DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2024.100524
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38346379
تاريخ النشر: 2024-02-06
المؤلف: Alistair Antonopoulos وآخرون
الموضوع الرئيسي: عدوى الديدان الطفيلية والسيطرة عليها
نظرة عامة
في هذه الدراسة، تم تحديد متغير S168T من وحدة مستقبل الأستيل كولين ACR-8 كعامل رئيسي في مقاومة اللفاميزول في الديدان الطفيلية Haemonchus contortus. باستخدام نظام التعبير عن البيض من نوع Xenopus laevis جنبًا إلى جنب مع تقنيات قياس الجهد الكهربائي باستخدام قطبين، أظهر الباحثون أن متغير S168T يقلل بشكل كبير من سعة التيار الناتج عن اللفاميزول مقارنة بالأستيل كولين، مما يغير فعليًا دور اللفاميزول من كونه منبهًا كاملًا إلى منبه جزئي عند مستقبل الأستيل كولين الحساس لللفاميزول L-AChR-1.1. تؤكد هذه التحقق الوظيفي على الدور الحاسم للمتغير في كل من الآلية وتحديد مقاومة اللفاميزول.
تشير النتائج إلى أن وحدة ACR-8 S168T يمكن أن تحل محل ACR-8 من النوع البري لتشكيل مستقبل وظيفي، مما يعكس عدم حساسية اللفاميزول الملحوظة في C. elegans، التي تمتلك ثريونين في الموضع المقابل. بالإضافة إلى ذلك، تشير وجود متغير S168T في ACR-8 المقاوم لللفاميزول في T. circumcincta إلى آلية مقاومة محفوظة عبر أنواع مختلفة من التريخوسترونغيلد. بشكل عام، تؤسس هذه الأبحاث متغير S168T في ACR-8 كعامل محوري في مقاومة اللفاميزول في الطفيليات المتأثرة، مما يعزز الفهم للأسس الجزيئية والجينية لهذه الظاهرة المقاومة.
مقدمة
تناقش المقدمة استخدام اللفاميزول (LEV)، وهو مضاد طفيليات واسع الطيف، في علاج العدوى الطفيلية في كل من السياقات البيطرية والبشرية. يعمل LEV كمنبه كولينيرجي، حيث يرتبط بمستقبلات الأستيل كولين الحساسة لللفاميزول (L-AChRs) في الديدان الأسطوانية، مما يؤدي إلى شلل تشنجي وطرد الطفيلي. لقد حددت خصائص هذه المستقبلات، وخاصة في Haemonchus contortus، أنواعًا فرعية مختلفة، حيث تعتبر وحدة ACR-8 حاسمة لحساسية LEV.
لقد حددت الدراسات الجينية الحديثة تعدد أشكال النوكليوتيد المفرد غير المرادف (SNP) في جين acr-8، وتحديدًا استبدال سيرين بثريونين (S168T)، والذي يرتبط بمقاومة LEV عبر عدة تجمعات من H. contortus. يبدو أن هذه الطفرة تمثل علامة على المقاومة، حيث يتم العثور عليها باستمرار في السلالات المقاومة ولكنها غائبة في السلالات الحساسة. تسلط المقدمة الضوء على الحاجة إلى التحقيق في الآثار الوظيفية لطفرات S168T، والتي تهدف هذه الدراسة إلى معالجتها باستخدام نظام التعبير عن Xenopus laevis لتحليل تأثيرها على استجابة L-AChR لـ LEV.
طرق
يستعرض قسم “الطرق” المواد والمنهجيات المستخدمة في البحث. يوضح المواد المحددة المستخدمة في التجارب، بما في ذلك مصادرها وعمليات التحضير. بالإضافة إلى ذلك، يصف القسم تصميم التجربة، بما في ذلك اختيار الموضوعات، وتدابير التحكم، والبروتوكولات المتبعة لضمان قابلية التكرار وموثوقية النتائج.
تُفصل المنهجيات بشكل أكبر، مع تسليط الضوء على التقنيات التحليلية والأدوات الإحصائية المستخدمة لجمع البيانات وتحليلها. يشمل ذلك أي نماذج رياضية أو معادلات تم تطبيقها لتفسير النتائج، مما يضمن أن البحث يتماشى مع المعايير العلمية الصارمة. بشكل عام، يوفر القسم نظرة شاملة على الإطار الإجرائي الذي يدعم استنتاجات الدراسة.
نتائج
في هذه الدراسة، تم التحقيق في التأثير الوظيفي لطفرات S168T على مستقبل الأستيل كولين (AChR) من *Haemonchus contortus* باستخدام البيض من نوع Xenopus. أنتجت وحدة ACR-8 من النوع البري قنوات وظيفية بقيم EC50 للأستيل كولين (ACh) واللفاميزول (LEV) تبلغ 4.2 ± 1.1 ميكرومول و3.2 ± 1.1 ميكرومول، على التوالي، مع عمل LEV كمنبه فائق. بالمقابل، أدى متغير S168T إلى قنوات أظهرت تيارات مخفضة بشكل كبير استجابةً لـ LEV (39.5 ± 3.1% من استجابة ACh، p < 0.001)، مما يشير إلى أن LEV يعمل كمنبه جزئي لهذا المتغير. كانت قيم EC50 لـ ACh وLEV في القنوات التي تحتوي على S168T 7.1 ± 1.1 ميكرومول و6.8 ± 1.3 ميكرومول، على التوالي، وكلاهما أعلى بشكل كبير من تلك الخاصة بـ ACR-8 من النوع البري (p < 0.001). عند حقن cRNAs لكل من S168T وACR-8 من النوع البري بنسبة 1:1، انخفض متوسط التيار استجابةً لـ 100 ميكرومول ACh إلى 57.0 ± 1.7% من استجابة النوع البري (p < 0.001). بينما لم يُلاحظ فرق كبير في قيم EC50 لـ LEV بين المستقبلات المختلطة وتلك من النوع البري، لوحظ فرق كبير في قيم EC50 لـ ACh (5.3 ± 1.1 ميكرومول للمختلطة مقابل 4.2 ± 1.1 ميكرومول للنوع البري، p = 0.048). تشير هذه النتائج إلى أن متغير S168T قد يقلل قليلاً من القابلية لـ LEV في الديدان الهجينة، مما قد يهدد وظيفة المستقبل، على الرغم من الحاجة إلى مزيد من التحقق من خلال النقل الجيني في *H. contortus* لتأكيد هذه النتائج.
مناقشة
في هذه الدراسة، نجح المؤلفون في استنساخ متغير acr-8 S168T من العزلة المقاومة متعددة الأدوية *Haemonchus contortus* MHco18 وعبروا عنه في البيض من نوع *Xenopus laevis* للتحقيق في خصائصه الوظيفية. تم تضخيم الجين acr-8 الكامل، واستنساخه في ناقل TOPO2.1، ثم تم استنساخه لاحقًا في ناقل النسخ لتخليق cRNA. أظهرت التجارب الكهربية أن متغير S168T يمكن أن يحل محل وحدة ACR-8 من النوع البري، مما يغير عمل اللفاميزول (LEV) من منبه كامل إلى منبه جزئي.
تشير النتائج إلى أن متغير S168T يساهم في مقاومة LEV، مما يتماشى مع الملاحظات السابقة في *Caenorhabditis elegans* و*Teladorsagia circumcincta*، حيث كانت الطفرات المماثلة مرتبطة بانخفاض الحساسية لـ LEV. تسلط هذه الأبحاث الضوء على إمكانية أن يعمل متغير S168T كآلية محفوظة للمقاومة عبر أنواع مختلفة من التريخوسترونغيلد، مما يعزز الفهم للأسس الجزيئية والجينية لمقاومة LEV في الديدان الطفيلية.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2024.100524
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38346379
Publication Date: 2024-02-06
Author(s): Alistair Antonopoulos et al.
Primary Topic: Helminth infection and control
Overview
In this study, the S168T variant of the acetylcholine receptor subunit ACR-8 was identified as a key factor in levamisole resistance in the parasitic helminth Haemonchus contortus. Utilizing the Xenopus laevis oocyte expression system alongside two-electrode voltage-clamp electrophysiology, the researchers demonstrated that the S168T variant significantly diminished the current amplitude induced by levamisole compared to acetylcholine, effectively altering levamisole’s role from a full agonist to a partial agonist at the levamisole-sensitive acetylcholine receptor L-AChR-1.1. This functional validation underscores the variant’s critical role in both the mechanism and identification of levamisole resistance.
The findings indicate that the S168T ACR-8 subunit can replace the wild-type ACR-8 to form a functional receptor, mirroring the levamisole insensitivity observed in C. elegans, which possesses a threonine at the corresponding position. Additionally, the presence of the S168T variant in the levamisole-resistant ACR-8 of T. circumcincta suggests a conserved mechanism of resistance across various trichostrongylid species. Overall, this research establishes the S168T variant in ACR-8 as a pivotal contributor to levamisole resistance in affected parasites, advancing the understanding of the molecular and genetic underpinnings of this resistance phenomenon.
Introduction
The introduction discusses the use of levamisole (LEV), a broad-spectrum anthelmintic, in treating helminth infections in both veterinary and human contexts. LEV acts as a cholinergic agonist, binding to levamisole-sensitive acetylcholine receptors (L-AChRs) in nematodes, leading to spastic paralysis and expulsion of the parasite. The characterization of these receptors, particularly in Haemonchus contortus, has identified various subtypes, with the ACR-8 subunit being crucial for LEV sensitivity.
Recent genetic studies have identified a non-synonymous single nucleotide polymorphism (SNP) in the acr-8 gene, specifically a serine-to-threonine substitution (S168T), which is associated with LEV resistance across multiple populations of H. contortus. This mutation appears to be a marker for resistance, as it is consistently found in resistant strains but absent in sensitive ones. The introduction highlights the need to investigate the functional implications of the S168T mutation, which this study aims to address using the Xenopus laevis expression system to analyze its impact on the L-AChR’s response to LEV.
Methods
The “Methods” section outlines the materials and methodologies employed in the research. It details the specific materials used for experimentation, including their sources and preparation processes. Additionally, the section describes the experimental design, including the selection of subjects, control measures, and the protocols followed to ensure reproducibility and reliability of results.
The methodologies are further elaborated upon, highlighting the analytical techniques and statistical tools utilized for data collection and analysis. This includes any mathematical models or equations applied to interpret the findings, ensuring that the research adheres to rigorous scientific standards. Overall, the section provides a comprehensive overview of the procedural framework that underpins the study’s conclusions.
Results
In this study, the functional impact of the S168T mutation on the acetylcholine receptor (AChR) from *Haemonchus contortus* was investigated using Xenopus oocytes. The wild-type ACR-8 subunit produced functional channels with acetylcholine (ACh) and levamisole (LEV) EC50 values of 4.2 ± 1.1 μM and 3.2 ± 1.1 μM, respectively, with LEV acting as a superagonist. In contrast, the S168T variant resulted in channels that exhibited significantly reduced currents in response to LEV (39.5 ± 3.1% of ACh response, p < 0.001), indicating that LEV functions as a partial agonist for this variant. The EC50 values for ACh and LEV in channels containing S168T were 7.1 ± 1.1 μM and 6.8 ± 1.3 μM, respectively, both significantly higher than those for wild-type ACR-8 (p < 0.001). When cRNAs for both S168T and wild-type ACR-8 were co-injected at a 1:1 ratio, the average current in response to 100 μM ACh decreased to 57.0 ± 1.7% of the wild-type response (p < 0.001). While no significant difference was observed in the LEV EC50 values between the mixed and wild-type receptors, a significant difference was noted in the ACh EC50 values (5.3 ± 1.1 μM for mixed vs. 4.2 ± 1.1 μM for wild-type, p = 0.048). These results suggest that the S168T variant may slightly reduce susceptibility to LEV in heterozygous worms, potentially compromising receptor function, although further validation through transgenesis in *H. contortus* is necessary to confirm these findings.
Discussion
In this study, the authors successfully cloned the acr-8 S168T variant from the multi-drug resistant *Haemonchus contortus* isolate MHco18 and expressed it in *Xenopus laevis* oocytes to investigate its functional properties. The full-length acr-8 gene was amplified, cloned into a TOPO2.1 vector, and subsequently subcloned into a transcription vector for cRNA synthesis. Electrophysiological experiments demonstrated that the S168T variant can substitute for the wild-type ACR-8 subunit, altering the action of levamisole (LEV) from a full agonist to a partial agonist.
The findings indicate that the S168T variant contributes to LEV resistance, aligning with previous observations in *Caenorhabditis elegans* and *Teladorsagia circumcincta*, where similar mutations were associated with reduced sensitivity to LEV. This research highlights the potential for the S168T variant to serve as a conserved mechanism of resistance across different trichostrongylid species, thereby advancing the understanding of the molecular and genetic underpinnings of LEV resistance in parasitic nematodes.