DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-56992-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39948084
تاريخ النشر: 2025-02-13
المؤلف: Jin Li وآخرون
الموضوع الرئيسي: التخطيط الجيني والتنوع في النباتات والحيوانات
طرق
في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون سلسلة من تقنيات الاستنساخ الجزيئي لبناء متجهات جينية متنوعة تهدف إلى تعديل تعبير جينات معينة في الأرز. قاموا بتصميم متجهات CRISPR/Cas9 تستهدف تسلسلات الترميز (CDSs) للجينات CTB3 و OsTCP19، موصلين تسلسلات مستهدفة بطول 20 زوج قاعدي إلى متجه pHUE411. لدراسات الإفراط في التعبير، تم تضخيم CDS الكامل لـ CTB3 من cDNA لنوع Nipponbare (Nip) و 9311 وإدخاله في متجه pCM1307، بينما تم الحصول على CDS لـ OsTCP19 بنفس الطريقة من Nip وتم توصيله إلى متجه pSuper1300-GFP. بالإضافة إلى ذلك، تم استنساخ CDS الكامل لـ OsTPP1 في متجه pSuper1300-MYC.
لإنشاء خطوط مكملة لـ CTB3، قام المؤلفون بتضخيم منطقة المحفز بطول 2.5 كيلو بايت من Nip وربطها مع CDS الكامل في متجه pCM163. ثم تم إدخال هذه البلازميدات في سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 عبر التحويل. شملت المواد المعدلة وراثيًا الناتجة خطوط knockout وoverexpression لـ CTB3 و OsTCP19 في خلفية Nip، وخطوط knockout لـ OsTCP19 وoverexpression لـ OsTPP1-MYC في خلفية CTB3-cr1، وخطوط مكملة لـ CTB3 في خلفية Teqing. علاوة على ذلك، تم الحصول على طفرات knockout لـ OsTPP1 (tpp1-1، tpp1-2) ونوع Dongjing البري (DJ) من البروفيسور جيان زانغ، بينما تم تحديد قطع CTB3-Hap1 من خطوط هجين معاد تركيبها مشتقة من أصناف الأرز المقاومة للبرد والحساسة للبرد، والتي تم إعادة تهجينها لاحقًا لتوليد خطوط قريبة من الإيزوجينية (NILs).
النتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب أو التحليلات التي تم إجراؤها. يبرز النتائج المهمة التي تدعم الفرضيات أو أسئلة البحث المطروحة سابقًا في الدراسة. عادةً ما تكون النتائج مصحوبة ببيانات إحصائية ذات صلة، أو رسوم بيانية، أو جداول توضح العلاقات أو الأنماط الملاحظة في البيانات.
في هذا القسم، قد يقوم المؤلفون بالإبلاغ عن فعالية التدخلات، أو العلاقة بين المتغيرات، أو التحقق من النماذج النظرية. غالبًا ما يتم وضع النتائج في سياق الأدبيات الحالية، مما يبرز مساهمتها في المجال والآثار المحتملة للبحث المستقبلي أو التطبيقات العملية. بشكل عام، توفر النتائج أساسًا حاسمًا للاستنتاجات المستخلصة في الأقسام اللاحقة من الورقة.
المناقشة
تحدد الدراسة الجين CTB3 كمنظم رئيسي لتحمل البرد في الأرز خلال مرحلة الإزهار. من خلال تحرير الجينات باستخدام CRISPR/Cas9، تم إنشاء طفرات knockout للجينات المرشحة Os01g0923600 و Os01g0923800، مما يكشف أن Os01g0923600 (المعينة CTB3) تؤثر بشكل كبير على معدلات وضع البذور تحت ظروف إجهاد البرد. أظهرت تحليل الأنماط الوراثية أن CTB3-Hap1، الموجود بشكل رئيسي في الأرز الياباني، يظهر تحملًا أفضل للبرد مقارنةً بـ CTB3-Hap2، الذي هو أكثر شيوعًا في الأرز الهندي. أظهرت التجارب الإضافية أن الإفراط في التعبير عن CTB3 يعزز تحمل البرد، بينما أظهرت الطفرات knockout انخفاضًا في الخصوبة وتطور الأنتير تحت إجهاد البرد.
بالإضافة إلى ذلك، تكشف الدراسة أن CTB3 ينظم مباشرة تعبير OsTPP1، وهو جين يشارك في استقلاب التريهالوز، وهو أمر حاسم لنقل السكر وتوفير الطاقة خلال إجهاد البرد. تم ربط وجود إدخالات محددة في محفز CTB3 بتباينات في تحمل البرد بين أصناف الأرز. تم تحديد عامل النسخ OsTCP19 كمنظم سلبي لـ CTB3، مما يشير إلى شبكة تنظيمية معقدة حيث يتوسط CTB3 تحمل البرد من خلال تعديل استقلاب السكر وتطور حبوب اللقاح. تشير النتائج إلى أن CTB3 قد خضع لاختيار إيجابي خلال تدجين الأرز الياباني المعتدل، مما يبرز أهميته التكيفية في البيئات الباردة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-56992-7
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39948084
Publication Date: 2025-02-13
Author(s): Jin Li et al.
Primary Topic: Genetic Mapping and Diversity in Plants and Animals
Methods
In this study, the authors employed a series of molecular cloning techniques to construct various genetic vectors aimed at manipulating the expression of specific genes in rice. They designed CRISPR/Cas9 vectors targeting the coding sequences (CDSs) of the genes CTB3 and OsTCP19, ligating 20-bp target sequences into the pHUE411 vector. For overexpression studies, the full-length CDS of CTB3 was amplified from Nipponbare (Nip) and 9311 cDNA and inserted into the pCM1307 vector, while the CDS of OsTCP19 was similarly obtained from Nip and ligated into the pSuper1300-GFP vector. Additionally, the full-length CDS of OsTPP1 was cloned into the pSuper1300-MYC vector.
To create complementary lines for CTB3, the authors amplified the 2.5-kb promoter region from Nip and ligated it with the full-length CDS into the pCM163 vector. These plasmids were then introduced into Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 via transformation. The resulting transgenic materials included knockout and overexpression lines for CTB3 and OsTCP19 in the Nip background, OsTCP19 knockout and OsTPP1-MYC overexpression lines in the CTB3-cr1 background, and CTB3 complementary lines in the Teqing background. Furthermore, OsTPP1-knockout mutants (tpp1-1, tpp1-2) and wild-type Dongjing (DJ) were sourced from Prof. Jian Zhang, while CTB3-Hap1 fragments were identified from recombinant inbred lines derived from cold-tolerant and cold-sensitive rice varieties, subsequently backcrossed to generate near-isogenic lines (NILs).
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments or analyses. It highlights the significant outcomes that support the hypotheses or research questions posed earlier in the study. The results are typically accompanied by relevant statistical data, graphs, or tables that illustrate the relationships or patterns observed in the data.
In this section, the authors may report on the effectiveness of interventions, the correlation between variables, or the validation of theoretical models. The findings are often contextualized within the existing literature, emphasizing their contribution to the field and potential implications for future research or practical applications. Overall, the results provide a critical foundation for the conclusions drawn in subsequent sections of the paper.
Discussion
The research identifies the gene CTB3 as a key regulator of cold tolerance in rice during the booting stage. Through CRISPR/Cas9 gene editing, knockout mutants of the candidate genes Os01g0923600 and Os01g0923800 were created, revealing that Os01g0923600 (designated CTB3) significantly influences seed setting rates under cold stress conditions. Haplotype analysis indicated that CTB3-Hap1, predominantly found in japonica rice, exhibits superior cold tolerance compared to CTB3-Hap2, which is more common in indica rice. Further experiments demonstrated that overexpression of CTB3 enhances cold tolerance, while knockout mutants displayed reduced fertility and anther development under cold stress.
Additionally, the study reveals that CTB3 directly regulates the expression of OsTPP1, a gene involved in trehalose metabolism, which is crucial for sugar transport and energy supply during cold stress. The presence of specific indels in the CTB3 promoter was linked to variations in cold tolerance among rice accessions. The transcription factor OsTCP19 was identified as a negative regulator of CTB3, suggesting a complex regulatory network where CTB3 mediates cold tolerance by modulating sugar metabolism and pollen development. The findings indicate that CTB3 has undergone positive selection during the domestication of temperate japonica rice, highlighting its adaptive significance in cold environments.