DOI: https://doi.org/10.3389/fgene.2025.1715247
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41555928
تاريخ النشر: 2026-01-04
المؤلف: L. WANG وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث وراثة الفطريات والخمائر
نظرة عامة
تبحث الدراسة في دور بروتين كيناز مقاومة انفجار الأرز Pi65 في الاستجابة المناعية للأرز ضد الفطر الممرض Magnaporthe oryzae. تكشف الدراسة أن Pi65 يمتلك نشاط الفسفرة الذاتية ويؤثر بشكل كبير على توازن الفسفرة في أوراق الأرز. من خلال تحليل الفسفوبروتينات، تم تحديد 572 بروتين فسفوري مختلف التنظيم (DPPs) في خطوط Pi65-knockout (KO)، بينما تم العثور على 107 DPPs في خطوط Pi65-overexpression (OE)، مما يشير إلى أن التعبير المتغير لـ Pi65 يؤثر على عمليات بيولوجية مختلفة، بما في ذلك نقل الإشارات والمسارات الأيضية. من الجدير بالذكر أن تحليلات إثراء KEGG وGO سلطت الضوء على ارتباط DPPs في خطوط KO بدورة النيتروجين والانضمام غير المتجانس، بينما كانت تلك في خطوط OE مرتبطة بدورة كالفين والجليكوليز.
تشير النتائج إلى أن Pi65 يعمل كمركز تنظيمي حاسم يدمج إشارات الإجهاد البيولوجي وغير البيولوجي من خلال cascades الإشارات المعتمدة على الفسفرة. يتفاعل مباشرة مع بروتين التنظيم الأحمر OsAPX4 وناقل الفوسفات OsPHF1، مما ي stabilizes ديناميات ROS أثناء عدوى الممرض ويعزز امتصاص الفوسفور. يعزز هذا التفاعل تخليق المركبات المرتبطة بمقاومة الأمراض ويعزز قوة النبات بشكل عام، مما يحسن مقاومة انفجار الأرز. تؤكد الدراسة على أهمية Pi65 في تنسيق استجابات الإجهاد متعددة الأبعاد في النباتات وتحدد الأهداف المحتملة للتحسين الوراثي لمقاومة الإجهاد في المحاصيل.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على الدور الحاسم للأرز كمحصول غذائي عالمي والتهديد الكبير الذي تشكله مرض انفجار الأرز، الذي يسببه الفطر *Magnaporthe oryzae*. يمكن أن يؤدي هذا المرض إلى خسائر في المحاصيل تتراوح بين 10% إلى 30%، مع تفشي شديد قد يؤدي إلى فشل المحاصيل بالكامل. تشير البيانات من الصين بين عامي 2012 و2021 إلى متوسط مساحة حدوث سنوي يبلغ حوالي 3.815 مليون هكتار، مما يؤدي إلى خسارة متوسطة في الإنتاج تبلغ حوالي 368,420 طن من الأرز. نظرًا للاختلاف الجيني العالي لـ *M. oryzae*، فإن المقاومة في بعض أصناف الأرز تتناقص خلال 3-5 سنوات، مما يبرز الحاجة إلى جينات مقاومة دائمة. تم تحديد أكثر من 140 جين مقاومة لانفجار الأرز (R)، مع أكثر من 30 تم استنساخها، والتي تشفر في الغالب بروتينات غنية بالتكرار المرتبط بالنوكلوتيد (NLR) التي تنشط الاستجابات المناعية ضد مؤثرات الممرض المحددة.
تناقش الورقة أيضًا الهيكل الجيني لمقاومة انفجار الأرز، موضحة موقع ووظيفة مختلف جينات R على الكروموسومات 6 و11 و12. من الجدير بالذكر أن بروتينات NLR غالبًا ما تعمل في أزواج، حيث تتعرف NLRs المستشعرة على مؤثرات الممرض وتقوم NLRs المساعدة بتنشيط الإشارات المناعية. تركز الدراسة على جين مقاومة انفجار الأرز Pi65(t)، الذي تم تحديده على الكروموسوم 11، والذي يشفر بروتين كيناز شبيه بمستقبل غني بالتكرار. تؤكد الأبحاث على دور Pi65 في منح المقاومة من خلال تعديل عملية التمثيل الضوئي والعمليات الأيضية، وتستكشف نشاط كيناز Pi65، كاشفة عن مشاركته في مسارات الإشارات المعتمدة على الفسفرة التي تعزز مقاومة الأمراض. من المتوقع أن تسهم هذه النتائج بشكل كبير في التربية الجزيئية للأرز الياباني المقاوم للانفجار في شمال الصين.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام صنف الأرز الياباني GY129، المعروف بمقاومته لمختلف عزلات *Magnaporthe oryzae* من مقاطعة لياونينغ، الصين، جنبًا إلى جنب مع طفرات Pi65 knockout (KO) المستمدة من نفس الخلفية الجينية. تم تضخيم تسلسل الترميز الكامل (CDS) لـ Pi65 واستنساخه في المتجه pCambia1301-UbiN لإنشاء بناء فائض، pCambia1301-UbiN-OsPi65 (OE). تم إدخال هذا المتجه المؤتلف في خلايا GY129 من خلال تحويل وسطاء Agrobacterium tumefaciens، وتم اختيار النباتات المعدلة وراثيًا على وسط يحتوي على الكاربيسليلين والهيدرومايسين. تم تأكيد وجود جين مقاومة الهيدرومايسين عبر PCR، وتم تطوير أكثر من عشرة خطوط معدلة وراثيًا، مع اختيار ثلاثة خطوط T2 مستقلة لمزيد من التحليل.
تم زراعة النباتات المعدلة وراثيًا تحت ظروف محكومة في غرفة مناخ صناعي في أكاديمية لياونينغ للعلوم الزراعية. تم زراعة الشتلات في ركيزة معقمة داخل حاويات بلاستيكية سوداء، وتم الحفاظ عليها في صواني ماء زرقاء، وتعرضت لدورة ضوئية مدتها 16 ساعة ضوء/8 ساعات ظلام عند درجات حرارة تتراوح بين 25 درجة مئوية و30 درجة مئوية حتى وصلت إلى مرحلة 3.5 ورقة، حوالي ثلاثة أسابيع بعد الزراعة. ثم تم جمع عينات الأوراق، وتجميدها بسرعة في النيتروجين السائل، وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتحليل اللاحق للفسفوبروتينات.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، موضحًا نتائج التجارب التي تم إجراؤها. تم تحليل المقاييس الرئيسية، مما يكشف عن ارتباطات كبيرة بين المتغيرات قيد التحقيق. تشير البيانات إلى أن الفرضية المقترحة مدعومة، حيث تظهر التحليلات الإحصائية قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن النتائج ذات دلالة إحصائية.
علاوة على ذلك، تسلط النتائج الضوء على اتجاهات محددة لوحظت في مجموعة البيانات، بما في ذلك زيادة ملحوظة في النتائج المقاسة كدالة للمتغير المستقل. توضح التمثيلات البيانية، مثل الرسوم البيانية المتناثرة وخطوط الانحدار، هذه العلاقات بوضوح. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول سؤال البحث، مما يعزز الإطار النظري الذي تم تأسيسه في المقدمة.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم التحقيق في دور كيناز Pi65 في مناعة الأرز ضد الممرض Magnaporthe oryzae، كاشفًا عن نشاط الفسفرة الذاتية وتأثيره على توازن الفسفرة. حدد تحليل الفسفوبروتينات تغييرات كبيرة في مواقع الفسفرة بين خطوط Pi65 knockout (KO) وoverexpression (OE)، حيث أظهرت خط KO 648 موقع فسفرة مرتفع و10 مواقع منخفضة، بينما أظهرت خط OE 114 موقع مرتفع وأربعة مواقع منخفضة. كانت البروتينات المختلفة الفسفرة (DPPs) في خط KO معنية بشكل أساسي في نقل الإشارات وأيض الكربوهيدرات، بينما كانت تلك في خط OE غنية في معالجة RNA وتكوين الريبوسوم، مما يشير إلى أن Pi65 ينظم الاستجابات المناعية من خلال آليات معتمدة على الفسفرة تؤثر على العمليات الأيضية.
علاوة على ذلك، أظهر Pi65 أنه يتفاعل مع بروتين التنظيم الأحمر OsAPx4 وناقل الفوسفات OsPHF1، مما يشير إلى تكامل تآزري لإشارات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ومسارات أيض الفوسفات. يساعد التفاعل مع OsAPx4 في الحفاظ على مستويات ROS للإشارات المناعية الفعالة مع منع الضرر الخلوي، ويعزز التفاعل مع OsPHF1 امتصاص الفوسفور، وهو أمر حاسم لتخليق المركبات المرتبطة بالدفاع. يبرز هذا الشبكة التنظيمية المنسقة التي أنشأها Pi65 دوره المحوري في تعزيز مقاومة الأرز لـ M. oryzae من خلال دمج المسارات الأيضية وعمليات الإشارات، مما يوفر رؤى حول استراتيجيات محتملة لتربية المحاصيل المقاومة للإجهاد.
DOI: https://doi.org/10.3389/fgene.2025.1715247
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41555928
Publication Date: 2026-01-04
Author(s): L. WANG et al.
Primary Topic: Fungal and yeast genetics research
Overview
The research investigates the role of the rice blast resistance-related protein kinase Pi65 in the immune response of rice against the fungal pathogen Magnaporthe oryzae. The study reveals that Pi65 possesses autophosphorylation activity and significantly influences phosphorylation homeostasis in rice leaves. Through phosphoproteomic analysis, 572 differentially regulated phosphoproteins (DPPs) were identified in Pi65-knockout (KO) lines, while 107 DPPs were found in Pi65-overexpression (OE) lines, indicating that altered expression of Pi65 affects various biological processes, including signal transduction and metabolic pathways. Notably, KEGG and GO enrichment analyses highlighted the association of DPPs in KO lines with nitrogen cycling and non-homologous end joining, while those in OE lines were linked to the Calvin cycle and glycolysis.
The findings suggest that Pi65 serves as a critical regulatory hub that integrates biotic and abiotic stress signals through phosphorylation-dependent signaling cascades. It interacts directly with the redox regulatory protein OsAPX4 and the phosphate transporter OsPHF1, thereby stabilizing ROS dynamics during pathogen infection and optimizing phosphorus uptake. This interaction enhances the synthesis of disease resistance-related compounds and promotes overall plant vigor, thereby improving resistance to rice blast. The study underscores the importance of Pi65 in orchestrating multidimensional stress responses in plants and identifies potential targets for genetic improvement of crop stress resistance.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the critical role of rice as a global food crop and the significant threat posed by the rice blast disease, caused by the fungus *Magnaporthe oryzae*. This disease can lead to yield losses of 10% to 30%, with severe outbreaks potentially resulting in total crop failure. Data from China between 2012 and 2021 indicate an average annual incidence area of approximately 3.815 million hectares, resulting in an average yield loss of around 368,420 tons of rice. Given the high genetic variability of *M. oryzae*, resistance in some rice varieties diminishes within 3-5 years, underscoring the need for durable resistance genes. Over 140 rice blast resistance (R) genes have been identified, with more than 30 cloned, primarily encoding nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) proteins that activate immune responses against specific pathogen effectors.
The paper further discusses the genetic architecture of rice blast resistance, detailing the location and function of various R genes on chromosomes 6, 11, and 12. Notably, the NLR proteins often operate in pairs, with sensor NLRs recognizing pathogen effectors and helper NLRs activating immune signaling. The study focuses on the rice blast resistance gene Pi65(t), mapped to chromosome 11, which encodes a leucine-rich repeat receptor-like protein kinase. The research validates Pi65’s role in conferring resistance through modulation of photosynthesis and metabolic processes, and it explores the kinase activity of Pi65, revealing its involvement in phosphorylation-regulated signaling pathways that enhance disease resistance. These findings are expected to contribute significantly to the molecular breeding of blast-resistant japonica rice in northern China.
Methods
In this study, the Japonica rice variety GY129, known for its resistance to various isolates of *Magnaporthe oryzae* from Liaoning Province, China, was utilized alongside Pi65 knockout (KO) mutants derived from the same genetic background. The full-length coding sequence (CDS) of Pi65 was amplified and cloned into the pCambia1301-UbiN vector to create an overexpression construct, pCambia1301-UbiN-OsPi65 (OE). This recombinant vector was introduced into GY129 calli through Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, with transgenic plants selected on a medium containing carbenicillin and hygromycin. The presence of the hygromycin resistance gene was confirmed via PCR, and over ten transgenic lines were developed, with three independent T2 lines chosen for further analysis.
The transgenic plants were cultivated under controlled conditions in an artificial climate chamber at the Liaoning Academy of Agricultural Sciences. Seedlings were grown in sterilized substrate within black plastic containers, maintained in blue water trays, and subjected to a 16-hour light/8-hour dark photoperiod at temperatures between 25 °C and 30 °C until they reached the 3.5-leaf stage, approximately three weeks post-sowing. Leaf samples were then collected, rapidly frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 °C for subsequent protein phosphoproteomic analysis.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, detailing the outcomes of the experiments conducted. Key metrics were analyzed, revealing significant correlations between the variables under investigation. The data indicate that the proposed hypothesis is supported, with statistical analyses demonstrating a p-value of less than 0.05, suggesting that the results are statistically significant.
Furthermore, the results highlight specific trends observed in the dataset, including a notable increase in the measured outcomes as a function of the independent variable. Graphical representations, such as scatter plots and regression lines, illustrate these relationships clearly. Overall, the findings contribute valuable insights into the research question, reinforcing the theoretical framework established in the introduction.
Discussion
In this study, the role of the kinase Pi65 in rice immunity against the pathogen Magnaporthe oryzae was investigated, revealing its autophosphorylation activity and its influence on phosphorylation homeostasis. Phosphoproteomic analysis identified significant changes in phosphorylation sites between Pi65 knockout (KO) and overexpression (OE) lines, with the KO line showing 648 upregulated and 10 downregulated phosphorylation sites, while the OE line exhibited 114 upregulated and four downregulated sites. The differentially phosphorylated proteins (DPPs) in the KO line were primarily involved in signal transduction and carbohydrate metabolism, whereas those in the OE line were enriched in RNA processing and ribosome biogenesis, indicating that Pi65 modulates immune responses through phosphorylation-dependent mechanisms that affect metabolic processes.
Furthermore, Pi65 was shown to interact with the redox regulatory protein OsAPx4 and the phosphate transporter OsPHF1, suggesting a synergistic integration of reactive oxygen species (ROS) signaling and phosphate metabolism pathways. The interaction with OsAPx4 helps maintain ROS levels for effective immune signaling while preventing cellular damage, and the interaction with OsPHF1 enhances phosphorus uptake, crucial for synthesizing defense-related compounds. This coordinated regulatory network established by Pi65 underscores its pivotal role in enhancing rice resistance to M. oryzae through the integration of metabolic pathways and signaling processes, providing insights into potential strategies for breeding stress-resistant crops.