DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-024-06663-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38637497
تاريخ النشر: 2024-04-18
المؤلف: Gideon Ong وآخرون
الموضوع الرئيسي: إجهاد الشبكة الإندوبلازمية والمرض
نظرة عامة
استجابة البروتين غير المطوي (UPR) هي آلية خلوية حيوية يتم تنشيطها استجابةً لتراكم البروتينات غير المطوية في الشبكة الإندوبلازمية (ER)، وهي حالة تعرف باسم إجهاد الشبكة الإندوبلازمية. يتم توجيه هذه الاستجابة بواسطة ثلاثة مستقبلات مثبتة في الشبكة الإندوبلازمية: IRE1 وPERK وATF6، التي تعمل كأجهزة استشعار لصحة الشبكة الإندوبلازمية. عند اكتشاف إجهاد الشبكة الإندوبلازمية، تبدأ هذه المستقبلات مسارات الإشارة السفلية التي تهدف إلى استعادة توازن الشبكة الإندوبلازمية. ومع ذلك، إذا لم يمكن تحقيق التوازن، قد تتحول UPR من استجابة وقائية إلى استجابة ضارة.
تسلط هذه الدراسة الضوء على التفاعل بين فرعي IRE1 وPERK من UPR، كاشفةً أن IRE1، من خلال إشارات XBP1s، يلعب دورًا في الحفاظ على تعبير PERK خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المطول. تشير هذه النتائج إلى أن التواصل بين فروع مختلفة من UPR يعزز قابلية تكيف النظام، مما يساهم في مرونة استجابات إشارات UPR تحت ظروف مختلفة من إجهاد الشبكة الإندوبلازمية.
مقدمة
تستعرض المقدمة الدور الحيوي للشبكة الإندوبلازمية (ER) في طي البروتينات وتعديلها، مشيرةً إلى أن أكثر من 30% من البروتينات الخلوية تمر عبر هذه العضية. تصف كيف أن إجهاد الشبكة الإندوبلازمية، الناجم عن عوامل مثل نقص المصل أو العدوى الفيروسية، يؤدي إلى تراكم البروتينات غير المطوية أو المشوهة، مما يحفز استجابة البروتين غير المطوي (UPR). يتم توجيه UPR بواسطة ثلاثة مستقبلات رئيسية عبر الغشاء: إنزيم 1 ألفا المطلوب للإنوزيتول (IRE1) وكيناز البروتين R (PKR)-مثل كيناز الشبكة الإندوبلازمية (PERK) وعامل النسخ 6 (ATF6)، التي تبقى غير نشطة بواسطة الشابيرون Grp78 في الظروف العادية. عند حدوث إجهاد الشبكة الإندوبلازمية، يتم تنشيط هذه المستقبلات، مما يبدأ مسارات الإشارة التي تهدف إلى استعادة توازن الشبكة الإندوبلازمية.
تتفصل هذه القسم أكثر في آليات تنشيط IRE1 وPERK وATF6، بما في ذلك دور IRE1 في تقطيع mRNA XBP1 لإنتاج عامل النسخ XBP1s، الذي يعزز تعبير الشابيرونات الشبكية الإندوبلازمية وآلات التحلل. يؤدي تنشيط PERK إلى فسفرة eIF2α، مما يقلل من الترجمة العالمية، بينما يتم معالجة ATF6 في جهاز جولجي لتعزيز تعبير جينات XBP1 والشابيرونات. تختتم المقدمة بالإشارة إلى أنه على الرغم من التقدم الكبير الذي تم إحرازه في فهم هذه المسارات، إلا أن تنظيم تعبير IRE1 وPERK وATF6 خلال ظروف إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المختلفة لا يزال أقل فهمًا. تهدف الدراسة إلى توضيح التفاعلات بين هذه المستشعرات، كاشفةً أن IRE1 يدعم تعبير PERK خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المزمن من خلال إشارات IRE1-XBP1s، مما يعزز فهمنا لتنظيم UPR.
طرق
في قسم “المواد والطرق”، تفصل الدراسة الأجسام المضادة والمواد الكيميائية المحددة المستخدمة في التجارب. تم الحصول على مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة من Cell Signaling Technology وAbcam، بما في ذلك IRE1 وPERK وATF6 وATF4 وphospho-eIF2α وeIF2α وCaspase 3 وأشكال مختلفة من β-Actin، مع تخفيفات محددة لكل منها. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على أجسام مضادة XBP1s من BioLegend.
كما يسرد القسم عدة مثبطات كيميائية ومواد كيميائية، بما في ذلك Tunicamycin وThapsigargin وBrefeldin A وMKC8866 وKIRA6 و4µ8C وAMGEN 44، التي تم الحصول عليها من موردين مختلفين مثل Cayman Chemicals وCSNPharm وTocris Bioscience. تم إعداد جميع المواد الكيميائية والمثبطات وفقًا لإرشادات الشركات المصنعة، مما يضمن التناسق والموثوقية في الإجراءات التجريبية.
نتائج
تشير نتائج الدراسة إلى أن إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER)، الناجم عن thapsigargin (Tg)، يؤدي إلى تغييرات كبيرة في تعبير البروتينات الرئيسية المشاركة في استجابة البروتين غير المطوي (UPR) في خلايا MDA-MB-231. أظهر تحليل PCR الكمي (qPCR) زيادة سريعة بمقدار أربعة أضعاف في مستويات نسخ PERK بعد 6 ساعات من العلاج، والتي ظلت مرتفعة طوال فترة المراقبة التي استمرت 36 ساعة. بالمقابل، أظهرت مستويات نسخ IRE1 زيادة أكثر تدريجية، بدءًا من زيادة بمقدار الضعف بعد 6 ساعات ووصولًا إلى زيادة بمقدار ستة أضعاف بعد 36 ساعة. ظلت مستويات نسخ ATF6 مستقرة نسبيًا، حيث أظهرت زيادة متواضعة بمقدار الضعف بعد 18 ساعة.
أكدت نتائج التحليل المناعي (Immunoblotting) النتائج التي تم الحصول عليها من qPCR، حيث أظهرت زيادة متسقة في مستويات بروتينات PERK وIRE1 على مدار فترة الـ 36 ساعة. ومن الملاحظ أن معالجة ATF6 لوحظت مبكرًا في الاستجابة، مما يدل على فقدان ATF6 الكامل، على الرغم من أن هذه المعالجة تضاءلت مع تمدد مدة إجهاد الشبكة الإندوبلازمية من الحاد إلى المزمن. بشكل عام، تسلط هذه النتائج الضوء على الآليات التنظيمية الديناميكية لـ IRE1 وPERK استجابةً لإجهاد الشبكة الإندوبلازمية، بينما يظهر ATF6 نمط تعبير أكثر استقرارًا تحت ظروف مماثلة.
مناقشة
في هذه الدراسة، استكشف المؤلفون التفاعل بين مسارات إشارات استجابة البروتين غير المطوي (UPR) التي يتم توجيهها بواسطة IRE1 وPERK خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المزمن. أظهروا أن تثبيط إشارات PERK باستخدام المثبط Amgen 44 أدى إلى انخفاض تعبير IRE1 في خلايا MDA-MB-231 المعرضة لإجهاد الشبكة الإندوبلازمية الناجم عن tunicamycin (Tg)، مما يؤكد العلاقة التي تم الإبلاغ عنها سابقًا بين هذين المسارين. علاوة على ذلك، أسس المؤلفون أن إشارات IRE1 تلعب دورًا حاسمًا في الحفاظ على تعبير PERK، خاصة خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المطول، من خلال آلية نسخ تتضمن XBP1s. لم تؤدي استخدام مثبطات IRE1، مثل MKC8866، إلى حجب نشاط IRE1 فحسب، بل أدت أيضًا إلى انخفاض كبير في مستويات بروتين PERK، مما يشير إلى حلقة تنظيمية متبادلة بين IRE1 وPERK.
بالإضافة إلى ذلك، وجدت الدراسة أن تثبيط إشارات IRE1-XBP1s قلل من إشارات PERK السفلية وأدى إلى تقليل موت الخلايا استجابةً لإجهاد الشبكة الإندوبلازمية. وقد تم إثبات ذلك من خلال انخفاض تنشيط caspase-3 وتقليل حركية موت الخلايا عندما تم معالجة خلايا MDA-MB-231 بكل من Tg وMKC8866. تشير النتائج إلى أن إشارات IRE1-XBP1s لا تدعم فقط تعبير PERK، ولكن قد تؤثر أيضًا على الانتقال من إشارات البقاء إلى إشارات الموت خلال إجهاد الشبكة الإندوبلازمية المزمن. قد تكون هذه الرؤى حول التواصل بين IRE1 وPERK لها آثار كبيرة على استراتيجيات العلاج المستهدفة لمسارات UPR في علاج السرطان، خاصة في سياق سرطان الثدي الثلاثي السلبي.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-024-06663-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38637497
Publication Date: 2024-04-18
Author(s): Gideon Ong et al.
Primary Topic: Endoplasmic Reticulum Stress and Disease
Overview
The Unfolded Protein Response (UPR) is a critical cellular mechanism activated in response to the accumulation of unfolded proteins in the Endoplasmic Reticulum (ER), a condition known as ER stress. This response is mediated by three ER-anchored receptors: IRE1, PERK, and ATF6, which function as sensors of ER health. Upon detecting ER stress, these receptors initiate downstream signaling pathways aimed at restoring ER homeostasis. However, if homeostasis cannot be achieved, the UPR may shift from a protective to a detrimental response.
This study highlights the interplay between the IRE1 and PERK branches of the UPR, revealing that IRE1, through XBP1s signaling, plays a role in sustaining PERK expression during prolonged ER stress. These findings indicate that the cross talk between different branches of the UPR enhances the system’s adaptability, thereby contributing to the plasticity of UPR signaling responses under varying conditions of ER stress.
Introduction
The introduction outlines the critical role of the Endoplasmic Reticulum (ER) in protein folding and modification, highlighting that over 30% of cellular proteins traverse this organelle. It describes how ER stress, caused by factors such as serum deprivation or viral infections, leads to the accumulation of unfolded or misfolded proteins, triggering the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR is mediated by three key transmembrane receptors: Inositol-Requiring Enzyme 1 Alpha (IRE1), Protein Kinase R (PKR)-like ER Kinase (PERK), and Activating Transcription Factor 6 (ATF6), which are kept inactive by the chaperone Grp78 under normal conditions. Upon ER stress, these receptors become activated, initiating signaling pathways aimed at restoring ER homeostasis.
The section further details the mechanisms of IRE1, PERK, and ATF6 activation, including IRE1’s role in splicing XBP1 mRNA to produce the transcription factor XBP1s, which enhances the expression of ER chaperones and degradation machinery. PERK’s activation leads to the phosphorylation of eIF2α, reducing global translation, while ATF6 is processed in the Golgi to promote XBP1 and chaperone gene expression. The introduction concludes by noting that while significant progress has been made in understanding these pathways, the regulation of IRE1, PERK, and ATF6 expression during varying ER stress conditions remains less understood. The study aims to elucidate the interactions between these sensors, revealing that IRE1 supports PERK expression during chronic ER stress through IRE1-XBP1s signaling, thereby enhancing our understanding of UPR regulation.
Methods
In the “Materials and Methods” section, the study details the specific antibodies and reagents utilized for the experiments. A variety of antibodies were sourced from Cell Signaling Technology and Abcam, including IRE1, PERK, ATF6, ATF4, phospho-eIF2α, eIF2α, Caspase 3, and different forms of β-Actin, with specified dilutions for each. Additionally, XBP1s antibodies were obtained from BioLegend.
The section also lists several chemical inhibitors and reagents, including Tunicamycin, Thapsigargin, Brefeldin A, MKC8866, KIRA6, 4µ8C, and AMGEN 44, which were acquired from various suppliers such as Cayman Chemicals, CSNPharm, and Tocris Bioscience. All chemicals and inhibitors were prepared following the manufacturers’ guidelines, ensuring consistency and reliability in the experimental procedures.
Results
The results of the study indicate that endoplasmic reticulum (ER) stress, induced by thapsigargin (Tg), leads to significant changes in the expression of key proteins involved in the unfolded protein response (UPR) in MDA-MB-231 cells. Quantitative PCR (qPCR) analysis revealed a rapid fourfold increase in PERK transcript levels at 6 hours post-treatment, which remained elevated throughout the 36-hour observation period. In contrast, IRE1 transcript levels exhibited a more gradual increase, starting with a twofold rise at 6 hours and reaching a sixfold increase by 36 hours. ATF6 transcript levels remained relatively stable, showing only a modest twofold increase by 18 hours.
Immunoblotting results corroborated the qPCR findings, demonstrating a consistent increase in the protein levels of PERK and IRE1 over the 36-hour time course. Notably, ATF6 processing was observed early in the response, indicated by the loss of full-length ATF6, although this processing diminished as the duration of ER stress extended from acute to chronic. Overall, these findings highlight the dynamic regulatory mechanisms of IRE1 and PERK in response to ER stress, while ATF6 shows a more stable expression pattern under similar conditions.
Discussion
In this study, the authors explored the interplay between the unfolded protein response (UPR) signaling pathways mediated by IRE1 and PERK during chronic endoplasmic reticulum (ER) stress. They demonstrated that inhibition of PERK signaling using the inhibitor Amgen 44 resulted in decreased IRE1 expression in MDA-MB-231 cells subjected to tunicamycin (Tg)-induced ER stress, confirming a previously reported relationship between these two pathways. Furthermore, the authors established that IRE1 signaling plays a crucial role in sustaining PERK expression, particularly during prolonged ER stress, through a transcriptional mechanism involving XBP1s. The use of IRE1 inhibitors, such as MKC8866, not only blocked IRE1 activity but also led to a significant reduction in PERK protein levels, indicating a reciprocal regulatory loop between IRE1 and PERK.
Additionally, the study found that the inhibition of IRE1-XBP1s signaling diminished PERK-mediated downstream signaling and reduced cell death in response to ER stress. This was evidenced by decreased activation of caspase-3 and reduced cell death kinetics when MDA-MB-231 cells were treated with both Tg and MKC8866. The findings suggest that IRE1-XBP1s signaling not only supports PERK expression but may also influence the transition from pro-survival to pro-death signaling during chronic ER stress. These insights into the cross talk between IRE1 and PERK could have significant implications for therapeutic strategies targeting UPR pathways in cancer treatment, particularly in the context of triple-negative breast cancer.