تاريخ الاستلام: 6 يونيو 2024 / تاريخ القبول: 10 يونيو 2024 / تاريخ النشر على الإنترنت: 17 يونيو 2024
© المؤلف(ون) 2024

الكلمات الرئيسية: سرطانات تجويف الفم الميكروبات الفموية لعاب مرض اللثة

سرطانات تجويف الفم هي الأكثر انتشارًا بين سرطانات الرأس والعنق، حيث تتسبب في حوالي 188,438 حالة وفاة سنويًا، مما يجعلها السرطان الذي يحتل المرتبة الخامسة عشرة من حيث معدل الوفيات، مما يمثل مصدر قلق صحي خطير على مستوى العالم [1]. السرطان الفموي معقد وغالبًا ما يرتبط بالتدخين، استهلاك الكحول، مضغ جوزة البيتا، عادات الأكل، نقص المناعة، عدوى فيروس الورم الحليمي البشري، والعوامل الوراثية [2، 3]. بالإضافة إلى ذلك، ارتبطت سوء نظافة الفم، وسوء التغذية، وارتداء الأطقم السنية بزيادة خطر الإصابة بسرطان الفم [4-6].

يمكن أن تكون العوامل الميكروبية عوامل مساهمة في نشوء سرطان الفم. قد تسبب أنواع ميكروبية معينة في الميكروبيوم البشري التهابًا مستمرًا في أنواع سرطانية محددة. تحتوي تجويف الفم على ثاني أعلى كثافة من الكائنات الدقيقة، حيث تضم حوالي 700 نوع، بما في ذلك البكتيريا والفطريات والفيروسات والعتائق والأوليات. نظرًا لأن اختلال التوازن البكتيري مرتبط بزيادة خطر الإصابة بأمراض نظامية أخرى، قد تشير التغيرات في الميكروبات في مواقع الأورام إلى مشاركة بكتيريا الفم في تطور السرطان وتقدمه. في الواقع، تم ربط أنواع معينة من السرطان، مثل سرطان الجهاز الهضمي وسرطان المريء وسرطان الفم وسرطان البنكرياس، بعدد من مسببات الأمراض اللثوية، بما في ذلك Porphyromonas gingivalis وTannerella forsythia وPrevotella intermedia، مما يشير إلى أن اختلال التوازن المرتبط بأمراض اللثة قد يشكل خطرًا على نشوء سرطان الفم. تم اكتشاف أورام أولية مرتبطة بالميكروبيوم الفموي في تجويف الفم والمريء والمعدة والبنكرياس والقولون، مما يشير إلى أن التغيرات الاختلالية في تجويف الفم قد تزيد من خطر الإصابة بأمراض غير فموية.

بينما يمكن للبكتيريا ربط الأمراض الفموية وسرطانات تجويف الفم من خلال عدة مسارات، فإن الفهم الحالي لدور الميكروبات الفموية في نشوء سرطان تجويف الفم محدود جداً. نظرًا لأن تصنيف السرطان أمر حاسم في التخطيط للعلاج الأورام، فإن الكشف المبكر قد يغير مسار العلاج، ومعدلات البقاء، وجودة الحياة. ومع ذلك، لا توجد حاليًا مؤشرات حيوية موثوقة لتشخيص الأورام الخبيثة في تجويف الفم، حيث يمكن أن يكون اكتشاف التغيرات الميكروبية الفموية أيضًا مؤشرات على نشوء الأورام. وبالتالي، اختبرنا الفرضية القائلة بأن اختلال توازن الميكروبات الفموية مرتبط بسرطان تجويف الفم وأن أنواعًا معينة يمكن استخدامها كعلامات للمرض.

تم التخطيط لهذه الدراسة كدراسة حالة وشاهد؛ وقد تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لبحوث إسطنبول.
ومستشفى التدريب والبحوث (2017/11/09-1109). تم جمع العينات بعد الحصول على موافقة مستنيرة؛ وتم إجراء التجربة وفقًا لإعلان هلسنكي. تم تجنيد المرضى من عيادات الأنف والأذن والحنجرة في مستشفى باججيلار للتدريب والبحوث ومستشفى إسطنبول للتدريب والبحوث. تم تأكيد تشخيص سرطان تجويف الفم بواسطة علم الأمراض النسيجي، وتم تصنيف الآفات باستخدام نظام TNM [13]. جميع المرضى كانوا حالات تم تشخيصها مؤخرًا ولم يتلق أي منهم أي علاج. كانت معايير الاستبعاد هي فقدان الأسنان الكامل، إجراء عملية جراحية على الغدد اللعابية، تاريخ مرض مناعي ذاتي أو مرض نظامي، الحمل، تاريخ العلاج الإشعاعي أو الكيميائي، العلاج التقويمي الثابت، العلاج بالمضادات الحيوية، أو مضادات الالتهاب، أو العلاج بمضادات التخثر أو استخدام البروبيوتيك خلال الأسابيع الأربعة الماضية، غير البالغين (< 18 عامًا)، العدوى الفيروسية أو البكتيرية أو الفطرية النشطة، وإيجابية فيروس الورم الحليمي البشري (تم اختبارها لفيروس الورم الحليمي باستخدام مجموعة اختبار PCR التجارية). من بين أكثر من 100 مريض تم تجنيدهم، استوفى 10 مرضى بسرطانات تجويف الفم الأولية (6 رجال و4 نساء) معايير الإدراج والاستبعاد في التوصيف السريري، أخذ عينات اللعاب، والتحليلات الميكروبية. تم تجنيد اثني عشر فردًا صحيًا بشكل نظامي بدون سرطان (6 رجال و6 نساء) كضوابط.

لتوصيف مجموعات الدراسة، تم جمع بيانات عن العوامل الاجتماعية والديموغرافية والسلوكية، وقياسات اللثة المبلغ عنها ذاتياً والعادات، والحالة السنية الحالية باستخدام استبيان منظم ورسم بياني للثة. تضمنت المتغيرات الاجتماعية والديموغرافية العمر (بالسنوات)، الجنس (ذكر/أنثى)، المستوى التعليمي ( سنوات مقابل سنوات) [14]، وجود حالات مرضية مصاحبة (نعم مقابل لا)، تاريخ عائلي للسرطان (نعم مقابل لا)، تاريخ التدخين (نعم مقابل لا)، حالة التدخين الحالية (نعم مقابل لا)، واستهلاك الكحول (نعم مقابل لا) [15]. تضمنت مقاييس الصحة الفموية المبلغ عنها ذاتيًا عادات تنظيف الأسنان (نعم مقابل لا)، استخدام خيط الأسنان/فرشاة بين الأسنان (نعم مقابل لا)، والفحوصات السنية (نعم مقابل لا). كما سألنا المشاركين عما إذا كان لديهم تاريخ من أمراض اللثة وأطقم الأسنان [16]. تم تقييم مرض اللثة المبلغ عنه ذاتيًا من خلال نزيف اللثة، والتورم، والاحمرار [17، 18]. تم تقييم الصحة الفموية المبلغ عنها ذاتيًا باستخدام سؤال واحد مع خيارات استجابة ترتيبية [16].

بالإضافة إلى مقاييس صحة الفم التي أبلغ عنها المشاركون بأنفسهم، تلقى كل مشارك فحصًا سريريًا قياسيًا ومفصلًا. تم إجراء الفحص اللثوي بواسطة فاحص واحد ذو خبرة ومؤهل (T.P.). الفحص اللثوي
تضمنت المعايير عمق الاستكشاف (PD) ، مستوى الارتباط السريري (CAL) ، النزيف عند الاستكشاف (BOP) ، تراجع اللثة (GR) ، مؤشر اللويحات (PI) ، ومؤشر اللثة (GI) [19، 20]. تم تقييم المعايير السريرية في جميع الأسنان، باستثناء الأضراس الثالثة. تم تسجيل PI و GI في أربعة مواقع، بينما تم قياس PD و CAL في ستة مواقع لكل سن (الخد، والميزيوبوكال، والدستوبوكال، واللساني، والميزيولساني، والدستولساني). تم قياس BOP من خلال وجود أو عدم وجود نزيف بعد 10 ثوانٍ من الاستكشاف. تم إجراء جميع القياسات باستخدام مسبار لثوي معتمد بالملليمتر (PCP15؛ Hu-Friedy®، شيكاغو، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم تقريب القيم إلى أقرب ملليمتر. تم حساب متوسط ​​الدرجة لعمق الاستكشاف في الفم بالكامل، ومستوى الارتباط السريري، ومؤشر اللثة، ومؤشر اللويحات، وBOP، مقسومًا على العدد الإجمالي للمواقع في الفم ومضروبًا في 100، لكل فرد.

تم الحصول على عينات اللعاب بعد 4-6 أسابيع من الخزعة الأولية للآفة. قبل أخذ العينات، تم توجيه المشاركين لشطف أفواههم بـ محلول ملحي. تم جمع خمسة ملليلترات من اللعاب غير المحفز، ووضعها في بيئة معقمة الحاويات، وتم نقلها إلى المختبر على الفور. تم إضافة مادة الحماية من الحمض النووي/الحمض النووي الريبي (Zymo Research Corp، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) للتثبيت وتم تخزينها في حتى استخراج الحمض النووي. تم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات Quick-DNA Fecal/Soil Microbe (Zymo Research Corp، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تحديد تركيز ونقاء عينات الحمض النووي باستخدام Qubit (Thermo Fisher Scientific، وولثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) قبل التسلسل.

تم إجراء تسلسل الجيل التالي من خلال استهداف مناطق الجين V3-V4 من 16 S rRNA. تم استخدام بادئات 16 S العالمية للبكتيريا (16 S الأمامية: TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG؛ 16 S الأمامية العكسية: GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C) للتضخيم [21، 22]. تم استخدام PCR بخطوتين في عملية إعداد المكتبة. باستخدام KAPA HiFi HotStart ReadyMix، تم إجراء 25 دورة من PCR بشكل فردي (Roche Diagnostics GmBH، مانهايم، ألمانيا). في الخطوة الأولى من PCR، كانت حالة PCR هي 3 دقائق عند ثم 30 ثانية عند في في لمدة 25 دورة، وأخيرًا، دورة واحدة عند لمدة 5 دقائق. في تطبيق PCR الثاني، تم إضافة مجموعات Nextera XT Index Primer 1 وNextera XT Index Primer 2 (Illumina، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى تسلسلات الفهرس والمهايئ من Illumina. في هذه الخطوة من PCR، كانت حالة PCR هي 3 دقائق عند في في في لمدة ثمانية دورات، ثم دورة واحدة عند لمدة 5 دقائق. كانت مجموعة Agencourt AMPure XP (بيكمان كولتر) هي
تم استخدامه لتنقية منتجات الأمبليكون بعد دورات PCR. تم فحص منتجات PCR لوجود الأشرطة وكثافة الأشرطة النسبية على تم إجراء هلام الأجاروز وفقًا لإجراءات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم قياس المكتبة المحضرة باستخدام جهاز قياس الفلورية Qubit وتم التسلسل بعد التعديل. تم إجراء التسلسل على جهاز iSeq 100 باستخدام مجموعة كواشف iSeq100i1 (Illumina، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة [21،23،24].

تم استخدام برنامج FastQC لمراقبة الجودة بعد تطبيق التسلسل. تم تحليل كميات البيانات، وجودة القراءة، وتوزيعات GC، وتوزيعات الكيمر، والملوثات المحتملة من الموصلات لكل عينة في ضوء نتائج مراقبة الجودة. بعد مراقبة الجودة، تم استبعاد القراءات ذات الجودة المنخفضة (درجة جودة فريد <Q20، نطاق النافذة 30 نقطة أساسية) من جميع البيانات. تم تقليم القراءات ذات الجودة المنخفضة، والقراءات القاعدية المحتملة الملوثة بالموصلات، والتسلسلات الشيميرية في أطراف القراءة بناءً على قاعدة بيانات الجينومات على الإنترنت (GOLD) وأداة Trimmomatic. تم محاذاة القراءات مع الكائنات المستهدفة للتوصيف التصنيفي باستخدام قاعدة بيانات SILVA [21،25]. تم تحديد مجموعات OTU في كل عينة بعد المحاذاة. تم إجراء تقارير البيانات، والتحليل الإحصائي، والتصور باستخدام برنامج ونصوص.

كانت جميع آفات سرطان الفم لدى المرضى من نوع سرطان الخلايا الحرشفية. لم تكن هناك اختلافات في توزيع الجنس والعمر بين الأفراد الأصحاء والمرضى الذين يعانون من سرطانات تجويف الفم (الجدول 1). كما لم تكن هناك اختلافات كبيرة في تاريخ التدخين، واستهلاك الكحول، وعادات التدخين بين المجموعتين. كان هناك اختلاف كبير في التاريخ العائلي للسرطان ومستوى التعليم بين المرضى والشهود. ). جميع الضوابط الصحية أفادت بأن لديهم أكثر من 8 سنوات من التعليم ( ).

كما هو موضح في الجدول 2، قام جميع المرضى في هذه الدراسة بتقييم صحتهم الفموية على أنها جيدة. شعر مرضى سرطان تجويف الفم بمزيد من علامات نزيف اللثة وتورم اللثة واحمرارها. ). قام الأفراد الأصحاء بتنظيف أسنانهم أكثر ( ) واستخدم خيط الأسنان/فرشاة بين الأسنان ( ) من مرضى سرطان تجويف الفم. جميع مرضى سرطان تجويف الفم أبلغوا عن تاريخ من مرض اللثة ( ).

أظهر التقييم المباشر لصحة الفم أن المرضى الذين يعانون من سرطانات تجويف الفم يعانون من صحة فموية سيئة

الصحة (مؤشر PI الأعلى، GI، نسبة BOP%، PD، CAL، GR) مقارنةً بالضوابط الصحية (الجدول 3، أظهر الفحص الفموي أن جميع مرضى سرطان تجويف الفم كانوا يعانون من تورم ونزيف لثوي. كان لدى جميع المرضى حالة نشطة أو تاريخ

من مرض اللثة، و2 من 10 كانوا يرتدون أطقم أسنان جزئية قابلة للإزالة.

توضح الشكل 1 أكثر الفصائل والأجناس البكتيرية وفرة والتغيرات في وفرتها بين مرضى سرطان تجويف الفم والأشخاص الأصحاء. يظهر الشكل 2 أكثر الأجناس والأنواع البكتيرية انتشارًا لدى مرضى سرطان الفم والأشخاص الأصحاء.

كان هناك 31 شعبة في المجموع، مع هيمنة 5 من هذه الشعب في جميع العينات: Firmicutes وProteobacteria وBacteroidetes وActinobacteria وFusobacteria، بينما كانت الشُعب الـ 26 المتبقية ذات وفرة نسبية أقل من في عينات التحكم، كان هناك هيمنة من Firmicutes (44.9%)، Bacteroidetes (13.5%)، Proteobacteria (23.1%)، Actinobacteria (13.3%)، وFusobacteria (2.7%). بالمقابل، في عينات سرطان تجويف الفم، انخفضت Proteobacteria (4.1%)، بينما ارتفعت Firmicutes (59.2%)، Bacteroidetes (14.2%)، Actinobacteria (17.2%) وFusobacteria (3.2%). زادت Cyanobacteria تقريبًا بمقدار ثمانية أضعاف في مجموعة السرطان مقارنةً بالأصحاء.

مجموعة التحكم. انخفضت Aggregatibacter وHaemophilus وNeisseria، التي هي من أعضاء Proteobacteria
في مجموعة المرضى بالتوازي مع الانخفاض الكلي في الشعبة. Fusobacterium، وهو عضو في شعبة Fusobacteria، وLactobacillus، وGemella، وهو عضو في Firmicutes، زادت في مجموعة المرضى بالتوازي مع الشعبة. كان الجنس البكتيري الذي سجل أعلى معدل في مجموعتي المرضى والشهود هو Streptococcus، تلاه Rothia وPrevotella وVeionella. بينما وُجد Streptococcus في من الضوابط الصحية، من المرضى الذين يعانون من سرطان الفم كان لديهم ستربتوكوكوس. بينما كانت نسبة الروثيا 6% في مجموعة الضبط، تضاعفت نسبتها (12%) في مجموعة المرضى. وبالمثل، كانت نسبة بيبتوستبتوكوكوس، وتانيرلا، واللاكتوباسيلوس أعلى في مجموعة سرطان تجويف الفم. تم الكشف عن بريفوتيلا في من الضوابط، بينما فقط من المرضى كانت نتائجهم إيجابية. تم العثور على فيلونيلة بمعدل متوسط قدره في عناصر التحكم؛ انخفضت وجوده إلى في مجموعة المرضى.

على مستوى الأنواع، زادت بكتيريا بورفيروموناس جينجيفاليس بمقدار 6.5 مرات في مرضى سرطان تجويف الفم. كانت بكتيريا جيملا هيموليسانس أعلى بشكل ملحوظ في مرضى سرطان الفم، بينما كانت بكتيريا كورينباكتيريوم دوروم، لاخنواانايروباكولوم أوميانس، نيسيريا سوبفلافا، أكتينوميس massiliensis، وفيلونيللا ديسبار أقل بشكل ملحوظ. تظهر التغيرات في كمية أكثر 40 نوعًا بكتيريًا وفرة في مرضى سرطان تجويف الفم ومجموعات التحكم في الشكل 3. كانت نسبة F. nucleatum مرتفعة بمقدار 2.8 مرة، بينما انخفضت نسبة A. actinomycetemcomitans بمقدار 1.3 مرة مقارنةً بالتحكم الصحي.

الشكل 2 أكثر الأجناس والأنواع البكتيرية انتشارًا. اللوحة يظهر التغيرات في كمية أكثر 40 جنسًا بكتيريًا وفرةً في مرضى سرطان تجويف الفم ومجموعات التحكم. اللوحة

يظهر الشكل B أول 30 نوعًا بأعلى معدل حدوث وفقًا للتحليل الميتاجينومي الذي تم الحصول عليه من مرضى سرطان تجويف الفم والشهود في كل عينة (H: المرضى، C: الشهود)

تظهر آثار عادات التدخين واستهلاك الكحول على الميكروبات الفموية في الشكل 4. تم تقديم بيانات الوفرة كجداول تكميلية. على مستوى الجنس، بينما كانت أنواع Neisseria وHaemophilus وPeptococcus وEikenella وKingella وCardiobacterium وAggregatibacter وPrevotella وVeillonella وCampylobacter وBulleidia أقل، كانت أنواع Actinomyces وAtopobium وLautropia مرتفعة لدى المدخنين. على مستوى الأنواع، كانت وفرة Haemophilus parainfluenzae وأنواع Saccharibacteria genera incertae sedis وRikenellaceae.
تم العثور على بكتيريا، جيملا بالاتكانيس، روثيا أيريا، بريفوتيلا ساكاروليتكا، بريفوتيلا ماكولوزا، فوسوبكتيريوم بيريودونتيكوم، بريفوتيلا بريانت، بورفيروموناس باستيري، بريفوتيلا شاهيي، تريبوينما سوكرانسكي، كارديوباكتيريوم هومينيس، أجرجاتيبكتير أفروليفوس، دياليستر نيوموسينتس، فيلونيللا روجوساي، هيموفيلوس سبوتوروم، وأنواع نيسيريا إيلونغاتا كانت موجودة بمستويات أقل بشكل ملحوظ في المدخنين. ).

تغير استهلاك الكحول الميكروبات الفموية في سرطان الفم. على مستوى الجنس، كانت أنواع Neisseria وHaemophilus وEikenella وKingella وAggregatibacter وPrevotella وVeillonella وCampylobacter أقل، بينما كانت Actinomyces.

كانت بليديا وكارديوبكتيريوم أكثر وفرة في مستهلكي الكحول. على وجه الخصوص، كانت أعضاء عائلة البروتيوبكتيريا، أجرجاتيباكتير أقل بمقدار 67 مرة، ونييسيريا أقل بمقدار 15 مرة، وهيماوفيليس أقل بمقدار 4 مرات في مستهلكي الكحول. على مستوى الأنواع، كانت فوسوبكتيريوم بيرودونتيكوم، بريفوتيلا براينتي، جيملا بالاتكانيس، بريفوتيلا ماكولوسا، بورفيروموناس باستيري، بريفوتيلا سكوبوس، أجرجاتيباكتير أفروليفوس، كينجيلا أوراليس، بريفوتيلا فيروراليس، وهيماوفيليس سبوتوروم أعلى بشكل ملحوظ في غير المستهلكين مقارنة بمستهلكي الكحول. ).

كما هو موضح في الشكل 5، كانت الأنواع العشر الأكثر وفرة في مرضى سرطان تجويف الفم الذين لديهم عادات تنظيف الأسنان اليومية هي (ترتيبًا) روثيا موكيلاجينوزا، ستربتوكوكوس سينيينس، بورفيروموناس باستيري، بارفيموناس ميكرا، بيبتوستربتوكوكوس ستوماتيس، جرانوبيكتيللا أدياسينس، جيملا.
هايموليسانس، جيملا موربيلوروم، أكتينوميس أودونتوليتيكوس، ستربتوكوكوس سانغوينيس، على التوالي. في المرضى الذين لم يكن لديهم عادات تنظيف الأسنان اليومية، كانت الأنواع العشر الأكثر وفرة هي روثيا موكيلاجينوزا، بريفوتيلا ميلانينوجينيكا، جرانوبيكاتيلا أدياسينس، أكتينوميس أودونتوليتيكوس، بورفيروموناس باستيري، ستافيلوكوكوس ديفريسي، ستربتوكوكوس غوردوني، ستربتوكوكوس سينيينس، بريفوتيلا جيجوني، ستربتوكوكوس سانغوينيس، على التوالي. في المرضى الذين يعانون من السرطان الفموي، سواء كانوا ينظفون أسنانهم أو لا، كانت روثيا موكيلاجينوزا هي النوع الأكثر وفرة؛ كانت أعلى بمقدار 3.2 مرة في المشاركين الذين لديهم عادات تنظيف الأسنان اليومية. في المرضى الذين يقومون بالعناية الفموية اليومية، زادت مستويات جيملا موربيلوروم، بارفيموناس ميكرا، جيملا هايموليسانس، وبيبتوستربتوكوكوس ستوماتيس. ، و 2.3 مرة، على التوالي. كانت بكتيريا Staphylococcus devriesei وPrevotella jejuni أعلى بمقدار 10,000 و100 مرة، على التوالي، في المرضى الذين لم يكن لديهم عادات تنظيف الأسنان اليومية. كانت Prevotella melaninogenica وStreptococcus sinensis وStreptococcus gordonii مرتفعة على مستوى الأنواع.

تم الكشف عن مسببات الأمراض الرئيسية في أمراض اللثة، مثل Porphyromonas gingivalis وTreponema denticola وTannerella forsythia، بمعدلات أعلى بمقدار 70 و4 و2 مرة، على التوالي، لدى الأشخاص الذين لا يتبعون عادات تنظيف الأسنان يوميًا، مما يشير إلى تحول مرتبط بأمراض اللثة في اختلال التوازن الميكروبي في سرطان الفم. كما لم يتم الكشف عن مسبب مرض اللثة الرئيسي الآخر، Aggregatibacter actinomycetemcomitans، لدى أولئك الذين ينظفون أسنانهم يوميًا. من بين بكتيريا المجموعة البرتقالية، وُجد أن Fusobacterium nucleatum كان أقل بمقدار 4 مرات لدى الذين ينظفون أسنانهم يوميًا مقارنةً بالذين لا ينظفون أسنانهم يوميًا. لم يتم الكشف عن Prevotella intermedia لدى الذين ينظفون أسنانهم يوميًا؛ وكانت مستويات Lachnoanaerobaculum umeaense وPrevotella bryantii وFretibacterium fastidiosum وPorphyromonas endodontalis وPrevotella shahii وCatonella morbi وPrevotella veroralis وPorphyromonas catoniae وPrevotella pallens وأنواع Saccharibacteria incertae sedis أقل بشكل ملحوظ. في المقابل، كانت مستويات Rothia amarae أعلى بشكل ملحوظ لدى أولئك الذين لديهم عادات تنظيف الأسنان يوميًا مقارنةً بالذين لا يفعلون ذلك. بينما كانت مستويات Corynebacterium durum وNeisseria subflava وLachnoanaerobaculum umeaense أعلى بشكل ملحوظ لدى الأفراد الذين يستخدمون أطقم الأسنان الجزئية مقارنةً بالأفراد الذين لديهم أسنان طبيعية، كانت Gemella haemolysans أقل بشكل ملحوظ. ).

تم تصميم هذه الدراسة لاختبار الفرضية القائلة بأن اختلال ميكروبات الفم مرتبط بسرطان تجويف الفم. في المرضى الذين يعانون من سرطان تجويف الفم الأولي والذين استوفوا معايير الإدراج والاستبعاد، تم جمع بيانات صحة الفم، وتم توصيف الميكروبيوم الفموي من خلال التسلسل الجيني المتقدم. أظهرت النتائج أن المرضى الذين يعانون من سرطانات تجويف الفم كانوا يعانون من صحة فموية أسوأ من الضوابط الأصحاء. دعمت الفروق المحددة بين الأجناس والأنواع وجود ميكروبيوم فموي مختل مرتبط بسرطان الفم، مع هيمنة مسببات الأمراض اللثوية على العينات. بشكل جماعي، اقترحت هذه البيانات أن المرضى الذين يعانون من سرطان الفم لديهم تركيبة ميكروبيوم فموي مميزة تتأثر بالعادات اليومية الشخصية وقد تكون مرتبطة بقدرة المرض على التسبب في المرض.

الميكروبيوم الفموي البشري هو ثاني أكثر الميكروبات عددًا في جسم الإنسان، حيث يحتوي على أكثر من 700 نوع. نظرًا لأن الميكروبيوم الفموي يؤثر على الاستجابات الأيضية والمناعية، فقد تم ربط اختلال التوازن البكتيري بالأمراض المحلية والنظامية، بما في ذلك دورها في الأورام الخبيثة. نظرًا لأن تصنيف السرطان أمر حاسم في التخطيط للعلاج الأورام، فإن الكشف المبكر قد يغير مسار العلاج، ومعدلات البقاء على قيد الحياة، وجودة الحياة. ومع ذلك، لا توجد حاليًا مؤشرات حيوية موثوقة لتشخيص الأورام الخبيثة في تجويف الفم مبكرًا، حيث إن الكشف
قد تكون التغيرات الميكروبية الفموية أيضًا مؤشرات على نشوء الأورام. لذلك، يمكن أن يوفر تكوين الميكروبات الفموية والأنواع المحددة لدى المرضى المصابين بسرطان تجويف الفم تقنية تشخيصية غير جراحية لسرطانات تجويف الفم.

ترتبط صحة الفم بالتغيرات الالتهابية في تجويف الفم. لتقييم صحة الفم لدى مرضانا المصابين بسرطان الفم، استخدمنا كل من التقارير الذاتية والتدابير المهنية المباشرة للأمراض. أظهرت البيانات أن صحة اللثة، وبشكل عام، كانت ضعيفة لدى مرضى سرطان الفم مقارنةً بالضوابط الصحية، وهو ما يتماشى مع التقارير السابقة حيث كان لدى مرضى السرطان مرض periodontitis المتقدم وأكياس لثوية أعمق من 6 ملليمترات [15، 27]. تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن مرض periodontitis قد يكون عامل خطر لسرطان تجويف الفم [6، 28-30]، حيث ارتبطت صحة الفم الضعيفة بزيادة خطر الإصابة بسرطانات الرأس والعنق والمريء [31]. تستخدم العديد من الدراسات مقاييس ذاتية لتحديد حالة صحة الفم، مما قد يكون مضللاً [32]. في دراستنا، أفاد مرضى سرطان تجويف الفم بأن لديهم صحة فموية جيدة بينما كان لديهم المزيد من علامات نزيف اللثة، والتورم، والاحمرار. لذلك، فإن البيانات المبلغ عنها ذاتياً هي ذات طابع شخصي. في الواقع، أظهرت دراسة أن جميع مرضى السرطان كانوا ينظفون أسنانهم حتى مرتين يومياً، لكن معظمهم يعانون من مرض periodontitis المتقدم [27]. للتحقق من صحة البيانات المبلغ عنها ذاتياً، استخدمنا مؤشرات صحة فموية محددة مثل و GR، التي تم تسجيلها بواسطة طبيب أسنان مختص في أمراض اللثة. سمح لنا هذا النهج بربط صحة الفم بدقة، وسرطان الفم، والميكروبات الفموية، مما أظهر أن صحة الفم السيئة كانت مرتبطة بزيادة مرض اللثة لدى المرضى المصابين بسرطان الفم، بما يتماشى مع دراسة سابقة تشير إلى أن سوء نظافة الفم يعد مؤشراً على سرطان الفم [33]. وبالمثل، تدعم بياناتنا النتائج السابقة حيث كانت هناك علاقة بين تاريخ التهاب اللثة وسرطان الخلايا الحرشفية الفموية وزيادة خطر الإصابة بسرطان الرأس والعنق [34، 35].

قدمت بياناتنا العديد من التوقيعات الميكروبية الجديدة المرتبطة بسرطانات الفم حيث قد تكون الأجناس الميكروبية المحددة علامات محتملة للأورام الخبيثة في تجويف الفم. كانت الأنواع الأكثر وفرة هي Firmicutes وProteobacteria وBacteroidetes وActinobacteria وFusobacteria. بينما زادت أعداد Streptococcus وRothia في مجموعة السرطان، انخفضت أعداد Prevotella وVeillonella. تتماشى بعض هذه النتائج مع التقارير السابقة حيث أظهرت ملفات الأجناس أن Streptococcus وPrevotella هي السائدة في جميع العينات، وكان Lactobacillus وفيرًا، بينما انخفضت أعداد Haemophilus وNeisseria وGemellaceae وRothia وAggregatibacter في اللعاب. ومع ذلك، على عكس نتائجنا، أظهرت هذه الدراسات السابقة انخفاضًا في جنس Streptococcus، ربما بسبب اختلافات محددة في مجموعة المرضى تحتاج إلى مزيد من الدراسة. وبالمثل، أظهرنا زيادة
وفرة من روثيا في مرضى سرطان تجويف الفم، مما يتناقض مع هذه التقارير السابقة [3].

تظهر بياناتنا أيضًا رؤى ميكانيكية ومرضية. كانت واحدة من أهم ملاحظاتنا هي أن هناك زيادة بمقدار 6.5 و 2.7 مرة في بكتيريا P. gingivalis و F. nucleatum في الميكروبيوم الفموي للمرضى الذين يعانون من سرطان تجويف الفم مقارنةً بالمجموعة الضابطة. نظرًا لأن P. gingivalis و F. nucleatum يمكن أن تولد التهابًا، وتكاثرًا خلويًا، وغزوًا خلويًا في سرطان الخلايا الحرشفية في الفم من خلال عدة مسارات، فإن إمكاناتهما المسرطنة قد تكون حاسمة لسرطانات تجويف الفم من خلال إنتاج إنترلوكين-6، وعامل نخر الورم- إنزيمات الماتريكس الميتالوبروتيناز، تقليل الموت الخلوي، وتنظيم جين كابح الورم p53. لتحقيق هذه الغاية، يمكن أن يعزز F. nucleatum بشكل خاص تكاثر الخلايا ويزيد من مستويات الإنترلوكينات وإنزيمات MMP الأخرى التي تؤثر على تقدم غزو الورم والنقائل، مما قد يؤدي إلى زيادة نشاط النسخ للجينات المسرطنة والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات. في الواقع، يمكن أن يكون F. nucleatum عامل خطر لمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة، بما في ذلك أورام تجويف الفم من خلال عدوى مستمرة، وتفاعل جزيئات سطح الخلايا مع الجهاز المناعي وخلايا السدى، وتجنب المناعة، وكبت المناعة وعوامل الضراوة مثل FadA وFap2 وLPS، وكلها مرتبطة بتحويل الخلايا الظهارية إلى خلايا ورمية.

بعيدًا عن الارتباط، فإن العلاقة بين مسببات الأمراض اللثوية المحددة وسرطانات الفم غير واضحة. من الناحية الميكانيكية، قد تسلط الروابط بين الأنواع الضوء على هذا اللغز حيث يمكن أن تكون تقنيات تسلسل الجينوم الجديدة أداة قيمة لتحديد العواقب المرضية المحتملة لتفاعلات البكتيريا مع بعضها البعض. قدمت بياناتنا في مجموعة محددة للغاية أدلة قوية على مثل هذه الرؤى الميكانيكية. في هذا السياق، واحدة من البكتيريا التي تم الإبلاغ عن ارتباطها القوي بموقع الورم في سرطانات تجويف الفم هي جيملا هيموليسانس. وجدنا أن ج. هيموليسانس كانت مرتفعة بشكل ملحوظ في الميكروبيوم الفموي لمرضى سرطان تجويف الفم مقارنةً بالضوابط الصحية. تم ربط مستويات أعلى من ج. هيموليسانس وجيملا باراهيموليسانس مؤخرًا بالتهاب الفم الحزازي، وهو عامل خطر لسرطانات الفم. في الوقت نفسه، كانت استعمار ب. جينجيفاليس أعلى بمقدار 6.5 مرة في الميكروبيوم الفموي لمرضى السرطان مقارنةً بالضوابط الصحية في هذه الدراسة. الآلية الأساسية لب. جينجيفاليس، على الرغم من اعتبارها عاملًا مسببًا مهمًا في الأورام الخبيثة لتجويف الفم، غير معروفة. على النقيض من الوضع في السرطان، فإن ج. هيموليسانس تقلل من الميكروبيوم الفموي لمرضى التهاب اللثة وتثبط ب. جينجيفاليس عن طريق إفراز مكونات بروتينية في المختبر. ومع ذلك، في سياق سرطانات الفم، قد يكون الارتباط بين الأنواع بين ج. هيموليسانس وب. جينجيفاليس معكوسًا، مما يشير إلى بيئة ميكروبية مختلفة لتفاعلات الميكروبات. هناك حاجة إلى تحليلات الميتا ترانسكريبتوميك لتحديد هذه التفاعلات الميكانيكية بالتفصيل.

ارتبطت سوء نظافة الفم، وسوء التغذية، وارتداء الأطراف الصناعية السنية بزيادة خطر الإصابة بسرطان الفم في بعض الدراسات [4، 6، 15]. ومع ذلك، لم يتم إثبات الآلية التي تجعل سوء نظافة الفم الأفراد عرضة لسرطان تجويف الفم ودور اختلال التوازن البكتيري في ظهور سرطان الفم بعد. أظهر تحليل الميكروبات الفموية أن نوع روثيا موكيلاجينوزا هو الأكثر وفرة بين الأنواع البكتيرية الموجودة في مرضى سرطان تجويف الفم بغض النظر عن عادات تنظيف الأسنان اليومية لديهم. . كان من المعروف أن mucilaginosa أقل بمقدار 3.2 مرة في الأشخاص الذين لا ينظفون أسنانهم يوميًا، وهو ما يتماشى مع الدراسات السابقة [3] [43]، مما يشير إلى أن تنظيف الأسنان قد يلعب دورًا في منع شدة سرطانات تجويف الفم. نظرًا لأن Rothia spp. معروفة بإنتاجها للإنترواكتين، وهو أقوى سلاسل الحديد المعروفة بين السلاسل، قد توفر هذه النتيجة رؤى علاجية لإضافة جزيئات السلاسل إلى علاج السرطان لتقليل وصول خلايا السرطان إلى جزيئات الحديد [44، 45].

كشفت نتائجنا عن زيادة P. jejuni و . melaninogenica في المشاركين الذين لديهم عادات نظافة فموية سيئة، مما يشير إلى المساهمة المحتملة لهذه الأنواع في سرطان تجويف الفم بما يتماشى مع تقرير سابق [46]. بالإضافة إلى هذه الأنواع، حددنا بكتيريا جديدة في مرضى سرطان الفم. على سبيل المثال، كانت Staphylococcus devriesei أعلى بمقدار 10,000 مرة في المرضى الذين لم يكن لديهم عادات تنظيف الأسنان اليومية. تم وصف هذا النوع من المكورات العنقودية في عام 2010 في قمم الحلمات وحليب الأبقار الحلوب [47] ومن حالات العدوى البكتيرية في الأبقار في جنوب إفريقيا في عام 2018 [48]. دراستنا هي الأولى التي تحدد S. devriesei من عينة بشرية، مما يشير إلى ارتباط محتمل بصحة الفم في سرطان الفم.

التدخين والكحول هما عاملان خطر مستقلان لسرطانات الرأس والعنق والمواد المسرطنة التي تسبب تلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي بشكل غير صحيح . بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ سابقًا عن تأثيرهما على تغيير الميكروبيوم الفموي، مما يعني أن التدخين سهل الاكتساب المبكر واستعمار مسببات الأمراض في الأغشية الحيوية الفموية [49]، [50] [51]. ومع ذلك، فإن الرابط بين التدخين والميكروبيوم الفموي في سرطانات الفم ليس واضحًا. وجدنا أن Neisseria وHaemophilus وPeptococcus وEikenella وKingella وCardiobacterium وLautropia وPrevotella وVeillonella وCampylobacter وBulleidia وAggregatibacter قد انخفضت، بينما زادت مستويات Actinomyces وAtopobium في المدخنين. على وجه الخصوص، انخفضت Aggregatibacter وHaemophilus بمقدار 100 و50 مرة على التوالي في المدخنين. على مستوى الأنواع، تم تقليل Rothia aeria وHaemophilus parainfluenzae بشكل كبير في المدخنين. كانت مستويات Fusobacterium periodonticum وPorphyromonas pasteri، المرتبطة بميكروبيوم فموي صحي، أقل بشكل كبير في المدخنين ( ) [52]. كانت مستويات Haemophilus parainfluenzae وHaemophilus sputorum وNeisseria elongata، التي هي أعضاء في Proteobacteria، أقل بشكل كبير في العينات المأخوذة من
المدخنين. كانت المستويات المنخفضة من Proteobacteria مرتبطة بتطور سرطانات الفم، مما يشير بشكل جماعي إلى أن التدخين، وهو عامل خطر رئيسي للعديد من السرطانات، قد يؤثر على مستويات بعض الأنواع، مما يؤدي إلى تطور سرطان الفم.

كان استهلاك الكحول مرتبطًا أيضًا بشكل إيجابي بالخلل الميكروبي في سرطانات الفم بالتوازي مع انخفاض أعضاء الميكروبيوم الفموي، مثل Neisseria وHaemophilus، في العدوى التي يبدو أنها تؤثر على الجهاز المناعي، مثل COVID-19 [53]. تم رؤية تحول مشابه في Lactobacillales وActinomyces وLeptotrichia وCardiobacterium – الأجناس التي زادت في الأشخاص الذين استهلكوا المزيد من الكحول. يوفر هذا أيضًا رؤى آلية مهمة لأن Neisseria يمكن أن تحول الإيثانول إلى مادة مسرطنة بشرية تسمى الأسيتالديهيد، مما يشير إلى أن مستويات Neisseria العالية قد تكون مرتبطة بالسرطنة [54]. كشفت دراسة حديثة عن وجود علاقة سلبية بين وفرة Neisseria في اللعاب وإنتاج ACH. على الرغم من أن أنواع Neisseria هي المنتج الرئيسي لـ ACH في المختبر، إلا أن ملف الميكروبيوم اللعابي مع وفرة نسبية أقل من هذه الأنواع كان مرتبطًا بشكل مستقل بقدرة عالية على إنتاج ACH، مما يوضح أهمية التفاعل بين الميكروبيوم الفموي [52]. في دراستنا، زادت مستويات Actinomyces وCardiobacterium من 4% إلى 7% في مستهلكي الكحول، مشابهة لعمل سابق [54]. ومع ذلك، انخفضت مستويات Neisseria بمقدار 15 مرة مع استهلاك الكحول. بالإضافة إلى Neisseria، كان لدى مستهلكي الكحول مستويات Aggregatibacter أقل بمقدار 67 مرة ومستويات Haemophilus أقل بمقدار 4 مرات، وهي أعضاء في Proteobacteria أيضًا.

كان حجم العينة هو القيد الرئيسي في دراستنا. ومع ذلك، كان ذلك بسبب معايير الإدراج والاستبعاد الصارمة، التي سمحت لنا بتحديد التغيرات المهمة وذات الصلة العالية في الميكروبيوم الفموي في حالات السرطان في مجموعة محددة جيدًا. على عكس الدراسات الارتباطية الأخرى، لا يمكن تقييم سرطانات الفم بشكل طولي حسب التعريف لأنها تُزال عند التشخيص. بالإضافة إلى ذلك، هناك نقص في المعرفة في هذا المجال حيث أن الدراسات التي تفحص الميكروبيوم الفموي في مرضى سرطان الفم محدودة. لا داعي للقول، إنه ليس بالأمر السهل تصنيف مرضى سرطان الفم، وجمع العينات، وإجراء تسلسل الجيل التالي، وهو أحد الأسباب الرئيسية التي تجعل هذه الدراسات محدودة. لذلك، تناول عملنا هذه الفجوة في المعرفة. يمكن إضافة المزيد من الضوابط لتفكيك دور التهاب اللثة وأشكال أخرى من أمراض اللثة في مسببات سرطانات الفم. لذلك، امتنعنا عن تقديم أي تصريحات جريئة تشير إلى مثل هذا الرابط حيث أن مرض اللثة لا يشمل فقط العوامل الميكروبية ولكن أيضًا العوامل الالتهابية التي قد تغير مسار سرطانات الفم. ما تم قياسه في عملنا هو الارتباط الجماعي للميكروبيوم الفموي بالكامل مع وجود سرطان الفم. لذلك، تتجاوز هذه الملاحظة التأثير المحدد لموقع التهاب اللثة. ومع ذلك،
أظهرت دراستنا أن العديد من الأنواع الميكروبية، بما في ذلك الكائنات الدقيقة الرئيسية المرتبطة بشكل جيد بالتهاب اللثة، كانت مرتبطة أيضًا بسرطانات الفم. لم نختار عمدًا مقارنة مرضانا في هذه الدراسة بمجموعة من المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة لأن هدف الدراسة لم يكن توضيح دور التهاب اللثة. سمح لنا نهجنا غير المتحيز بتحديد الأنواع الميكروبية المرتبطة بسرطانات الفم مقارنة بتلك التي لا تعاني من أي سرطان فم. نظرًا لأن أيًا من مواضيع التحكم لم يكن لديهم أمراض لثة (كما هو مذكور في الجدول 2)، أظهرنا ارتباطًا واضحًا بين سرطانات الفم وأنواع ميكروبية معينة من تجويف الفم، بعضها مرتبط بمرض اللثة. أظهرت النتائج أنه حتى في غياب التهاب اللثة، كانت الأنواع البكتيرية التي تلعب دورًا في مرض اللثة مرتبطة بسرطان الفم، مما يطرح سؤالًا مثيرًا: هل تقتصر مسببات الأمراض اللثوية فقط على أمراض اللثة في تأثيرها، أم أن تأثيراتها تتجاوز سبب وشدة التهاب اللثة؟ بينما كان هذا السؤال خارج نطاق هذا العمل، ستتركز دراساتنا الجارية على هذا الموضوع. ما إذا كان الخلل الميكروبي هو سبب أو نتيجة للسرطان لا يزال يتعين تحديده؛ ومع ذلك، فإن الروابط بين الأنواع التي أظهرناها حاسمة لفهم علم الأمراض لسرطانات الفم ودور الميكروبيوم الفموي.

تشير بياناتنا إلى أن مرضى سرطان الفم كانوا يعانون من ظروف صحية فموية أسوأ وتركيب ميكروبيوم فموي مميز يتأثر بالعادات اليومية الشخصية وقد يكون مرتبطًا بمرضية المرض. قد تساعد تحسينات النظافة الفموية وعلاج مرض اللثة في الحد من تطور أو انتشار سرطان الفم. بينما تمنعنا النتائج من تقديم أي ادعاءات آلية إضافية بسبب تصميم الدراسة العرضي، توفر النتائج أساسًا للدراسات المستقبلية التي ستختبر دور الخلل الميكروبي الفموي في سرطان الفم.

معلومات إضافية تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi.org/10.1007/s00784-024-05770-8.

مساهمات المؤلفين أوزغى أونلو: التصور؛ تنسيق البيانات؛ التحليل الرسمي؛ الحصول على التمويل؛ التحقيق؛ المنهجية؛ إدارة المشروع؛ الموارد؛ البرمجيات؛ التحقق؛ التصور؛ الأدوار/الكتابة – المسودة الأصلية؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. محمد دميرجي: التصور؛ تنسيق البيانات؛ التحليل الرسمي؛ التحقيق؛ المنهجية؛ البرمجيات؛ الأدوار/الكتابة – المسودة الأصلية؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. أيسجول دالمزراك: التحقيق؛ المنهجية؛ الأدوار/الكتابة – المسودة الأصلية؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. كاجداش أكتان: التحقيق؛ المنهجية؛ الأدوار/الكتابة – المسودة الأصلية؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. أروزو بايقول إيدن: تنسيق البيانات؛ التحليل الرسمي؛ المنهجية؛ البرمجيات؛ الكتابة – المراجعة والتحرير.

توجي باكصوي: التحليل الرسمي؛ التحقيق؛ المنهجية؛ البرمجيات؛ الأدوار/الكتابة – المسودة الأصلية؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. فرديفس سنيل: التحليل الرسمي؛ الإشراف؛ التحقق؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. حسن دينيز تانسوكر: التحقيق؛ المنهجية؛ الموارد؛ البرمجيات؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. أحمد فولكان سونتر: التحقيق؛ المنهجية؛ الموارد؛ البرمجيات؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. أوزغور ييغي: التحليل الرسمي؛ الإشراف؛ الموارد؛ التحقق؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. بوراك أومور جاكير: التحليل الرسمي؛ الإشراف؛ الموارد؛ التحقق؛ الكتابة – المراجعة والتحرير. ألبدوغان كانتارجي: التحليل الرسمي؛ الإشراف؛ التحقق؛ الكتابة – المراجعة والتحرير.

تم دعم هذا البحث من قبل وحدة تنسيق مشاريع البحث العلمي في جامعة بيكنت. رقم المشروع: 2018-2019-BAP-02، 2018.
تم توفير تمويل الوصول المفتوح من قبل مجلس البحث العلمي والتكنولوجي في تركيا (TÜBİTAK).

توفر البيانات لم يتم إنشاء أو تحليل أي مجموعات بيانات خلال الدراسة الحالية.

الامتثال للمعايير الأخلاقية تم إجراء التجارب التي تشمل الأنسجة البشرية وفقًا لموافقة لجنة هلسنكي في مستشفى إسطنبول للبحث والتدريب (رقم الموافقة: 2017/11/09-1109).

الموافقة على المشاركة تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين الأفراد الذين تم تضمينهم في الدراسة.

المصالح المتنافسة يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

الإفصاح لا توجد مصالح مالية متنافسة.
الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي للاستخدام، والمشاركة، والتكيف، والتوزيع، وإعادة الإنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا كانت هناك تغييرات قد تم إجراؤها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة واستخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، ستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.

Publisher’s Note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Received: 6 June 2024 / Accepted: 10 June 2024 / Published online: 17 June 2024
© The Author(s) 2024

Keywords Oral cavity cancers Oral microbiota Saliva Periodontal disease

Oral cavity cancers are the most prevalent head and neck cancers, causing approximately 188.438 deaths annually, which makes it the cancer with the fifteenth highest mortality rate, presenting a serious health concern on a global scale [1]. Oral malignancy is multifaceted and frequently linked to smoking, alcohol consumption, chewing areca nuts, eating habits, immunodeficiency, HPV infection, and genetic factors [2, 3]. In addition, poor oral hygiene, poor nutrition, and wearing dental prostheses were associated with an increased risk of oral cancer [4-6].

Microbial factors can be contributory factors in oral cancer pathogenesis. Specific microbial species in the human microbiome may cause persistent inflammation in distinct cancer types [7]. The oral cavity has the second-highest density of microorganisms, with about 700 species, including bacteria, fungi, viruses, archaea, and protozoans [8, 9]. Since bacterial dysbiosis is associated with an increased risk of other systemic diseases, altered microbiota at tumor locations may suggest an involvement of oral bacteria in the development and progression of malignancy [3, 9]. Indeed, certain cancer types, such as gastrointestinal cancer, esophageal cancer, oral cancer, and pancreatic cancer, have been linked to several periodontal pathogens, including Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Prevotella intermedia [10,11], suggesting that periodontal diseaseassociated dysbiosis may pose a risk for oral cancer pathogenesis. Primary tumors linked to the oral microbiota have been detected in the oral cavity and the esophagus, stomach, pancreas, and colon, suggesting that dysbiotic changes in the oral cavity may increase the risk for non-oral pathologies.

While bacteria can link oral diseases and oral cavity cancers through several pathways, there is currently a very limited understanding of the role of oral microbiotas in oral cavity cancer pathogenesis [11]. Since cancer staging is crucial in oncotherapeutic planning, early detection may alter the course of treatment, survival rates, and quality of life. However, no reliable biomarkers for early diagnosing oral cavity malignancies are currently available, where detection of oral microbial shifts may also serve as predictors of oncopathogenesis [12]. Thus, we tested the hypothesis that oral microbiota dysbiosis is associated with oral cavity cancer and that specific species can be used as disease markers.

This study was planned as a case-control study; it was approved by the Ethical Committee of the Istanbul Research
and Training Hospital (2017/11/09-1109). Samples were collected after obtaining informed consent; the trial was carried out in conformity with the Declaration of Helsinki. Patients were recruited from the otorhinolaryngology clinics of Bağcılar Research and Training Hospital and Istanbul Research and Training Hospital. Oral cavity cancer diagnosis was confirmed by histopathology, and the lesions were classified using the TNM system [13]. All patients were recently diagnosed cases and none of them received any treatment. The exclusion criteria were complete edentulism, surgical operation on salivary glands, history of autoimmune disease or systemic disease, pregnancy, history of radiotherapy or chemotherapy, fixed orthodontic treatment, antibiotic, anti-inflammatory, and anticoagulant therapy or probiotic use for the past 4 weeks, non-adults (< 18 ages), active viral, bacterial, or fungal infections, and HPV positivity (tested for HPV using a commercial HPV real-time PCR kit). Out of more than 100 patients recruited, 10 patients with primary oral cavity cancers ( 6 men and 4 women) met the inclusion and exclusion criteria in clinical characterization, saliva sampling, and microbial analyses. Twelve systemically healthy individuals with no cancer ( 6 men and 6 women) were recruited as controls.

To characterize the study cohorts, data on socio-demographic and behavioral factors, self-reported periodontal measures and habits, and current dental status were collected using a structured questionnaire and periodontal chartings. Socio-demographic variables included age (years), gender (male/female), educational level ( years vs. years) [14], having comorbidities (yes vs. no), familial history of cancer (yes vs. no), history of smoking (yes vs. no), current smoking status (yes vs. no), and alcohol consumption (yes vs. no) [15]. Self-reported measures of oral health behavior included tooth-brushing habits (yes vs. no), use of dental floss/interdental brush (yes vs. no), and dental check-ups (yes vs. no). We also asked the participants whether they had a history of periodontal diseases and dental prostheses [16]. Self-reported periodontal disease was assessed by gingival bleeding, swelling, and redness [17, 18]. Self-rated oral health was assessed using a single-item question with ordinal response options [16].

In addition to self-reported oral health measures, each participant received a standard and detailed clinical examination. Periodontal examination was performed by a single experienced and calibrated examiner (T.P.). Periodontal
parameters included probing depth (PD), clinical attachment level (CAL), bleeding on probing (BOP), gingival recession (GR), plaque index (PI), and gingival index (GI) [19, 20]. Clinical parameters were evaluated in all teeth, excluding third molars. PI and GI were recorded at four sites, while PD and CAL were measured at six sites per tooth (buccal, mesiobuccal, distobuccal, lingual, mesiolingual, and distolingual). BOP was measured by the presence or absence of bleeding 10 s after probing. All measurements were performed using a calibrated millimeter periodontal probe (PCP15; Hu-Friedy®, Chicago, IL, USA), and the values were rounded up to the nearest millimeter. The average score for whole-mouth PD, CAL, GI, PI, and BOP, divided by the total number of sites per mouth and multiplied by 100, was calculated for each individual.

The saliva samples were obtained after 4-6 weeks after the initial biopsy of the lesion. Before sampling, participants were instructed to rinse their mouths with saline solution. Five ml of unstimulated saliva were collected, placed in sterile containers, and transferred to the laboratory promptly. DNA/RNA Shield reagent (Zymo Research Corp, CA, USA) was added for stabilization and stored at until the nucleic acid extraction. DNA was extracted using Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Kits (Zymo Research Corp, CA, USA), according to the manufacturer’s instructions. The concentration and purity of DNA samples were determined with Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) before sequencing.

Next-generation sequencing was performed by targeting V3-V4 gene regions of the 16 S rRNA. 16 S Universal Eubacterial primers ( 16 S Forward: TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG; 16 S Forward Reverse: GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C) were used for amplification [21, 22]. 2-step PCR was used in the library preparation process. Using KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 25 cycles of PCR were carried out individually (Roche Diagnostics GmBH, Mannheim, Germany). In the first PCR step, the PCR condition was 3 min at , then 30 s at at at for 25 cycles, and finally, a single cycle at for 5 min . In the second PCR application, Nextera XT Index Primer 1 and Nextera XT Index Primer 2 sets (Illumina, CA, USA) were added to the Illumina index and adapter sequences. In this PCR step, the PCR condition was 3 min at at at at for eight cycles, and then a single cycle at for 5 min . The Agencourt AMPure XP kit (Beckman Coulter) was
used to purify the amplicon products following both PCR cycles. PCR products were examined for band presence and relative band intensities on a agarose gel following the PCR procedures. The prepared library was measured with a Qubit fluorometer and sequencing after normalization. Sequencing was performed on an iSeq 100 instrument using an iSeq100i1 Reagent kit (Illumina, San Diego, CA, USA) per the manufacturer’s instructions [21,23,24].

The FastQC program was used for quality control following the sequencing application. Data quantities, read quality, GC distributions, kmer distributions, and potential adapter contaminations of each sample were analyzed in light of the quality control results. After quality control, reads with poor read quality (Phred Quality Score<Q20, window range of 30 bp ) were excluded from all data. Low-quality base reads possible adapter contaminants, and chimeric sequences at the read tips were trimmed based on the Genomes OnLine Database (GOLD) and with the Trimmomatic tool. Reads were aligned to target organisms for taxonomic characterization using the SILVA database [21,25]. OTU groups in each sample were identified after alignment. Data reporting, statistical analysis, and visualization were done using the program and scripts.

The oral cancer lesions from patients were all squamous cell carcinoma. There were no differences in gender and age distribution between healthy individuals and patients with oral cavity cancers (Table 1). History of smoking, alcohol consumption, and smoking habits were also not significantly different between groups. Family history of cancer and educational level significantly differed between patients and controls ( ). All healthy controls reported more than 8 years of education ( ).

As shown in Table 2, all the patients in this study rated their oral health as good. Oral cavity cancer patients perceived more signs of gingival bleeding and gum swelling and redness ( ). Healthy controls performed more tooth-brushing ( ) and used dental floss/interdental brush ( ) than oral cavity cancer patients. All oral cavity cancer patients reported a history of periodontal disease ( ).

Direct assessment of oral health demonstrated that the patients with oral cavity cancers suffered from poor oral

health (higher PI, GI, BOP%, PD, CAL, GR) in comparison to healthy controls (Table 3, ). Oral examination revealed that all the oral cavity cancer patients had swelling and gingival bleeding. All patients had an active or a history

of periodontal disease, and 2 of 10 wore partial removable dental prostheses.

Figure 1 demonstrates the most abundant bacterial phyla and genera and the alterations of the abundances in these taxa among oral cavity cancer patients and healthy controls. Figure 2 shows the most prevalent bacterial genus and species in oral cancer patients and healthy controls.

There were 31 phyla in total, with 5 of these dominating in all samples: Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, and Fusobacteria, with the remaining 26 phyla having a relative abundance of less than . In the control samples, there was a dominance of Firmicutes (44.9%), Bacteroidetes (13.5%), Proteobacteria (23.1%), Actinobacteria (13.3%), and Fusobacteria (2.7%). In contrast, in the oral cavity cancer samples, Proteobacteria (4.1%) was decreased, Firmicutes (59.2%), Bacteroidetes (14.2%), Actinobacteria (17.2%) and Fusobacteria (3.2%) were elevated. Cyanobacteria increased approximately eight times in the cancer group compared to the healthy

control group. Aggregatibacter, Haemophilus, and Neisseria, which are the members of Proteobacteria, decreased
in the patient group in parallel with the total decrease in the phylum. Fusobacterium, a member of the phylum of Fusobacteria, Lactobacillus, and Gemella, a member of Firmicutes, increased in the patient group in parallel with the phylum. The bacterial genus with the highest rate in the patient and control groups was Streptococcus, followed by Rothia, Prevotella, and Veionella. While Streptococcus was found in of the healthy controls, of the patients with oral cancer had Streptococcus. While the Rothia was 6% in the controls, its presence doubled (12%) in the patient group. Likewise, Peptosteptococcus, Tannerella, and Lactobacillus were higher in the oral cavity cancer group. Prevotella was detected in of controls, while only of the patients were positive. Veillonella was found at an average rate of in the controls; its presence decreased to in the patient group.

At the species level, Porphyromonas gingivalis increased 6.5 times in oral cavity cancer patients. Gemella haemolysans was significantly higher in the oral cancer patients, while Corynebacterium durum, Lachnoanaerobaculum umeaens, Neisseria subflava, Actinomyces massiliensis, and Veillonella dispar were significantly lower ( ). Alterations in the amount of the most abundant 40 bacterial species in oral cavity cancer patients and the control groups are shown in Fig. 3. F. nucleatum was elevated 2.8 -fold, and A. actinomycetemcomitans declined 1.3-fold compared to the healthy controls.

Fig. 2 The most prevalent bacterial genus and species. Panel demonstrates the changes in the amount of the most abundant 40 bacterial genera in oral cavity cancer patients and the control groups. Panel

B shows the first 30 species with the highest incidence according to metagenomic analysis obtained from both oral cavity cancer patients and the controls in each sample (H: Patients, C: Control)

The effects of smoking habits and alcohol consumption on oral microbiota are shown in Fig. 4. The data for abundances were given as supplementary tables. At the genus level, while Neisseria, Haemophilus, Peptococcus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium, Aggregatibacter, Prevotella, Veillonella, Campylobacter, and Bulleidia were lower, Actinomyces, Atopobium and Lautropia were increased in smokers. At the species level, the abundance of Haemophilus parainfluenzae, Saccharibacteria genera incertae sedis, Rikenellaceae
bacterium, Gemella palaticanis, Rothia aeria, Prevotella saccharolytica, Prevotella maculosa, Fusobacterium periodonticum, Prevotella bryantii, Porphyromonas pasteri, Prevotella shahii, Treponema socranskii, Cardiobacterium hominis, Aggregatibacter aphrophilus, Dialister pneumosintes, Veillonella rogosae, Haemophilus sputorum, Neisseria elongata species were found to be significantly lower in smokers ( ).

Alcohol consumption changed the oral microbiota in oral cancer. At the genus level, Neisseria, Haemophilus, Eikenella, Kingella, Aggregatibacter, Prevotella, Veillonella, and Campylobacter were lower, while Actinomyces,

Bulleidia, and Cardiobacterium were more abundant in alcohol consumers. In particular, members of the Proteobacteria family, Aggregatibacter was 67-fold lower, Neisseria was 15-fold lower, and Haemophilus was 4-fold lower in alcohol consumers. At the species level, Fusobacterium periodonticum, Prevotella bryantii, Gemella palaticanis, Prevotella maculosa, Porphyromonas pasteri, Prevotella scopos, Aggregatibacter aphrophilus, Kingella oralis, Prevotella veroralis, and Haemophilus sputorum were significantly higher in non-consumers compared to alcohol consumers ( ).

As shown in Fig. 5, the most abundant 10 species in oral cavity cancer patients who have daily tooth-brushing habits were (in ranking order) Rothia mucilaginosa, Streptococcus sinensis, Porphyromonas pasteri, Parvimonas micra, Peptostreptococcus stomatis, Granulicatella adiacens, Gemella
haemolysans, Gemella morbillorum, Actinomyces odontolyticus, Streptococcus sanguinis, respectively. In patients who did not have daily tooth-brushing habits, the most abundant 10 species were Rothia mucilaginosa, Prevotella melaninogenica, Granulicatella adiacens, Actinomyces odontolyticus, Porphyromonas pasteri, Staphylococcus devriesei, Streptococcus gordonii, Streptococcus sinensis, Prevotella jejuni, Streptococcus sanguinis, respectively. In brushing and non-brushing patients with oral cancer, Rothia mucilaginosa was the most abundant species; it was 3.2fold higher in participants with daily tooth brushing habits. In patients with daily oral care, Gemella morbillorum, Parvimonas micra, Gemella haemolysans, and Peptostreptococcus stomatis levels were increased by , and 2.3 fold, respectively. Staphylococcus devriesei and Prevotella jejuni were 10.000 – and 100 -fold higher, respectively, in patients who did not have daily tooth brushing habits. Prevotella melaninogenica, Streptococcus sinensis, and Streptococcus gordonii were increased at the species level.

Major periodontopathogens, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, and Tannerella forsythia, were detected 70, 4, and 2-fold higher, respectively, in those who did not have daily tooth-brushing habits, suggesting a periodontal disease-associated shift in dysbiosis in oral cancer. Another major periodontopathogen, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, was also not detected in those who brush their teeth daily. Among orange complex bacteria, Fusobacterium nucleatum was found 4 times less in those who brush their teeth daily compared to those who do not brush their teeth daily. Prevotella intermedia was not detected in those who brush their teeth daily; the levels of Lachnoanaerobaculum umeaense, Prevotella bryantii, Fretibacterium fastidiosum, Porphyromonas endodontalis, Prevotella shahii, Catonella morbi, Prevotella veroralis, Porphyromonas catoniae, Prevotella pallens, and Saccharibacteria genera incertae sedis were found significantly lower. In contrast, Rothia amarae levels were significantly higher in those with daily tooth brushing habits than those without. While the levels of Corynebacterium durum, Neisseria subflava, and Lachnoanaerobaculum umeaense were significantly higher in individuals using partial dental prosthesis compared to dentate individuals, Gemella haemolysans was significantly lower ( ).

This study was designed to test the hypothesis that oral microbiota dysbiosis was associated with oral cavity cancer. In patients with primary oral cavity cancer who met the inclusion and exclusion criteria, oral health data were collected, and the oral microbiome was characterized by nextgeneration sequencing. The results showed that the patients with oral cavity cancers had poorer oral health than healthy controls. Genus and species-specific differences supported a dysbiotic oral microbiome associated with oral cancer, with periodontopathogens dominating the samples. Collectively, these data suggested that patients with oral cancer had a distinct oral microbiome composition that is affected by personal daily habits and may be associated with the pathogenicity of the disease.

The human oral microbiome is the second-most numerous microbiota in the human body, with more than 700 species. Because the oral microbiome influences metabolic and immunological responses, bacterial dysbiosis has been linked to local and systemic illnesses, including their role in malignancies [9, 26]. Since cancer staging is crucial in oncotherapeutic planning, early detection may alter the course of treatment, survival rates, and quality of life. However, no reliable biomarkers for early diagnosing oral cavity malignancies are currently available, where detection
of oral microbial shifts may also serve as predictors of oncopathogenesis. Therefore, oral microbiota composition and specific species in patients with oral cavity cancer can provide a non-invasive diagnostic technique for oral cavity cancers [3, 26].

Oral health is associated with inflammatory changes in the oral cavity. To assess the oral health of our patients with oral cancer, we used both self-reported and direct professional measures of diseases. The data demonstrated that periodontal and, in general, oral health was poor in oral cancer patients compared to the healthy controls, which is in line with previous reports where of cancer patients had advanced periodontal disease and periodontal pockets deeper than 6 millimeters [15, 27]. These findings support the premise that periodontal disease may be a risk factor for oral cavity cancer [6, 28-30], where poorer oral health was linked to a greater risk of cancers of the head, neck, and esophagus [31]. Several studies use self-reported measures to determine oral health status, which can be misleading [32]. In our study, oral cavity cancer patients stated that they had good oral health while they had more signs of gingival bleeding, swelling, and redness. The self-reported data, therefore, are subjective. Indeed, a study showed that all cancer patients brushed their teeth up to twice daily, but most have advanced periodontal disease [27]. To validate the self-reported data, we used specific oral health indicators such as , and GR , which were recorded by a periodontist. This approach allowed us to accurately link oral health, oral cancer, and oral microbiota, demonstrating that poor oral health was associated with increased periodontal disease in patients with oral cancer, in line with a previous study suggesting poor oral hygiene as a predictor of oral cancer [33]. Likewise, our data support the previous findings where a history of periodontitis was associated with oral squamous cell carcinoma and increased head and neck cancer risk [34, 35].

Our data presented many novel microbial signatures associated with oral cancers where specific microbial genera may be potential markers for oral cavity malignancies. The most abundant were Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, and Fusobacteria. While Streptococcus and Rothia increased in the cancer group, Prevotella and Veillonella decreased. Some of these findings align with previous reports where genus-level profiles showed that Streptococcus and Prevotella dominated all samples, Lactobacillus was abundant, and Haemophilus, Neisseria, Gemellaceae, Rothia, and Aggregatibacter decreased in saliva [3]’ [26]. In contrast to our findings, however, these previous studies demonstrated a decrease in the Streptococcus genus, possibly due to patient population-specific variations that need further study. Likewise, we demonstrated an increased
abundance of Rothia in oral cavity cancer patients, contrasting with these previous reports [3]. .

Our data also demonstrate mechanistic and pathogenetic insights. One of our most important observations was that there were 6.5- and 2.7-fold P. gingivalis and F. nucleatum in the oral microbiota of patients with oral cavity cancer compared to controls. Since P. gingivalis and F. nucleatum can generate inflammation, cell proliferation, and cellular invasion in OSCC through several routes [36], their carcinogenic potential may be critical for oral cavity cancers through the production of interleukin-6, tumor necrosis factor- , matrix metalloproteinases, reduced apoptosis, and regulation of the p53 tumor suppressor gene. To this end, F. nucleatum can specifically promote cell proliferation and increase interleukins and other MMPs that affect the progression of tumor invasion and metastasis, potentially resulting in increased oncogene and pro-inflammatory cytokine transcriptional activity [12, 37]. Indeed, F. nucleatum can be a risk factor for a variety of malignancies, including tumors of the oral cavity through a persistent infection, the interaction of cell surface molecules with the immune system and stromal cells, immune evasion, and immunological suppression and virulence factors such as FadA, Fap2, LPS, all of which linked to transforming epithelial cells into tumor cells [38].

Beyond association, the link between specific periodontopathogens and oral cancers is unclear. Mechanistically, inter-species associations may shed light on this puzzle where NGS can be a valuable tool to identify potential pathological consequences of bacteria-bacteria interactions. Our data in a highly defined cohort provided compelling evidence for such mechanistic insights. To this end, one of the bacteria reported to be strongly associated with the tumor site of oral cavity tumors is Gemella haemolysans [39]. We found that G. haemolysans was significantly elevated in the oral microbiota of oral cavity cancer patients compared to the healthy controls. Higher levels of G. haemolysans and Gemella parahaemolysans were recently linked to oral lichen planus, which is a risk factor for oral cancers [40]. Meanwhile, P. gingivalis colonization was 6.5 times higher in the oral microbiota of cancer patients compared to the healthy controls in this study. The underlying mechanism for P. gingivalis, despite being regarded as a significant etiological agent in oral cavity malignancies, is unknown [41]. . In contrast to the situation in cancer, G. haemolysans decreases the oral microbiota of periodontitis patients and inhibits P.gingivalis by secreting protein components in vitro [42]. In the context of oral cancers, however, the interspecies association between G. haemolysans and P.gingivalis may be reversed, suggesting a different microenvironment for microbial interactions. Metatranscriptomic analyses are required to identify these mechanistic interactions in detail.

Poor oral hygiene, poor nutrition, and wearing dental prostheses were associated with an increased risk of oral cancer in some studies [4, 6, 15]. However, the mechanism for poor oral hygiene making individuals susceptible to oral cavity cancer and the role of bacterial dysbiosis in the emergence of oral cancer has not been shown yet. Oral microbiota analysis revealed that Rothia mucilaginosa is the most abundant bacterial species found in oral cavity cancer patients regardless of their daily tooth brushing habits. . mucilaginosa was found to be 3.2 -fold less in the ones who do not brush their teeth daily, which is in line with previous studies [3]’ [43], suggesting that tooth brushing may play a role in preventing the severity of oral cavity cancers. Since Rothia spp. is known to produce enterobactin, which is the most potent iron-binding siderophore known among the siderophores, this finding may provide therapeutic insights of adding siderophore molecules to the cancer treatment to reduce cancer cell access to the iron molecules [44, 45].

Our results revealed the enrichment of P. jejuni and . melaninogenica in the participants with poor oral hygiene habits, suggesting the potential contribution of these species to oral cavity cancer in line with a previous report [46]. In addition to such species, we defined novel bacteria in patients with oral cancer. For example, Staphylococcus devriesei was 10.000-fold higher in patients who did not have daily tooth brushing habits. This Staphylococcus species was described in 2010 in teat apices and milk of dairy cows [47] and from cases of bovine IMIs in South Africa in 2018 [48]. Ours is the first study that identified S. devriesei from a human specimen, suggesting a potential link to oral health in oral cancer.

Smoking and alcohol are independent risk factors for head and neck malignancies and carcinogens that cause DNA damage and incorrect DNA repair . Additionally, their impact on changing the oral microbiome was previously reported, implying that smoking facilitated the early acquisition and colonization of pathogens in oral biofilms [49], [50]’ [51]. However, the link between smoking and oral microbiome in oral cancers is not that clear. We found that Neisseria, Haemophilus, Peptococcus, Eikenella, Kingella, Cardiobacterium, Lautropia, Prevotella, Veillonella, Campylobacter, Bulleidia, and Aggregatibacter decreased, and Actinomyces and Atopobium increased in smokers. In particular, Aggregatibacter and Haemophilus decreased 100 and 50 -fold in smokers, respectively. At the species level, Rothia aeria and Haemophilus parainfluenzae were significantly reduced in smokers. Fusobacterium periodonticum and Porphyromonas pasteri, associated with a healthy oral microbiome, were significantly lower in smokers ( ) [52]. Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, and Neisseria elongata, which are members of Proteobacteria, were significantly lower in the samples obtained from
smokers. Lower levels of Proteobacteria were associated with the development of oral cancers, collectively suggesting that smoking, a key risk factor for many cancers, may affect the levels of some species, resulting in the development of oral cancer.

Alcohol consumption was also positively associated with dysbiosis in oral cancers in parallel with the decrease of the members of the oral microbiota, such as Neisseria and Haemophilus, in infections that seem to affect the immune system, such as COVID-19 [53]. A similar shift was seen for Lactobacillales, Actinomyces, Leptotrichia, and Cardiobac-terium- the genera enriched in people who consumed more alcohol. This also provides an important mechanistic insight because Neisseria can convert ethanol into the human carcinogen acetaldehyde, suggesting high Neisseria levels may be associated with carcinogenesis [54]. A recent study revealed a negative correlation between the abundance of Neisseria in saliva and ACH production. Even though Neisseria species are the main producers of ACH in vitro, the salivary microbiota profile with a lower relative abundance of these species was independently linked to high ACH production ability, demonstrating the importance of the interplay of oral microbiome [52]. In our study, Actinomyces and Cardiobacterium levels increased from %4 to %7 in alcohol consumers, similar to a previous work [54]. However, Neisseria levels decreased 15 -fold with alcohol consumption. In addition to Neisseria, alcohol consumers had 67 times lower Aggregatibacter levels and 4 times lower Haemophilus levels, which are members of Proteobacteria as well.

The sample size was the main limitation of our study. However, this was due to strict inclusion and exclusion criteria, which allowed us to determine significant and highly relevant alterations of oral microbiota in cancer cases in a well-defined cohort. As opposed to other association studies, oral cancers cannot be longitudinally assessed by definition as they are removed upon diagnosis. In addition, there is a paucity of knowledge in this field where studies examining the oral microbiome in oral cancer patients are limited. Needless to add, it is not trivial to characterize oral cancer patients, collect samples, and perform next-generation sequencing, which is one of the key reasons these studies are limited. Therefore, our work addressed this gap in knowledge. More controls can be added to dissect the role of periodontitis and other forms of periodontal disease in the pathogenesis of oral cancers. We, therefore, refrained from making any bold statements suggesting such a link since periodontal disease not only includes microbial but also inflammatory factors that may change the course of oral cancers. What was measured in our work was the collective association of the entire oral microbiome with the presence of oral cancer. Therefore, this observation overrides the sitespecific impact of periodontal inflammation. Nevertheless,
our study demonstrated that several microbial species, including major microorganisms that are well-linked to periodontitis, were also associated with oral cancers. We intentionally did not choose to compare our patients in this study to a group of patients with periodontitis because the goal of the study was not to elucidate the role of periodontitis. Our unbiased approach allowed us to identify microbial species that are associated with oral cancers compared to those without any oral cancer. Since none of the control subjects had periodontal diseases (as mentioned in Table 2), we demonstrated a clear association between oral cancers and specific microbial species of the oral cavity, some of which were linked to periodontal disease. The results demonstrated that even in the absence of periodontitis, bacterial species that play a role in periodontal disease were associated with oral cancer, which posits a fascinating question: Are periodontopathogens only limited to periodontal diseases in their impact, or do their effects go beyond the cause and severity of periodontitis? While this question was beyond the scope of this work, our ongoing studies will be focused on this topic. Whether dysbiosis is a cause or consequence of the malignancy is yet to be determined; however, the interspecies associations that we demonstrated are critical for understanding the pathobiology of oral cancers and the role of oral microbiome.

Our data suggested that patients with oral cancer had worse oral health conditions and a distinct oral microbiome composition that is affected by personal daily habits and may be associated with the pathogenicity of the disease. Improved oral hygiene and treatment of periodontal disease may help limit the development or spread of oral cancer. While the results prevent us from making any further mechanistic claims due to the study’s cross-sectional design, the findings provide a basis for future studies that would test the role of oral microbial dysbiosis in oral cancer.

Supplementary Information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1007/s00784-024-05770-8.

Author contributions Ozge Unlu: Conceptualization; Data curation; Formal analysis; Funding acquisition; Investigation; Methodology; Project administration; Resources; Software; Validation; Visualization; Roles/Writing – original draft; Writing – review & editing. Mehmet Demirci: Conceptualization; Data curation; Formal analysis; Investigation; Methodology; Software; Roles/Writing – original draft; Writing – review & editing. Aysegul Dalmizrak: Investigation; Methodology, Roles/Writing – original draft; Writing – review & editing. Cagdas Aktan: Investigation; Methodology, Roles/Writing – original draft; Writing – review & editing. Arzu Baygul Eden: Data curation, Formal analysis; Methodology; Software; Writing – review & editing.

Tugce Paksoy: Formal analysis; Investigation; Methodology; Software; Roles/Writing – original draft; Writing – review & editing. Firdevs Senel: Formal analysis; Supervision; Validation; Writing – review & editing. Hasan Deniz Tansuker: Investigation; Methodology; Resources; Software; Writing – review & editing. Ahmet Volkan Sunter: Investigation; Methodology; Resources; Software; Writing – review & editing. Ozgur Yigit: Formal analysis; Supervision; Resources; Validation; Writing – review & editing. Burak Omur Cakir: Formal analysis; Supervision; Resources; Validation; Writing – review & editing. Alpdogan Kantarci: Formal analysis; Supervision; Validation; Writing – review & editing.

Funding This research has been supported by the Beykent University Scientific Research Projects Coordination Unit. Project Number: 2018-2019-BAP-02, 2018.
Open access funding provided by the Scientific and Technological Research Council of Türkiye (TÜBİTAK).

Data availability No datasets were generated or analysed during the current study.

Compliance with ethical standards Experiments involving human tissues were conducted according to the approval of the Helsinki Committee of the Istanbul Research and Training Hospital (approval number: 2017/11/09-1109).

Consent to participate Informed consent was obtained from all individual participants included in the study.

Competing interests The authors declare no competing interests.

Disclosure No competing financial interests exist.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons. org/licenses/by/4.0/.

Publisher’s Note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.