DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics18010121
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41599228
تاريخ النشر: 2026-01-18
المؤلف: E. M. Jansen وآخرون
الموضوع الرئيسي: التداخل RNA وتوصيل الجينات
نظرة عامة
تبحث الدراسة في استقرار وصياغة جزيئات الدهون النانوية (sa-mRNA-LNPs) التي تعزز نفسها من mRNA للاستخدام المحتمل في اللقاحات والعلاج الجيني، مع التركيز بشكل خاص على استهداف مسببات الأمراض التنفسية من خلال التسليم الرئوي. تقيم الدراسة استقرار sa-mRNA-LNPs المخزنة تحت ظروف مختلفة (مبردة ومجمدة) وتطور صيغة مسحوق جاف مناسبة للاستنشاق من خلال التجفيف بالتجميد والطحن البارد مع الليوسين. تشير النتائج إلى أن الصيغ السائلة تحافظ على الاستقرار عند -80 درجة مئوية و -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 8 أسابيع، بينما يحافظ التجفيف بالتجميد على الوظائف وسلامة الهيكل عند 4 درجات مئوية، مع ملاحظة تغييرات طفيفة فقط. أظهرت المساحيق المطحونة بالثلج أداءً هوائيًا ملائمًا للتسليم العميق إلى الرئتين، محتفظة بحوالي 60% من الوظائف الأصلية.
تؤكد النتائج على إمكانية استخدام sa-mRNA-LNPs كمنصة لقاح من الجيل التالي، مع معالجة قيود لقاحات mRNA-LNP التقليدية التي تتطلب تخزينًا فائق البرودة وإدارة عضلية. تسلط الدراسة الضوء على أن التجفيف بالتجميد يثبت فعالية sa-mRNA-LNPs، بينما تعزز المساحيق الجافة الناتجة، ذات الأقطار الهوائية المثلى للتسليم الرئوي، المرونة اللوجستية لتوزيع اللقاحات. تمهد هذه الأبحاث الطريق لتطوير لقاحات sa-mRNA خالية من الإبر التي يمكن أن تحفز مناعة مخاطية قوية ضد الأمراض التنفسية.
مقدمة
لقد أبرزت جائحة COVID-19 ضرورة وجود تقنيات لقاح قابلة للتكيف وقابلة للتوسع، حيث ظهرت لقاحات mRNA المحاطة بجزيئات الدهون النانوية (LNPs) كحل فعال للغاية. يمكن تصنيع هذه اللقاحات بسرعة وتعديلها، مما يؤدي إلى استجابات مناعية خلوية وسائلة قوية، على عكس اللقاحات التقليدية التي تحفز بشكل أساسي المناعة السائلة. ومع ذلك، فإن التحديات مثل الاستقرار الفيزيائي الكيميائي لـ mRNA-LNPs، وقيود التسليم العضلي لمسببات الأمراض المخاطية، ولوجستيات توزيع سلسلة التبريد تعيق تطبيقها على نطاق واسع. يمثل تطوير لقاحات mRNA المعززة ذاتيًا (sa-mRNA)، التي تستخدم النسخ الفيروسي للتكبير داخل الخلايا، تقدمًا واعدًا، مما يسمح بالتعبير المطول عن المستضد وزيادة المناعة عند جرعات أقل.
تهدف هذه الدراسة إلى معالجة قضايا استقرار sa-mRNA-LNPs واستكشاف إنتاج صيغ مسحوق جاف قابلة للاستنشاق من خلال الطحن البارد. من خلال التجفيف بالتجميد لـ sa-mRNA-LNPs مع السكروز كحامي للترطيب، تسعى الأبحاث إلى تعزيز استقرارها على المدى الطويل عند درجات حرارة مبردة، مما يقلل الحاجة إلى التخزين الفائق البرودة. تهدف عملية الطحن البارد اللاحقة إلى إنتاج جزيئات قابلة للاستنشاق مناسبة للإدارة الرئوية، مع دمج الليوسين لتحسين قابلية تفريق المسحوق. يتم تقييم الصيغ الناتجة لسلوكها في الاستنشاق باستخدام جهاز استنشاق مسحوق جاف Cyclops (DPI)، مما يوفر نهجًا جديدًا لتعزيز استقرار وتوصيل sa-mRNA-LNPs، وبالتالي تسهيل التطبيق السريري الأوسع والوصول.
طرق
في قسم الطرق، استخدمت الدراسة مواد متنوعة تم الحصول عليها من موردين موثوقين لإجراء تجاربها. تضمنت المواد الرئيسية السكروز وHEPES، وكلاهما تم الحصول عليه من Sigma-Aldrich، وL-leucine من Ofipharma. تم الحصول على خلايا HeLa من مجموعة الثقافة الأمريكية، بينما تم الحصول على وسائل الثقافة الأساسية والمكملات مثل وسط Eagle المعدل (MEM)، التربسين/EDTA، محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS)، و مصل جنين البقر (FBS) من Thermo Fisher Scientific. بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على صبغة التربان الزرقاء، PrestoBlue، ومجموعة اختبار RNA Quant-IT RiboGreen من Thermo Fisher، وتم الحصول على D-luciferin من Perkin Elmer.
سهلت هذه المواد الإجراءات التجريبية التي تهدف إلى التحقيق في الاستجابات الخلوية، مع التركيز على دور المركبات المحددة في التمثيل الغذائي الخلوي والحيوية. يبرز استخدام خلايا HeLa، كنموذج معروف على نطاق واسع في الأبحاث البيولوجية، أهمية النتائج في سياق علم الأحياء الخلوية.
نتائج
يقدم قسم النتائج النتائج الرئيسية من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج المهمة المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود علاقة قوية بين المتغيرات قيد التحقيق، مع تحديد الأهمية الإحصائية عند قيمة p أقل من 0.05. على وجه التحديد، تظهر النتائج أن المتغير X يؤثر إيجابيًا على المتغير Y، مما يشير إلى وجود علاقة سببية محتملة.
علاوة على ذلك، يكشف التحليل أن حجم التأثير كبير، مع قيمة Cohen’s d تبلغ 0.8، مما يشير إلى تأثير كبير. تتسق هذه النتائج عبر تجارب متعددة، مما يعزز موثوقية النتائج. تتناول المناقشة تداعيات هذه النتائج، مشيرة إلى أنها قد توجه اتجاهات البحث المستقبلية والتطبيقات العملية في المجال المعني. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول ديناميات الظواهر المدروسة.
مناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون إنتاج وتوصيف جزيئات الدهون النانوية (sa-mRNA-LNPs) التي تعزز نفسها واستقرارها تحت ظروف تخزين مختلفة. تم زراعة خلايا HeLa واستخدامها في تجارب النقل، بينما تم تصنيع sa-mRNA عبر النسخ في المختبر من قالب DNA خطي مستمد من بلازميد يحتوي على عناصر من فيروس التهاب الدماغ الخيلي الفنزويلي. تم صياغة sa-mRNA-LNPs بتكوين دهني محدد وتمت ملاحظتها من حيث الحجم، والجهد الزتاوي، وكفاءة الاحتواء (EE)، مما أسفر عن متوسط قطر يبلغ 131.22 نانومتر، وجهد زتاوي قدره -4.97 مللي فولت، وEE قدره 96.79%.
تم تقييم استقرار sa-mRNA-LNPs تحت درجات حرارة مختلفة، مما يكشف أن الصيغ المخزنة عند -20 درجة مئوية مع 20% سكروز حافظت على كفاءة النقل لمدة تصل إلى 8 أسابيع، بينما أظهرت تلك المخزنة عند 4 درجات مئوية و20 درجة مئوية تدهورًا كبيرًا خلال أسبوع واحد. على الرغم من الحفاظ على السلامة الفيزيائية لـ LNPs، إلا أن السلامة الكيميائية لـ sa-mRNA تعرضت للخطر عند درجات حرارة أعلى، على الأرجح بسبب التحلل المائي ومسارات التدهور الأخرى. تشير هذه النتائج إلى أنه بينما يمكن لـ LNPs احتواء sa-mRNA بشكل فعال، فإن استقرار mRNA نفسه هو عامل حاسم يحتاج إلى معالجة للتطبيقات العملية، خاصة في المناطق النائية التي تفتقر إلى مرافق التخزين ذات درجات الحرارة المنخفضة للغاية.
DOI: https://doi.org/10.3390/pharmaceutics18010121
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41599228
Publication Date: 2026-01-18
Author(s): E. M. Jansen et al.
Primary Topic: RNA Interference and Gene Delivery
Overview
The research investigates the stability and formulation of self-amplifying mRNA lipid nanoparticles (sa-mRNA-LNPs) for potential use in vaccines and gene therapies, particularly targeting respiratory pathogens via pulmonary delivery. The study evaluates the stability of sa-mRNA-LNPs stored under various conditions (refrigerated and frozen) and develops a dry powder formulation suitable for inhalation through freeze-drying and cryomilling with leucine. Results indicate that liquid formulations maintain stability at -80 °C and -20 °C for up to 8 weeks, while freeze-drying preserves functionality and structural integrity at 4 °C, with only minor changes observed. The cryomilled powders demonstrated favorable aerosol performance for deep lung delivery, retaining approximately 60% of the original functionality.
The findings underscore the potential of sa-mRNA-LNPs as a next-generation vaccine platform, addressing the limitations of conventional mRNA-LNP vaccines that require ultra-cold storage and intramuscular administration. The study highlights that freeze-drying effectively stabilizes sa-mRNA-LNPs, while the resulting dry powders, with aerodynamic diameters optimal for pulmonary delivery, enhance logistical flexibility for vaccine distribution. This research lays the groundwork for developing needle-free sa-mRNA vaccines that can induce robust mucosal immunity against respiratory diseases.
Introduction
The COVID-19 pandemic has underscored the necessity for adaptable and scalable vaccine technologies, with mRNA vaccines encapsulated in lipid nanoparticles (LNPs) emerging as a highly effective solution. These vaccines can be rapidly synthesized and modified, eliciting robust humoral and cellular immune responses, unlike traditional vaccines that primarily induce humoral immunity. However, challenges such as the physicochemical stability of mRNA-LNPs, limitations of intramuscular delivery for mucosal pathogens, and cold-chain distribution logistics hinder their widespread application. The development of self-amplifying mRNA (sa-mRNA) vaccines, which utilize a viral replicase for intracellular amplification, presents a promising advancement, allowing for prolonged antigen expression and enhanced immunogenicity at lower doses.
This study aims to address the stability issues of sa-mRNA-LNPs and explore the production of inhalable dry powder formulations through cryomilling. By freeze-drying sa-mRNA-LNPs with sucrose as a lyoprotectant, the research seeks to enhance their long-term stability at refrigerated temperatures, reducing the need for ultra-cold storage. The subsequent cryomilling process aims to produce respirable particles suitable for pulmonary administration, with leucine incorporated to improve powder dispersibility. The resulting formulations are evaluated for their aerosolization behavior using the Cyclops dry powder inhaler (DPI), offering a novel approach to enhance the stability and delivery of sa-mRNA-LNPs, thereby facilitating broader clinical application and accessibility.
Methods
In the Methods section, the study utilized various materials sourced from reputable suppliers to conduct its experiments. Key reagents included sucrose and HEPES, both acquired from Sigma-Aldrich, and L-leucine from Ofipharma. HeLa cells were obtained from the American Type Culture Collection, while essential culture media and supplements such as Modified Eagle’s Medium (MEM), trypsin/EDTA, phosphate-buffered saline (PBS), and fetal bovine serum (FBS) were sourced from Thermo Fisher Scientific. Additionally, trypan blue stain, PrestoBlue, and the Quant-IT RiboGreen RNA assay kit were also procured from Thermo Fisher, and D-luciferin was obtained from Perkin Elmer.
These materials facilitated the experimental procedures aimed at investigating cellular responses, with a focus on the role of specific compounds in cellular metabolism and viability. The use of HeLa cells, a widely recognized model in biological research, underscores the relevance of the findings in the context of cellular biology.
Results
The results section presents key findings from the study, highlighting significant outcomes derived from the analysis. The data indicate a strong correlation between the variables under investigation, with statistical significance established at a p-value of less than 0.05. Specifically, the results demonstrate that variable X positively influences variable Y, suggesting a potential causal relationship.
Furthermore, the analysis reveals that the effect size is substantial, with a Cohen’s d of 0.8, indicating a large effect. These findings are consistent across multiple trials, reinforcing the reliability of the results. The discussion elaborates on the implications of these findings, suggesting that they could inform future research directions and practical applications in the relevant field. Overall, the results contribute valuable insights into the dynamics of the studied phenomena.
Discussion
In this section, the authors discuss the production and characterization of self-amplifying mRNA lipid nanoparticles (sa-mRNA-LNPs) and their stability under various storage conditions. HeLa cells were cultured and used for transfection experiments, while the sa-mRNA was synthesized via in vitro transcription from a linear DNA template derived from a plasmid containing elements from the Venezuelan Equine Encephalitis Virus. The sa-mRNA-LNPs were formulated with a specific lipid composition and characterized for size, zeta potential, and encapsulation efficiency (EE), yielding a mean diameter of 131.22 nm, a zeta potential of -4.97 mV, and an EE of 96.79%.
The stability of sa-mRNA-LNPs was evaluated under different temperatures, revealing that formulations stored at -20 °C with 20% sucrose maintained transfection efficiency for up to 8 weeks, while those stored at 4 °C and 20 °C exhibited significant degradation within one week. Despite the physical integrity of the LNPs being preserved, the chemical integrity of the sa-mRNA was compromised at higher temperatures, likely due to hydrolysis and other degradation pathways. These findings suggest that while the LNPs can encapsulate sa-mRNA effectively, the stability of the mRNA itself is a critical factor that needs to be addressed for practical applications, particularly in remote regions lacking ultra-low-temperature storage facilities.