلين )، لكن تكميم -التحفيز الضوئي الضوئي أوقف إطلاق العصب الحائر استجابةً للفلجيلينفئران; الشكل 3ب). علاوة على ذلك، في تيلرالفئران، لم ينتج الفلاجيلين اللميني استجابة سريعة للعصب المبهم مقارنةً بالحالة في مجموعة التحكم من الأشقاءفئرانلذلك، تستخدم خلايا النيوروبود المعلّمة بـ PYY مستقبل TLR5 لاستشعار الفلاجيلين اللميني وتنقل بسرعة هذه المحفزات الميكروبية إلى العصب المبهم.
شكل.تستخدم دوائر PYY-العصبية TLR5 و Y2R لتحفيز التغيرات في تناول الطعام. تم صيام الفئران طوال الليل وتم إعطاؤها حقنة شرجية من إماالفلاجيلين أو PBS قبل الحصول على الوصول إلى الطعام القياسي بحرية.a,b,أكلت الفئران المتحكم بها من نفس القمامة كمية أقل بكثير من الطعام بعد حقنة الفلاجيلين عند 20 و 40 وبينماتيلرالفئران لمفئران لكل جينوتيب؛تفاعل الجينوتيب-الحقنة-الوقت بواسطة تحليل التباين ذي القياسات المتكررة مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد ذلك). ج، د، في الفئران من النوع البري، تم إجراء حقن PBS وflagellin مع إضافة إمافي محلول الحقنة الشرجية (الفئران؛ ج) أو الحقن داخل الصفاق لـ BIIE-0246 قبل الحقنة الشرجية ( الفئران؛ د). إن تثبيط TLR5 و Y2R قلل من انخفاض تناول الطعام بعد حقنة الفلاجيلين (تفاعل الوقت مع الحقن الدوائي بواسطة تحليل التباين المتكرر مع اختبار توكي بعد ذلك؛ انظر الشكل 9c، d في البيانات الموسعة للتحكم في المركبات). i.p.، داخل الصفاق. e، يتتبع Crunch Master (المخطط العلوي) بنية التغذية الدقيقة من خلال تسجيل الصوت والفيديو. علامات سوداء (أسفل) تشير إلى أنماط العضفئران بعد حقنة PBS أو حقنة الفلاجيلين. ف، اليسار، حقنة الفلاجيلين تأخرت بشكل كبير في ظهور الثلاثة لدغات الأولى (أسود: اللدغة 1؛ أزرق: اللدغة 2؛ أخضر: اللدغة 3؛P< 0.0001 التأثير الرئيسي للعلاج بواسطة تحليل التباين المتكرر). على اليمين، كان الاستهلاك (بعد تصحيح الانسكاب) قد انخفض بشكل كبير على مدارجلسة اختبار بعد حقنة الفلاجيلين (غير متطابقة ذات طرفين)-اختبار،تظهر مخططات الكمان الوسيط المشار إليه بالخط السميك والمتوسط المشار إليه بالخط الرفيع.في الفئران الخالية من الجراثيم من النوع البري، أدى حقن الفلاجيلين إلى تقليل تناول الطعام مقارنة بحقن PBS.فئران؛تفاعل وقت الحقنة الشرجية بواسطة تحليل التباين المتكرر مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد ذلك). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري المتوسط. نموذج لاستشعار نمط الميكروبات بواسطة الدوائر العصبية الظهارية لتحفيز التغيير السلوكي. يتم اكتشاف بروتين السوط البكتيري بواسطة TLR5 في خلايا القولون المعلّمة بـ PYY، والتي بدورها تطلق PYY لتنشيط الخلايا العصبية الحجاجية من خلال Y2R. يساهم تنشيط هذه الدائرة في إجمالي تناول الطعام. الرسوم البيانية فيمعدل بإذن من المرجع 3، AAAS.
من الجدير بالذكر أن التحليلات الجزيئية باستخدام تسلسل RNA، وqRT-PCR، والهجين في الموقع تظهر أن الخلايا العصبية المبهمة لا تعبر عن Tlr5.الفئران؛ الشكل 8b-d من البيانات الموسعة). علاوة على ذلك، أظهرت تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية العقدية الظهرية المنفصلة بشكل حاد أنه بينما يثير الكابسيسين (المنبه الضابط) تغيرات في الكالسيوم، فإن الفلاجيلين لا يفعل ذلك، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية العقدية الظهرية نفسها لا تستشعر الفلاجيلين.الخلايا العصبية من 4 فئران؛ الشكل التوضيحي الممتد 8e)، مما يثبت أكثر أن خلايا النيوروبود المعلّمة بـ PYY تعمل كموصلات للفلاجيلين.
مستقبل NPY2 العائد للعصب الحائر مطلوب
ثم سعينا لتحديد ما إذا كانت نشاط العصب الحائر استجابةً للفلجيلين يتطلب إفراز PYY من خلايا النيوروبود. تظهر بيانات تسلسل RNA المنشورة أن الخلايا العصبية الحائرة التي تعصب القولون تعبر عن مستقبل PYY Y2R. ( الخلايا؛ الشكل الإضافي 8f). في الأمعاء، يُعتقد أن هذا المستقبل يتوسط إشارات PYY المحليةباستخدام تقنية التهجين في الموقع، أكدنا تعبير Y2R في خلايا العقدة الظهرية للعصب المبهم.الفئران؛ الشكل 3د). ثم، وجدنا أن حجب Y2R باستخدام BIIE-0246يقلل من نشاط العصب المبهم العنقي استجابةً للفلجيلين المتدفق عبر تجويف القولونفئران; الشكل 3e).
لفهم أفضل لكيفية استجابة الخلايا العصبية الحجاجية الفردية للفلجيلين في الأمعاء، استخدمنا تصوير الكالسيوم داخل الجسم لمراقبة نشاط هذه الخلايا العصبية استجابةً للمؤثرات التي تم ضخها عبر القولون. استخدمنا نموذج فأر ثلاثي الجينات، Snap25-FosTRAP-tdTomato.، الذي يمكّن من تتبع تغييرات الكالسيوم في الوقت الحقيقي في خلايا العصب الحائر الفردية ومن ثم وسم هذه الخلايا المستجيبة لمزيد من التحليل. بعد التصوير، قمنا باستخراج العقدة العقدية واستخدمنا تحليل الحيز للنشاط الزمني بواسطة التهجين الموضعي بالفلوريسين.أكدنا أنمن 332 خلية عصبية موسومة بـ NPY2R تفاعلت مع الفلاجيلين في القولون (الشكل 3f والشكل الإضافي 8g-i).
علاوة على ذلك، كشفت تصوير الكالسيوم لعصبونات العقدة الهدبية استجابات مميزة:استجابت 27.7% من الخلايا العصبية لكل من الإينتراليبيد والفلاغيلين، بينما استجابت 60.6% فقط للفلاغيلين، واستجابت نسبة 100% من الخلايا العصبية فقط للإينتراليبيد (وهو التحكم الإيجابي).الخلايا العصبية؛الفئران؛ الشكل 3 ج والشكل الإضافي 8ي). تشير هذه الملاحظة – أن ما يقرب من ثلثي الخلايا العصبية التي تم تنشيطها بواسطة الحقن القولوني استجابت بشكل خاص للفلجيلين – إلى وجود دائرة عصبية ظهارية فريدة لاستشعار الفلجيلين، منفصلة عن المسارات المعنية في اكتشاف المغذيات. على الرغم من أن الدراسات المستقبلية يجب أن تحقق في الخلايا العصبية المستجيبة لكل من الدهون الداخلية والفلجيلين، إلا أن هذه النتائج تبرز مسار مميز لإشارات الأمعاء-الدماغ استجابةً لنمط الميكروبات الفلاجيلين.
الفلاجيلين ينظم التغذية من خلال خلايا PYY
اكتشافنا لدائرة عصبية ظهارية لاستشعار نمط ميكروبي بسرعة في القولون قادنا إلى التحقيق في كيفية تأثير الفلاجيلين على السلوك في الوقت الحقيقي. استنتجنا أن وجود الفلاجيلين في القولون سيؤدي إلى انخفاض سريع في تناول الطعام. لاختبار ذلك، صمنا الفئران طوال الليل لتحفيز الجوع ثم أعطيناها إما الفلاجيلين ( ) أو تحكم PBS عن طريق الحقنة الشرجية. وجدنا أن حقنة الفلاجيلين قللت بشكل كبير من تناول الطعام خلال 20 دقيقة في الفئران الضابطة من نفس السلالة، لكنها لم تؤثر على الفئران التي تفتقر إلى TLR5 في الخلايا المعلّمة بـ PYY ( تي إل آر 5; فئران“; الشكل 4أ، ب والشكل البياني الموسع 9أ). كانت هذه الاستجابة للفلجيلين متسقة عبر الفئران اليافعة (عمر 5 أسابيع) والبالغة (عمر 10 أسابيع)، مما يشير إلى أن هذه المسار الحسي محفوظ طوال فترة التطور (فئران؛ الشكل 9ب من البيانات الموسعة).
لفحص خصوصية تأثير الفلاجيلين، أجرينا حقنة شرجية تحتوي على بولي(:C)، وهو ربيط TLR3، ووجدنا أن هذا التحفيز لم يؤثر على تناول الطعام.فئران; الشكل البياني الموسع 9c). علاوة على ذلك، تسبب الفلاجلين في انخفاض مؤقت في تناول الطعام، والذي تلاشى بعد 3 ساعات (فئران; الشكل البياني الموسع 9c). أخيرًا، أدى تثبيط TLR5 أو مستقبل Y2 دوائيًا إلى منع الانخفاض الناتج عن الفلاجيلين في تناول الطعام (فئرانتشير هذه البيانات بقوة إلى أن الفلاجيلين اللمعي يثبط بسرعة وبشكل عكسي تناول الطعام من خلال التأثير على TLR5 وتحفيز إفراز PYY ضمن هذه الدائرة العصبية الظهارية.
لتحليل سلوك التغذية بدقة أكبر، قمنا بتطوير نظام سلوكي باستخدام تسجيلات الفيديو والصوت. يُشار إلى النظام باسم Crunch Master، ويعمل على قياس عدد اللدغات الفردية تلقائيًا في الوقت الحقيقي (الشكل 4e ومقاطع الفيديو التكميلية 1 و 2). كشفت هذه التحليلات أن حقنة الفلاجيلين أخرّت بدء التغذية وقللت من إجمالي استهلاك الطعام دون التأثير على تكرار اللدغات أو مدة الأكل ضمن فترة ( فئران لكل مجموعة،; الشكل 4f والشكل الإضافي 9e). هذا يوضح أكثر أن تحفيز الفلاجيلين القولوني يعدل سلوك التغذية في الوقت الحقيقي.
من الجدير بالذكر أن مستويات الفلاجيلين التي تم توصيلها عن طريق الحقنة الشرجية كانت ضمن نطاق التركيزات الفسيولوجية الموجودة في الفئران التي تم إطعامها مقابل الفئران الصائمة.فئران“; الشكل 9f من البيانات الموسعة). بالإضافة إلى ذلك، لم تظهر الفئران أي علامات على الشعور بالضيق أو الإسهال أو الألم أو القيود الجسدية، ولم يكن هناك زيادة ملحوظة في تعبير السيتوكينات في القولون أو الطحال خلال ساعة واحدة بعد الحقنة الشرجية (فئران؛ الشكل 10 أ، ب من البيانات الموسعة). وبالتالي، فإن استشعار النيورويليال للفلاغيلين يقلل من تناول الطعام في غياب استجابة مناعية.
أخيرًا، لتأكيد أن تأثيرات الفلاجيلين على تناول الطعام كانت نتيجة تنشيط مباشر للخلايا الظهارية، وليس تفاعلات مع ميكروبات الأمعاء، قمنا بإعطاء حقنة شرجية من الفلاجيلين لفئران خالية من الجراثيم. على الرغم من أن الفئران الخالية من الجراثيم يمكن أن تظهر اختلافات سلوكية مقارنة بالحيوانات التي تربى بشكل تقليدي.إنها نموذج مفيد لدراسة هذه الدائرة العصبية بين الأمعاء والدماغ بدون ميكروبيوم. تظهر نتائجنا أن حقنة الفلاجيلين قللت بشكل كبير من تناول الطعام في هذه الفئران الخالية من الجراثيم خلال ساعة واحدة.فئران; الشكل 4 ج). هذا يوضح أن الاستشعار المباشر للفلاغيلين بواسطة خلايا الظهارة القولونية كافٍ لقمع تناول الطعام، بغض النظر عن إشارات ميكروبية أخرى. بشكل جماعي، تُظهر هذه النتائج أن الإحساس المعوي بنمط الفلاغيلين الميكروبي ينظم التغذية (الشكل 4 ح).
الخاتمة
تشكل هذه الدائرة العصبية بين الأمعاء والدماغ أساس ‘حس عصبي حيوي’ – وهو حس يمكن من خلاله للمضيف تعديل سلوكه من خلال مراقبة نمط الميكروبات المعوية. بينما ركزت الأبحاث السابقة على المغذيات التحويل الحسي في الأمعاء الدقيقةاكتشفنا أن الخلايا القولونية المتخصصة، وهي خلايا النيوروبود المعلّمة بـ PYY، تستخدم مستقبل التعرف على الأنماط TLR5 لاكتشاف الفلاجيلين البكتيري. ثم تقوم هذه الخلايا بإرسال إشارات سريعة إلى الدماغ، عبر العصب المبهم، لتنظيم سلوك التغذية.
من المهم الاعتراف بأنه في هذه الدراسة، تم استخدام نوع واحد من الفلاجيلين من السالمونيلا التيفية، وهي مُمْرِض نمطي. ومع ذلك، يمكن أن تكون البكتيريا مُمْرِضة أو متعايشة اعتمادًا على نوع الفلاجيلين المحدد المعبر عنه.لذلك، فإن آثار المتغيرات الجزيئية الأخرى للفلجيلين تستحق التحقيق. يجب أن تستفيد الأبحاث المستقبلية من التقنيات المتطورة لتعديل تجمعات الميكروبات في الوقت الحقيقي لدراسة آثار تقلبات الفلجيلين بشكل مستقل عن التحفيز الخارجي. تمامًا كما تعتمد الكائنات الحية على البصر والصوت والرائحة والطعم واللمس للتنقل في العالم، فإنها أيضًا تعدل سلوكها استجابةً للمؤثرات التي تشكل بيئتها الداخلية..
المحتوى عبر الإنترنت
أي طرق، مراجع إضافية، ملخصات تقارير Nature Portfolio، بيانات المصدر، بيانات موسعة، معلومات تكميلية، شكر وتقدير، معلومات مراجعة الأقران؛ تفاصيل مساهمات المؤلفين والمصالح المتنافسة؛ وبيانات توفر البيانات والرموز متاحة علىhttps://doi.org/10.1038/s41586-025-09301-7.
بوهوركيز، د. ف. وآخرون. دائرة عصبية ظهارية تتكون من ت innervation خلايا الأمعاء الحسية الغدية. ج. استثمار سريري. 125، 782-786 (2015).
بيلونو، ن. و. وآخرون. خلايا الإنتروكرومافين هي مستشعرات كيميائية في الأمعاء ترتبط بمسارات عصبية حسية. خلية 170، 185-198 (2017).
كايلبرر، م. م. وآخرون. دائرة عصبية بين الأمعاء والدماغ لنقل الإحساس بالمغذيات. ساينس 361، eaat5236 (2018).
بيوكهام، ك. ل. وآخرون. تفضيل السكر على المحليات يعتمد على خلية مستشعر في الأمعاء. نات. نيوروساينس. 25، 191-200 (2022).
بوهوركيز، د. ف.، تشاندرا، ر.، سامسا، ل. أ.، فيغنا، س. ر. & ليدل، ر. أ. توصيف العمليات الشبيهة بالأقدام الكاذبة القاعدية في خلايا PYY المعوية والقولونية. ج. مول. هيستول. 42، 3-13 (2011).
بوهوركيز، د. ف. وآخرون. اتصال بين الخلايا المعوية الصماء والجلية المعوية تم الكشف عنه بواسطة المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد. PLoS ONE 9، e89881 (2014).
لو، ف. ب. وآخرون. يتم إفراز الأدينوزين ثلاثي الفوسفات مع الببتيد الشبيه بالجلوكاجون-1 لتنظيم الخلايا المعوية والعصبونات الواردة. نات. كوميون. 10، 1029 (2019).
هاياشي، م. وآخرون. سلالات خلايا الأمعاء الصماء التي تتحكم بشكل مختلف في التغذية وحركة الأمعاء. إيليف 12، e78512 (2023).
باي، ل. وآخرون. أنواع الخلايا المعوية الصماء التي تحفز مكافأة الطعام والاشمئزاز. إيليف 11، e74964 (2022).
ليو، و. و. وبوهوركويز، ف. د. الأساس العصبي لتفضيل السكر. نات. ريف. نيوروسا. 23، 584-595 (2022).
غريبل، ف. م. & ريمان، ف. خلايا الغدد الصماء المعوية: حساسات كيميائية في الظهارة المعوية. مراجعة سنوية لعلم وظائف الأعضاء. 78، 277-299 (2016).
جاباني، إ. وآخرون. استشعار البكتيريا عبر نود2 العصبي ينظم الشهية ودرجة حرارة الجسم. ساينس 376، eabj3986 (2022).
تولهرست، ج. وآخرون. الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة تحفز إفراز ببتيد الجلوكاجون الشبيه-1 عبر مستقبلات البروتين G المرتبطة FFAR2. داء السكري 61، 364-371 (2012).
لين، ف. هـ. وآخرون. البيوتيرات والبروبيونات تحمي من السمنة الناتجة عن النظام الغذائي وتنظم هرمونات الأمعاء عبر آليات مستقلة عن مستقبلات الأحماض الدهنية الحرة 3. PLoS ONE 7، e35240 (2012).
مقالة
تشيميريل، سي. وآخرون. المستقلب البكتيري إندول ينظم إفراز الإنتيرتين من الخلايا المعوية الصماء.الخلايا. تقرير الخلايا 9، 1202-1208 (2014).
تشاسينغ، ب.، لي، ر. إ. وجويرتس، أ. ت. مستقبلات Toll-like 5 في خلايا الظهارة المعوية تنظم الميكروبات المعوية لمنع الالتهاب منخفض الدرجة ومتلازمة الأيض في الفئران. علم الجهاز الهضمي 147، 1363-1377 (2014).
تشيو، إ. م. وآخرون. البكتيريا تنشط الخلايا العصبية الحسية التي تعدل الألم والالتهاب. ناتشر 501، 52-57 (2013).
سغريتا، م. وآخرون. الآليات الكامنة وراء التغيرات السلوكية الاجتماعية التي تتوسطها الميكروبات في نماذج الفئران لاضطراب طيف التوحد. نيورون 101، 246-259 (2018).
مولر، ب. أ. وآخرون. الميكروبيوتا تعدل الأعصاب الودية عبر دائرة الأمعاء-الدماغ. ناتشر 583، 441-446 (2020).
فولينغ، سي.، دينان، تي. جي. وكرايان، جي. إف. إشارة الميكروبات المعوية إلى الدماغ: ماذا يحدث في العصب الحائر…. نيورون 101، 998-1002 (2019).
مارغوليس، ك. ج.، كرايان، ج. ف. وماير، إ. أ. محور الميكروبيوتا-الأمعاء-الدماغ: من الحركة إلى المزاج. أمراض الجهاز الهضمي 160، 1486-1501 (2021).
برافو، ج. أ. وآخرون. تناول سلالة اللاكتوباسيلس ينظم السلوك العاطفي وتعبير مستقبلات GABA المركزية في الفأر عبر العصب الحائر. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 108، 16050-16055 (2011).
ساجان، ل. حول أصل الخلايا الانقسامية. مجلة البيولوجيا النظرية 14، 225-274 (1967).
جويرتس، أ. ت.، نافاس، ت. أ.، ليونز، س.، جودوفسكي، ب. ج. ومادارا، ج. ل. الحافة المتقدمة: الفلاجيلين البكتيري ينشط TLR5 المعبر عنه في الجانب القاعدي الجانبي لتحفيز التعبير الجيني الالتهابي البروتيني الظهاري. مجلة المناعة. 167، 1882-1885 (2001).
هاياشي، ف. وآخرون. الاستجابة المناعية الفطرية للبكتيريا الفلاجيلين تتم بواسطة مستقبلات تول 5. الطبيعة 410، 1099-1103 (2001).
بوغونوفيتش، م. وآخرون. تعبر الخلايا المعوية الصماء عن مستقبلات شبيهة بالتول الوظيفية. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. علم وظائف الأعضاء المعوية والكبد 7032، 1770-1783 (2007).
لوندبرغ، ج. م. وآخرون. تحديد موقع الببتيد YY (PYY) في خلايا الغدد الصماء المعوية وتأثيراته على تدفق الدم المعوي والحركة. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 79، 4471-4475 (1982).
جيهارت، هـ. وآخرون. تحديد المنظمات المعوية الصماء من خلال رسم خرائط تمايز الخلايا الفردية في الوقت الحقيقي. خلية 176، 1158-1173 (2019).
بيلينغ، ل. ج. وآخرون. تحليل النسخ الجيني على مستوى الخلية الواحدة لخلايا الأمعاء الغليظة المفرزة للهرمونات في الفئران – تحديد المحفزات الانتقائية للخلايا التي تعبر عن الببتيد الشبيه بالأنسولين-5 والببتيد الشبيه بالجلوكاجون-1. موليكولار ميتابوليزم 29، 158-169 (2019).
لي، هـ. ج. وآخرون. تعبير Neurod1 في الأمعاء يعيق تمايز خلايا بانث ويعزز تحديد سلالة الأمعاء الصماء. تقارير العلوم 9، 19489 (2019).
ري، س. هـ. وآخرون. الدور الفيزيولوجي المرضي لتفاعل مستقبلات Toll-like 5 مع الفلاجيلين البكتيري في الالتهاب القولوني. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 102، 13610-13615 (2005).
سون، ج.، فيغان، ب. إي.، ديساي، أ. س.، مادارا، ج. ل. وهوبيرت، م. إي. التحمل الناتج عن الفلاجيلين لمسار الإشارات لمستقبلات تول 5 في خلايا الظهارة المعوية المستقطبة. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. وظائف الكبد والجهاز الهضمي 292، G767-G778 (2007).
كلاسن، س. ج. وآخرون. التعرف الصامت على الفلاجيلينات من بكتيريا الأمعاء المتعايشة البشرية بواسطة مستقبلات المناعة من النوع Toll-5. ساي. إيمونول. 8، eabq7001 (2023).
ياو، ز. وآخرون. أطلس عالي الدقة للتعبير الجيني والمكاني لأنواع الخلايا في دماغ الفأر بالكامل. ناتشر 624، 317-332 (2023).
راكوف-ناهوم، س.، باجلينو، ج.، إسلامي-فارزانه، ف.، إيدبرغ، س. وميدزهيتوف، ر. التعرف على الميكروبات المتعايشة بواسطة مستقبلات شبيهة التول ضروري للحفاظ على توازن الأمعاء. خلية 118، 229-241 (2004).
دونغ، ت. إكس. وآخرون. ديناميات الكالسيوم في خلايا T المرئية في فأر ناقل tdTomato-GCaMP6f بتقنية النسبة. إيليف 6، e32417 (2017).
باترهام، ر. ل. وآخرون. هرمون الأمعاء PYY3-36 يثبط تناول الطعام بشكل فسيولوجي. نيتشر 418، 650-654 (2002).
أبوت، سي. آر. وآخرون. حجب مستقبل الببتيد العصبي Y Y 2 باستخدام المضاد المحدد BIIEO246 يقلل من تأثير الببتيد YY (3-36) الداخلي والخارجي على تناول الطعام. أبحاث الدماغ. 1043، 139-144 (2005).
كودا، س. وآخرون. دور العصب المبهم في تقليل التغذية الناتج عن PYY3-36 المحيطي في الجرذان. الغدد الصماء 146، 2369-2375 (2005).
ألونسو، أ. م. وآخرون. العصب المبهم يتوسط التأثيرات الفسيولوجية ولكن ليس التأثيرات الدوائية لـ PYY3-36 على تناول الطعام. موليكولار ميتابوليزم 81، 101895 (2024).
كايلبرر، م. م.، روبرخت، ل. إ.، ليو، و. و.، وينغ، ب. و بوهوركويز، ف. د. خلايا النيوروبود: بيولوجيا ناشئة لنقل الحواس من الأمعاء إلى الدماغ. مراجعة سنوية لعلم الأعصاب 43، 337-353 (2020).
هان، و. وآخرون. دائرة عصبية للمكافأة الناتجة عن الأمعاء. خلية 175، 665-678 (2018).
باي، ل. وآخرون. التعرف الجيني على خلايا الأعصاب الحسية المبهمة التي تتحكم في التغذية. خلية 179، 1129-1143 (2019).
مكدوجل، م. وآخرون. دوائر الأمعاء والدماغ المنفصلة لتعزيز الدهون والسكر تتحد لتعزيز الإفراط في تناول الطعام. خلية الأيض. 36، 393-407 (2024).
ويليامز، إ. ك. ك. وآخرون. خلايا عصبية حسية تكتشف التمدد والمواد الغذائية في الجهاز الهضمي. خلية 166، 209-221 (2016).
تشاو، ق. وآخرون. بنية ترميز متعددة الأبعاد لنظام الإحساس الداخلي المبهم. ناتشر 603، 878-884 (2022).
لوتشينسكي، ب. وآخرون. النشأة في فقاعة: استخدام الحيوانات الخالية من الجراثيم لتقييم تأثير ميكروبيوتا الأمعاء على الدماغ والسلوك. المجلة الدولية لعلم النفس العصبي وعلم الأدوية. 19، pywO2O (2016).
ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسبية-غير التجارية-بدون اشتقاقات 4.0 الدولية، التي تسمح بأي استخدام غير تجاري، ومشاركة، وتوزيع، وإعادة إنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح إذا قمت بتعديل المادة المرخصة. ليس لديك إذن بموجب هذه الرخصة لمشاركة المواد المعدلة المشتقة من هذه المقالة أو أجزاء منها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/. (ج) المؤلف(ون) 2025
طرق
سلالات الفئران
تم إجراء جميع التجارب على الفئران بعد الحصول على موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز ديوك الطبي وفقًا للبروتوكول A212-21-10. تم إيواء الفئران في مجموعات في قسم موارد الحيوانات المخبرية بجامعة ديوك، حيث تم الاحتفاظ بها على دورة ضوء-ظلام (0700-1900) مع الوصول إلى الماء وطعام الفئران القياسي (Purina 5001) بحرية، ما لم يُذكر خلاف ذلك. حافظت المنشأة على درجة حرارة محيطة منورطوبةتم استخدام ذكور وإناث الفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 6-20 أسبوعًا في جميع التجارب. تم شراء سلالات الفئران التجريبية التالية أو استلامها أو تربيتها داخليًا واستخدامها مباشرة: C57BL6/J (JAX 000664)، PYY-GFPCCK-GFPبينيويرود1-كري (JAX 028364)، كاسيت لوكس بي-توقف-لوكس بي (LSL)_تي دي توماتو (JAX 007914)، LSL_هالو-واي إف بي (JAX 014539)، LSL_تش آر 2-تي دي توماتو (JAX 012567)، LSL_سالسا6ف (JAX 031968)، تير (JAX 028599)، Myd88 (JAX 008888)، B6.Cg-Snap25 ج (JAX 025111) وفوس030323). تم تربية سلالات الفئران المزدوجة المتحولة وراثيًا التالية داخليًا: Pyy;سالسا6ف، نيورو دي 1-كري_سالسا6ف، بي واي واي;هالو-YFP و Pyy; ChR2-tdTomato. Pyy تم تربية الفئران أيضًا لتكون floxed Tlr5 (فلوكسيد إكسون 4) و Myd88 فئران (فلوكسد إكسون 3) لإنشاء الفئران المعدلة وراثيًا الشرطية التالية: Pyyتيلر و بي مايد88.
فصل وعزل خلايا الظهارة المعوية الفردية
تم فصل القولون والأمعاء الدقيقة للفئران من أجل qPCR (PYYGFP) ، تصوير الكالسيوم (Pyycre;Salsa6f) أو التسلسل (CCK-GFP و PYY-GFP) كما هو موصوف سابقًا.باختصار، تم إزالة القولون بالكامل أو الثلث القريب من الأمعاء الدقيقة، وتم شطفه بمحلول PBS بارد وقطعه إلىالأقسام. تم شطف الأنسجة بمحلول PBS البارد ثم تم هزها في 1.5 مللي مولار EDTA في PBS لمدة 30 دقيقة قبلالحضانة فيثم تم فصل الطبقة الظهارية ميكانيكياً عن طبقة العضلات عن طريق الاهتزاز في محلول PBS بارد. بعد ذلك، تم الطرد المركزي عند. (Eppendorf 5702 RH ؛ الدوار A-4-38)، تم إعادة تعليق الرواسب وتم حضنها في HBSS (Gibco) مع الديسباس والكولاجيناز لمدة 10 دقائق فيثم تم طرد العينات مركزيًا (800 دورة في الدقيقة)، وتم تصفيتها مرتين من خلال و تصفية، وإعادة تعليقها في وسط L15 (FBSهيبزبنسيلين ستربتوميسينمنتم استخدام DNase لإنتاج تعليق خلوى مفرد لمزيد من التحليل. بالنسبة لتحليلات الطبقة الظهارية الكاملة، تم أولاً إعادة تعليق الرواسب في محلول التحلل وتمت معالجتها لاحقًا لاستخراج RNA.
فصل وعزل خلايا العقدة الفردية
تم فصل الخلايا العصبية العقدية للفئران لإجراء qPCR (C57BL/6J) أو تصوير الكالسيوم (NeuroD1-Cre;Salsa6f) أو التسلسل (C57BL/6J) كما تم وصفه سابقًا.باختصار، تم تشريح العقد العقدية ووضعها على الفور فيمحلول تفكك العقد العصبية يحتوي على 10 مللي مول من HEPES،جلوتامينمكملمكملعامل نمو الأعصاب وليبرس (روش، 5401054001) في DMEM/F-12 المتقدم. بعد الهضم، تم شطف العقد مرتين بمحلول PBS، وتم تفكيكها ميكانيكياً في محلول التفكيك، وتم تصفيتها من خلالمنخل الخلايا. ثم تم وضع المحلول المفصول بعناية على تدرج كثافة من و بيركول (سيغما) وتم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عندعند درجة حرارة الغرفة. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي، الجزء العلويتمت إزالته، وتم إضافة محلول تفكيك طازج. ثم تم طرد الخلايا مركزيًا لمدة 15 دقيقة عند، وتم إعادة تعليق الكريات النهائية فيPBS بلس.
تسلسل RNA
تم استخراج RNA من تعليقات الخلايا الفردية باستخدام مجموعة تنقية RNA للخلايا الفردية (Norgen). تم تقييم جميع العينات باستخدام جهاز Bioanalyzer (Agilent)، وتم قبول العينات التي حصلت على درجات رقم سلامة RNA فقط.تم استخدامها للتحليل اللاحق. نظرًا لندرة تم استخدام تسلسل باركود RNA أحادي الخلية لإنشاء المكتبات. تم تسلسل المكتبات على جهاز Illumina NextSeq 500. تم استخدام STAR مع الجينوم المرجعي للفأر mm10 لمحاذاة القراءات، وتم إنشاء جداول العد باستخدام featureCounts. تم إجراء مقارنات ثنائية بين الجينات من PYY-و PYY-تم إنشاء المجموعات باستخدام DESeq2. تم إجراء تحليلات علم وظائف الجينات باستخدام topGO.
qPCR
تم فصل الظهارة القولونية لفئران PYY-GFP، وتم فرز الخلايا كما هو موضح أعلاه. وتم استخدام عدد متساوٍ منوتم جمع الخلايا مباشرة في محلول التحلل. تم فصل الظهارة بالكامل من و تم جمع الأشقاء الضابطة في محلول التحلل كما هو موضح أعلاه. تم تشريح العقدة اللمفاوية وتجميدها بسرعة في النيتروجين السائل. تم استخراج RNA بناءً على بروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعة RNeasy Micro Plus (Qiagen رقم 74034). تم جمع أنسجة الطحال والقولون بالكامل وتفتيتها في مادة TRIzol (Thermo Fisher، 15596026)، وتم استخراج RNA وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إنتاج cDNA وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام مجموعة تحويل النسخ العكسي cDNA عالية السعة (Applied Biosystems، 4368814). تم استخدام مجسات TaqMan التالية لتحديد النسخ: Pyy (Mm00520716_g1)، 18s (Mm03928990_g1)، Tlr1 (Mm00446095_m1، Mm01208874_m1)، Tlr2 (Mm00442346_m1، Mm01213946_g1)، Tlr3 (Mm01207404_m1)، Tlr4 (Mm00445273_m1)، Tlr5 (Mm00546288_s1)، Actb (Mm02619580_g1)، Tnf (Mm00443258_m1)، Illb (Mm00434228_m1)، Il6 (Mm00446190_m1)، Tjp1 (Mm01320638)، Tjp2 ( )، Ocln ( Mm 00500910 مل ) و Cldn ( Mm 01342184 ). تم إجراء qPCR على نظام StepOnePlus (ثيرمو فيشر)، باستخدام TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (أبلايد بيوسيستمز رقم 4352042) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد معدل النسخ كـ أو مقارنة كتغيير مضاعف باستخدامجميع القيم مُبلغ عنها كمتوسط ± الانحراف المعياري القياسي.
الهجين في الموقع مع التألق المناعي
تمت عملية غسل القلب لمجموعة الفئران NeuroD1_tdTomato و PYY-GFP بمحلول PBS لمدة 3 دقائق متتالية تلتهالمدة 3 دقائق بمعدلتم جمع الأمعاء بالكامل، وفتحها بالطول وتقسيمها إلى أقسام مختلفة: الثلث القريب، والثلث الأوسط، والثلث البعيد من الأمعاء الدقيقة؛ ونصف الأمعاء الغليظة القريب والبعيد. ثم تم لف نسيج الأمعاء بحيث يكون الطرف القريب في المركز، وتم تثبيته بعد ذلك فييرجى العثور على 24 ساعة. تم تشريح العقد العقدية والعقد الجذرية الظهرية على مستويات L5 وL6 وS1 بشكل ثنائي. تم شطف العقد العصبية في PBS وثبتت بعد ذلك فييرجى العثور على 24 ساعة. تم بعد ذلك تجفيف الأنسجة في السكروز لمدة ساعة واحدة و السكروز لمدة لا تقل عن 12 ساعة. تم تضمين العينات في OCT (VWR) وتخزينها فيتم قطع الأنسجة إلى شرائح على الشرائح فيباستخدام جهاز التبريد. تم إجراء كشف RNA باستخدام مجموعة كاشف الفلورسنت المتعدد RNAscope v2 (ACD). باختصار، تم خبز شرائح الأنسجة لمدة 30 دقيقة عند، ومثبت في الفورمالين المحايد المدعوم (VWR) لمدة 60 دقيقة قبل أن يتم غسله في PBS مرتين (Sigma). ثم تم تجفيف الشرائح باستخدام غسلات كحول متتالية من و وثانيالإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منها. ثم تم تحضين الشرائح مع بيروكسيد الهيدروجين لمدة 10 دقائق قبل أن تخضع لاسترجاع الهدف باستخدام مواد RNAscope في جهاز بخار. تم غمر الشرائح في محلول استرجاع الهدف الخاص بـ RNAscope فيلمدة 5 دقائق. ثم تم معالجة الشرائح بالبروتياز III لمدة 30 دقيقة عندقبل خطوات التهجين والتضخيم اللاحقة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم شراء المجسات المستخدمة جميعها من ACD: Mm-Tlr5 (رقم الكتالوج 468888)، Mm-Pyy-C3 (رقم الكتالوج 420681) وMm-Npy2r (رقم الكتالوج 515431). تم الكشف عن إشارة التهجين باستخدام أصباغ أوبال (Akoya Biosciences) بتركيز 1:1,500. ثم تم حجب الأنسجة في مصل الحمار بنسبة 10% (Jackson ImmunoResearch) لمدة ساعة واحدة. ثم تم حضن الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية المذابة في محلول تخفيف الأجسام المضادة (PBS مع BSA و ترايتون X-100) لمدة 24 ساعة في، تليها ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كانت الأجسام المضادة الأولية والتخفيفات كما يلي: Rb-anti-PYY (1:250؛ هدية من ليدل المختبر)، Rb-مضاد-PGP9.5 (1:500؛ أبكام: ab27053)، Gt-مضاد-سيروتونين (1:500؛ أبكام، ab66047) وCHK-مضاد-GFP (1:500؛ أبكام: ab13970). بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، تم غسل الأنسجة فيتمت معالجة Tween-20 في محلول TBS (TBST) ثم تم الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية في محلول تخفيف الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة: Dk-anti-Rb-488 (1:250، رقم الكتالوج 711-546-152)، Dk-anti-Rb-Cy3 (1:250، رقم الكتالوج 11-166-152)، Dk-anti-Ck-488 (1:250، رقم الكتالوج 703-546-155)، Dk-anti-Gt-647 (1:500، رقم الكتالوج 705-606-147)، جميعها من جاكسون إيمونوريسيرش. ثم تم غسل الأنسجة باستخدام TBST، وتم صبغها بـ DAPI (1:4000) لمدة 10 دقائق، وغسلها في TBST، وتم تثبيتها باستخدام Fluoro-Gel مع محلول Tris (علوم المجهر الإلكتروني). تم إجراء التصوير باستخدام مجهر زيس 880 Airyscan المقلوب. تم ضبط الصور من حيث السطوع والتباين باستخدام ImageJ (Fiji V.2.9.0). في كل منطقة من الأمعاء، تم تحليل 50 خلية الأقرب من إجماليفئران. خلايا معتم اعتبار النقاط داخل جسم الخلية إيجابية للجين. تم استخدام شرائح التحكم باستخدام مجسات التحكم السلبية (ACD) لضمان أن الصبغة الخلفية كانتنقاط لكل خلية. يتم تقديم الأعداد كنسبة مئوية متوسطة للتداخل ± الانحراف المعياري.
تقييم الأنماط الأساسية
وتم وزن صغارهم الذين لا يحملون جين Cre بعد الفطام، وكل أسبوع بعد ذلك حتى بلوغهم 3 أشهر من العمر. ثم تم euthanize الفئران، وتم قياس طول القولون ووزن القولون ووزن الطحال. تم شطف الأنسجة القولونية بمحلول PBS بارد، وتم حضنها في فورمالين مخفف محايد (VWR) لـفيتم تجفيفها في سلسلة متدرجة من الإيثانول وتضمينها في البارافين. تم قطع الأنسجة وصبغها بالهيماتوكسيلين والإيوزين (Abcam، ab245880) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة وتم تصويرها لتقييم الأنماط الظاهرية التنموية والمناعية.
قياس تناول الطعام
مطابق للعمرتم وضع الفئران وأشقائها في أقفاص نظيفة مع حاويات طعام. تم تصميم الحاويات لتقليل قدرة الفئران على إزالة الكريات بالكامل. تم تسجيل وزن الطعام في الحاوية في بداية ونهاية فترة 24 ساعة. ثم تم إعادة الفئران إلى قفصها المنزلي لمدة لا تقل عن يومين قبل تكرار الاختبار مرتين أخريين. يتم الإبلاغ عن متوسط ثلاثة أيام اختبار منفصلة لكل فأر فردي.
تحليل مفصل لنمط التغذية والنشاط والوجبات
مطابق في العمر والجنس وتم وضع أشقائهم من نوع Crenegative في نظام تصنيف سلوكي PhenoMaster مصمم خصيصًا لمدة 10 أيام (أنظمة TSE). اعتُبرت الأسبوع الأول فترة تأقلم، وتم إجراء جميع تحليلات نمط الوجبات في الأيام الثلاثة الأخيرة داخل النظام. تم برمجة PhenoMaster (إصدار البرنامج 6.6.9) للحفاظ تلقائيًا على دورة ضوء (07:00 تشغيل الأضواء؛ 19:00 إيقاف الأضواء)، والتحكم في درجة الحرارة ( ) والتحكم في الرطوبة ( ). يحتوي جهاز PhenoMaster على 12 قفصًا شفافًا، حيث تم إيواء الحيوانات بشكل فردي. تم غسل الأقفاص صناعيًا، وتم استبدال الفراش (ALPHA-dri) أسبوعيًا. تم تزويد الحيوانات بطعام الفئران القياسي (Purina 5001) ومياه التناضح العكسي بحرية. كما احتوت جميع الأقفاص على جهاز إثراء، والذي كان أيضًا يستخدم لوزن الحيوانات. تم توصيل حاوية الطعام، زجاجة الماء وحاوية الوزن بأجهزة استشعار الوزن (TSE). تم قياس تناول الطعام، تناول الماء والوزن تلقائيًا كل 5 ثوانٍ لأقرب 0.01 جرام. بالنسبة لقياسات الشرب، تم السماح بفترة تنعيم بحد أقصى لفارق عدد التحويل من التناظرية إلى الرقمية الخام قدره 40,000. بالنسبة لقياسات الوزن، تم السماح بفترة تنعيم مدتها 15 ثانية مع عتبة قدرها 15 جرامًا وحد أقصى لفارق عدد التحويل من التناظرية إلى الرقمية الخام قدره 1,000,000. تم قياس المدخول كل 5 ثوانٍ وتجميعه كل دقيقة للتحليلات ما لم يُذكر خلاف ذلك. تم تحديد نشاط الحيوان من خلال الأشعة المتقاطعة في و طائرات وتم جمعها معمعدل المسح. ما لم يُذكر خلاف ذلك، كانت جميع قياسات النشاط، وتناول الطعام، وتناول الماء تم تجميع البيانات في فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة للتحليل. تم تصحيح البيانات للتقلبات الطفيفة من خلال السماح فقط بدالة متزايدة بشكل أحادي لكل من تناول الطعام والماء: القيم التي تمثل تناول الطعام السلبي تم استبدالها بأحدث قيمة. تم تعريف حجم الوجبة وتكرارها وتوقيتها بناءً على المعايير داخل نظام PhenoMaster. كانت الفترات بين الوجبات مطلوبة أن تكون. فقط وجبات بحجم ومعدلتم تضمينها في تحليل نمط الوجبات.
فحص سكر الدم الصائم واختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم
تم قياس مستوى الجلوكوز في الدم في مجموعة متطابقة في العمر و الفئران التي تتبع صيامًا ليليًا لمدة 18 ساعة. لاختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم، تم حرمان مجموعة منفصلة من الفئران من الطعام والماء لمدة 5 ساعات. ثم تم إعطاء الفئران سكر السكروز عن طريق الفم.تم قياس مستوى الجلوكوز في الدم (جهاز قياس جلوكوز الدم True Metrix 60) بعد الحرمان، و15 و30 و60 و90 و120 دقيقة بعد إعطاء الجرعة.
قياسات الليبوكالين-2 البرازي
تم تقييم التهاب القولون من خلال قياس الليبوكالين-2 في البراز باستخدام اختبار ELISA (راي بيوتيك). تم جمع عينات البراز من أشخاص متطابقين في العمر.وتم استخدام ضوابط سلبية لـ Cre خلال بداية دورة الضوء. تم إعادة تكوين عينات البراز في PBS إلى تركيز نهائي منثم تم تدويرها لمدة 5 دقائق للحصول على خليط متجانس. بعد ذلك، تم طرد المادة البرازية مركزيًا لمدة 10 دقائق عندتم جمع السوبرناتانت وتخزينه فيتم تقييم مستويات ليبوكالين-2 وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، وتم قياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر (تيكان إنفينيت 200 برو).
اختبار الميالوبيروكسيداز القولوني
تم تقييم نشاط العدلات في الأنسجة من خلال اختبار النشاط الإنزيمي للميولوبيروكسيداز باستخدام مجموعة ملونة (Abcam).جزء من القولون البعيد من الأفراد المتطابقين في العمر والجنستم تشريح الأنسجة والأشقاء ووزنها. ثم تم غسل الأنسجة في PBS، وتم تجانسها ميكانيكياً في محلول التحلل المقدم في المجموعة. ثم تم تجميد الأنسجة وإذابتها مرتين وتم استخدام الموجات فوق الصوتية. تم تقييم نشاط الميالوبيروكسيداز وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة وتم تطبيعه على كتلة الأنسجة، وتم قياس الكثافة الضوئية عند 450 نانومتر (Tecan Infinite 200 Pro).
قياس هرمونات المصل
متطابق في العمرتم صيام مجموعة الشهادات السلبية لمدة 15 ساعة ثم تم إطعامها بحرية لمدة ساعتين. بعد فترة إعادة التغذية، تم euthanizing الفئران، وتم جمع المصل. تم إضافة مثبط DPP-4 والأبروتينين إلى عينات المصل لمنع تحلل الببتيدات. تم تقييم مستويات PYY3-36 الكلية (RayBiotech) وGLP-1 الكلي (Alpco) باستخدام ELISA وفقًا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
اختبار الفلاجيلين في البراز
تم تقييم مستويات الفلاجيلين باستخدام خلايا HEK-Blue-mTLR5 (إنفيوجن). تم جمع البراز من نوع بري مطابق في العمر،والمراقبة السلبية لكرات الدم الحمراء خلال بداية دورة الضوء، بعد التغذية الحرة، صيام لمدة 18 ساعة طوال الليل أو صيام لمدة 18 ساعة طوال الليل متبوعًا بحقنة شرجية من الفلاجيلين (فيتم إعادة تعليق المادة البرازية في PBS إلى تركيز نهائي منتم خلط المحاليل ميكانيكياً وتم تدويرها لمدة 5 دقائق لتكوين تعليق. ثم تم طرد العينات مركزياً عندلمدة دقيقتين، وتم جمع المصل إما لتقييمه على الفور أو تخزينه فيللاختبار لاحقًا. تم وضع تخفيفات متسلسلة من المحلول على خلايا HEK-TLR5، وتم استخدام الفلاجيلين النقي من S. typhimurium (Invivogen) لإنشاء منحنى قياسي. بعد 18 ساعة من التحفيز، تم تطبيق سوائل زراعة الخلايا على وسط QUANTI-Blue وتم حضنه لمدة 30 دقيقة عندتم قياس نشاط الفوسفاتاز القلوي QUANTI-Blue عند 620 نانومتر (Tecan Infinite 200 Pro).
تصوير الكالسيوم للخلايا المفصولة
بالنسبة للخلايا العصبية، تم فصل خلايا الأعصاب العقدية NeuroD1-Cre_Salsa6f كما هو موضح أعلاه. تم زرع الخلايا العصبية علىشرائح زجاجية ووُضعت فيالحاضنة طوال الليل. الوسط العصبي المضمن:جلوتا ماكس، 10 مللي مول HEPES،البنسلين-ستربتوميسينمكملمكملعامل نمو الأعصاب في DMEM/F-12 المتقدم. تم تصوير الخلاياأيام بعد الزراعة. بالنسبة للخلايا المعوية الصماء، تم فصل خلايا Neurod1Cre_Salsa6f كما هو موضح أعلاه وتم فرزها بالفلوريسنس (BD FACSAria)، مع اختيار خلايا tdTomato.خلايا فلورية. ثم تم زرع الخلايا على شرائح زجاجية مغطاة بـماتريجيل (كورنينج رقم 356231). تم تصوير الخلايا المعوية الصماءبعد الزرع. تم غسل الخلايا مرتين في محلول التصويرهيبز، 10 مللي مول من الجلوكوز؛ ) وتم وضعها في الظلام لمدة 5 دقائق حتى وصلت إلى درجة حرارة الغرفة. ثم تم وضع الشرائح الزجاجية في غرفة التسجيل لجهاز Zeiss Examiner Z1 وتم تصويرها بكاميرا هاماماتسو (Orca-flash4.0؛ C11440) باستخدام حزمة برامج Zeiss ZEN Blue. تم الحصول على صور انبعاث GCaMP6f باستخدام التحفيز. تم جمع الصور في فترات مع وقت التعرض. كانت كل تسجيلات مدتها 180 ثانية، مع تحفيز يتم ضخه بين 30 و 60 ثانية. تم ضخ محلول التصوير بشكل مستمر (حوالي ) فوق الشرائح الزجاجية طوال جلسة التصوير. خضعت كل شريحة زجاجية لأربع تسجيلات: محلول عازل، محفز اختبار، تكرار محفز الاختبار، و KCl. انتهت كل جلسة تسجيل بـ 50 مليمول من KCl كتحكم في النشاط (تم تحقيق تركيز KCl عن طريق الاستبدال بـ NaCl، وليس بإضافة المزيد من KCl). تم تعريف الاستجابة لـ KCl كنسبة زيادة فوق المستوى الأساسي. لم يتم تضمين الخلايا التي لم تصل إلى هذا العتبة من KCl في التحليلات. تم إجراء فترة غسيل لمدة 5 دقائق مع تدفق مستمر لمحلول التصوير بين المحفزين التجريبيين. بالنسبة للتجارب التي تتضمن مثبط TLR5، تم إضافة TH1020 إلى البئر للوصول إلى تركيز نهائي منبعد فترة الغسيل. تم إيقاف تدفق العازل، وتم حضانة الخلايا مع المثبط لمدة 10 دقائق قبل استئناف التدفق وإعادة الاختبار مع المحفز.
التحليل. تم حساب قيم الفلورية لكل خلية فردية كمتوسط شدة الفلورية في منطقة اهتمام محددة من قبل المستخدم على برنامج فيجي. ثم تم حساب التغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا كـفي الذي هو متوسط شدة الخلية خلال الخمسة عشر ثانية الأولى. ثم تم تطبيع القيم النسبية إلى استجابة ذروة KCl. تم تعريف الاستجابة الإيجابية على أنها زيادة في النسبة.فوق الخط الأساسي.
اختبار إفراز PYY
تم تشريح القولون من الفئران ذات النوع البري والفئران المعدلة وراثيًا، وغسله بمحلول PBS البارد، وفتحه بالطول وقطعه إلى قطع بحجم حوالي 1 سم. تم حضانة قطع الأنسجة على الثلج في محلول PBS لمدة ساعتين قبل الحضانة مع 1.5 مللي مولار EDTA على الثلج لمدة 30 دقيقة، ثملمدة 15 دقيقة. تم فصل الكهوف عن طريق الاهتزاز في PBS بارد، وتم جمعها في راسبومُزَيَّن علىشرائح زجاجية مغطاة بـماتريجيل (رقم كورنينج 356231). ثم تم حضن الكهوف فيذاكرة L-WRN (ATCC) معY-27632 (إنزو) لمدة 16 ساعة قبل التحفيز. ثم تم تحفيز الكهوف باستخدام المحلول.“10 مللي مولار هيبيس، 10 مللي مولار جلوكوز”،الفلاجيلين في المحلول، أو مزيج من M IBMX (سيغما) و 1 نانومتر فورسكولين (سيغما) في المحلول لمدة 30 دقيقة عند تم جمع السائل العلوي، ثم تم حضن الخبايا في محلول التحلل لمدة 30 دقيقة فيتم جمع lysate، وتمت عملية الطرد المركزي لكل من lysate والسائل الفائق لمدة 10 دقائق عندلإزالة المواد غير القابلة للذوبان، وتخزينها فيلمدة تصل إلى أسبوعين. تم تقييم تركيز PYY في العينات باستخدام مجموعة ELISA لـ PYY (راي بيوتيك) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء كل حالة تجريبية في نسختين على كل لوحة. تم تشغيل معيار PYY لكل لوحة. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر على جهاز قراءة اللوحات (تيكان إنفينيت 200 برو). تم حساب كمية وتركيز PYY. تم حساب إفراز PYY باستخدام المنحنى القياسي. تم حساب إفراز PYY كالتالي: السائل الفائق / (السائل الفائق + lysate).
تسجيلات العصب المبهم
تم إجراء تسجيلات للأعصاب الكاملة في الفئران من النوع البري،فئران هالو-واي إف بي; فئران ChR2، ; فئران; الفئران والضوابط الجينية السلبية. تم إجراء تسجيلات الكهربية العصبية الكاملة للعصب المبهم العنقي كما تم الإبلاغ عنه سابقًا.تم إدخال إبرة تغذية من عيار 20 مع أنبوبين متصلين لتوصيل محلول PBS والمنبهات جراحيًا من خلال جدار السليلة إلى القولون القريب. تم عمل شق لخروج المحلول بالقرب من المستقيم للقولون. تم استخراج كريات البراز بلطف من القولون باستخدام أعواد قطنية. تم ضخ محلول PBS باستمرار عبر المنطقة المعزولة من الأمعاء بمعدل حواليكخط أساسي وتحكم في ضغط الحجم. تم تطبيق ظروف التحفيز بعد تسجيل نشاط أساسي لمدة دقيقتين. خلال ظروف التحفيز، كان تدفق PBS مستمراً، ومنتم ضخ الفلاجيلين على مدى دقيقة واحدة باستخدام مضخة حقن (Fusion 200، Chemyx). كتحكم إيجابي لتنشيط العصب المبهم من تجويف القولون، تم ضخ إنتراليبيد (7%، سيغما).
جمع البيانات. تم تسجيل الجهد خارج الخلية كما تم وصفه سابقًا.تم تحليل البيانات الخام باستخدام Spike Tailor، وهو برنامج مخصص بلغة MATLAB (Mathworks).تم الكشف عن النبضات باستخدام عتبة تم تحديدها بناءً على جذر متوسط مربع الضوضاء. تم حساب معدل إطلاق النار باستخدام خوارزمية تنعيم نواة غاوسية فيصناديق.
تثبيط وتحفيز الأوبتوجينيتك. تم تمرير ألياف القولون الضوئية الإلكترونية عبر إبرة التغذية إلى تجويف القولون. تم تطبيق تحفيز الميكرو LED بالتزامن مع ضخ المغذيات. تم نبض الميكرو LED لمدة دقيقة واحدة عندذروةدورة العمل ( ).
التثبيط الدوائي. بعد تسجيل استجابة ما قبل التثبيط، تم توصيل المثبط على مدىبي آي آي إي-0246وتم السماح له بالت incubate لمدة 10 دقائق قبل إعادة حقن الفلاجيلين.
تحليل البيانات. تم قياس استجابة التحفيز كأقصى معدل إطلاق نار بعد التحفيز (ظروف المنبه) أو أثناء التسجيل (الخط الأساسي). كانت كل تجربة تعمل كتحكم خاص بها من خلال تطبيع معدل الإطلاق إلى معدل الإطلاق الأساسي قبل التحفيز (أول دقيقتين من التسجيل). طوال التجارب، تم استخدام استجابة الإينتراليبيد كتحكم إيجابي. بالنسبة لجميع ظروف التحفيز الغذائي والليزر، تم استبعاد البيانات إذا لم تُلاحظ استجابة الإينتراليبيد طوال جلسة التسجيل. تم تحليل أقصى معدل إطلاق نار ومساحة تحت المنحنى عبر ظروف التحفيز.
تصنيع ألياف القولون الضوئية الإلكترونية
بدأت عملية تجميع الشكل الأولي للألياف الضوئية ذات المؤشر المتدرج من خلال تشكيل حبيبات بولي ستيرين-كتلة-بولي (إيثين-كوبوتادين)-كتلة-بولي ستيرين (SEBS) (Kraton G1657M) في أنماط هندسية مرغوبة في قالب ألومنيوم مقلوب تم تصنيعه باستخدام CNC في لمدة 8 ساعات تحت الفراغ. الطبقة العلوية حددت القنوات المربعة المجوفة ( ) بحجم فتحة 4 مم لاستضافة الأسلاك الدقيقة المتصلة. تم بعد ذلك تبطين قنوات التقارب SEBS بطبقة من PC على شكل U بسمك جدار 1 مم وحجم قناة تم إنتاجه بواسطة عملية تشغيل CNC القياسية. تم دمج هذا الشكل الأولي في فرن، 45 دقيقة) ثم تم تحويلها إلى ألياف ميكروسكوبية بطول عدة أمتار بنسبة تقليل الحجم من، بينما يتم تغذية ثلاثة بكرة في نفس الوقتأسلاك دقيقة.
تصنيع جهاز الألياف. بدأ تصنيع جهاز الألياف ذات المؤشر المتدرج بإذابة طبقة SEBS في 1 سم البعيد من الألياف. (طول إجمالي 8.5 سم) في ثنائي كلوريد الميثيل لمدة 10 دقائق، مما كشف عن الأسلاك الدقيقة المتصلة. تم لحام الوصلات بعد ذلك على دبابيس رأس ذكر تم تجميعها داخل صندوق مطبوع بتقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد مخصص. ) وتم تأمينها باستخدام الإيبوكسي القابل للتصلب بالأشعة فوق البنفسجية. تم كشف حوالي 0.5 سم من الأسلاك الدقيقة المتصلة من خلال المعالجة المنخفضة باستخدام شفرة حلاقة في الطرف البعيد من الألياف تحت المجهر الضوئي، تلاها تركيب اللون الأزرق ( أقصى انبعاث) وأخضر (أقصى انبعاث 532 نانومتر)شرائح microLED (CREE TR2227 و SR2130) باستخدام لاصق فضي ثنائي المكونات (Epo-tek). بعد ذلك،طبقة من الباريلين-C المترسب بالبخار حددت طبقة حاجز السوائل الحيوية. أخيرًا، تم تغليف الجهاز في حواليطبقة من السيليكون الطبي عن طريق إدخال جهاز الألياف في أنبوب PTFE بقطر داخلي يبلغ 0.8 مم، والذي عمل كقالب تضحوي. تم ملء خليط السيليكون وتصلبه في الأنبوب، وبعد ذلك تم قطع الأنبوب لانتاج جهاز ناعم مغطى بالسيليكون. كان طول الألياف النهائي 8.5 سم مع ثلاثة مصابيح LED صغيرة باللونين الأخضر والأزرق مستضافة على 2 سم النهائية من الألياف بفصل 1 سم.
تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الجسم الحي وتحليل النشاط الزمني بواسطة التهجين الموضعي الفلوري
تم استخدام فئران ثلاثية الجينات Snap25-FosTRAP-tdTomato لإنشاء علامة tdTomatoعصبونات العقدة الوعائية لتحليل النشاط الزمني بواسطة التهجين الموضعي الفلوري (catFISH) من خلال إعادة التركيب المستهدفة في مجموعات نشطة (TRAP) قبل 10 أيام على الأقل من تصوير الكالسيوم كما هو موصوف سابقًا..باختصار، تم إعطاء الفئران التي صامت لمدة 6 ساعات تسريبات داخل المعدة من المغذياتقبل بدء دورة الظلام. بعد 3 ساعات من تسليم المحفز، تم حقن الفئران بـ 4-هيدروكسي تاموكسيفين (, داخل البطن؛ سيغما) لتحفيز تعبير tdTomato في مجموعة فرعية من عصبونات الحسية الوعائية المستجيبة للمغذيات، مما يسمح بتحديد العلامات والمحاذاة بعد ذلك. تم إعادة تقديم الطعام بعد 3 ساعات من حقن 4-هيدروكسي تاموكسيفين. بالنسبة لتصوير الكالسيوم، تم صيام الفئران طوال الليل (18 ساعة) وتم الحفاظ عليها تحت تخدير مستمر (إيزوفلوران-أكسجين) على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم طوال الإجراء. تم إجراء شق بطني أولاً في الفئران المخدرة لكشف الأعور والقولون. تم إدخال إبرة تغذية مقاس 20 جرا مع أنبوبين مزدوجين لتروية PBS وتوصيل المحفز جراحيًا عبر جدار الأعور إلى القولون القريب وتأمينها بخياطة. تم قطع المستقيم لإنشاء مخرج لتصريف السوائل. تم طرد كريات البراز برفق من القولون باستخدام تطبيقات قطنية. بعد ذلك، تم إجراء شق (حوالي 2 سم) فوق القص وأسفل الفك. تم كشف الشريان السباتي والعصب المبهم عن طريق فصل الغدد اللعابية. تم استخدام أجهزة السحب لسحب العضلات السطحية والعضلات الوعائية والعضلات الخلفية من العضلة ثنائية البطن جانبًا لرؤية العقدة الوعائية. تم قطع العصب المبهم مباشرة فوق العقدة الوعائية، والتي تم فصلها بعناية عن العصب تحت اللساني والفروع الصغيرة المجاورة. تم تشريح العصب المبهم بعيدًا عن الشريان السباتي والأنسجة المحيطة. تم وضع العقدة الوعائية اليمنى برفق على منصة تصوير مستقرة تتكون من-قطر غطاء زجاجي مثبت على ذراع معدني مثبت على قاعدة مغناطيسية. تم تطبيق لاصق سيليكون جراحي (Kwik-Sil، WPI) لتثبيت العصب المبهم على الغطاء الزجاجي، وتم تغطية العقدة الوعائية، المغموسة في وسط دلبوكو المعدل (كورنينغ)، بغطاء زجاجي ثانٍ قبل التصوير.
تروية المحفز. تم إجراء الترويات باستخدام مضخة دقيقة متصلة بأنبوب سيليكون مملوء بـ PBS، الفلاجيلين () أوالدهون الداخلية. تم تروية PBSبشكل مستمر طوال التسجيل. تم تسجيل النشاط العصبي الأساسي لمدة 30 ثانية، تليهاتسريب الفلاجيلينوسجل إضافي لمدة دقيقتين بعد التسريب.
في الفئران التي تم اختبار استجابتها لكل من الفلاجيلين والدهون الداخلية، تم شطف القولون بـ 10 مل من PBS بعد تروية الفلاجيلين لإزالة الفلاجيلين المتبقي من خلال منفذ الخروج. تم أخذ تسجيل نشاط أساسي ثانٍ
ثم تم أخذ تسجيل نشاطتروية الدهون الداخلية () وتسجيل آخر لمدة دقيقتين بعد التروية.
التصوير. تم إجراء التصوير في الجسم الحي باستخدام ميكروسكوب ثنائي الفوتون (Bruker) مزود بجالوانومتر لالتقاط الصور وهدف بيزو مجمع مع ماسح جالفي/رنان، مما يتيح التقاط الصور بسرعة 29 إطارًا في الثانية (Prairie View v.5.7). تم إعداد الميكروسكوب لظروف الجسم الحي مع جهاز تخدير Somnosuite (إيزوفلوران) متصل بوسادة تدفئة للتحكم في درجة الحرارة (Kent Scientific) ومضخة حقن قابلة للبرمجة (Harvard Apparatus PHD 2000) لتروية المغذيات إلى الأمعاء. تم إجراء التصوير باستخدامهدف عمودي مغمور في الماء.
RNAscope والمحاذاة. لتحليل catFISH للعقدة الوعائية، قمنا بتكييف بروتوكول تم الإبلاغ عنه سابقًا لتسجيل العصبونات الوعائية بين تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وصور التهجين الموضعي الفلوري RNAscope. بعد التصوير في الجسم الحي، تم تثبيت العقد الوعائية المجمّدة على الفور فيPFA لمدة ساعتين ثم وضعت فيسكر لمدة ساعة قبل أن يتم تضمينها في OCT وتجميدها عند. تم تقطيع العقد الوعائية إلىشرائح، وتم إجراء اختبار RNAscope للتحقق من تعبير mRNA لـ Npy2r كما هو موصوف أعلاه، دون خبز الشرائح، أو التثبيت بعد ذلك واسترجاع الهدف. لمحاذاة شرائح RNAscope مع تصوير الجسم الحي-الكتل، تم استخدام العصبونات ‘الدليل’ كنقاط مرجعية موضعية للتخطيط بين الصور في الجسم الحي والصور المقطوعة. باختصار، تم تحديد عصبونات tdTomatoالمرئية في كل من شرائح RNAscope ومستويات الجسم الحي كنقاط مرجعية وتمت مطابقتها يدويًا باستخدام أداة BigWarp ضمن مكون Fiji BigDataViewer. باستخدام هذه الأداة، تم تحويل شرائح RNAscope ومحاذاتها مع المستويات المقابلة ضمن تصوير الجسم الحي-الكتل، مما يسمح برؤية عصبونات NPY2Rالمتراكبة على عصبونات GCaMP6s الفلورية. لم يتم استخدام الخلايا ذات المحاذاة الغامضة أو غير الناجحة في التحليل الإضافي.
تقدير النشاط العصبي. تم تقدير تغييرات الفلورية GCaMP6s من خلال تحديد مناطق الاهتمام (ROIs)، كل منها يتوافق مع خلية واحدة طوال جلسة التصوير. بالنسبة لصور العقدة الوعائية المعالجة باستخدام محاذاة catFISH، تم إنشاء ROIs بشكل انتقائي حول خلايا NPY2R. تم حساب كثافات البكسل في ROIs (متوسط عبر البكسلات) إطارًا بإطار باستخدام ImageJ وتم تصديرها إلى Excel للتحليل. تم حساب-الدرجة لكل عصبون عن طريق طرح متوسط الفلورية الأساسية (على مدى فترة 30 ثانية) من كثافة الفلورية في كل نقطة زمنية وتقسيمها على الانحراف المعياري للفلورية الأساسية. تمثل هذه القيمة المعيارية عدد الانحرافات المعيارية عن الفلورية الأساسية. تم اعتبار العصبون مستجيبًا إذا: وصلت ذروة فلورية GCaMP6s إلى-درجة منوكان متوسط فلورية GCaMP6sأعلى من المتوسط الأساسي لمدة 5 ثوانٍ على الأقل أثناء أو بعد التسريب. تم استبعاد العصبونات التي لا تحتوي على نشاط أساسي من التحليل.
نظام سلوك تناول الطعام
تم تكييف الفئران مع الحقن الشرجية مرتين قبل بدء الاختبار. بدأت الاختبارات بعد 3 ساعات من بدء دورة الضوء. تم صيام الفئران طوال الليل لمدة 18 ساعة. عند بدء الاختبار، تلقت الفئرانحقنة شرجية منالفلاجيلين أو PBS ثم وضعت في قفص نظيف. تم إدخال كريات غذاء قياسية (5001 بورينا) تم وزنها مسبقًا إلى القفص، ثم تم وزنها عندو180 دقيقة بعد الحقنة الشرجية. في نهاية الاختبار، تم إعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية. تم فصل بداية جميع جلسات الاختبار بفترة لا تقل عن 48 ساعة. بالنسبة للتثبيط الدوائي لـ TLR5، تم تكييف الفئران البرية C57BL/6J مع الحقن الشرجية، وتم إنشاء استجابة أساسية للفلاجيلين، ثم تلقت الفئران حقن شرجية منالفلاجيلين أو PBS معTH1020 (سيغما). تم قياس تناول الطعام كما هو موصوف أعلاه.
للتثبيط الدوائي لمستقبلات Y2 باستخدام الحقن داخل البطن، تم تكييف الفئران البرية C57BL/6J مع الحقن الشرجية و الحقن داخل البطن مرتين قبل بدء الاختبار. عند بدء الاختبار، تلقت الفئران حقنًا داخل البطن معBIIE-0246 أو المركب ثم وضعت في قفص نظيف. بعد 10 دقائق، تلقت الفئرانحقنة شرجية منالفلاجيلين أو PBS. تم قياس تناول الطعام كما هو موصوف أعلاه.
فئران خالية من الجراثيم. تم نقل فئران خالية من الجراثيم متطابقة في العمر والجنس C57BL/6J من مركز Duke Gnotobiotic في أقفاص فردية معقمة. بدأت الاختبارات بعد 3 ساعات من بدء دورة الضوء. تم صيام الفئران طوال الليل لمدة 18 ساعة. عند بدء الاختبار، تلقت الفئرانحقنة شرجية من PBS، تلتها حقنة شرجية منالفلاجيلين بعد 7 أيام. تم قياس تناول الطعام كما هو موصوف أعلاه.
نظام سلوك Crunch Master
تم تكييف ذكور وإناث الفئران من نوع C57BL/6J البالغة من العمر 8 أسابيع لمدة ساعة واحدة في اليوم لمدة يومين في الجهاز السلوكي قبل جلسة الاختبار. تم حرمان الفئران من الطعام لمدة 18 ساعة قبل جلسة الاختبار، التي أجريت خلال المرحلة الضوئية للفئران. قبل جلسة الاختبار، تم وزن الفئران ومن ثم تم إعطاؤها حقنة شرجية من أيالفلاجيلين أو PBS. مباشرة بعد إعطاء الحقنة الشرجية، تم وضع الفئران في الصندوق الأكريليكي وسمح لها بالتغذية بحرية لمدة ساعة واحدة. بعد جلسة الاختبار، تم إعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية.
جهاز سلوكي. صندوق أكريليك (تم تجهيز الغرفة بميكروفون (FIFINE T-669) مثبت على أحد الجدران. لتعزيز تسجيل الصوت، تم دمج 12 ثقبًا صغيرًا (بقطر 0.5 سم) في الجدار بالقرب من الميكروفون. تم وضع كاميرا فيديو (Kayeton Technology، الطراز KYT-U400-MCS2812R01) على بعد 57 سم تحت الصندوق الأكريلي لالتقاط منظر من الأسفل لسلوك تغذية الفأر. على نفس الجدار الذي يوجد عليه الميكروفون، تم لصق حبة طعام عادية واحدة على غطاء بلاستيكي تم تثبيته بعد ذلك على الجدار. تم قياس وزن حبة الطعام قبل وبعد جلسة الاختبار لحساب كمية الطعام المستهلك، مع إجراء التعديلات اللازمة لأي تسرب للطعام. تم تسجيل البيانات الصوتية والمرئية باستخدام برنامج OBS 29.1.3.
معالجة الصوت. تم تحويل تسجيلات الصوت إلى تنسيق .ogg. تم التقاط التسجيلات الأولية بتردد عينة قدره 44.1 كيلوهرتز، ثم تم تقليل العينة إلىلحساب طيف القدرة. تم تحديد تردد العض بين 400 و، تم حساب متوسط طيف القوة المطلقة، وتم استخدام فلتر تمرير نطاقي بين 400 وتم تطبيقه لتحديد إطارات العض بدقة. من الإشارة المفلترة، تم حساب عتبة تبلغ 0.5 انحراف معياري فوق المتوسط. تم تحويل كل إطار صوتي يتجاوز هذه العتبة إلى 1 (مما يشير إلى عض محتمل)، بينما تم تعيين تلك التي تقل عن ذلك إلى 0 (غير عض). ساعدت هذه الإجراءات أيضًا في القضاء على أحداث العض الكاذبة. ثم تم استخدام الإشارة الثنائية لحساب بداية ونهاية العض. تم تعريف العض على أنه تسلسل من إطارات الصوت الثنائية (بقيمة 1) مفصولة بفترات توقف في التغذية (بقيمة 0) تزيد عن 10 ثوانٍ. كانت هذه الفترات تُعرف بفترات بين العض. كان مطلوبًا حد أدنى من ثلاثة إطارات صوتية متتالية بقيمة 1 ليتم اعتبارها عضًا.
معالجة الفيديو. لضمان تحديد اللدغات بدقة، تم إنشاء مقاطع فيديو تلقائيًا لكل حدث لدغة محتمل. ثم تمت مراجعة هذه المقاطع والتحقق منها بواسطة مراقب بشري. تم تضمين مقاطع الفيديو التي تصور اللدغات المحددة بشكل صحيح فقط في التحليل اللاحق. جميع مقاطع الفيديو المستخدمة في هذه الدراسة متاحة في المعلومات التكميلية. تم تسجيل اللقطات الأصلية بتنسيق .mkv بمعدل إطار 30 إطارًا في الثانية.
الإحصائيات وإمكانية التكرار
قمنا بإجراء تحليلات إحصائية باستخدام R (3.1) و JMP Pro (SAS، الإصدار 16)، ما لم يُذكر خلاف ذلك. تم تقييم البيانات من حيث التوزيع الطبيعي. باستخدامالتحليل. بالنسبة للبيانات الموزعة بشكل طبيعي، تم استخدام تحليل التباين (ANOVA) وتم إجراء اختبار توكي HSD بعد ذلك عند الاقتضاء. لدراسات السلوك، استخدمنا تحليل التباين المتكرر لقياس كل فرد، تلاه اختبار ستودنت المزدوج بعد ذلك.-الاختبارات. بالنسبة للبيانات التي لا تتوزع بشكل طبيعي، تم تقييم المتوسطات باستخدام اختبار كروسكال-واليس مع مقارنات غير معلمية باستخدام طريقة ويلكوكسون. بالنسبة للدراسات الأخرى، تم تضمين تعليقات حول الاختبارات الإحصائية التي تم إجراؤها في جميع أنحاء الطرق وفي أساطير الأشكال. تمثل جميع أشرطة الخطأ والمناطق المظللة الانحراف المعياري للمتوسط ما لم يُذكر خلاف ذلك. لم يتم تحديد حجم العينة مسبقًا باستخدام تحليلات القوة. لم يتم إجراء عشوائية موحدة للاختبارات في المختبر أو في الكائنات الحية. تم موازنة جميع الدراسات السلوكية عبر العمر والجنس للتحكم في المتغيرات بما في ذلك الموقع في القفص وتأثير الترتيب. لم يكن الباحثون معصوبي الأعين عن حالة العلاج أو النمط الجيني أو النتيجة.
ملخص التقرير
معلومات إضافية حول تصميم البحث متاحة في ملخص تقارير مجموعة ناتشر المرتبط بهذه المقالة.
توفر البيانات
جميع البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة ضمن الورقة والمعلومات التكميلية لها. الجينوم المرجعي لفأر mm 10 متاح من GENCODE vM23/Ensembl 98. مجموعات بيانات تسلسل RNA متاحة على قاعدة بيانات التعبير الجيني التابعة للمعهد الوطني للصحة (NIH Gene Expression Omnibus) تحت الرقم GSE288590. البيانات من تحليل تسلسل RNA على مستوى الخلية الواحدة لدماغ الفأر الكامل متاحة في المرجع 46 أو عبر أطلس دماغ معهد ألين.https://portal. brain-map.org/atlases-and-data/bkp/abc-atlas.
الشكل البياني الموسع 1| تسلسل RNA لخلايا موسومة بـ Cck و Pyy. خريطة حرارية تظهر تعبير (أ، هـ) جينات الببتيد العصبي، (ب، و) جينات مستشعرات المغذيات، و (ج، ز) جينات مستقبلات الأيض في خلايا الظهارة غير GFP وخلايا الظهارة CckGFP من النصف القريب من (أ-د) الأمعاء الدقيقة أو خلايا الظهارة غير GFP وخلايا الظهارة PyyGFP من
الأمعاء الدقيقة والقولونفئران؛ معدلةالقيم بواسطة DESeq 2 مع اختبارات t ذات الطرفين). (د، ح) جدول لمتوسط التعب الأساسي، التغير النسبي، والتعديلقيمة مستقبلات Toll-like بين خلايا CckGFP وخلايا غير GFP وخلايا PyyGFP وخلايا غير GFP.
الشكل البياني الممتد 2 | نسخ Tlr5 في خلايا النيوروبود. (أ) (يسار) خلايا النيوروبود المعلّمة بـ Pyy لكل كريبت: تُظهر هذه اللوحة عدد الخلايا الإيجابية لـ Pyy لكل كريبت في الفئران الإناث والذكور. كل نقطة تمثل متوسط 50 كريبت تم تحليلها.باستخدام اختبار t ذو ذيلين. (يمين) أنسجة اللفائفي والقولون من فئران PyyGFP (تم تقييم (الفئران) لعدد خلايا Pyy لكل قطاع. (ب) (يسار) خلية Neurod1Cre_tdTomato (باللون الأحمر) مع وسم ISH لـ Pyy، تمثلالفئران. (يمين) قياس التداخل بين خلايا Neurod1Cre_tdTomato مع 5HT و Pyy في القولونالفئران، كل نقطة تمثلخلايا). (ج) (يسار) خلية Neurod1Cre_tdTomato (أخضر) مع وسم ISH لـ Tlr5 (أحمر) ممثل لـالفئران. (يمين) التعبير الإقليمي لجين Tlr 5 في خلايا النيوروبود المعلّمة بـ Neurod1الفئران، كل نقطة تمثلالخلايا). (د) (يسار) خلية مميزة بالأجسام المضادة للسيروتونين (الأخضر) مع وسم ISH لـ Tlr5 (الأحمر)، تمثلالفئران. (يمين) التعبير الإقليمي لـ Tlr5 في خلايا 5HT (الفئران، كل نقطة تمثلخلايا). قضبان القياستمثل أشرطة الخطأ متوسط الخطأ القياسي. e-h: تحليل تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNAseq) لدماغ الفأر الكامل (معهد ألين لخرائط الدماغ). (f,g) تجمع خلايا موسومة بـ Pyy في النخاع. (g,h) هذه الخلايا الموسومة بـ Pyy لا تعبر عن Tlr5. e-h، مقتبسة من المرجع 46، Springer Nature Limited، بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC BY 4.0.
الشكل البياني الممتد 3 | انظر الصفحة التالية للتعليق.
الشكل البياني الممتد 3 | النمط الأيضي والمناعي لـ PyyCre_Tlr5الفئران. (أ) التهجين في الموقع لنسخ Tlr5 في خلايا القولون المعلّمة بـ Pyy في PyyCre_Tlrالفئران و_Tlrأشقاء من نفس القمامةالفئران لكل جينوتيب؛ اختبار t غير المقترن ذو طرفين ). شريط القياس لم يؤثر الحذف الجيني لـ Tlr5 في خلايا Pyylabeled على (ب) تحمل الجلوكوز الفموي، (ج) مستوى الجلوكوز في الدم بعد الصيام، (د) أوزان وسادات الدهون، (هـ) مستويات السيروم PYY أو GLP-1 (بعد صيام طوال الليل، وإعادة تغذية لمدة ساعة)، (و) طول القولون، و (ز) الوزن، أو (ح) وزن الطحال. بواسطة ANOVA، لمقاييس العينة انظر الجدول التكميلي 2). (ط) مستويات الميالوبيروكسيداز القولوني (الفئران لكل نمط وراثي) ومستويات الليبوكالين-2 في البراز (الفئران لكل نمط وراثي) عبر الأنماط الوراثية ( بواسطة اختبار t غير المتزاوج ذو الذيلين). (j) تحليل مورفولوجي-pathological لشرائح القولون الملونة بالهيماتوكسيلين والإيوزين من PyyCre_Tlr5الفئران و Tlr5خلايا الغشاء المخاطي المسببة للالتهابات في كلا المجموعتين كانت ضمن الحدود الطبيعية، تمثلفئران. شريط القياس. مقارنة القولون من PyyCre_Tlr5الفئران و_Tlr أظهرت أشقاء التحكم عدم وجود تغيير في (ك) عمق الكريبت (ن=3 فئران)، (ل) كثافة خلايا PYY و5-HT (تعبير Tlr الظهاري (فئران)الفئران)، أو (ن) تعبير الوصلات الضيقة (فئران) بواسطة اختبار t غير المتزاوج ذو الذيلين). (o) أدى الحذف الجيني لـ Tlr5 في الخلايا المعلّمة بـ Pyy إلى زيادة كبيرة في زيادة الوزن لدى الذكور والإناث (الذكور: فئران لـ PyyCre_Tlrفئران لـ _Tlr5تحكم الأشقاء؛ الإناث:فئران لـ PyyCre_Tlr5فئران لـ Tlr5تحكم الأشقاء في القمامة؛*تفاعل الجينوتيب*الوقت حسب الجنس بواسطة rmANOVA مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد الاختبار). (ص) كان استهلاك الطعام لمدة 24 ساعة أعلى بشكل ملحوظ في PyyCre_Tlr5الفئران مقارنة بـ Tlr5أقران من نفس القمامة (ذكور: فئران لـ PyyCre_Tlrفئران لـ Tlrتحكمات الأشقاء؛ الإناث:فئران لـ PyyCre_Tlr5فئران لـ Tlr5تحكم الأشقاء في القمامة؛تأثير الجينوتيب الرئيسي بواسطة تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد الاختبار، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين الأيام، متوسط الاستهلاك عبر 3 أيام متتالية عند 21 أسبوعًا من العمر). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط.
مقالة
الشكل البياني الموسعالظاهرة الجينية لـ PyyCre_Myd88الفئران. (أ) في الموقع
تأكيد التهجين على عدم وجود نسخ Myd88 في خلايا القولون المعلّمة بـ Pyy في PyyCre_Myd88فئرانفئران؛* بواسطة اختبار t غير المتزاوج ذو ذيلين). (ب) أدى الحذف الجيني لـ Myd88 حصريًا في الخلايا المعلّمة بـ Pyy إلى عدم حدوث تغيير كبير في التركيز النسبي للفلجيلين في البراز (فئرانباستخدام اختبار t غير المتزاوج ذي الذيلين). PyyCre_Mydلم يحدث أي تغيير في الفئران في زيادة الوزن مقارنةً بأقرانهم من نفس القمامة في كل من (ج) الإناث (PyyCre_Mydفئرانفئران؛ بواسطة rmANOVA) و (د) الذكور (PyyCre_Mydفئران،_ميدفئران؛ بواسطة rmANOVA). (هـ) PyyCre_Myd88 لم يكن هناك أي تغييرات في استهلاك الطعام على مدار 24 ساعة متوسطًا عبر 3 أيام متتاليةفئران؛ بواسطة ANOVA). تمثل أشرطة الخطأ S.E.M.
الشكل البياني الموسع 5 | تحليل نمط الوجبات في PyyCre_Tlr5فئران. (أ) مخطط تحليل نمط الوجبات يوضح أن الوجبات تُعرف على أنها استهلاكمع وجود فترة لا تقل عن 10 دقائق بين الجولات. تم تقييم استهلاك الطعام التراكمي لـ PyyCre_Tlr5 و_Tlr5 فئران التحكم من نفس القمامة على مدار 3 أيام في جهاز TSE Phenomaster لـ (ب) الفئران الذكور و (ج) الفئران الإناث. قياس الوجبات على مدار 72 ساعة في دورات الظلام والضوء في الذكور و
إناث (د) مدة الوجبة، (هـ) حجم الوجبة، و(و) الفاصل بين الوجبات. تمثل الرسوم البيانية الصندوقية النطاق الربعي، والخطوط البيضاء تشير إلى الوسيط. و(ز) عدد الوجبات (PyyCre_Tlr5الفئران الذكور وفئران إناث؛ Tlr5الفئران الذكور وإناث الفئران؛*أثر الجينوتيب الرئيسي بواسطة تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار توكي الثنائي الطرف.
مقالة
أ تصوير الكالسيوم في خلايا Neurod1_Salsa6f القولونية تباين استجابة خلايا Neurod1 لأنماط الميكروبات
اختبار إفراز C PYY في الظهارة القولونية
الشكل 6 من البيانات الموسعة | يتم تنشيط الخلايا المعوية الصماء بواسطة الفلاجيلين.
(أ) (يسار) تتبع الكالسيوم المختار من خلايا القولون المشتقة بشكل حاد من Neurod1Cre_Salsa6f، يوضح النموذج التجريبي، ممثل لـالخلايا. تم تعريض كل خلية لكل محفز مرتين، وتم تعريف المستجيب على أنه خلية استجابت مرتين. (يمين) قياس حجم استجابة الكالسيوم لمستجيبي الفلاجلين (* بواسطة rmANOVA مع اختبار توكي الثنائي الطرف. (ب) آثار الكالسيوم من خلايا القولون المشتقة بشكل حاد من Neurod1Cre_ Salsa6f.الخلايا استجابت لـ بولي: سي ( خلايا، فئران)الخلايا استجابت لـليبوبوليسكاريد (LPS) خلايا، الفئران)، والخلايا استجابت لـفلاجيلين خلايا، الفئران). اللون الرمادي يشير إلى تسريب لمدة 30 ثانية. (ج) (يسار) صورة مناعية مضيئة تظهر الكروم القولونية المصفوفة مع خلايا فردية موسومة بـ Pyy (خضراء) في فئران PyyGFP. شريط القياستحفيز الكرُوب القولونية بواسطة منشطات cAMPفورسكولين وIBMX، ولكن ليس بولي I:C يحفز إفراز PYY الفئران). (اليمين) تحفيز الكرُوب في القولون باستخدام منشطات cAMPفورسكولين ومIBMX، والفلجيلين يحفز إفراز PYYفئران؛ *عن طريق تحليل التباين الأحادي (ANOVA) مع اختبار توكي بعد التجربة. تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط الخطأ المعياري (S.E.M).
الشكل البياني الموسع 7 | يتم الاتصال بالعصبونات الحجاجية بواسطة خلايا موسومة بـ Pyy وتُ activated بواسطة المحفزات داخل القولون. (أ) قائمة بمصطلحات علم الأحياء الجيني الغنية بشكل ملحوظ المتعلقة بالاتصال العصبي في خلايا موسومة بـ Pyyفئران؛ تم التعديل بواسطة تحليل topGO). (ب) جدول للمتوسط الأساسي، تغيير الطي، والتعديلقيمة الجينات ما قبل المشبك بين خلايا PyyGFP وخلايا غير GFP (DESeq2 مع اختبارات t ذات الطرفين). (ج) قياس الاتصالات بين الخلايا المعلّمة بـ Pyy والألياف العصبية Pgp9.5 في مناطق مختلفة من الأمعاء.الفئران). (د) مخطط لتقنية تسجيل العصب الحائر. تم تسجيل العصب الحائر العنقي بينما تم ضخ القولون بالكامل في نفس الوقت بالمنبه. (هـ) (يسار) مخطط يوضح ضوء 473 نانومتر عبر صمام ضوئي (LED) داخل القولون ينشط قناة الكاتيون Channelrhodopsin (ChR2) ويؤدي إلى إزالة الاستقطاب لخلية موسومة بـ Pyy. (يمين) صورة تمثيلية تظهر التعبير
استجابة النوع البري للدهون الداخلية
التحفيز الضوئي المثبط
من ChR2-tdTomato (أحمر) في خلية موسومة بـ Pyy في القولون (أخضر). (f) رسم بياني للنبضات من تسجيلات العصب الحائر حيث PBS،الفلاجيلين، أوتم ضخ الإنترا ليبيد في القولون، ممثلاً لـالفئران. الشريط الرمادي يمثل فترة التروية. (ج) (يسار) استجابات العصب المبهم لتروية القولون الداخلي بمحلول PBS أوإنتراليبيد في الفئران من النوع البريالفئران). تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط الخطأ المعياري. (اليمين) قياس الاستجابة القصوى للإنتراليبد. بواسطة اختبار t المزدوج الذيل المقترن). (هـ) (يسار) مخطط يوضح تفعيل ضوء 532 نانومتر لقناة الأنيون هالورودوبسين (هالو) وتفريغ خلية موسومة بـ Pyy. (يمين) صورة تمثيلية تظهر تعبير هالورودوبسين-YFP (أخضر) في خلية قولونية موسومة بـ Pyy (أحمر). قضبان القياس. الرسوم البيانية معدلة من المرجع 3، AAAS.
الشكل البياني الممتد 8 | لا تعبر الخلايا العصبية المبهمة عن Tlr5 ولا تستجيب مباشرة للفلجيلين. (أ) قياس استجابة العصب المبهم القصوى للفلجيلين في PyyCre_Tlr5 و_Tlr5 أقران القمامة (PyyCre_Tlr5فئران؛تي إل آر 5فئران؛ بواسطة اختبار كروسكال واليس مع مقارنات غير معلمية باستخدام طريقة ويلكوكسون). (ب) أظهر تسلسل RNA لخلية العقدة الحلقية العصبية عدم تعبير عن Tlr5 (خلايا PyyGFP+: فئران، خلايا PyyGFP-الفئران، الخلايا العصبية العقدية:الفئران؛ تطبيع DESeq2). (ج) qPCR لمؤشرات التشابك والعوامل المستقبلة الشبيهة بالـ Toll في خلايا العقدة الظهرية للعصب المبهمالفئران). (د) أظهر التهجين في الموقع للخلايا العصبية الملونة بصبغة نيسل (الخضراء) في العقدة العقدية عدم وجود تعبير عن (أحمر)، ممثل لـ فئران. قضبان القياس. (e) تمثيل تمثيلي لانتقال الكالسيوم في خلايا Neurod1Cre المفصولة حديثًاأظهرت خلايا الأعصاب Salsa6f النودوز استجابة في 57% من الخلايا العصبية للكابسيسين، لكن
ليس إلى الفلاجيلينالخلايا العصبيةالفئران). (و) التحليل الثانوي للبيانات من باي وآخرون، 2018 عن الخلايا العصبية الحائرة التي تتجه نحو القولون أظهر تعبير مستقبل PYYالخلايا). (ز) التراكب المكاني لعصبونات العقدة الودية باستخدام فلوريسcence tdTomato و GCaMP6s. (ح) التراكب المكاني لعصبونات العقدة الودية باستخدام تحليل تقسيم النشاط الزمني بواسطة الهجين الفلوري في الموقع (CatFISH). (ط) صورة تمثيلية لرسم خرائط CaTFISH للانتقالات الكالسيومية في الجسم الحي علىالخلايا العصبية الإيجابية. قضبان القياس. (ج) آثار الكالسيوم من خلايا الأعصاب العقدية الحجاجية المستجيبة إما فقط للفلاجيلين (علوي)، إنتراليبيد ( ) و الفلاجيلين ( مُدمج بشكل منفصل (في المنتصف)، أو فقط إنتراليبيد (7%) (في الأسفل)، يمثلالخلايا العصبية. تشير أشرطة الخطأ والظلال إلى متوسط الخطأ المعياري، مقتبس من المرجع 56، دار نشر سيل.
الشكل 9 من البيانات الموسعة | الفلاجيلين داخل القولون يؤثر على تناول الطعام. تم صيام الفئران طوال الليل وتلقوا الفلاجيلين ( ) أو حقن PBS الشرجية قبل الحصول على الوصول الحر إلى الطعام القياسي لمدة 60 دقيقة. قلل الفلاجيلين من تناول الطعام مقارنةً بـ PBS في (أ) فئران PyyCre ( الفئران); (ب) فئران عمرها 5 أسابيع (الفئران)؛ وفئران عمرها 10 أسابيع (فئران؛حقنة شرجيةتفاعل الزمن بواسطة rmANOVA مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد الاختبار). (ج) (يسار) بوليل: C (لم يكن الحقن الشرجى كافياً لتغيير تناول الطعام مقارنةً بحقن PBS الشرجية.فئران؛حقنة شرجيةتفاعل الزمن بواسطة rmANOVA مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد ذلك). (يمين) تأثيرات الفلاجلين تلاشت بعد 180 دقيقة من الحقنة الشرجية.فئران؛عند 180 دقيقة بواسطة اختبار توكي بعد التحليل). (د) لا الحقنة الشرجية للسيارة (ثنائي ميثيل سلفوكسيد، DMSO؛الفئران) ولا حقن داخل الصفاق للمركبة (محلول ملحي؛استجابة التغذية المعدلة للفئران تجاه حقنة الفلاجيلين ( بواسطة اختبار t ذي الطرفين. (هـ) تحليل Crunch Master للعضات من حيث عدد العضات، ووقت العض، وهو متوسط الوقت لجولة تغذية واحدة، ووقت التغذية الذي يمثل عدد الدقائق التي انخرطت فيها الفئران في التغذية، لم يتغير خلال جلسة التسجيل التي استمرت ساعة واحدة (فئران لكل مجموعة علاجية؛باستخدام اختبار t غير المتزاوج ذي الذيلين). تُظهر الرسوم البيانية على شكل كمان الوسيط المشار إليه بالخط السميك والمتوسط المشار إليه بالخط الرقيق. (f) تم قياس تركيز الفلاجلين النسبي في البراز الم collected من الفئران البرية بعد صيام لمدة 18 ساعة.الفئران)، التغذية حسب الرغبة (الفئران)، أو صيام لمدة 18 ساعة بالإضافة إلى حقنة شرجية من PBS (الفئران) أو الفلاجيلين ( الفئران). زادت التغذية بشكل كبير من مستوى الفلاجيلين في البراز، ومع ذلك، لم يكن حقن الفلاجيلين كافياً لاستعادة مستويات الفلاجيلين إلى حالة التغذية (* بواسطة تحليل التباين المتكرر (rmANOVA) مع اختبار توكي الثنائي الاتجاه بعد الاختبار. تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط الخطأ المعياري (S.E.M).
مقالة
تعبير السيتوكينات في القولون تعبير السيتوكينات في الطحال
الشكل 10 من البيانات الموسعة | حقنة الفلاجيلين ليست كافية لتحفيز استجابة مناعية
استجابة. (أ) تعبير السيتوكين في القولون بعد ساعة من حقنة PBS (الفلاجيلينفئرانفلاجيلينفئرانبوليل: ( الفئران)، أو الحقن داخل الصفاق (i.p.) لمحلول فوسفات البفر (PBSالفلاجيلينفئران,بوليل:جفئران ، LPS ( فئران) (*الدلالة من مجموعة حقنة PBS بواسطة اختبار ويلكوكسون غير المعلمي ذو الطرفين لكل زوج). (ب) تعبير السيتوكينات في الطحال بعد ساعة من حقنة PBS (الفلاجيلينفئرانفلاجيلين ( فئران)، بولي: سي ( الفئران)، أو الحقن داخل الصفاق (i.p.) لمحلول فوسفات البفر (PBSالفلاجيلينفئرانبوليل: سيفئران ، LPS فئرانالدلالة من مجموعة حقنة PBS الشرجية بواسطة اختبار ويلكوكسون غير المعلمي ذو الاتجاهين لكل زوج). تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط الخطأ المعياري.
محفظة الطبيعة
المؤلف(المؤلفون) المراسلون:
آخر تحديث بواسطة المؤلفين: 05/08/2025
ملخص التقرير
تسعى Nature Portfolio إلى تحسين إمكانية تكرار العمل الذي ننشره. يوفر هذا النموذج هيكلًا للاتساق والشفافية في التقرير. لمزيد من المعلومات حول سياسات Nature Portfolio، يرجى الاطلاع على سياسات التحرير وقائمة مراجعة سياسة التحرير.
الإحصائيات
لجميع التحليلات الإحصائية، تأكد من أن العناصر التالية موجودة في أسطورة الشكل، أسطورة الجدول، النص الرئيسي، أو قسم الطرق. غير متوفر □ □ حجم العينة بالضبطلكل مجموعة/شرط تجريبي، معطاة كرقم منفصل ووحدة قياس □
بيان حول ما إذا كانت القياسات قد أُخذت من عينات متميزة أو ما إذا كانت نفس العينة قد تم قياسها عدة مرات □
اختبار(ات) الإحصاء المستخدمة وما إذا كانت أحادية الجانب أو ثنائية الجانب يجب أن تُوصف الاختبارات الشائعة فقط بالاسم؛ واصفًا التقنيات الأكثر تعقيدًا في قسم الطرق. □ وصف لجميع المتغيرات المرافقة التي تم اختبارها □ X وصف لأي افتراضات أو تصحيحات، مثل اختبارات الطبيعية والتعديل للمقارنات المتعددة □
وصف كامل للمعلمات الإحصائية بما في ذلك الاتجاه المركزي (مثل المتوسطات) أو تقديرات أساسية أخرى (مثل معامل الانحدار) و التباين (مثل الانحراف المعياري) أو تقديرات مرتبطة بعدم اليقين (مثل فترات الثقة) □ X لاختبار الفرضية الصفرية، يتم استخدام إحصائية الاختبار (مثل F، t، r) مع فترات الثقة، أحجام التأثير، درجات الحرية وقيمة ملحوظة أعطِالقيم كقيم دقيقة كلما كان ذلك مناسبًا. □ لتحليل بايزي، معلومات حول اختيار القيم الأولية وإعدادات سلسلة ماركوف مونت كارلو □ لتصميمات هرمية ومعقدة، تحديد المستوى المناسب للاختبارات والتقارير الكاملة عن النتائج □ تقديرات أحجام التأثير (مثل حجم تأثير كوهين)بيرسون )، مما يشير إلى كيفية حسابها
تحتوي مجموعتنا على الويب حول الإحصائيات لعلماء الأحياء على مقالات تتناول العديد من النقاط المذكورة أعلاه.
البرمجيات والشيفرة
معلومات السياسة حول توفر كود الكمبيوتر جمع البيانات إلومينا نكست سيك 500، نظام ستب وان بلس (ثيرمو فيشر)، برنامج فينو ماستر (تي إس إي سيستمز إنك؛ إصدار البرنامج 6.6.9)، تيكان إنفينيت 200 برو الإصدار 2.0، برنامج زيس زين بلو الإصدار 3.5، برياري فيو الإصدار 5.7.
بالنسبة للمخطوطات التي تستخدم خوارزميات أو برامج مخصصة تكون مركزية في البحث ولكن لم يتم وصفها بعد في الأدبيات المنشورة، يجب أن تكون البرمجيات متاحة للمحررين والمراجعين. نحن نشجع بشدة على إيداع الشيفرة في مستودع مجتمعي (مثل GitHub). راجع إرشادات مجموعة Nature لتقديم الشيفرة والبرمجيات لمزيد من المعلومات.
بيانات
معلومات السياسة حول توفر البيانات
يجب أن تتضمن جميع المخطوطات بيانًا حول توفر البيانات. يجب أن يوفر هذا البيان المعلومات التالية، حيثما ينطبق:
رموز الانضمام، معرفات فريدة، أو روابط ويب لمجموعات البيانات المتاحة للجمهور
وصف لأي قيود على توفر البيانات
بالنسبة لمجموعات البيانات السريرية أو بيانات الطرف الثالث، يرجى التأكد من أن البيان يتماشى مع سياستنا.
جميع البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة ضمن الورقة والمعلومات التكميلية لها. الجينوم المرجعي للفأر mm10 متاح.
البحث الذي يتضمن مشاركين بشريين، بياناتهم، أو مواد بيولوجية
معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل مشاركين بشريين أو بيانات بشرية. انظر أيضًا معلومات السياسة حول الجنس، الهوية/التقديم الجنسي، والتوجه الجنسي والعرق، والاثنية والعنصرية.
التقارير عن الجنس والنوع الاجتماعي
غير متوفر
التقارير عن العرق أو الإثنية أو غيرها من المجموعات الاجتماعية ذات الصلة
غير متوفر
خصائص السكان
غير متوفر
التوظيف
غير متوفر
رقابة الأخلاقيات
غير متوفر
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.
التقارير المتخصصة في المجال
يرجى اختيار الخيار أدناه الذي يناسب بحثك بشكل أفضل. إذا لم تكن متأكدًا، اقرأ الأقسام المناسبة قبل اتخاذ قرارك. علوم الحياة □ العلوم السلوكية والاجتماعية □ العلوم البيئية والتطورية والبيئية لنسخة مرجعية من الوثيقة بجميع الأقسام، انظرnature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf
تصميم دراسة العلوم الحياتية
يجب على جميع الدراسات الإفصاح عن هذه النقاط حتى عندما يكون الإفصاح سلبياً.
حجم العينة
استبعاد البيانات
لم تُستخدم أي طرق إحصائية لتحديد أحجام العينات مسبقًا، لكن أحجام عيناتنا مشابهة لتلك المبلغ عنها في منشورات سابقة تدرس سلوك الاستهلاك في نماذج الفئران (هان وآخرون، Cell، 2018؛ تان وآخرون، Nature، 2020؛ سكلفاني وآكرُوف، Physiol. Behav.، 2017).
بالنسبة لتسجيلات العصب المبهم: خلال التجارب، تم استخدام استجابة الإينتراليبيد كتحكم إيجابي. بالنسبة لجميع ظروف التحفيز بالفلاغيلين والليزر، تم استبعاد البيانات إذا لم تُلاحظ استجابة مستقرة للإينتراليبيد طوال جلسة التسجيل.
للتصوير بالكالسيوم: انتهت كل جلسة تسجيل بـ 50 مللي مولار من كلوريد البوتاسيوم كتحكم في النشاط. تم تعريف الاستجابة لكلوريد البوتاسيوم كنسبةزيادة فوق المستوى الأساسي. الخلايا التي لم تصل إلى هذا العتبة من KCl لم تُدرج في التحليلات.
للتجارب الشرجية، الفئران التي تناولت أقل منتم استبعاد الحيوانات التي تناولت الطعام بعد حقنة شرجية من PBS من التجارب بسبب سلوك التغذية غير المعتاد بعد صيام ليلة كاملة. -لتحليل نمط الوجبات، الوجبات الفردية التي تجاوزت معدل . أو 1 ج إجمالي الحجم تم استبعادها لكونها فوق الفسيولوجية.
التكرار
لأغراض تجارب المجهر الكمي، تم تنفيذ كل تقنية وسم في الموقع وقياسها في عينات الأنسجة من ثلاثة فئران فردية على الأقل من كلا الجنسين. كانت جميع محاولات التكرار ناجحة.
في تجارب الكفة العصب vagal، تم اختبار استجابة التحكم الإيجابي intralipid وتكرارها بين العلاجات في ثلاثة فئران على الأقل لكل علاج لضمان تكرار النتائج داخل الموضوع. إذا تغيرت الاستجابة بشكل كبير، فإن معيار الإدراج لم يتم الوفاء به وبالتالي تم إنهاء التجربة.
بالنسبة لتصوير الكالسيوم، لم يتم تكرار الاستجابة للمؤثرات داخل نفس الخلية بسبب قيود بقاء الخلايا حية مع التطبيقات المتكررة. لضمان القابلية للتكرار، تم إجراء التجارب عبر عدة جلسات.
في تجارب الحقن الشرجية، تم تكرار كل حالة تجريبية في 5 فئران على الأقل. تم إجراء التجارب على فئران من سلالات وأعمار وأجناس مختلفة لضمان القابلية للتكرار. -لتحليل نمط الوجبات، تم إجراء تجربتين مستقلتين لضمان القابلية للتكرار.
التوزيع العشوائي
في جميع التجارب، تم تخصيص الحيوانات للمجموعة التجريبية بشكل عشوائي.
تم موازنة جميع الدراسات السلوكية عبر العمر والجنس للتحكم في المتغيرات بما في ذلك الموقع في القفص، وتأثير الترتيب، واليد المهيمنة.
في تجارب الحقن الشرجية، تلقت جميع الفئران المشمولة تحفيزًا باستخدام PBS، وتحفيزًا باستخدام الفلاجيلين، وفي تجارب علم الأدوية، تلقت الفئران كل من تحفيز PBS وتحفيز الفلاجيلين بالاشتراك مع العلاج الدوائي. تم عشوائية ترتيب تسليم التحفيز بين الفئران المختلفة. هذا يستثني الفئران الخالية من الجراثيم، حيث تم تسليم PBS أولاً لتقليل الاستعمار البكتيري. تم فصل كل تسليم للتحفيز بفترة لا تقل عن 48 ساعة عن التسليم السابق للتحفيز.
عمى
محفظة الطبيعة | ملخص التقرير أبريل 2023
التقارير عن مواد وأنظمة وطرق محددة
نحتاج إلى معلومات من المؤلفين حول بعض أنواع المواد والأنظمة التجريبية والأساليب المستخدمة في العديد من الدراسات. هنا، يرجى الإشارة إلى ما إذا كانت كل مادة أو نظام أو طريقة مدرجة ذات صلة بدراستك. إذا لم تكن متأكدًا مما إذا كان عنصر القائمة ينطبق على بحثك، يرجى قراءة القسم المناسب قبل اختيار رد.
المواد والأنظمة التجريبية
غير متوفر
مشارك في الدراسة
□
أجسام مضادة X
□
– خطوط خلايا حقيقية النواة
□ علم الحفريات وعلم الآثار
□
X الحيوانات وغيرها من الكائنات
□ البيانات السريرية
إكس
□
إكس
□
الأجسام المضادة
طرق
مشارك في الدراسة
تسلسل شريحة الكروماتين
تدفق الخلايا
تصوير الأعصاب القائم على الرنين المغناطيسي
التحقق
التألق المناعي النسيجي: Rb-Anti-PYY (1:250؛ تم إنتاجه في مختبر رودجر ليدل – تم إنتاج جسم مضاد PYY في الأرانب باستخدام ببتيد اصطناعي، KPEAPGEDASPEELSRYC، الذي يتوافق مع الأحماض الأمينيةمن PYY الفأر، منقى بال affinity)، جسم مضاد Anti-GFP (المضيف = دجاج) (1:500، Abcam؛ Cat#ab13970)؛ جسم مضاد Anti-Pgp9.5 (المضيف = أرنب) (1:500؛ Abcam؛ CAT#ab27053)، جسم مضاد Anti-serotonin (المضيف = ماعز) (1:500؛ Abcam؛ CAT#ab66047)؛ Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab́) Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (1:250، Jackson ImmunoResearch؛ Cat#711-546-152؛ RRID#AB_2340619)؛ Cy3 AffiniPure F(ab́) Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (1:250، Jackson ImmunoResearch؛ Cat#711-166-152؛ RRID#AB_2313568)؛ Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab’) Fragment Donkey Anti-Chicken IgG (H+L) (1:250، Jackson ImmunoResearch؛ Cat#703-546-155؛ RRID#AB_2340376)؛ Dk-Anti-Gt-647 (1:500، Jackson Immunoresearch 705-606-147)
الهجين في الموقع: تم شراء مجسات Mm-Tlr5 (رقم الكات#759 468888)، Mm-Pyy-C3 (420681-C3)، وMm-Npy2r (رقم الكات# 515431) من.
تمت المصادقة على جسم مضاد Rb-Anti-PYY بشكل موسع في خلايا الظهارة القولونية بواسطة بوهوركويز وآخرون، J Mol Hist، 2011؛ تم التحقق من صحة Ck-Anti-GFP تجارياً للاستخدام في الكيمياء المناعية بواسطة الشركة المصنعة (Abcam) وتمت المصادقة عليه بشكل إضافي للاستخدام في الكيمياء المناعية النسيجية بواسطة PMID:29895301، تم التحقق من صحة Rb-Anti-Pgp9.5 تجارياً وتمت المصادقة عليه للاستخدام في الكيمياء المناعية النسيجية بواسطة الشركة المصنعة (Abcam)، تم التحقق من صحة Gt-Anti-serotonin تجارياً للاستخدام في الكيمياء المناعية بواسطة الشركة المصنعة (Abcam) وتمت المصادقة عليه بشكل إضافي للاستخدام في الكيمياء المناعية النسيجية بواسطة PMID: 25420775.
خطوط خلايا حقيقية النواة
معلومات السياسة حول خطوط الخلايا والجنس والنوع في البحث
مصدر(s) خط الخلية
المصادقة
تلوث الميكوبلازما الخطوط التي يتم التعرف عليها بشكل خاطئ بشكل شائع (انظر سجل ICLAC)
تم شراء خلايا HEK-Blue™-mTLR5 من مورد تجاري (Invivogen). تم الحصول على هذه الخلايا من خلال نقل الجينات المشترك لجين TLR5 الفأري وجين تقرير SEAP (الفوسفاتاز القلوي الجنيني المفرز) القابل للتحفيز إلى خلايا HEK293.
تم التحقق من صحة خلايا HEK-Blue™-mTLR5 من قبل الشركة المصنعة، بما في ذلك التحقق من تعبير mTLR5 بواسطة RT-PCR وضمان الاستقرار حتى 20 تمريرة (تم تمرير الخلايا في مختبرنا حتى 10 مرات لكل تجربة).
تم ضمان خلو خلايا HEK-Blue™-mTLR5 من الميكوبلازما من قبل المورد (إنفيوجن). خلايا HEK-293 هي خط خلايا غالبًا ما يتم التعرف عليها بشكل خاطئ. تم استخدام هذه الخلايا كخط خلايا مُبلغ عنه بعد إدخال جين TLR5 الفأري وجين تقرير SEAP (الفوسفاتاز القلوي الجنيني المفرز) القابل للتحفيز لقياس مستويات الفلاجيلين في عينات براز الفئران. تم التحقق من صحة الخلايا من قبل المورد (إنفيوجن).
الحيوانات وغيرها من الكائنات البحثية
معلومات السياسة حول الدراسات التي تشمل الحيوانات؛ إرشادات ARRIVE الموصى بها للإبلاغ عن أبحاث الحيوانات، والجنس والنوع في البحث
الحيوانات المخبرية تم استخدام ذكور وإناث الفئران البالغة التي تتراوح أعمارها بين 6-20 أسبوعًا في جميع التجارب. كانت الفئران تعيش في مجموعات في قسم موارد الحيوانات المخبرية بجامعة ديوك، حيث تم الاحتفاظ بها في دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة (0700-1900) مع الوصول إلى الماء وطعام الفئران القياسي (Purina 5001) بحرية، ما لم يُذكر خلاف ذلك في طرق المخطوطة. حافظت المنشأة على درجة حرارة محيطة منورطوبة تتراوح بين 40-60%. الفئران المستخدمة كانت: C57BL/6J (النوع البري) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #000664)؛ PyyGFP (الخلفية = سويس ويبستر) (رودجر ليدل، دكتور في الطب؛ بوهوركز وآخرون، 2011)؛ PyyCre (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #012706)؛ CckGFP (الخلفية = سويس ويبستر) (رودجر ليدل، دكتور في الطب؛ وانغ وآخرون، 2010)؛ Neurod1Cre (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #028364)؛ LSL_tdTomato (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #007914)؛ LSL_Halo-YFP (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #014539)؛ LSL_ChR2-tdTomato (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #012567)؛ LSL_Salsa6f (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #031968)؛ Tlr5-KO (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #028599)؛ Myd88-KO (الخلفية = C57BL/6J) (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #00888)؛ B6.Cg-Snap25tm3.1Hze/J (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #025111)؛ B6.129(Cg)Fostm2.1(cre/ERT2)Luo/J (مختبر جاكسون؛ الرقم المرجعي #030323).
الحيوانات البرية لم يتم استخدام حيوانات برية في هذه الدراسة.
التقارير عن الجنس تم تفصيل النتائج والاختلافات المتعلقة بالجنس في المخطوطة مع الإشارة إلى أحجام العينات.
عينات تم جمعها من الميدان لم يتم استخدام أي عينات تم جمعها من الميدان في هذه الدراسة.
رقابة الأخلاقيات تم إجراء جميع التجارب على الفئران بعد الحصول على موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز ديوك الطبي وفقًا للبروتوكول A212-21-10. اتبعت جميع المختبرات المتعاونة إرشادات هذا البروتوكول الحيواني.
يرجى ملاحظة أنه يجب أيضًا تقديم معلومات كاملة حول الموافقة على بروتوكول الدراسة في المخطوطة.
نباتات
مخزونات البذور غير متوفر
أنماط جينية نباتية جديدة غير متوفر
المصادقة غير متوفر
مختبر علم الأعصاب المعوي الدماغي، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم علم الأعصاب، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم الطب، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.كلية الثالوث للفنون والعلوم، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.مختبر المناعة الأيضية، قسم البحث، مستشفى المكسيك العام الدكتور إدواردو ليسياغا، مدينة مكسيكو، المكسيك.مختبر أبحاث الإلكترونيات، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية.معهد مكغفرن لأبحاث الدماغ، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم علوم المواد والهندسة، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم علوم الدماغ والمعرفة، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، كامبريدج، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية.مركز مونييل للحواس الكيميائية، فيلادلفيا، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم علوم الأعصاب، كلية بيرلمان للطب، جامعة بنسلفانيا، فيلادلفيا، بنسلفانيا، الولايات المتحدة الأمريكية.علم الأعصاب المختبري للشهية، قسم علم الأدوية، CINVESTAV، مدينة مكسيكو، المكسيك.مركز أبحاث الشيخوخة (CIE)، سينفستاف سيدي سور، مدينة مكسيكو، المكسيك.قسم علم المناعة التكاملي، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم الوراثة الجزيئية والميكروبيولوجيا، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم علم الأمراض، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم بيولوجيا الخلايا، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.قسم الفسيولوجيا، جامعة أريزونا، توكسون، أريزونا، الولايات المتحدة الأمريكية.معهد ديوك لعلوم الدماغ، جامعة ديوك، دورهام، نورث كارولينا، الولايات المتحدة الأمريكية.العنوان الحالي: قسم الأمراض الجلدية، كلية الطب بجامعة ستانفورد، ريدوود سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية.ساهم هؤلاء المؤلفون بالتساوي: وينستون و. ليو، نعمة ريشر، إميلي أولوي.هذان المؤلفان أشرفا معًا على هذا العمل: م. مايا كيلبرير، دييغو ف. بوهوركيز. البريد الإلكتروني: mkaelberer@arizona.edu; دييغو.بوهوركويز@ديوك.إدو
وانغ، ي. وآخرون. الأحماض الأمينية تحفز إفراز الكوليسيستوكينين من خلال-مستقبل الاستشعار. المجلة الأمريكية لعلم وظائف الأعضاء. الجهاز الهضمي. وظائف الكبد 300، G528-G537 (2011). 62. شونهوف، س. وآخرون. توازن الطاقة والتمايز الغدد الصماء المعوية لا يتطلبان هرمون الشهية الببتيد YY. علم الأحياء الجزيئي والخلايا 25، 4189-4199 (2005).
الشكر والتقدير نشكر J. Kotula و M. Toh على المساعدة في التسلسل؛ R.A. Liddle و S. G. Lisberger و M.D. Gunn و J.A. Alspaugh و N.K. Surana و G. J. Schwartz و Z. Lorsch و M. Toc Sagra و E.B. Bohórquez على المساهمات التحريرية. نعترف بمصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة (NIH) F3O DK122712 (W.W.L.); NIH F32 DK139628 (N.R.); NIH F3O DK136229 (E.A.); NIH F32 DK127757 و NIH KO1 DK138286 (L.E.R.); NIH F3O DK127650 (P.W.); J.A.A.G. هو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في العلوم الطبية الحيوية في الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك وقد حصل على منحة CONAHCyT رقم CVU959984؛ CONAHCyT CF-2023-G-518 (R.G.); NIH KO1 DK131403 (M.M.K.); و NIH DP2 MH122402، NIH R21 AT010818، NIH RO3 DK114500، NIH RO1 DK131112 و NIH RO1 DK132070 (D.V.B.).
مساهمات المؤلفين: قام W.W.L. وN.R. وE.A. وL.E.R. وP.W. وC.S. وM.E.K. وJ.A.V. وC.P.-H. وY.G.K.A. وA.Carbajal وJ.A.A.G. وA. Coss بإجراء التجارب وجمع البيانات؛ قام A.S. وP.A. بإنشاء موارد ضوئية داخل اللمعة وميكرو LED ضوئي؛ قام E.G.-L. وR.G. بتطوير اختبار Crunch Master، وإجراء التجارب، وجمع وتحليل البيانات؛ قام A.d.A وA.B. وG.d.L. بإجراء تصوير الكالسيوم داخل الجسم وcatFISH، وجمع وتحليل البيانات؛ قام W.W.L. وN.R. وE.A. وL.E.R. وP.W. وJ.F.R. وE.A.M. وM.M.K. وD.V.B. بتحليل وتفسير البيانات. قام W.W.L. وN.R. وE.A. وM.M.K. وD.V.B. بتصميم وكتابة المخطوطة بمشاركة جميع المؤلفين. قام M.M.K. وD.V.B. بتطوير الفكرة والإشراف على المشروع. حصل D.V.B. على تمويل للمشروع.
المصالح المتنافسة: D.V.B. وM.M.K. هما مؤسسان ومديران في مجلس إدارة مؤسسة غاسترونوتس، وهي شركة غير ربحية 501(c)3. تم تقديم بعض النتائج من قبل D.V.B. كطلب براءة اختراع مؤقت. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة. الشكر والتقدير نشكر J. Kotula و M. Toh على المساعدة في التسلسل؛ R.A. Liddle، S. G. Lisberger، M.D. Gunn، J.A. Alspaugh، N.K. Surana، G. J. Schwartz، Z. Lorsch، M. Toc Sagra程的 DK136229 (E.A.); NIH F32 DK127757 و NIH KO1 DK138286 (L.E.R.); NIH F3ODK127650 (P.W.); J.A.A.G. هو طالب دكتوراه من برنامج الدكتوراه في العلوم الطبية الحيوية في الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك وقد حصل على منحة CONACYT رقم. CVU959984؛ CONAHCyT CF-2023-G-518 (R.G.)؛ NIH KO1 DK1314O3 (M.M.K.)؛ و NIH DP2 CVU9592402، NIH R21 AT010818، NIH RO3 DK114500، NIH RO1 DK131112 و NIH RO1 DK132O70 (D.V.B.).
\section*{معلومات إضافية}
معلومات إضافية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد إضافية متاحة فيhttps://doi.org/10.1038/s41586-025-09301-7. يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى م. مايا كيلبرر أو دييغو ف. بوهوركيس. تُعرب مجلة Nature عن شكرها لجون لوكنز والمراجعين الآخرين المجهولين على مساهمتهم في مراجعة هذا العمل. معلومات إعادة الطباعة والتصاريح متاحة علىhttp://www.nature.com/reprints.
لم يكن الباحثون معصوبين العينين بالنسبة لحالة العلاج أو النمط الجيني لضمان تنفيذ الإجراءات بشكل صحيح. تلقى كل نمط جيني أنظمة علاجية متطابقة.
Winston W. Liu , Naama Reicher , Emily Alway , Laura E. Rupprecht , Peter Weng , Chloe Schaefgen , Marguerita E. Klein , Jorge A. Villalobos , Carlos Puerto-Hernandez , Yolanda Graciela Kiesling Altún , Amanda Carbajal , José Alfredo Aguayo-Guerrero , Alam Coss , Atharva Sahasrabudhe , Polina Anikeeva , Alan de Araujo , Avnika Bali , Guillaume de Lartigue , Elvi Gil-Lievana , Ranier Gutierrez , Edward A. Miao , John F. Rawls , M. Maya Kaelberer & Diego V. Bohórquez
Abstract
To coexist with its resident microorganisms, the host must have a sense to adjust its behaviour in response to them. In the intestine, a sense for nutrients transduced to the brain through neuroepithelial circuits guides appetitive choices . However, a sense that allows the host to respond in real time to stimuli arising from resident gut microorganisms remains to be uncovered. Here we show that in the mouse colon, the ubiquitous microbial pattern flagellin-a unifying feature across phyla -stimulates Toll-like receptor 5 (TLR5) in peptide YY (PYY)-labelled colonic neuropod cells. This stimulation leads to PYY release onto NPY2R vagal nodose neurons to regulate feeding. Mice lacking TLR5 in these cells eat more and gain more weight than controls. We found that flagellin does not act on the nerve directly. Instead, flagellin stimulates neuropod cells from the colonic lumen to reduce feeding through a gut-brain sensory neural circuit. Moreover, flagellin reduces feeding independent of immune responses, metabolic changes or the presence of gut microbiota. This sense enables the host to adjust its behaviour in response to a molecular pattern from its resident microorganisms. We call this sense at the interface of the biota and the brain the neurobiotic sense .
Every organism interprets the world through its senses-its Umwelt . Although five canonical senses have been extensively studied, emerging evidence has established the neural basis of a gut sense, a sense that constantly assesses stimuli arising from the gut lumen . Nutrients, stretch, and microorganisms are among the most salient stimuli that the gut encounters. In the small intestine, epithelial neuropod cells rapidly detect nutrients and relay the sensory information, through the vagus nerve, to influence an animal’s appetitive choices in real time . Growing evidence suggests that gut microorganisms, which are most abundant in the colon , substantially modulate feeding behaviour , potentially through neuromodulators ,immune signals and vagal pathways . However, a direct neural circuit through which the host interprets microbial sensory information to adjust its feeding remains unknown.
In the colon, vagal neurons form neuroepithelial circuits with neuropod cells, labelled by the neuromodulator . These, and other colonic epithelial cells, are constantly exposed to microorganisms, which can be recognized by molecular patterns such as flagellin,
collectively known as microbe-associated molecular patterns. Flagellin is a structural component of one of the three most ancient organelles, flagella , and a protein conserved across bacterial phyla that activates the pattern recognition receptor TLR5 (refs. 36,37). Deleting Tlr5in all intestinal epithelial cells of mice leads to obesity, metabolic inflammation, and spontaneous colitis . Furthermore, evidence from immortalized gut cell lines suggests that Toll-like receptors may be expressed by specialized sensory epithelial cells, including those that secrete the satiety-inducing protein . Here we determined that feeding behaviour is regulated by a previously unrecognized gut-brain sensory modality for microbial patterns. We call this sense, at the interface of the biota and the brain, the neurobiotic sense.
PYY cells express Tlr5
In the gut, sensory epithelial cells are dispersed among other epithelial cells at a ratio of less than 1 in 1,000 (ref. 39). They encompass two main lineages: those that express serotonin and substance P , and those that
Fig. 1 | The absence of microbial pattern recognition receptor TLR5 in colonic PYY-labelled cells increases food intake. a, Mouse colon with GFP-labelled PYY-labelled cells was rolled longitudinally (proximal colon in the centre); representative of mice. Inset: magnified view of the outlined area showing a single PYY-GFP cell with apical process reaching into the lumen and neuropod reaching towards the base of the crypt. DAPI, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole. Scale bars, . b, Volcano plot of microbial pattern recognition receptor gene expression in epithelial PYY-GFP and non-GFP cells by RNA sequencing. Compared to non-GFP cells, PYY-GFP cells are enriched for the pattern recognition receptor gene ( mice; adjusted by DESeq2 with two-tailed -test). c, Fluorescence in situ hybridization of in PYY-GFP cells. Error bars represent s.e.m. Left: regional expression of Tlr5in PYY-GFP cells ( mice, each dot represents 50 cells). n.d., not detected (no cells expressing Tlr5). Dist. distal; Duo., duodenum;Jej., jejunum; Ile., ileum; Prox., proximal. Right, PYY-labelled cell (green) expressing (red) in the distal colon; representative of mice. Scale bar, . White dashed line represents PYY-labelled cell outline. d, Left, genetic deletion of Tlr5 exclusively
in PYY-labelled cells causes increased weight gain in male and female mice (males (M) Pyy Tlr5 mice, starting weight Tlr littermate controls: mice, starting weight ; females (F) Tlr5 mice, starting weight Tlr littermate controls: mice, starting weight genotype-time interaction by repeated-measures analysis of variance (ANOVA) with post hoc Tukey honestly significant difference (HSD). Error bars represent s.e.m. Right, meal duration in females and meal size in males and females significantly increased in Pyy ; Tlr mice ( Tlr males: meals, mice; 5Pyy Tlr males: meals, mice; Tlr females: meals, mice; Tlr females: meals, mice; independent experiments; by two-way ANOVA with post hoc Tukey HSD; main effect of genotype and sex for meal size and duration with genotype-sex interaction). No changes observed in meal frequency (see Extended Data Fig. 5 for further analyses). Box plots represent interquartile range; white lines indicate median; whiskers extend to the furthest point above the third quartile or below the first quartile within the interquartile range.
express several neuromodulators including cholecystokinin (CCK), glucagon-like peptide 1 (GLP-1) and PYY . The expression of these neuropeptides is preceded by that of the transcription factor Neurod1 (ref. 42). In different regions of the intestine, Neurod1-labelled cells favour the expression of specific neuromodulators. For example, CCK prevails in the proximal small intestine, whereas PYY is enriched in the distal ileum and colon (Fig. 1a). The colon is a habitat rich in microorganisms . Using reporter mice expressing green fluorescent protein (GFP) driven by the CCK and PYY promoters, we sequenced the transcriptome of epithelial cells from the small intestine and colon (Extended Data Fig. 1). In each segment, we compared the transcriptome of sensory epithelial cells to that of their neighbouring epithelial cells to identify enriched receptors that detect microbial signals, including byproducts of dietary fermentation, metabolites, and patterns .
Both CCK-GFP cells in the proximal small intestine and PYY-GFP cells in the ileum and colon were significantly enriched in genes encoding receptors of microbial byproducts, such as Ffar1, Ffar2, Gpbar1 and Gpr119 ( mice, ; Extended Data Fig. 1). However, only PYYGFP cells were significantly enriched in genes for pattern recognition receptors, the most prominent being ( mice, ; Fig. 1b). TLR5 detects flagellin , a ubiquitous microbial pattern, classically associated with host immune defence and commensal tolerance .
The robust expression of Tlr5 in PYY-labelled cells was corroborated using in situ hybridization. Overall, co-localization significantly increased from in the ileum to in the distal colon ( mice, 50 cells per segment; , Fig. 1c), where PYY-labelled cell density is highest ( ; Extended Data Fig. 2a). Tlr 5 was not expressed in PYY-labelled cells of the brain or serotonin-labelled cells of the colon; in fact, Tlr5 was predominantly expressed in
PYY-labelled cells of the ileum and colon ( mice; Extended Data Fig. 2b-h).
TLR5 in PYY cells regulates feeding
To determine the role of TLR5 in PYY-labelled cells, we bred Pyycre; Tlr mice. In these mice, Tlr5 is knocked out of all PYY-labelled cells ( mice; Extended Data Fig. 3a). Studies have shown that a global knockout of Tlr5in mice causes metabolic dysfunction, inflammation, and obesity . Furthermore, when TLR5 is ablated in all gut epithelial cells, both the metabolic dysfunction and inflammation persist . However, we found that when TLR5 is ablated specifically in PYY-labelled cells, mice show no evidence of metabolic dysfunction or inflammation (Extended Data Fig. 3).
Compared to littermate controls, mice had normal oral glucose tolerance, fasting blood glucose ( mice, ; Extended Data Fig. 3b,c), and fat pad weight ( mice, , Extended Data Fig. 3d). Pyy Tlr mice also showed no change in the serum levels of the metabolic neuromodulators GLP-1 and PYY following 1 h of food consumption, suggesting that the circulating levels of gut hormones were no different from those of littermate controls ( mice, ; Extended Data Fig. 3e). Moreover, these mice showed no signs of spontaneous colitis and exhibited normal colon length, weight and spleen size ( mice, ; Extended Data Fig. 3f-h). Levels of the inflammatory markers colonic myeloperoxidase and fecal lipocalin-2 were unchanged between mice and controls ( mice, ; Extended Data Fig. 3i). Furthermore, there were no histological differences in the colon, including crypt depth and sensory cell density ( mice, ; Extended Data Fig. ), TLR gene expression in epithelial cells remained unaltered ( mice, ; Extended Data Fig. 3m), and no changes in tight junctions were observed ( mice, ; Extended Data Fig. 3n) in Tlr mice compared to littermate controls.
Notably, when TLR5 is ablated specifically in PYY-labelled cells, mice eat more and gain more weight ( mice, ; Fig. 1d, Extended Data Fig. 3o-p and Supplementary Table 1). As TLR5 is known to canonically trigger immune responses through intracellular activation of myeloid differentiation factor 88 (MyD88) , we bred ; mice to determine the effect of MyD88 ablation in PYY-labelled cells. We found that, compared to littermates, mice did not show increased body weight gain or food intake ( mice, ; Extended Data Fig. 4). Therefore, independent of canonical immune signalling, metabolic dysfunction, or inflammation, TLR5 in PYY-labelled cells regulates body weight gain.
Furthermore, we performed meal pattern analysis to determine the quantity, frequency, and timing of food ingestion. We optimized an automated home-cage behavioural system that records food intake to the nearest 0.01 g with temporal resolution of 1 s (Extended Data Fig. 5a). Both male and female ; mice ate significantly larger meals compared to littermate controls (males: mice; females: mice; ;Fig. 1d and Extended Data Fig. 5b,c). Moreover, female mice also ate longer meals than littermate controls ( ; Fig. 1d and Extended Data Fig. 5d-g), revealing that the length and size of meals are modulated by TLR5 in PYY-labelled cells.
PYY cells use TLR5 to sense flagellin
The established ligand for TLR5 is flagellin. Although transcriptional models suggest that diet influences microbial signals , it is unclear whether the amount of colonic flagellin changes with feeding. Using a cell-based assay, we found that relative flagellin levels in the stool are significantly higher in fed compared to fasted mice ( , mice ; Fig. 2a). This response is unaltered in mice ( mice, ; Fig. 2a), indicating that flagellin levels in the colon are independent of Tlr5 expression in PYY-labelled cells. Thus, feeding correlates with increased flagellin in the colon.
Analysis by quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) confirmed expression of Tlr1-Tlr5 in colonic PYY-GFP cells; however, compared to the expression levels in neighbouring epithelial cells, only Tlr5 expression showed significant enrichment in PYY-labelled cells ( mice, ; Fig. 2b). To determine whether these cells respond to ligands for Toll-like receptors, we recorded intracellular calcium activity from colonic PYY-labelled cells. We bred a mouse in which PYY-labelled cells express the SALSA6F protein. This fusion protein, linking tdTomato and GCaMP6f, allows for sorting primary cells on the basis of their red fluorescence, and recording their intracellular calcium activity while avoiding the toxicity of calcium indicator dyes .
Of all ; Salsa6f cells imaged, none responded to the TLR4 ligand lipopolysaccharide ( cells from 3 mice; Fig. 2c), responded to the TLR3 ligand poly(I:C) cells from 4 mice; Fig. 2c) and responded to the TLR5 ligand flagellin ( cells from 5 mice; Fig. 2c). The calcium responses to poly(I:C) were unaltered in the presence of the TLR5 inhibitor TH1020 ( cells from 3 mice, ; Fig. 2d,e), but the responses to flagellin were significantly attenuated ( cells from 3 mice, ;Fig. 2d,e), demonstrating that flagellin activation of PYY-labelled cells requires TLR5. Similar results were confirmed using NeuroD1-Cre;Salsa6f mice (Extended Data Fig. 6a,b).
We then determined whether the activation of PYY-labelled cells by TLR ligands leads to the release of PYY. Although poly(I:C) did not stimulate PYY release from dissociated colonic crypts compared to buffer ( mice, ; Extended Data Fig. 6c), flagellin ( ) stimulated significant release of PYY ( mice, ; Extended Data Fig. 6c). This release was significantly suppressed in colonic crypts from mice lacking TLR5 in PYY-labelled cells ( mice, ;Fig. 2f). Therefore, PYY-labelled cells sense flagellin using TLR5 and transduce it by releasing PYY-a known inducer of satiety .
PYY cells connect with vagal neurons
Besides the circulatory functions of intestinal PYY , recent work shows local paracrine and synaptic signalling onto the vagus nerve . Previously, monosynaptic rabies tracing has shown that PYY-labelled cells in the colon form synaptic connections with vagal neurons. These cells, known as neuropod cells, rapidly and directly transduce sensory cues to the nervous system .
Compared to neighbouring epithelial cells, PYY-labelled cells are significantly enriched in genes encoding proteins involved in synaptic signalling, synaptic formation and neurotransmission ( mice, ; Fig. 2g and Extended Data Fig. 7a,b). In addition, approximately one in five PYY-labelled cells contact peripheral neurons labelled by PGP9.5 in the ileum and colon cells per segment; Fig. 2h and Extended Data Fig. 7c). To confirm that PYY-labelled cells are functionally connected with the vagus nerve, we paired luminal optogenetics with in vivo whole-nerve electrophysiology of the cervical vagus nerve. We bred a Pyycre;ChR2 mouse in which PYY-labelled cells express channelrhodopsin-2 (ChR2), which is an opsin activated by light (Extended Data Fig. 7d,e). In ; ChR2 mice, a control -light stimulus applied to the lumen of the colon did not activate the cervical vagus, but a -light luminal stimulus led to a rapid and significant increase in the vagal firing rate ( mice, ; Fig. 2i). Vagal firing peaked within seconds of -light stimulus, demonstrating that PYY-labelled cells directly activate the vagus nerve. These results establish a direct PYY-labelled cell-vagal circuit for rapid signalling between the colon and the hindbrain, where the afferent vagus nerve terminates .
Fig. 2 | PYY-labelled cells sense microbial flagellin through TLR5. a, Relative stool flagellin concentration from mice and littermate controls following 16-h fast or ad libitum feeding. No differences across genotype. Feeding increased stool flagellin ( mice;* by repeated-measures ANOVA with post hoc two-tailed Tukey HSD). b, Heat map ( mice; adjusted by DESeq2 with two-tailed -tests; values in Extended Data Fig. 1; left) and qRT-PCR (non-PYY mice; mice;* by repeatedmeasures ANOVA with post hoc Tukey HSD; right) of TLR gene expression in non-GFP and PYY-GFP colonic epithelial cells. c, Selected calcium responses of ; Salsa6f colonic cells to poly(I:C) ( cells, mice), lipopolysaccharide (LPS; cells, mice) and flagellin ( cells, ). Grey bar indicates 30 -s infusion. d, Calcium responses to poly(I:C) and flagellin before (solid) and after (dashed) TLR5 inhibitor TH1020 . e, Calcium response quantification. Only flagellin, not poly(I:C), responses were reduced (poly(I:C): cells; flagellin: cells; by paired,
two-tailed -test). NS, not significant.f, Colonic epithelial monolayer cultures from mice and littermate controls stimulated with buffer, flagellin and forskolin (F) (I; positive control (ctrl)). PYY concentration in cell lysates and supernatants measured using enzyme-linked immunosorbent assay. Flagellin stimulated PYY release in Tlrsflfl but not cultures ( mice; by repeated-measures ANOVA with post hoc two-tailed Tukey HSD). g, Heat map of synaptic gene expression in non-GFP and PYY-GFP colonic cells ( mice; adjusted by DESeq2 with two-tailed -tests, values in Extended Data Fig. 1). h, Colonic PYY-GFP tissue immunostained for PGP9.5 (red). Representative of mice; regions quantified in Extended Data Fig. 7. Scale bars, . i, Left: vagal responses to intracolonic PBS and stimulation by a and lightemitting diode (LED) in ; ChR2 mice ( mice). Right: quantification of peak vagal responses ( mice;* by two-tailed Wilcoxon signed ranked test with non-parametric comparisons). Error bars and shading represent s.e.m.
Flagellin is transduced to vagal neurons
We then recorded cervical vagal activity in response to colonic perfusion of flagellin. Intralipid served as a positive control ( mice, ; Extended Data Fig. 7f,g). Perfusing flagellin( ) through the colon resulted in a significant increase in vagal firing rate within
seconds ( mice, ; Fig. 3a). To determine whether the PYY-labelled cell is necessary to transduce luminal flagellin onto the vagus, we bred a Pyycre;Halo mouse. In these mice, PYY-labelled cells express the optogenetic silencing protein halorhodopsin (Extended Data Fig. 7h), an anion channel that hyperpolarizes cells in response to light. A control -light stimulus applied to the
Fig.3|PYY-vagal circuits transduce colonic flagellin. a, Left, vagal responses to intracolonic perfusion of PBS or flagellin in wild-type mice ( mice). Right, quantification of peak response to flagellin ( mice;* by two-tailed paired -test). b, Left, vagal responses to intracolonic perfusion of PBS and flagellin with simultaneous -LED or -LED stimulation in ; Halo mice ( mice). Right, quantification of the peak vagal response to flagellin ( mice;* by two-tailed Wilcoxon signed ranked test with non-parametric comparisons using the Wilcoxon method). c, Vagal responses to intracolonic perfusion of flagellin in Pyy ; Tlr5 flfl mice ( mice) and littermate controls ( mice; for quantification, see Extended Data Fig. 8). d, Fluorescence in situ hybridization of PYY receptor Y2R (encoded by Npy2r) in a subpopulation of neurons in the vagal nodose ganglion. Representative of ganglia. Scale bars, . e, Left, vagal responses to intracolonic perfusion of PBS or flagellin before and
after intraperitoneal delivery of the Y2R inhibitor (Y2Ri) BIIE-0246 ( mice). Right, quantification of the peak vagal response to flagellin with and without the addition of Y2R inhibitor BIIE-0246 ( mice;* by Kruskal-Wallis test with non-parametric comparisons using the Wilcoxon method). f, In vivo calcium imaging of vagal nodose neurons positive for Npy2r in response to colonic perfusion of flagellin ( mice, neurons). A total of of NPY2R cells respond to flagellin.g, Left, in vivo calcium imaging of vagal nodose neurons in response to colonic perfusion of either intralipid ( ) or flagellin ( ). neurons, mice. Right, number of responding neurons to each stimulus ( mice, neurons). Grey dashed lines in the heat maps represent start and end of perfusion. Error bars and shading represent s.e.m. Graphics in f adapted with permission from ref. 3, AAAS.
lumen of the colon did not alter vagal activity in response to flagellin ( ), but a silencing -light luminal stimulus ablated vagal firing in response to flagellin ( mice, ; Fig. 3b). Moreover, in Tlr mice, luminal flagellin produced no rapid vagal response
compared to the case in littermate controls ( mice, ; Fig. 3c and Extended Data Fig. 8a). Therefore, PYY-labelled neuropod cells use TLR5 to sense luminal flagellin and rapidly transduce this microbial stimulus to the vagus nerve.
Fig. PYY-vagal circuits use TLR5 and Y2R to drive changes in food intake. Mice were fasted overnight and given an enema of either flagellin or PBS before receiving access to standard chow ad libitum.a,b, littermate control mice ate significantly less food post-flagellin enema at 20,40 and , whereas Tlr mice did not mice per genotype; genotype-enema-time interaction by repeated-measures ANOVA with post hoc two-tailed Tukey HSD). c,d, In wild-type mice, PBS and flagellin enemas were performed with the addition of either in the enema solution ( mice; c); or intraperitoneal injection of BIIE-0246 before enema ( mice; d). TLR5 and Y2R inhibition attenuated the reduction of food intake post-flagellin enema ( drug-enema-time interaction by repeatedmeasures ANOVA with post hoc Tukey HSD; see Extended Data Fig. 9c,d for vehicle controls). i.p., intraperitoneal. e, Crunch Master (top schematic) tracks feeding microstructure by means of audio and video recording. Black ticks
(bottom) indicate biting patterns of mice post-PBS or flagellin enema. f, Left, flagellin enema significantly delayed onset of the first three bites (black: bite 1; blue: bite 2; green: bite 3;P< 0.0001 main effect of treatment by repeatedmeasures ANOVA). Right, intake (spillage-corrected) was significantly decreased over test session after flagellin enema (two-tailed unpaired -test, ). Violin plots show median indicated by thick line and mean indicated by thin line. , In wild-type germ-free mice, flagellin enema decreased food intake compared to PBS enema ( mice;, enema-time interaction by repeatedmeasures ANOVA with post hoc two-tailed Tukey HSD). Error bars represent s.e.m.h, Model for microbial pattern sensing by neuroepithelial circuits to drive behavioural change. Bacterial flagellin is detected by TLR5 in colonic PYY-labelled cells, which in turn release PYY to activate vagal neurons through Y2R. Activation of this circuit contributes to overall food intake. Graphics in adapted with permission from ref. 3, AAAS.
Notably, molecular analyses using RNA sequencing, qRT-PCR and in situ hybridization show that vagal neurons do not express Tlr5 ( mice; Extended Data Fig. 8b-d). Moreover, calcium imaging of acutely dissociated vagal nodose neurons revealed that whereas capsaicin (the control stimulus) elicits calcium transients, flagellin does not, indicating that vagal nodose neurons themselves do not sense flagellin ( neurons from 4 mice; Extended Data Fig. 8e), further establishing PYY-labelled neuropod cells as flagellin transducers.
Vagal NPY2 receptor is required
We then sought to determine whether vagal activity in response to flagellin requires PYY release from neuropod cells. Published RNA-sequencing data show that vagal neurons innervating the colon express the PYY receptor Y2R ( cells; Extended Data Fig. 8f). In the gut, this receptor is thought to mediate local PYY signalling . Using in situ hybridization, we confirmed the expression of Y2R in vagal nodose neurons ( mice;Fig. 3d). Then, we found that blocking Y2R using BIIE-0246 ablates cervical vagal activity in response to flagellin perfused through the lumen of the colon ( mice, ; Fig. 3e).
To better understand how individual vagal neurons respond to flagellin in the gut, we used intravital calcium imaging to observe the activity of these neurons in response to stimuli perfused through the colon. We used a triple-transgenic mouse model, Snap25-FosTRAP-tdTomato , that enables real-time tracking of calcium changes in individual vagal neurons and subsequent labelling of these responsive neurons for further analysis. After imaging, we extracted the nodose ganglia and using compartment analysis of temporal activity by fluorescence in situ hybridization , we confirmed that of 332 NPY2R-labelled neurons reacted to flagellin in the colon (Fig. 3f and Extended Data Fig. 8g-i).
Moreover, calcium imaging of vagal nodose neurons revealed distinct response patterns: of neurons responded only to intralipid (a positive control), 27.7% responded to both intralipid and flagellin, and 60.6% responded exclusively to flagellin ( neurons; mice; Fig. 3 g and Extended Data Fig. 8j). This observation-that almost two thirds of the neurons activated by colonic infusions specifically responded to flagellin-suggests the existence of a unique neuroepithelial circuit for sensing flagellin, separate from the pathways involved in nutrient detection. Although future studies should investigate the neurons responding to both intralipid and flagellin, these results highlight a
distinct pathway for gut-brain signalling in response to the microbial pattern flagellin.
Flagellin regulates feeding through PYY cells
Our discovery of a neuroepithelial circuit for rapid sensing of a microbial pattern in the colon led us to investigate how flagellin influences behaviour in real time. We reasoned that the presence of flagellin in the colon would lead to a rapid decrease in food intake. To test this, we fasted mice overnight to induce hunger and then administered either flagellin ( ) or a PBS control by means of enema. We found that a flagellin enema significantly reduced food intake within 20 min in littermate control mice but had no effect on mice lacking TLR5 in PYY-labelled cells ( Tlr5 ; mice, ; Fig. 4a,b and Extended Data Fig. 9a). This response to flagellin was consistent across juvenile (5-week-old) and adult (10-week-old) mice, suggesting that this sensory pathway is conserved throughout development ( mice, ; Extended Data Fig. 9b).
To examine the specificity of the flagellin effect, we conducted an enema containing poly(:C), a TLR3 ligand, and found that this stimulus did not affect food intake ( mice, ; Extended Data Fig. 9c). Furthermore, flagellin caused a temporary decrease in food intake, which dissipated after 3 h ( mice, ; Extended Data Fig. 9c). Finally, pharmacologically inhibiting either TLR5 or the Y2 receptor prevented the flagellin-induced reduction in food intake ( mice, ; Fig. 4c,d and Extended Data Fig. 9d,e). These data strongly suggest that luminal flagellin rapidly and reversibly suppresses food intake by acting on TLR5 and triggering the release of PYY within this neuroepithelial circuit.
To analyse feeding behaviour with greater precision, we developed a behavioural system using video and audio recordings. The system, referred to as Crunch Master, serves to automatically quantify individual bite bouts in real time (Fig. 4e and Supplementary Videos 1 and 2). This analysis revealed that a flagellin enema delayed the onset of feeding and reduced overall food consumption without affecting bite frequency or eating duration within a period ( mice per group, ; Fig. 4f and Extended Data Fig. 9e). This further demonstrates that colonic flagellin stimulation modulates feeding behaviour in real time.
Notably, levels of flagellin delivered by means of enema were within the range of physiological concentrations found in fed versus fasted mice ( mice, ; Extended Data Fig. 9f). In addition, mice showed no signs of malaise, diarrhoea, pain, or physical limitations, and there was no significant increase in cytokine expression in the colon or spleen within 1 h post-enema ( mice, ; Extended Data Fig. 10a,b). Thus, neuroepithelial sensing of flagellin reduces food intake in the absence of an immune response.
Finally, to confirm that the effects of flagellin on food intake were due to direct activation of epithelial cells, and not interactions with gut microorganisms, we administered a flagellin enema to germ-free mice. Although germ-free mice can exhibit behavioural variations compared to conventionally raised animals , they are a useful model for studying this gut-brain neural circuit without a microbiome. Our results show that a flagellin enema significantly reduced food intake in these germ-free mice within 1 h ( mice, ; Fig. 4 g ). This demonstrates that direct sensing of flagellin by colonic epithelial cells is sufficient to suppress food intake, irrespective of other microbial signals. Collectively, these findings demonstrate that a gut sense for the microbial pattern flagellin regulates feeding (Fig. 4h).
Conclusion
This gut-brain neural circuit forms the foundation of a ‘neurobiotic sense’-a sense by which the host adjusts its behaviour by monitoring a gut microbial pattern. While previous research has focused on nutrient
sensory transduction in the small intestine , we discovered that the specialized colonic cells, PYY-labelled neuropod cells, utilize the pattern recognition receptor TLR5 to detect bacterial flagellin. These cells then rapidly signal to the brain, through the vagus nerve, to regulate feeding behaviour.
It is important to acknowledge that, in this study, one type of flagellin from Salmonella typhimurium, a stereotypical pathogen, was used. However, bacteria can be pathogenic or commensal depending on the specific flagellin variant expressed . Therefore, the effects of other molecular variants of flagellin warrant investigation. Future research should leverage developing technologies for real-time modulation of microbial populations to investigate the effects of flagellin fluctuations independently of exogenous induction.
Just as organisms rely on sight, sound, scent, taste and touch to navigate the world, they also adjust their behaviour in response to stimuli shaping their gut Umwelt .
Online content
Any methods, additional references, Nature Portfolio reporting summaries, source data, extended data, supplementary information, acknowledgements, peer review information; details of author contributions and competing interests; and statements of data and code availability are available at https://doi.org/10.1038/s41586-025-09301-7.
Bohórquez, D. V. et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. J. Clin. Invest. 125, 782-786 (2015).
Bellono, N. W. et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell 170, 185-198 (2017).
Kaelberer, M. M. et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science 361, eaat5236 (2018).
Buchanan, K. L. et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nat. Neurosci. 25, 191-200 (2022).
Furness, J. B., Rivera, L. R., Cho, H. J., Bravo, D. M. & Callaghan, B. The gut as a sensory organ. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10, 729-740 (2013).
Hu, D. & Reeves, P. R. The remarkable dual-level diversity of prokaryotic flagellins. mSystems 5, e00705-e00719 (2020).
von Uexküll, J. Umwelt und Innenwelt der Tiere (Springer, 1909).
Yong, E. An Immense World: How Animal Senses Reveal the Hidden Realms around Us (Random House, 2022).
de Hoyos-Vega, J. M. et al. Modeling gut neuro-epithelial connections in a novel microfluidic device. Microsyst. Nanoeng. 9, 144 (2023).
Servin-Vences, M. R. et al. PIEZO2 in somatosensory neurons controls gastrointestinal transit. Cell 186, 3386-3399 (2023).
Bayrer, J. R. et al. Gut enterochromaffin cells drive visceral pain and anxiety. Nature 616, 137-142 (2023).
Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R. & Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J. Mol. Histol. 42, 3-13 (2011).
Bohórquez, D. V. et al. An enteroendocrine cell – enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PLoS ONE 9, e89881 (2014).
Lu, V. B. et al. Adenosine triphosphate is co-secreted with glucagon-like peptide-1 to modulate intestinal enterocytes and afferent neurons. Nat. Commun. 10, 1029 (2019).
Hayashi, M. et al. Enteroendocrine cell lineages that differentially control feeding and gut motility. Elife 12, e78512 (2023).
Bai, L. et al. Enteroendocrine cell types that drive food reward and aversion. Elife 11, e74964 (2022).
Liu, W. W. & Bohórquez, V. D. The neural basis of sugar preference. Nat. Rev. Neurosci. 23, 584-595 (2022).
Gribble, F. M. & Reimann, F. Enteroendocrine cells: chemosensors in the intestinal epithelium. Annu. Rev. Physiol. 78, 277-299 (2016).
Martinez-Guryn, K., Leone, V. & Chang, E. B. Regional diversity of the gastrointestinal microbiome. Cell Host Microbe 26, 314-324 (2019).
Vijay-kumar, M. et al. Metabolic syndrome and altered gut microbiota in mice lacking Toll-like receptor 5. Science 344, 228-232 (2010).
ODonnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C. & Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature 583, 415-420 (2020).
Ye, L. et al. Enteroendocrine cells sense bacterial tryptophan catabolites to activate enteric and vagal neuronal pathways. Cell Host Microbe 29, 179-196 (2021).
Gabanyi, I. et al. Bacterial sensing via neuronal Nod2 regulates appetite and body temperature. Science 376, eabj3986 (2022).
Tolhurst, G. et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via the G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes 61, 364-371 (2012).
Lin, V. H. et al. Butyrate and propionate protect against diet-induced obesity and regulate gut hormones via free fatty acid receptor 3 -independent mechanisms. PLoS ONE 7, e35240 (2012).
Article
Chimerel, C. et al. Bacterial metabolite indole modulates incretin secretion from intestinal enteroendocrine cells. Cell Rep. 9, 1202-1208 (2014).
Chassaing, B., Ley, R. E. & Gewirtz, A. T. Intestinal epithelial cell toll-like receptor 5 regulates the intestinal microbiota to prevent low-grade inflammation and metabolic syndrome in mice. Gastroenterology 147, 1363-1377 (2014).
Chiu, I. M. et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature 501, 52-57 (2013).
Sgritta, M. et al. Mechanisms underlying microbial-mediated changes in social behavior in mouse models of autism spectrum disorder. Neuron 101, 246-259 (2018).
Muller, P. A. et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature 583, 441-446 (2020).
Fülling, C., Dinan, T. G. & Cryan, J. F. Gut microbe to brain signaling: what happens in vagus…. Neuron 101, 998-1002 (2019).
Margolis, K. G., Cryan, J. F. & Mayer, E. A. The microbiota-gut-brain axis: from motility to mood. Gastroenterology 160, 1486-1501 (2021).
Bravo, J. A. et al. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc. Natl Acad. Sci. USA 108, 16050-16055 (2011).
Sagan, L. On the origin of mitosing cells. J. Theoret. Biol. 14, 225-274 (1967).
Gewirtz, A. T., Navas, T. A., Lyons, S., Godowski, P. J. & Madara, J. L. Cutting edge: bacterial flagellin activates basolaterally expressed TLR5 to induce epithelial proinflammatory gene expression. J. Immunol. 167, 1882-1885 (2001).
Hayashi, F. et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410, 1099-1103 (2001).
Bogunovic, M. et al. Enteroendocrine cells express functional Toll-like receptors. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 7032, 1770-1783 (2007).
Lundberg, J. M. et al. Localization of peptide YY (PYY) in gastrointestinal endocrine cells and effects on intestinal blood flow and motility. Proc. Natl Acad. Sci. USA 79, 4471-4475 (1982).
Gehart, H. et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell 176, 1158-1173 (2019).
Billing, L. J. et al. Single cell transcriptomic profiling of large intestinal enteroendocrine cells in mice-identification of selective stimuli for insulin-like peptide-5 and glucagon-like peptide-1 co-expressing cells. Mol. Metab. 29, 158-169 (2019).
Li, H. J. et al. Intestinal Neurod1 expression impairs paneth cell differentiation and promotes enteroendocrine lineage specification. Sci. Rep. 9, 19489 (2019).
Rhee, S. H. et al. Pathophysiological role of Toll-like receptor 5 engagement by bacterial flagellin in colonic inflammation. Proc. Natl Acad. Sci. USA 102, 13610-13615 (2005).
Sun, J., Fegan, P. E., Desai, A. S., Madara, J. L. & Hobert, M. E. Flagellin-induced tolerance of the Toll-like receptor 5 signaling pathway in polarized intestinal epithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G767-G778 (2007).
Clasen, S. J. et al. Silent recognition of flagellins from human gut commensal bacteria by Toll-like receptor 5. Sci. Immunol. 8, eabq7001 (2023).
Yao, Z. et al. A high-resolution transcriptomic and spatial atlas of cell types in the whole mouse brain. Nature 624, 317-332 (2023).
Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S. & Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell 118, 229-241 (2004).
Thaiss, C. A. et al. Microbiota diurnal rhythmicity programs host transcriptome oscillations. Cell 167, 1495-1510 (2016).
Dong, T. X. et al. T-cell calcium dynamics visualized in a ratiometric tdTomato-GCaMP6f transgenic reporter mouse. Elife 6, e32417 (2017).
Batterham, R. L. et al. Gut hormone PYY3-36 physiologically inhibits food intake. Nature 418, 650-654 (2002).
Abbott, C. R. et al. Blockade of the neuropeptide Y Y 2 receptor with the specific antagonist BIIEO246 attenuates the effect of endogenous and exogenous peptide YY (3-36) on food intake. Brain Res. 1043, 139-144 (2005).
Koda, S. et al. The role of the vagal nerve in peripheral PYY3-36-induced feeding reduction in rats. Endocrinology 146, 2369-2375 (2005).
Alonso, A. M. et al. The vagus nerve mediates the physiological but not pharmacological effects of PYY3-36 on food intake. Mol. Metab. 81, 101895 (2024).
Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P. & Bohórquez, V. D. Neuropod cells: emerging biology of the gut-brain sensory transduction. Annu. Rev. Neurosci. 43, 337-353 (2020).
Han, W. et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell 175, 665-678 (2018).
Bai, L. et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell 179, 1129-1143 (2019).
McDougle, M. et al. Separate gut-brain circuits for fat and sugar reinforcement combine to promote overeating. Cell Metab. 36, 393-407 (2024).
Williams, E. K. K. et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell 166, 209-221 (2016).
Zhao, Q. et al. A multidimensional coding architecture of the vagal interoceptive system. Nature 603, 878-884 (2022).
Luczynski, P. et al. Growing up in a bubble: using germ-free animals to assess the influence of the gut microbiota on brain and behavior. Int. J. Neuropsychopharmacolog. 19, pywO2O (2016).
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License, which permits any non-commercial use, sharing, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if you modified the licensed material. You do not have permission under this licence to share adapted material derived from this article or parts of it. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/.
(c) The Author(s) 2025
Methods
Mouse strains
All experiments on mice were performed following approval by the Institutional Animal Care and Use Committee at Duke University Medical Center under the protocol A212-21-10. Mice were group-housed in Duke University’s Division of Laboratory Animal Resources, where they were kept on a light-dark cycle (0700-1900) with access to water and standard mouse chow (Purina 5001) ad libitum, unless otherwise indicated. The facility maintained an ambient temperature of and humidity of . Male and female adult mice aged 6-20 weeks were used in all experiments. The following experimental mouse strains were purchased, received or bred in-house and used directly: C57BL6/J (JAX 000664), PYY-GFP , CCK-GFP , Pyy , NeuroD1-Cre (JAX 028364), loxP-STOP-loxP cassette (LSL)_tdTomato (JAX 007914), LSL_Halo-YFP (JAX 014539), LSL_ChR2-tdTomato (JAX 012567), LSL_Salsa6f (JAX 031968), Trr (JAX 028599), Myd88 (JAX 008888), B6.Cg-Snap25 J (JAX 025111) and Fos 030323). The following double-transgenic mouse strains were bred in-house: Pyy ;Salsa6f, NeuroD1-Cre_Salsa6f, Pyy ;Halo-YFP and Pyy ; ChR2-tdTomato. Pyy mice were also bred to floxed Tlr5 (floxed exon 4) and Myd88 (floxed exon 3) mice to generate the following conditional knockout mice: Pyy Tlr and Pyy Myd88 .
Dissociation and isolation of single intestinal epithelial cells
Colons and small intestines of mice were dissociated for qPCR (PYYGFP), calcium imaging (Pyycre;Salsa6f) or sequencing (CCK-GFP and PYY-GFP) as previously described . In brief, the entire colon or proximal one-third of the small intestine was removed, flushed with cold PBS and cut into sections. Tissue was rinsed with cold PBS and then shaken in 1.5 mM EDTA in PBS for 30 min before a incubation at . The epithelial layer was then mechanically detached from the muscle layer by shaking in cold PBS. Following centrifugation at . (Eppendorf 5702 RH ; rotor A-4-38), the pellet was resuspended and incubated in HBSS (Gibco) with dispase and collagenase for 10 min at . Samples were then centrifuged ( 800 r.p.m.), filtered twice through a and filter, and resuspended in L15 medium ( FBS, HEPES, penicillinstreptomycin and of DNAse) to produce a single-cell suspension for further analysis. For whole-epithelial-layer analyses, first the pellet was resuspended in lysis buffer and further processed for RNA extraction.
Dissociation and isolation of single nodose neurons
Nodose neurons of mice were dissociated for qPCR (C57BL/6J), calcium imaging (NeuroD1-Cre;Salsa6f) or sequencing (C57BL/6J) as previously described . In brief, nodose ganglia were dissected and immediately placed into of ganglia dissociation solution containing 10 mM HEPES, glutamine, supplement, supplement, nerve growth factor and liberase (Roche, 5401054001) in Advanced DMEM/F-12. Following digestion, ganglia were rinsed twice with PBS, mechanically dissociated in dissociation solution, and filtered through a cell strainer. The dissociated solution was then carefully laid on a density gradient of and Percoll (Sigma) and centrifuged for 10 min at at room temperature. Once centrifugation was complete, the top was removed, and of fresh dissociation solution was added. Cells were then centrifuged for 15 min at , and the final pellet was resuspended in PBS plus .
RNA sequencing
RNA was extracted from single-cell suspensions using the Single Cell RNA Purification Kit (Norgen). All samples were assessed with a Bioanalyzer (Agilent), and only samples with RNA integrity number scores were used for downstream analysis. Given the rarity of
the cells, Single-cell RNA barcoding sequencing was used to generate libraries. Libraries were sequenced on an Illumina NextSeq 500. STAR was used with the mm10 mouse reference genome to align reads, and count tables were generated using featureCounts. Pairwise comparisons between genes from the PYY- and PYY- groups were made using DESeq2. Gene ontology analyses were conducted using topGO.
qPCR
The colonic epithelium of PYY-GFP mice was dissociated, and cells were sorted as described above. An equal number of and cells were collected directly into lysis buffer. Whole epithelium was dissociated from and control littermates and collected into lysis buffer as described above. Nodose was dissected and flash-frozen in liquid nitrogen. RNA was extracted on the basis of the manufacturer’s protocol using the RNeasy Micro Plus Kit (Qiagen no. 74034). Spleen and whole-colon tissues were collected and homogenized in TRIzol reagent (Thermo Fisher,15596026), and RNA was extracted per the manufacturer’s protocol. cDNA was produced per the manufacturer’s protocol using the High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, 4368814). The following TaqMan probes were used for transcript identification: Pyy (Mm00520716_g1), 18s (Mm03928990_g1), Tlr1 (Mm00446095_m1, Mm01208874_m1), Tlr2 (Mm00442346_m1, Mm01213946_g1), Tlr3(Mm01207404_m1), Tlr4 (Mm00445273_m1), Tlr5 (Mm00546288_s1),Actb (Mm02619580_g1), Tnf (Mm00443258_m1),Illb (Mm00434228_m1),Il6(Mm00446190_m1), Tjp1 (Mm01320638), Tjp2 ( ), Ocln ( Mm 00500910 ml ) and Cldn ( Mm 01342184 ). qPCR was run on a StepOnePlus System (Thermo Fischer), using TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems no. 4352042) according to the manufacturer’s protocol. Transcription rate was determined as or compared as fold change using . All values are reported as mean ± s.e.m.
In situ hybridization with immunofluorescence
NeuroD1_tdTomato and PYY-GFP mice were transcardially perfused with PBS for 3 min followed by for 3 min at a rate of . The entire intestine was collected, opened lengthwise and divided into different sections: proximal, middle and distal third of the small intestine; and proximal and distal halves of the large intestine. Intestinal tissue was then rolled with the proximal end in the centre, and post-fixed in PFA for 24 h . Nodose ganglia and dorsal root ganglia at the levels of L5, L 6 and S1 were also dissected bilaterally. Neuronal ganglia were rinsed in PBS and post-fixed in PFA for 24 h . Tissue was then dehydrated in sucrose for 1 h and sucrose for at least 12 h . Samples were embedded in OCT (VWR) and stored at . Tissue was sectioned onto slides at using a cryostat. RNA detection was performed using the RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACD). In brief, tissue slides were baked for 30 min at , and post-fixed in neutral buffered formalin (VWR) for 60 min before being washed in PBS twice (Sigma). Slides were then dehydrated using successive alcohol washes of and , and a second of ethanol for 5 min each. Slides were then incubated with hydrogen peroxide for 10 min before undergoing target retrieval using RNAscope reagents in a steamer. Slides were submerged into the RNAscope target retrieval solution at for 5 min . Slides were then treated with protease III for 30 min at before subsequent hybridization and amplification steps per the manufacturer’s instructions. The probes used were all purchased from ACD:Mm-Tlr5 (catalogue no. 468888), Mm-Pyy-C3 (catalogue no. 420681) and Mm-Npy2r (catalogue no.515431). Hybridization signal was detected using Opal dyes (Akoya Biosciences) at a dilution of 1:1,500. Tissue was then blocked in 10% donkey serum (Jackson ImmunoResearch) for 1 h . Tissue was then incubated with primary antibody dissolved in antibody dilution solution (PBS with BSA and Triton X-100) for 24 h at , followed by 1 h at room temperature. Primary antibodies and dilutions were as follows: Rb-anti-PYY (1:250; gift from the Liddle
laboratory), Rb-anti-PGP9.5(1:500; Abcam: ab27053), Gt-anti-serotonin (1:500; Abcam, ab66047) and CHK-anti-GFP (1:500; Abcam: ab13970). Following primary antibody incubation, tissue was washed in Tween-20 in TBS buffer (TBST) and then incubated with secondary antibody in antibody dilution solution for 1 h at room temperature: Dk-anti-Rb-488(1:250, catalogue no. 711-546-152), Dk-anti-Rb-Cy3 (1:250, catalogue no. 11-166-152), Dk-anti-Ck-488 (1:250, catalogue no. 703-546-155), Dk-anti-Gt-647 (1:500, catalogue no. 705-606-147), all from Jackson ImmunoResearch. Tissue was then washed with TBST, stained with DAPI (1:4,000) for 10 min , washed in TBST, and mounted using Fluoro-Gel with Tris buffer (Electron Microscopy Sciences). Imaging was carried out on a Zeiss 880 Airyscan inverted confocal microscope. Images were adjusted for brightness and contrast using ImageJ (Fiji V.2.9.0). In each region of the intestine, the 50 most proximal cells were analysed from a total of mice. Cells with puncta within the cell body were considered positive for the gene. Control slides using the negative control probes (ACD) were used to ensure that background staining was puncta per cell. Counts are presented as the mean percentage of co-localization ± s.e.m.
Assessment of basal phenotypes
and their Cre-negative littermates were weighed following weaning, and every week thereafter until 3 months of age. Mice were then euthanized, and colon length, colon weight and spleen weight were measured. Colonic tissues were flushed with cold PBS, incubated in neutral buffered formalin (VWR) for at , dehydrated in a graded series of ethanol and embedded in paraffin. Tissues were sectioned and stained with haematoxylin and eosin (Abcam, ab245880) per the manufacturer’s protocol and imaged for assessment of developmental and immune phenotypes.
Measurement of food intake
Age-matched and littermates were placed into clean cages with food hoppers. The hoppers are designed to minimize the ability of mice to remove entire pellets. The weight of the food in the hopper was recorded at both the start and end of a 24 -h period. Mice were then returned to their home cage for at least 2 days before repeating the test twice more. The mean of three separate testing days for each individual mouse is reported.
Detailed feeding, activity and meal pattern analysis
Age- and sex-matched and their Crenegative littermates were placed in a custom-built PhenoMaster behavioural phenotyping system for 10 days (TSE Systems). The first week was considered an acclimation period, and all meal pattern analyses were performed on the last 3 days within the system. The PhenoMaster was programmed (software version 6.6.9) to automatically maintain a light cycle (07:00 lights on; 19:00 lights off), temperature control ( ) and humidity control ( ). The PhenoMaster holds 12 clear cages, in which animals were singly housed. Cages were industrially washed, and bedding (ALPHA-dri) was replaced weekly. Animals were provided with standard mouse chow (Purina 5001) and reverse-osmosis water ad libitum. All cages also housed an enrichment device, which also served to weigh the animals. Food hopper, water bottle and weigh container were attached to weight sensors (TSE). Food intake, water intake and weight were automatically measured every 5 s to the nearest 0.01 g . For drinking measurements, a smoothing interval with a maximum raw analog-to-digital conversion count difference of 40,000 was permitted. For weight measurements, a 15 -s smoothing interval with a15-g threshold and a maximum raw analog-to-digital conversion count difference of 1,000,000 was permitted. Intake was measured every 5 s and binned every minute for analyses unless otherwise indicated. Animal activity was determined by beams crossed in the and planes and was collected with a scan rate. Unless otherwise indicated, all activity, food intake and water intake measurements were
binned in 1-min intervals for analysis. Data were corrected for minor fluctuations by only permitting a monotonically increasing function for both food and water intake: values that represented negative food intake were replaced by the most recent value. Meal size, frequency and timing were defined on the basis of parameters within the PhenoMaster system. Inter-meal intervals were required to be . Only meals of size and rate were included in the meal pattern analysis.
Fasting blood glucose and oral glucose tolerance test
Blood glucose was measured in age-matched and mice following an overnight fast of 18 h . For oral glucose tolerance test, a separate cohort of mice were food- and water-deprived for 5 h . Then, mice were gavaged with sucrose ( body weight in sterile PBS). Blood glucose was measured (True Metrix 60 Blood Glucose Meter) after the deprivation, and 15, 30, 60, 90 and 120 min following gavage.
Fecal lipocalin-2 measurements
Colonic inflammation was assessed by assaying for fecal lipocalin-2 using an ELISA (Ray Biotech). Stool samples were collected from age-matched and Cre-negative controls during the beginning of the light cycle. Fecal samples were reconstituted in PBS to a final concentration of and vortexed for 5 min to obtain a homogeneous mixture. Fecal matter was then centrifuged for 10 min at . Supernatants were collected and stored at . Lipocalin-2 levels were assessed following the manufacturer’s instructions, and optical density was measured at 450 nm (Tecan Infinite 200 Pro).
Colonic myeloperoxidase assay
Neutrophil activity in tissue was assessed by testing for the enzymatic activity of myeloperoxidase using a colorimetric kit (Abcam). A segment of the distal colon from age- and sex-matched and littermates was dissected and weighed. Tissue was then washed in PBS, and mechanically homogenized in the lysis buffer provided in the kit. Tissue was then freeze-thawed twice and sonicated. Myeloperoxidase activity was assessed following the manufacturer’s protocol and normalized to the tissue mass, and optical density was measured at 450 nm (Tecan Infinite 200 Pro).
Serum hormone measurement
Age-matched and Cre-negative controls were fasted for 15 h and then fed ad libitum for 2 h . Following the re-feeding period, mice were euthanized, and serum was collected. DPP-4 inhibitor and aprotinin were added to serum samples to prevent peptide degradation. Total PYY3-36 (RayBiotech) and total GLP-1 (Alpco) levels were assessed using an ELISA per the manufacturer’s protocols.
Stool flagellin assay
Flagellin levels were assessed using HEK-Blue-mTLR5 cells (Invivogen). Stool was collected from age-matched wild-type, and Cre-negative controls during the start of the light cycle, following ad libitum feeding, an 18 -h overnight fast or an 18 -h overnight fast followed by a flagellin enema ( in ). Fecal material was resuspended in PBS to a final concentration of . Solutions were mechanically homogenized and vortexed for 5 min to form a suspension. Samples were then centrifuged at for 2 min , and serum was collected and either immediately assessed or stored at for later testing. Serial dilutions of the solution were placed onto the HEK-TLR5 cells, and purified S. typhimurium flagellin (Invivogen) was used to generate a standard curve. After 18 h of stimulation, cell culture supernatant was applied to QUANTI-Blue medium and incubated for 30 min at . QUANTI-Blue alkaline phosphatase activity was then read at 620 nm (Tecan Infinite 200 Pro).
Calcium imaging of dissociated cells
For neurons, NeuroD1-Cre_Salsa6f nodose neurons were dissociated as described above. Neurons were plated on coverslips and placed in a incubator overnight. Neuronal medium included: GlutaMAX, 10 mM HEPES, penicillin-streptomycin, supplement, supplement and nerve growth factor in Advanced DMEM/F-12. Cells were imaged days after plating. For enteroendocrine cells, Neurod1Cre_Salsa6f cells were dissociated as described above and fluorescence-sorted (BD FACSAria), selecting for tdTomato fluorescent cells. Cells were then plated on coverslips coated with Matrigel (Corning no. 356231). Enteroendocrine cells were imaged after plating. Cells were washed twice in imaging buffer HEPES, 10 mM glucose; ) and placed in the dark for 5 min until they reached room temperature. Coverslips were then placed in the recording chamber of a Zeiss Examiner Z1 and imaged with a Hamamatsu camera (Orca-flash4.0; C11440) using the Zeiss ZEN Blue software package. GCaMP6f emission images were obtained using excitation. Images were collected at intervals with a exposure time. Each recording was 180 s long, with a stimulus perfused between 30 and 60 s . Imaging buffer was continuously perfused (about ) over the coverslips throughout the imaging session. Each coverslip underwent four recordings: buffer, test stimulus, repeat of the test stimulus, and KCl . Each recording session concluded with 50 mM KCl as an activity control ( KCl concentration was achieved by substituting for NaCl , and not an addition of more KCl ). A response to KCl was defined as a ratio increase above baseline. Cells that did not reach this KCl threshold were not included in analyses. A 5-min wash-out period with continuous perfusion of imaging buffer was carried out between the two test stimuli. For experiments involving the TLR5 inhibitor, TH1020 was added to the well to reach a final concentration of following the wash-out period. Buffer flow was stopped, and cells were incubated with the inhibitor for 10 min before restarting flow and retesting with the stimulus.
Analysis. Fluorescence values for each individual cell were calculated as the mean fluorescence intensity in a user-defined region of interest on Fiji software. Intracellular calcium changes were then calculated as , in which is the average intensity of the cell within the first 15 s . Ratiometric values were then normalized to the peak KCl response. A positive response was defined as an increase in ratio above baseline.
PYY release assay
Colons from wild-type and knockout mice were dissected, flushed with cold PBS, opened lengthwise and cut into pieces of about 1 cm . Tissue pieces were incubated on ice in PBS for 2 h before incubation with 1.5 mM EDTA on ice for 30 min , and then for 15 min . Crypts were detached by shaking in cold PBS, pelleted at and plated on coverslips coated with Matrigel (Corning no. 356231). Crypts were then incubated in L-WRN Buffer (ATCC) with Y-27632 (Enzo) for 16 h before stimulation. Crypts were then stimulated with buffer , 10 mM HEPES, 10 mM glucose), flagellin in buffer, or a mixture of M IBMX (Sigma) and 1 nM forskolin (Sigma) in buffer for 30 min at . Supernatant was collected, and the crypts were then incubated in lysis buffer for 30 min at . Lysate was collected, and both lysate and supernatant were centrifuged for 10 min at to remove insoluble material, and stored at for up to 2 weeks. PYY concentration in samples was assessed using the PYY ELISA Kit (Ray BioTech) following the manufacturer’s protocol. Each experimental condition was run in duplicate on every plate. A PYY standard was run for every plate. Absorbance at 450 nm was measured on a plate reader (Tecan Infinite 200 Pro). PYY amount and concentration was calculated
using the standard curve. PYY release was calculated as supernatant/ (supernatant + lysate).
Vagus nerve recordings
Whole-nerve recordings were performed in wild-type mice, ; Halo-YFP mice, ; ChR2 mice, ; mice, ; mice and negative genetic controls. Whole-nerve electrophysiology recordings of the cervical vagus nerve were performed as previously reported . A 20-gauge gavage needle with two connected tubes for PBS perfusion and stimulant delivery was surgically inserted through the caecum wall into the proximal colon. A perfusion exit incision was made just proximal to the rectum for colon. Fecal pellets were gently expressed from the colon using cotton applicators. PBS was constantly perfused through the isolated intestinal region at about as a baseline and volume pressure control. Stimulation conditions were applied after recording 2 min of baseline activity. During stimulation conditions, PBS perfusion was continuous, and of flagellin was perfused over 1 min using a syringe pump (Fusion 200, Chemyx). As a positive control to activate the vagus nerve from the colon lumen, intralipid (7%, Sigma) was infused.
Data acquisition. Extracellular voltage was recorded as previously described . The raw data were analysed using Spike Tailor, a custom MATLAB software (Mathworks) script . Spikes were detected using a threshold detected on the basis of root-mean-square noise. The firing rate was calculated using a Gaussian kernel smoothing algorithm in bins.
Optogenetic inhibition and stimulation. The optoelectronic colon fibre was threaded along the gavage needle into the colonic lumen. MicroLED stimulation was applied simultaneously with nutrient infusion. The microlED was pulsed for 1 min at peak and duty cycle ( ).
Pharmacologic inhibition. Following recording of a pre-inhibitor response, the inhibitor was delivered over BIIE-0246 and allowed to incubate for 10 min before re-infusion of flagellin.
Data analysis. Stimulation response was quantified as the maximum firing rate after stimulation (stimulant conditions) or during recording (baseline). Each trial served as its own control by normalizing the firing rate to the pre-stimulus baseline firing rate (first 2 min of recording). Throughout experiments, intralipid response was used as a positive control. For all nutrient and laser stimulation conditions, data were excluded if an intralipid response was not seen throughout the recording session. Maximum firing rate and area under the curve were analysed across stimulation condition.
Optoelectronic colon fibre fabrication
The preform assembly for optoelectronic graded-index fibres began with moulding polystyrene-block-poly(ethene-co-butadiene)-block-polystyrene (SEBS) pellets (Kraton G1657M) into desired geometrical patterns in a CNC machined inverse aluminium mould at for 8 h under vacuum. The top layer defined the hollow square channels ( ) with a pitch size of 4 mm for hosting the interconnect microwires. The SEBS convergence channels were subsequently lined with a U-shaped PC layer that had a wall thickness of 1 mm and channel size of produced by standard CNC machining process. This preform was consolidated in an oven , 45 min ) and subsequently drawn into metres-long microscale fibres at a size reduction ratio of , while simultaneously feeding three spools of microwires.
Fibre device fabrication. Fabrication of graded-index fibre device began with dissolving away the SEBS layer in the distal 1 cm of fibre
( 8.5 cm total length) in dichloromethane for 10 min , which exposed the interconnect microwires. The interconnects were subsequently soldered onto male header pins that were assembled inside a custom 3D-printed box ( ) and secured using UV curable epoxy. About 0.5 cm of the interconnect microwires was exposed by low-end machining with a razor blade at the distal end of the fibre under an optical microscope, followed by mounting of blue ( emission maxima) and green (532-nm emission maxima) microLED chips (CREE TR2227 and SR2130) using two-part silver epoxy (Epo-tek). Subsequently, a layer of vapour-deposited parylene-C defined the bio-fluid barrier layer. Finally, the device was encapsulated in an approximately layer of medical-grade silicone by inserting the fibre device in a PTFE tubing with an inner diameter of 0.8 mm , which acted as a sacrificial mould. The silicone mixture was filled and cured in the tubing, and subsequently the tubing was cut open to yield a silicone-coated soft device. The final fibre had an overall length of 8.5 cm with three green and blue microLEDs hosted on the distal 2 cm of the fibre at a separation of 1 cm .
In vivo two-photon calcium imaging and compartment analysis of temporal activity by fluorescence in situ hybridization
Snap25-FosTRAP-tdTomato triple-transgenic mice were used to generate landmark tdTomato vagal nodose neurons for compartment analysis of temporal activity by fluorescence in situ hybridization (catFISH) analysis through targeted recombination in active populations (TRAP) at least 10 days before calcium imaging as previously described .In brief, 6-h-fasted mice were given intragastric infusions of nutrients before dark cycle onset. At 3 h after stimulus delivery, mice were injected with 4-hydroxytamoxifen ( , intraperitoneal; Sigma) to induce tdTomato expression in a subpopulation of nutrient-responsive vagal sensory neurons, allowing for post hoc landmarking and alignment. Chow was returned 3 h after 4-hydroxytamoxifen injection. For calcium imaging, mice were fasted overnight ( 18 h ) and maintained under continuous anaesthesia (isoflurane-oxygen) on a heating pad to sustain body temperature throughout the procedure. An abdominal incision was first made in the anaesthetized mice to expose the caecum and colon. A20-gauge gavage needle with dual tubing for PBS perfusion and stimulant delivery was surgically inserted through the caecal wall into the proximal colon and secured with a suture. The rectum was severed to create an exit for fluid drainage. Fecal pellets were gently expelled from the colon using cotton applicators. Next, an incision (about 2 cm ) was made above the sternum and below the jaw. The carotid artery and vagus nerve were exposed by separating the salivary glands. Retractors were used to pull the sternomastoid, omohyoid and posterior belly of the digastric muscle aside to visualize the nodose ganglion. The vagus nerve was transected just above the nodose ganglion, which was carefully separated from the hypoglossal nerve and small adjacent branches. The vagus nerve was then dissected away from the carotid artery and surrounding tissues. The right nodose ganglion was gently positioned on a stable imaging platform consisting of a -diameter coverslip attached to a metal arm fixed to a magnetic base. Surgical silicone adhesive (Kwik-Sil, WPI) was applied to immobilize the vagus nerve on the coverslip, and the nodose ganglion, immersed in Dulbecco’s modified Eagle medium (Corning), was covered with a second coverslip before imaging.
Stimulus perfusion. Perfusions were performed using a precision pump connected to silicone tubing filled with PBS, flagellin ( ) or intralipid. PBS was continuously perfused throughout the recording. Baseline neuronal activity was recorded for 30 s , followed by a flagellin infusion and an additional 2 min of recording post-infusion.
In mice in which responses to both flagellin and intralipid were tested, the colon was flushed with 10 ml of PBS after flagellin perfusion to remove residual flagellin through the exit port. A second baseline
activity recording was then taken, followed by a intralipid perfusion ( ) and another 2 -min post-perfusion recording.
Imaging. In vivo imaging was performed using a two-photon microscope (Bruker) equipped with a galvanometer for image acquisition and a piezo objective combined with a galvo/resonant scanner, enabling image capture at 29 frames per second (Prairie View v.5.7). The microscope was set up for in vivo conditions with a Somnosuite (isoflurane) anaesthesia device coupled to a homeothermic control warming pad (Kent Scientific) and a programmable syringe pump (Harvard Apparatus PHD 2000) for nutrient perfusion into the gut. Imaging was conducted using a water-immersion upright objective.
RNAscope and alignment. For nodose catFISH analysis, we adapted a previously reported protocol for registration of vagal neurons between in vivo calcium imaging and RNAscope fluorescent in situ hybridization images . After in vivo imaging, immobilized nodose ganglia were immediately fixed in PFA for 2 h and then placed in sucrose for 1 h before being embedded in OCT and frozen at . Nodose ganglia were then sliced into sections, and an RNAscope assay was performed to probe for Npy2r mRNA expression as described above, without slide baking, post-fixation and target retrieval. To align RNAscope sections to in vivo imaging -stacks, ‘guidepost’ neurons were used as positional landmarks for mapping between in vivo and sectioned images. In brief, tdTomato neurons visible in both RNAscope sections and in vivo planes were identified as landmark reference points and were manually paired using the BigWarp tool within the Fiji BigDataViewer plugin. Using this tool, RNAscope sections were transformed and aligned to corresponding planes within the in vivo imaging -stack, allowing visualization of NPY2R neurons overlaid on GCaMP6s-fluorescent neurons. Cells with ambiguous or unsuccessful alignment were not used for further analysis.
Quantification of neural activity. GCaMP6s fluorescence changes were quantified by outlining regions of interest (ROIs), each corresponding to a single cell throughout the imaging session. For nodose images processed using catFISH alignment, ROIs were selectively generated around NPY2R cells. Pixel intensities in ROIs (average across pixels) were calculated frame by frame using ImageJ and exported to Excel for analysis. The -score for each neuron was calculated by subtracting the mean baseline fluorescence (over a 30 -s period) from the fluorescence intensity at each time point and dividing by the standard deviation of the baseline fluorescence. This normalized value represents the number of standard deviations from the baseline fluorescence. A neuron was considered responsive if: the peak GCaMP6s fluorescence reached a -score of , and the mean GCaMP6s fluorescence was above the baseline mean for at least 5 s during or after infusion. Neurons without baseline activity were excluded from the analysis.
Food intake behavioural system
Mice were acclimated to enema two times before the start of the test. Tests were started 3 h into the start of the light cycle. Mice were fasted overnight for 18 h . At the start of the test, mice received a enema of flagellin or PBS and were then placed into a clean cage. A pre-weighed pellet of standard rodent chow ( 5001 Purina) was then introduced to the cage, and then weighed at and 180 min following the enema. At the end of the test, mice were returned to their home cages. The start of all test sessions was separated by at least 48 h . For pharmacological inhibition of TLR5, C57BL/6J wild-type mice were acclimated to enema, a baseline response to flagellin was established, and then mice received enemas of flagellin or PBS combined with TH1020 (Sigma). Food intake was then measured as described above.
For pharmacologic inhibition of Y2 receptors with intraperitoneal injections, C57BL/6J wild-type mice were acclimated to enema and
intraperitoneal injections two times before the start of the test. At the start of the test, mice received an intraperitoneal injection with BIIE-0246 or vehicle and were then placed into a clean cage. After 10 min , mice received a enema of flagellin or PBS. Food intake was then measured as described above.
Germ-free mice. Age- and sex-matched germ-free C57BL/6J wild-type mice were transferred from the Duke Gnotobiotic core in sterile, individual cages. Tests were started 3 h into the start of the light cycle. Mice were fasted overnight for 18 h . At the start of the test, mice received a enema of PBS, followed by an enema flagellin 7 days later. Food intake was measured as described above.
Crunch Master behavioural system
Female and male, 8-week-old, wild-type C57BL/6J mice were habituated for 1 h a day for 2 days in the behavioural device before the test session. Mice were food-deprived 18 h before the test session, which was performed during the light phase of the mice. Preceding the test session, mice were weighed and subsequently administered a enema of either flagellin or PBS. Immediately following the enema administration, the mice were placed into the acrylic box and allowed to feed ad libitum for 1 h . After the test session, the mice were returned to their home cages.
Behavioural device. An acrylic box ( ) was equipped with a microphone (FIFINE T-669) attached to one wall. To enhance sound recording, 12 small drill holes ( 0.5 cm diameter) were incorporated into the wall near the microphone. A video camera (Kayeton Technology, model KYT-U400-MCS2812R01) was positioned 57 cm beneath the acrylic box to capture a bottom-up view of the mouse’s feeding behaviour. On the same wall as the microphone, a single standard chow food pellet was glued to a plastic lid that was then affixed to the wall. The weight of the food pellet was measured both before and after the test session to calculate food intake, with adjustments made for any food spillage. The audio and video data were recorded using the OBS 29.1.3 software.
Audio processing. Audio recordings were converted into .ogg format. Initial recordings were captured at a sampling frequency of 44.1 kHz , and then subsampled to for power spectrogram computation. The biting frequency was determined to lie between 400 and , the absolute power spectrum was averaged, and a band-pass filter between 400 and was applied to accurately identify biting frames. From the filtered signal, a threshold of 0.5 standard deviations above the mean was calculated. Each audio frame exceeding this threshold was binarized to 1 (indicating a potential bite), whereas those below were set to 0 (non-bite). This procedure further helped to eliminate false bite events. The binarized signal was then used to compute the bite start and end. A bite was defined as a sequence of binarized audio frames (with values of 1 ) separated by pauses in feeding (values of 0 ) longer than 10 s . These pauses were referred to as inter-bite intervals. A minimum of three consecutive audio frames with a value of 1 was required to be considered a bite.
Video processing. To ensure accurate bite identification, video snippets were automatically generated for each potential bite event. These snippets were then reviewed and validated by a human observer. Only the video snippets depicting correctly identified bites were included in the subsequent analysis. All video snippets utilized in this study are available in the Supplementary Information. The original video footage was recorded in .mkv format at a frame rate of 30 frames per second.
Statistics and reproducibility
We performed statistical analyses using R (3.1) and JMP Pro (SAS, version 16), unless otherwise indicated. Data were evaluated for normality
using a plot. For normally distributed data, ANOVA was used and Tukey HSD post hoc testing was performed when applicable. For behaviour studies, we used a repeated-measures ANOVA to account for each individual, followed by post hoc paired Student’s -tests. For data not normally distributed, means were evaluated by Kruskal-Wallis test with non-parametric comparisons using the Wilcoxon method. For other studies, comments on statistical tests performed are included throughout the Methods and in the figure legends. All error bars and shaded regions represent s.e.m. unless otherwise indicated. Sample size was not predetermined using power analyses. Standardized randomization was not performed for in vitro or in vivo experiments. All behavioural studies were counterbalanced across age and sex to control for variables including position in cage and order effect. Experimenters were not blinded to treatment condition, genotype or outcome.
Reporting summary
Further information on research design is available in the Nature Portfolio Reporting Summary linked to this article.
Data availability
All data supporting the findings of this study are available within the paper and its Supplementary Information. The mm 10 mouse reference genome is available from GENCODE vM23/Ensembl 98. RNA-sequencing datasets are available on the NIH Gene Expression Omnibus (GEO database under accession GSE288590. Data from single-cell RNA-sequencing analysis of whole mouse brain are available at ref. 46 or via the Allen Institute Brain Atlas at https://portal. brain-map.org/atlases-and-data/bkp/abc-atlas.
Extended Data Fig. 1| RNASeq of Cck- and Pyy-labeled cells. Heatmap showing expression of (a,e) neuropeptide, (b,f) nutrient sensor, and (c,g) metabolite receptor genes in non-GFP and CckGFP epithelial cells from the proximal half of the (a-d) small intestine or non-GFP and PyyGFP epithelial cells from the
(e-h) ileum and colon ( mice; adjusted values by DESeq 2 with two-tailed t-tests). (d,h) Table of base mean expression, fold change, and adjusted value of Toll-like receptors between (d) CckGFP cells and non GFP cells and (h) PyyGFP cells and non-GFP cells.
Extended Data Fig. 2 | Tlr5 transcripts in neuropod cells. (a) (Left) Pyy-labeled neuropod cells per crypt: This panel shows the number of Pyy-positive cells per crypt in female and male mice. Each dot represents the average of 50 crypts analyzed. by two-tailed t-test. (Right) Ileal and colonic tissues from PyyGFP mice ( mice) were evaluated for Pyy cell quantities per segment. (b) (Left) Neurod1Cre_tdTomato (red) cell with ISH labeling of Pyy, representative of mice. (Right) Quantification of overlap between Neurod1Cre_tdTomato cells with 5HT and Pyyin the colon ( mice, each dot represents cells). (c) (Left) Neurod1Cre_tdTomato (green) cell with ISH labeling of Tlr5 (red),
representative of mice. (Right) Regional expression of Tlr 5 in Neurod1-labeled neuropod cells ( mice, each dot represents cells). (d) (Left) Antibodylabeled serotonin (green) cell with ISH labeling of Tlr5 (red), representative of mice. (Right) Regional expression of Tlr5 in 5HT cells ( mice, each dot represents cells). Scale bars . Error bars represent S.E.M. e-h: Singlecell RNA sequencing (scRNAseq) analysis of whole mouse brain (Allen Institute Brain Atlas). (f,g) Cluster of Pyy-labeled cells in the medulla. (g,h) These Pyylabeled cells do not express Tlr5. e-h, adapted from ref. 46, Springer Nature Limited, under a Creative Commons licence CC BY 4.0.
Extended Data Fig. 3 | See next page for caption.
Extended Data Fig. 3 | Metabolic and immune phenotype of PyyCre_Tlr5 mice. (a) In-situ hybridization of Tlr5 transcripts in colonic Pyy-labeled cells in PyyCre_Tlr mice and_Tlr littermates ( mice per genotype; two-tailed unpaired t-test ). Scale bar . Genetic deletion of Tlr5 in Pyylabeled cells did not affect (b) oral glucose tolerance, (c) fasting blood glucose, (d) fat pad weights, (e) serum PYY or GLP-1 levels (fasted overnight, one-hour refed), (f) colon length, and (g) weight, or (h) spleen weight by ANOVA, for sample sizes see Supplementary Table 2). (i) Colonic myeloperoxidase levels ( mice per genotype) and fecal lipocalin-2 levels ( mice per genotype) across genotypes ( by two-tailed unpaired t-test). (j) Morpho-pathological analysis of Hematoxylin & Eosin-stained colon sections from PyyCre_Tlr5 mice and_Tlr5 control littermates. Proinflammatory lamina propria cells in both groups were within normal limits, representative of mice. Scale bar . Comparison of colons from PyyCre_Tlr5 mice and_Tlr
control littermates showed no change in (k) crypt depth (n=3 mice), (l) PYY and 5-HT cell density ( mice), (m) epithelial Tlr expression ( mice), or (n) tight junction expression ( mice) by two-tailed unpaired t-test). (o) Genetic deletion of Tlr5 in Pyy-labeled cells significantly increased weight gain in males and females (males: mice for PyyCre_Tlr mice for _Tlr5 littermate controls; females: mice for PyyCre_Tlr5 mice for_Tlr5 littermate controls;* genotype*time interaction per sex by rmANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD). (p) 24 h food consumption was significantly higher in PyyCre_Tlr5 mice compared to_Tlr5 littermate controls (males: mice for PyyCre_Tlr mice for_Tlr littermate controls; females: mice for PyyCre_Tlr5 mice for_Tlr5 littermate controls; , genotype main effect by ANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD, no significant differences between days, intake averaged across 3 consecutive days at 21 weeks of age). Error bars represent S.E.M.
Article
Extended Data Fig. Phenotype of PyyCre_Myd88 mice. (a) In situ
hybridization validating the lack of Myd88transcripts in colonic Pyy-labeled cells in PyyCre_Myd88 mice mice;* by two-tailed unpaired t-test). (b) Genetic deletion of Myd88 exclusively in Pyy-labeled cells caused no significant change in the relative concentration of flagellin in the stool ( mice, by two-tailed unpaired t-test). PyyCre_Myd mice had no changes
in weight gain compared to their littermate controls in both (c) females (PyyCre_Myd mice, mice; by rmANOVA) and (d) males (PyyCre_Myd mice,_Myd mice; by rmANOVA). (e) PyyCre_Myd88 had no changes in 24-hour food consumption averaged across 3 consecutive days ( mice; by ANOVA). Error bars represent S.E.M.
Extended Data Fig. 5 | Meal pattern analysis in PyyCre_Tlr5 mice.
(a) Schematic of meal pattern analysis showing that meals are defined as consumption with at least 10 min in between bouts. Cumulative food consumption was assessed for PyyCre_Tlr5 and_Tlr5 littermate control mice across 3 days in the TSE Phenomaster for (b) male and (c) female mice. Quantification of meals across 72 h in the dark and light cycles in males and
females of (d) meal duration, (e) meal size, and (f) inter-meal interval. Box plots represent interquartile range, white lines indicate median. and (g) meal count (PyyCre_Tlr5 male mice and female mice;_Tlr5 male mice and female mice;* genotype main effect by ANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD).
Article
a
Calcium imaging in colonic Neurod1_Salsa6f cells
b Neurod1 cell response heterogeneity to microbial patterns
C PYY release assay in colonic epithellia
Extended Data Fig. 6 | Enteroendocrine cells are activated by flagellin.
(a) (Left) Selected Calcium trace from acutely dissociated Neurod1Cre_Salsa6f colonic cells demonstrating experimental paradigm, representative of cells. Each cell was exposed to each stimulus twice, and a responder was defined as a cell that responded twice. (Right) Quantification of calcium response magnitude of flagellin responders (* by rmANOVA with post-hoc twotailed Tukey HSD). (b) Calcium traces from acutely dissociated Neurod1Cre_ Salsa6f colonic cells. of cells responded to Polyl:C ( cells, mice), of cells responded to lipopolysaccharide (LPS) ( cells, mice), and of cells responded to flagellin ( cells, mice). Gray indicates 30 s infusion. (c) (Left) Immunofluorescence image showing plated colonic crypts with individual Pyy-labeled cells (green) in PyyGFP mice. Scale bar . (Middle) Stimulation of colonic crypts with cAMP activators forskolin and IBMX, but not PolyI:C induce PYY release ( mice). (Right) Stimulation of colonic crypts with cAMP activators forskolin and MIBMX, and flagellin induce PYY release ( mice; * by one way ANOVA with post-hoc Tukey HSD). Error bars indicate S.E.M.
Extended Data Fig. 7 | Vagal neurons are contacted by Pyy-labeled cells and are activated by intracolonic stimuli. (a) List of significantly enriched gene ontology terms related to neuronal connection in Pyy-labeled cells ( mice; adjusted by topGO analysis). (b) Table of base mean, fold change, and adjusted value for pre-synaptic genes between PyyGFP cells and non-GFP cells (DESeq2 with two-tailed t-tests). (c) Quantification of contacts between Pyylabeled cells and Pgp9.5 neuronal fibers in different regions of the intestine ( mice). (d) Schematic of the vagal recording technique. The cervical vagus was recorded while the entire colon was simultaneously perfused with stimulus. (e) (Left)Schematic demonstrating 473 nm light via an intracolonic light emitting diode (LED) activating the cation channel Channelrhodopsin (ChR2) and depolarizing a Pyy-labeled cell. (Right) Representative image showing expression
g Wildtype response to intralipid
h Optogenetic inhibition
of ChR2-tdTomato (red) in a colonic Pyy-labeled cell (green). (f) Spike raster from vagal recordings in which PBS, flagellin, or intralipid was perfused into the colon, representative of mice. Gray bar represents the perfusion interval. (g) (Left) Vagal responses to intracolonic perfusion of PBS or intralipid in wild-type mice ( mice). Error bars indicate S.E.M. (Right) Quantification of peak response to intralipid ( by two-tailed paired t-test). (h) (Left) Schematic demonstrating 532 nm light activating the anion channel Halorhodopsin (Halo) and hyperpolarizing a Pyy-labeled cell. (Right) Representative image showing expression of Halorhodopsin-YFP (Green) in a colonic Pyy-labeled cell (red). Scale bars . Graphics ind,e,h adapted from ref. 3, AAAS.
Extended Data Fig. 8 | Vagal neurons neither express Tlr5 nor respond directly to flagellin. (a) Quantification of the peak vagal response to flagellin in PyyCre_Tlr5 and_Tlr5 littermate controls (PyyCre_Tlr5 mice; Tlr5 mice; by Kruskal Wallis test with non-parametric comparisons using the Wilcoxon method). (b) RNAseq of vagal nodose neurons showed no expression of Tlr5 (PyyGFP+ cells: mice,PyyGFP- cells: mice, nodose neurons: mice; DESeq2 normalization). (c) qPCR of synaptic markers and Toll-like receptors in vagal nodose neurons ( mice). (d) In situ hybridization of Nissl (green) stained neurons of the nodose ganglion showed no expression of (red), representative of mice. Scale bars . (e) Representative trace of calcium transient in acutely dissociated Neurod1Cre Salsa6f nodose neurons showed responses in 57% of neurons to capsaicin, but
not to flagellin ( neurons, mice). (f) Secondary analysis of data from Bai et al., 2018 of the colon-projecting vagal neurons showed expression of the PYY receptor cells). (g) Spatial overlay of vagal nodose neurons using tdTomato and GCaMP6s fluorescence. (h) Spatial overlay of vagal nodose neurons using compartment analysis of temporal activity by fluorescence in situ hybridization (CatFISH). (i) Representative image of CaTFISH mapping of in vivo calcium transients onto positive neurons. Scale bars . (j) Calcium traces from vagal nodose neurons responsive to either only flagellin (top), intralipid ( ) and flagellin ( ) infused separately (middle), or only intralipid (7%) (bottom), representative of neurons. Error bars and shades indicate S.E.M.f, adapted from ref. 56, Cell Press.
Extended Data Fig. 9 | Intracolonic flagellin modulates food intake. Mice were fasted overnight and received flagellin ( ) or PBS enemas prior to gaining ad libitum access to standard chow for 60 min . Flagellin reduced food intake compared to PBS in (a) PyyCre mice ( mice); (b) 5-week-old mice ( mice); and 10 -week-old mice ( mice; , enematime interaction by rmANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD). (c) (Left) Polyl:C ( ) enema was not sufficient to alter food intake compared to PBS enema ( mice; , enematime interaction by rmANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD). (Right) Effects of flagellin dissipated after 180-minutes post-enema ( mice; at 180 min by post-hoc Tukey HSD). (d) Neither vehicle enema (dimethyl sulfoxide, DMSO; mice) nor vehicle intraperitoneal injection (saline; mice) altered feeding response to flagellin enema
( by two-tailed t-test. (e) Crunch Master analysis of bites for number of bites, bite time, which is the average time of a single feeding bout, and feeding time which is the number of minutes that mice engaged in feeding, did not change during the 1-hour recording session ( mice per treatment group; by two-tailed unpaired t-test). Violin plots show median indicated by thick line and mean indicated by thin line. (f) Relative flagellin concentration was measured in stool collected from wildtype mice following an 18-hour fast ( mice), ad libitum feeding ( mice), or an 18-hour fast plus enema of PBS ( mice) or flagellin ( mice). Feeding significantly increased stool flagellin, however, flagellin enema was not sufficient to rescue flagellin levels to the fed state (* by rmANOVA with post-hoc two-tailed Tukey HSD). Error bars indicate S.E.M.
Article
a Colon cytokine expression
b Spleen cytokine expression
Extended Data Fig. 10 | Flagellin enema is not sufficient to induce an immune
response. (a) Cytokine expression in the colon1 h after enema of PBS ( mice), flagellin mice , flagellin mice , Polyl: ( mice), or intraperitoneal (i.p.) injection of PBS ( mice), flagellin mice ,Polyl:C mice , LPS ( mice) (* significance from PBS enema group by non-parametric two-tailed Wilcoxon each pair test). (b) Cytokine expression in the spleen 1 h after enema of PBS ( mice), flagellin mice , flagellin ( mice), Polyl:C ( mice), or intraperitoneal (i.p.) injection of PBS ( mice), flagellin mice , Polyl:C mice , LPS mice significance from PBS enema group by non-parametric two-tailed Wilcoxon each pair test). Error bars indicate S.E.M.
natureportfolio
Corresponding author(s):
Last updated by author(s): 05/08/2025
Reporting Summary
Nature Portfolio wishes to improve the reproducibility of the work that we publish. This form provides structure for consistency and transparency in reporting. For further information on Nature Portfolio policies, see our Editorial Policies and the Editorial Policy Checklist.
Statistics
For all statistical analyses, confirm that the following items are present in the figure legend, table legend, main text, or Methods section.
n/a
□
□ The exact sample size for each experimental group/condition, given as a discrete number and unit of measurement
□
A statement on whether measurements were taken from distinct samples or whether the same sample was measured repeatedly
□
The statistical test(s) used AND whether they are one- or two-sided
Only common tests should be described solely by name; describe more complex techniques in the Methods section.
□ A description of all covariates tested
□ X
A description of any assumptions or corrections, such as tests of normality and adjustment for multiple comparisons
□
A full description of the statistical parameters including central tendency (e.g. means) or other basic estimates (e.g. regression coefficient) AND variation (e.g. standard deviation) or associated estimates of uncertainty (e.g. confidence intervals)
□ X
For null hypothesis testing, the test statistic (e.g. F, t, r) with confidence intervals, effect sizes, degrees of freedom and value noted Give values as exact values whenever suitable.
□ For Bayesian analysis, information on the choice of priors and Markov chain Monte Carlo settings
□ For hierarchical and complex designs, identification of the appropriate level for tests and full reporting of outcomes
□ Estimates of effect sizes (e.g. Cohen’s , Pearson’s ), indicating how they were calculated
Our web collection on statistics for biologists contains articles on many of the points above.
Software and code
Policy information about availability of computer code
Data collection
Illumina NextSeq 500, StepOnePlus System (Thermo Fischer), PhenoMaster software (TSE Systems Inc.; software version 6.6.9), Tecan Infinite 200 Pro version 2.0, Zeiss ZEN Blue software version 3.5, Prairie View version 5.7.
Data analysis
RStudio (R Consortium; https://www.r-project.org, version 3.1); JMP Pro (JMP from SAS; https://www.jmp.com, version 16); Spike Tailor (Mathworks; Kaelberer et al., Science, 2018); Fiji version 2.9.0. CrunchMaster code is available at https://osf.io/7xgfd/ (see Software policy form), Excel 2024 (Microsoft).
For manuscripts utilizing custom algorithms or software that are central to the research but not yet described in published literature, software must be made available to editors and reviewers. We strongly encourage code deposition in a community repository (e.g. GitHub). See the Nature Portfolio guidelines for submitting code & software for further information.
Data
Policy information about availability of data
All manuscripts must include a data availability statement. This statement should provide the following information, where applicable:
Accession codes, unique identifiers, or web links for publicly available datasets
A description of any restrictions on data availability
For clinical datasets or third party data, please ensure that the statement adheres to our policy
All data supporting the findings of this study are available within the paper and its Supplementary Information. The mm10 mouse reference genome is available
Research involving human participants, their data, or biological material
Policy information about studies with human participants or human data. See also policy information about sex, gender (identity/presentation), and sexual orientation and race, ethnicity and racism.
Reporting on sex and gender
N/A
Reporting on race, ethnicity, or other socially relevant groupings
N/A
Population characteristics
N/A
Recruitment
N/A
Ethics oversight
N/A
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.
Field-specific reporting
Please select the one below that is the best fit for your research. If you are not sure, read the appropriate sections before making your selection.
Life sciences □ Behavioural & social sciences □ Ecological, evolutionary & environmental sciences
For a reference copy of the document with all sections, see nature.com/documents/nr-reporting-summary-flat.pdf
Life sciences study design
All studies must disclose on these points even when the disclosure is negative.
Sample size
Data exclusions
No statistical methods were used to pre-determine sample sizes but our sample sizes are similar to those reported in previous publications studying ingestive behavior in mouse models (Han et al., Cell, 2018; Tan et al., Nature, 2020; Sclafani & Ackroff, Physiol. Behav., 2017).
For vagal nerve recordings: Throughout experiments, intralipid response was used as a positive control. For all flagellin and laser stimulation conditions, data were excluded if a stable intralipid response was not seen throughout the recording session.
For calcium imaging : Each recording session concluded with 50 mM KCl as an activity control. A response to KCl was defined as a ratio increase above baseline. Cells that did not reach this KCl threshold were not included in analyses.
For enema experiments, mice that consumed less than of food following a PBS enema were excluded from the experiments due to atypical feeding behavior following an overnight fast.
-For meal pattern analysis, individual meals that exceeded a rate of . or 1 g total volume were excluded for being supraphysiological.
Replication
For quantitative microscopy experiments, each in-situ labeling technique was performed and quantified in tissue samples from at least 3 individual mice of both sexes. All replication attempts were successful.
For vagal cuff experiments, the response to positive control intralipid was tested and replicated in between treatments in at least three mice per treatment to ensure within subject reproducibility. If the response changed substantially, the inclusion criterion was not met and therefore, the experiment was terminated.
For calcium imaging, the response to stimuli within the same cell was not replicated due to limitations of cell viability with repeated applications. To ensure reproducibility, experiments were conducted across several sessions.
In enema experiments, each experimental condition was replicated in at least 5 mice. Experiments were performed on mice from different litters, ages, and sexes to ensure reproducibility.
-For meal pattern analysis, two independent experiments were run to ensure reproducibility.
Randomization
In all experiments, animal allocation to experimental group was randomized.
All behavioral studies were counterbalanced across age and sex to control for variables including position in cage, order effect, and handedness.
In enema experiments, all included mice received a PBS stimulus, a flagellin stimulus, and in pharmacology experiments, mice received both PBS and flagellin stimuli in combination with pharmacological treatment. The order of stimulus delivery was randomized among different mice. This excludes germ-free mice, in which PBS was delivered first for minimizing bacterial colonization. Each stimulus delivery was separated by at least 48 hours from previous stimulus delivery.
Blinding
nature portfolio | reporting summary
April 2023
Reporting for specific materials, systems and methods
We require information from authors about some types of materials, experimental systems and methods used in many studies. Here, indicate whether each material, system or method listed is relevant to your study. If you are not sure if a list item applies to your research, read the appropriate section before selecting a response.
Materials & experimental systems
n/a
Involved in the study
□
X Antibodies
□
– Eukaryotic cell lines
□ Palaeontology and archaeology
□
X Animals and other organisms
□ Clinical data
X
□
X
□
Antibodies
Methods
Involved in the study
ChIP-seq
Flow cytometry
MRI-based neuroimaging
Validation
Immunohistochemistry: Rb-Anti-PYY (1:250; Generated in the laboratory of Rodger Liddle – The PYY antibody was raised in rabbits using a synthetic peptide, KPEAPGEDASPEELSRYC, corresponding to amino acids of mouse PYY, affinity-purified), Anti-GFP antibody (host = chicken) (1:500, Abcam; Cat#ab13970); Anti-Pgp9.5 (host = rabbit) (1:500; Abcam; CAT#ab27053), Anti-serotonin (host = goat) (1:500; Abcam; CAT#ab66047); Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab́) Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (1:250, Jackson ImmunoResearch; Cat#711-546-152; RRID#AB_2340619); Cy3 AffiniPure F(ab́) Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (1:250, Jackson ImmunoResearch;Cat#711-166-152; RRID#AB_2313568); Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab’) Fragment Donkey Anti-Chicken IgG (H+L) (1:250, Jackson ImmunoResearch; Cat#703-546-155; RRID#AB_2340376); Dk-Anti-Gt-647 (1:500, Jackson Immunoresearch 705-606-147)
In-situ hybridization: Mm-Tlr5 (cat#759 468888), Mm-Pyy-C3 (420681-C3), and Mm-Npy2r (cat# 515431) probes were purchased from .
Rb-Anti-PYY antibody was extensively validated in colonic epithelial cells by Bohórquez et al., J Mol Hist, 2011; Ck-Anti-GFP was commercially validated for immunocytochemistry by the manufacturer (Abcam) and further validated for immunohistochemistry by PMID:29895301, Rb-Anti-Pgp9.5 was commercially KO validated and validated for immunohistochemistry by the manufacturer (Abcam), Gt-Anti-serotonin was commercially validated for immunocytochemistry by the manufacturer (Abcam) and further validated for immunohistochemistry by PMID: 25420775).
Eukaryotic cell lines
Policy information about cell lines and Sex and Gender in Research
Cell line source(s)
Authentication
Mycoplasma contamination
Commonly misidentified lines
(See ICLAC register)
HEK-Blue™-mTLR5 cells were purchased from a commercial supplier (Invivogen). These cells were obtained by cotransfection of the murine TLR5 gene and an inducible SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) reporter gene into HEK293 cells.
HEK-Blue™-mTLR5 cells were authenticated by the manufacturer, including validation for mTLR5 expression by RT-PCR and guaranteed stability for the up to 20 passages (cells were passaged in our lab up to 10 times per experiment).
HEK-Blue™-mTLR5 cells were guaranteed mycoplasma-free by the supplier (Invivogen).
HEK-293 cells are a commonly misidentified cell line. These cells were used as a reported cell line following their transfection with the murine TLR5 gene and an inducible SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) reporter gene for quantifying the levels of flagellin in mouse stool samples. Authentication of cells was performed by the supplier (Invivogen).
Animals and other research organisms
Policy information about studies involving animals; ARRIVE guidelines recommended for reporting animal research, and Sex and Gender in Research
Laboratory animals
Male and female adult mice aged 6-20 weeks were used in all experiments. Mice were group housed in Duke University’s Division of Laboratory Animal Resources, where they were kept on a 12 -hour light-dark cycle (0700-1900) at with access to water and standard mouse chow (Purina 5001) ad-libitum, unless otherwise indicated in the manuscript Methods. The facility maintained an ambient temperature of and humidity of 40-60%. Mice used were: C57BL/6J (wild-type) (Jackson Lab; Stock #000664); PyyGFP (background = Swiss Webster) (Rodger Liddle, M.D.; Bohórquez et al., 2011); PyyCre ((background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #012706); CckGFP (background = Swiss Webster) (Rodger Liddle, M.D.; Wang et al., 2010); Neurod1Cre (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #028364); LSL_tdTomato (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #007914); LSL_Halo-YFP (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #014539); LSL_ChR2-tdTomato (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #012567); LSL_Salsa6f
(background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #031968); Tlr5-KO (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #028599); Myd88-KO (background = C57BL/6J) (Jackson Lab; Stock #00888); B6.Cg-Snap25tm3.1Hze/J (Jackson Lab; Stock #025111; B6.129(Cg)Fostm2.1(cre/ERT2)Luo/J (Jackson Lab; Stock #030323).
Wild animals
No wild animals were used in this study.
Reporting on sex
Sex-related findings and differences are detailed in the manuscript with sample sizes indicated.
Field-collected samples
No field-collected samples were used in this study.
Ethics oversight
All experiments on mice were performed following approval by the Institutional Animal Care and Use Committee at Duke University Medical Center under the protocol A212-21-10. All collaborating laboratories followed the guidelines of this animal protocol.
Note that full information on the approval of the study protocol must also be provided in the manuscript.
Plants
Seed stocks
N/A
Novel plant genotypes
N/A
Authentication
N/A
Laboratory of Gut Brain Neurobiology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Neurobiology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Medicine, Duke University, Durham, NC, USA. Trinity College of Arts & Sciences, Duke University, Durham, NC, USA. Laboratory of Immunometabolism, Research Division, General Hospital of Mexico Dr. Eduardo Liceaga, Mexico City, Mexico. Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. McGovern Institute for Brain Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Monell Chemical Senses Center, Philadelphia, PA, USA. Department of Neuroscience, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. Laboratory Neurobiology of Appetite, Department of Pharmacology, CINVESTAV, Mexico City, Mexico. Center for Research on Aging (CIE), CINVESTAV Sede Sur, Mexico City, Mexico. Department of Integrative Immunobiology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Pathology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Cell Biology, Duke University, Durham, NC, USA. Department of Physiology, University of Arizona, Tucson, AZ, USA. Duke Institute for Brain Sciences, Duke University, Durham, NC, USA. Present address: Department of Dermatology, Stanford University School of Medicine, Redwood City, CA, USA. These authors contributed equally: Winston W. Liu, Naama Reicher, Emily Alway. These authors jointly supervised this work: M. Maya Kaelberer, Diego V. Bohórquez. e-mail: mkaelberer@arizona.edu; diego.bohorquez@duke.edu
Wang, Y. et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the -sensing receptor. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011). 62. Schonhoff, S. et al. Energy homeostasis and gastrointestinal endocrine differentiation do not require the anorectic hormone peptide YY. Mol. Cell. Biol. 25, 4189-4199 (2005).
Acknowledgements We thank J. Kotula and M. Toh for assistance with sequencing; R.A. Liddle, S. G.Lisberger, M.D. Gunn, J.A.Alspaugh, N.K. Surana, G. J. Schwartz, Z. Lorsch, M. Toc Sagra and E.B.Bohórquez for editorial input. We acknowledge the following funding sources: National Institutes of Health (NIH) F3O DK122712 (W.W.L.); NIH F32 DK139628 (N.R.); NIH F3O DK136229 (E.A.); NIH F32 DK127757 and NIH KO1 DK138286 (L.E.R.); NIH F3ODK12765O (P.W.); J.A.A.G. is a doctoral student from the Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas of the Universidad Nacional Autónoma de México and has received CONAHCyT fellowship no. CVU959984; CONAHCyT CF-2023-G-518 (R.G.); NIH KO1 DK1314O3 (M.M.K.); and NIH DP2 MH1224O2, NIH R21 AT010818, NIH RO3 DK114500, NIH RO1 DK131112 and NIH RO1 DK132O70 (D.V.B.).
Author contributions W.W.L., N.R., E.A., L.E.R., P.W., C.S., M.E.K., J.A.V., C.P.-H., Y.G.K.A., A.Carbajal, J.A.A.G. and A. Coss conducted experiments and acquired data; A.S. and P.A. generated luminal optogenetic resources and optoelectronic microLED; E.G.-L. and R.G. developed the Crunch Master assay, conducted experiments, and acquired and analysed data; A.d.A, A.B. and G.d.L. conducted in vivo calcium imaging and catFISH, acquired and analysed data; W.W.L., N.R., E.A., L.E.R., P.W., J.F.R., E.A.M., M.M.K. and D.V.B. analysed and interpreted data. W.W.L., N.R., E.A., M.M.K. and D.V.B. conceptualized and wrote the manuscript with input from all authors. M.M.K. and D.V.B. developed the idea and supervised the project. D.V.B. acquired funding for the project.
Competing interests D.V.B. and M.M.K. are founders and board directors of the Gastronauts Foundation, Inc, a 501(c)3 non-profit company. Some of the findings have been filed by D.V.B. as a provisional patent application. All other authors declare no competing interests.
Acknowledgements We thank J. Kotula and M. Toh for assistance with sequencing; R.A. Liddle, S. G.Lisberger, M.D. Gunn, J.A.Alspaugh, N.K. Surana, G. J. Schwartz, Z. Lorsch, M. Toc Sagra程的 DK136229 (E.A.); NIH F32 DK127757 and NIH KO1 DK138286 (L.E.R.); NIH F3ODK127650 (P.W.);
J.A.A.G. is a doctoral student from the Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas of the Universidad Nacional Autónoma de México and has received CONAHCyT fellowship no.
CVU959984; CONAHCyT CF-2023-G-518 (R.G.); NIH KO1 DK1314O3 (M.M.K.); and NIH DP2 CVU9592402, NIH R21 AT010818, NIH RO3 DK114500, NIH RO1 DK131112 and NIH RO1 DK132O70 (D.V.B.).
section*{Additional information}
Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41586-025-09301-7.
Correspondence and requests for materials should be addressed to M. Maya Kaelberer or Diego V. Bohórquez.
Peer review information Nature thanks John Lukens and the other, anonymous, reviewer(s) for their contribution to the peer review of this work.
Reprints and permissions information is available at http://www.nature.com/reprints.
Experimenters were not blinded to treatment condition or genotype for ensuring the conduction of proper procedures. Each genotype received identical treatment regimes.
