DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-55739-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39747160
تاريخ النشر: 2025-01-02
المؤلف: Jiawei Ge وآخرون
الموضوع الرئيسي: هندسة التمثيل الغذائي الميكروبي والإنتاج الحيوي
طرق
في هذه الدراسة، تم الحصول على مواد ومركبات متنوعة من موردين موثوقين، بما في ذلك TCI وAdamas-beta Ltd. وSangon Biotech Ltd. تم استخدام جينات وبلازميدات محددة، بما في ذلك جين bte من *U. californica* وجين NADH kinase POS5 من *S. cerevisiae* S288C، من بين آخرين. تم تحسين هذه المكونات الجينية من حيث الشيفرة الحيوية وتم تصنيعها لتسهيل أهداف البحث. بالإضافة إلى ذلك، تم توفير البلازميدات بسخاء من قبل المتعاونين من الأكاديمية الصينية للعلوم والجامعة الوطنية في سنغافورة.
تضمنت الطرق التحليلية المستخدمة لت quantifying ω-AmDDA وω-OHDDA وα,ω-DCA الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) باستخدام نظام Shimadzu LC-20AT مع بروتوكول إيلاء محدد. لت quantification DDA المتبقية، تم تحميض العينات واستخراجها باستخدام تيرت-ميثيل بوتيل إيثر، تلاها تحويل وكروماتوغرافيا الغاز (GC) التحليل. كما شملت الدراسة طرقًا لتقييم توزيع DDA داخل الخلايا وقياس مستويات NADP(H) وNAD(H) وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) باستخدام مجموعات اختبار متاحة تجاريًا، مع الالتزام ببروتوكولات الشركات المصنعة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود علاقة كبيرة بين المتغيرات المستقلة والنتائج الملاحظة، حيث كشفت التحليلات الإحصائية عن قيم p أقل من 0.05، مما يشير إلى وجود دليل قوي ضد الفرضية الصفرية.
بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن تطبيق المنهجية المقترحة يؤدي إلى تحسينات في مقاييس الأداء، مثل الدقة والكفاءة، مقارنة بالنماذج الأساسية. ومن الجدير بالذكر أن النتائج موضحة من خلال أشكال وجداول متنوعة، والتي توفر تمثيلًا بصريًا واضحًا للاتجاهات والعلاقات التي تم تحديدها في الدراسة. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في الجسم المعرفي القائم وتؤكد فعالية النهج المقترح في معالجة الأسئلة البحثية المطروحة.
نقاش
تناقش البحث تطوير مسار تخليقي جديد لإنتاج حمض ω-أمينودوديكانيك (ω-AmDDA) من الجلوكوز في سلالات *E. coli* المهندسة. في البداية، تم تحسين السلالة B1-1 عن طريق حذف جين fadD لمنع تحلل حمض الدوديكانيك (DDA) ودمج جين alkL لتعزيز استيراد DDA. أدى إدخال ثيوستراز (BTE) إلى إنتاج DDA، والذي تم تحويله بعد ذلك إلى ω-AmDDA باستخدام سلسلة إنزيمات متعددة. أنتجت السلالة المحسنة 27.5 ملغ/لتر من ω-AmDDA، وهو أقل بكثير من العائد من الخلايا المستريحة (1.04 غ/لتر)، مما يشير إلى تحديات في التوازن الأيضي وإمكانية الوصول إلى الركيزة.
شملت التحسينات الإضافية استبدال الكحول ديهيدروجيناز المعتمد على الزنك بنسخة غير معتمدة على الزنك (AlkJ)، مما حسن إنتاج ω-AmDDA إلى 48.1 ملغ/لتر. أدت التعديلات الإضافية، مثل دمج وحدات لتخليق الأحماض الدهنية وتحسين إمدادات العوامل المساعدة، إلى تحقيق أقصى عائد قدره 471.5 ملغ/لتر من ω-AmDDA. تبرز الدراسة أهمية موازنة إمدادات DDA والتحويل، ومعالجة الأعباء الأيضية، وتعزيز نشاط الإنزيم من خلال هندسة البروتين لتحقيق تخليق حيوي فعال لـ ω-AmDDA، مما يضعه كمسار مستدام لإنتاج مونومر النايلون 12.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-55739-0
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39747160
Publication Date: 2025-01-02
Author(s): Jiawei Ge et al.
Primary Topic: Microbial Metabolic Engineering and Bioproduction
Methods
In this study, various materials and reagents were sourced from reputable suppliers, including TCI, Adamas-beta Ltd., and Sangon Biotech Ltd. Specific genes and plasmids were utilized, including the bte gene from *U. californica* and the NADH kinase gene POS5 from *S. cerevisiae* S288C, among others. These genetic components were codon-optimized and synthesized to facilitate the research objectives. Additionally, plasmids were generously provided by collaborators from the Chinese Academy of Sciences and the National University of Singapore.
Analytical methods employed for quantifying ω-AmDDA, ω-OHDDA, and α,ω-DCA involved high-performance liquid chromatography (HPLC) using a Shimadzu LC-20AT system with a specific gradient elution protocol. For residual DDA quantification, samples were acidified and extracted with tert-methyl butyl ether, followed by derivatization and gas chromatography (GC) analysis. The study also included methods for assessing the distribution of DDA within cells and the measurement of NADP(H), NAD(H) levels, and reactive oxygen species (ROS) using commercially available assay kits, adhering to the manufacturers’ protocols.
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicate a significant correlation between the independent variables and the observed outcomes, with statistical analyses revealing p-values less than 0.05, suggesting strong evidence against the null hypothesis.
Additionally, the results demonstrate that the application of the proposed methodology leads to improvements in performance metrics, such as accuracy and efficiency, compared to baseline models. Notably, the results are illustrated through various figures and tables, which provide a clear visual representation of the trends and relationships identified in the study. Overall, these findings contribute to the existing body of knowledge and underscore the effectiveness of the proposed approach in addressing the research questions posed.
Discussion
The research discusses the development of a de novo synthetic pathway for the production of ω-aminododecanoic acid (ω-AmDDA) from glucose in engineered *E. coli* strains. Initially, the strain B1-1 was optimized by deleting the fadD gene to prevent dodecanoic acid (DDA) degradation and integrating the alkL gene to enhance DDA import. The introduction of a thioesterase (BTE) led to the production of DDA, which was then converted to ω-AmDDA using a multi-enzyme cascade. The optimized strain produced 27.5 mg/L of ω-AmDDA, significantly lower than the yield from resting cells (1.04 g/L), indicating challenges in metabolic balance and substrate accessibility.
Further enhancements included replacing the zinc-dependent alcohol dehydrogenase with a zinc-independent variant (AlkJ), which improved ω-AmDDA production to 48.1 mg/L. Additional modifications, such as integrating modules for fatty acid synthesis and optimizing cofactor supply, led to a maximum yield of 471.5 mg/L of ω-AmDDA. The study highlights the importance of balancing DDA supply and conversion, addressing metabolic burdens, and enhancing enzyme activity through protein engineering to achieve efficient biosynthesis of ω-AmDDA, positioning it as a sustainable route for nylon 12 monomer production.