DOI: https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117758
تاريخ النشر: 2024-05-15
المؤلف: Honorine Lardeux وآخرون
الموضوع الرئيسي: الكيمياء التحليلية والكروماتوغرافيا
نظرة عامة
تناقش المراجعة التقدمات الكبيرة في استخدام كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء المرتبطة بمطيافية الكتلة (HILIC-MS) لتحليل الأوليغونيوكليوتيدات العلاجية (ONs). منذ عام 2018، وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على 14 دواءً من الأدوية الأوليغونيوكليوتيدية، مما يبرز الحاجة الملحة لطرق تحليلية قوية. بينما تظل كروماتوغرافيا السائل العكسي مع تزاوج الأيونات (IP-RPLC) هي المعيار الذهبي، ظهرت HILIC كبديل قابل للتطبيق. تؤكد المراجعة على أهمية تحسين ظروف الكروماتوغرافيا، بما في ذلك آليات الاحتفاظ التي تتأثر بخصائص ON مثل طول السلسلة والتعديلات الكيميائية.
علاوة على ذلك، يتم تسليط الضوء على تطوير أجهزة HILIC غير النشطة حيوياً كأمر أساسي لمنع مشاكل مثل الامتصاص، وتلاشي القمة، وفقدان الحساسية. لقد أظهرت تحسينات منهجية في الظروف لتعزيز التأين السالب وضبط معلمات مطيافية الكتلة وعدًا في تحسين أداء HILIC-MS. على الرغم من أن IP-RPLC-MS تقدم حاليًا حساسية أعلى، إلا أن التقدم في التكنولوجيا، بما في ذلك التصغير، قد يعزز من قدرات HILIC-MS. بشكل عام، توضح المراجعة الأهمية المتزايدة لـ HILIC-MS في التطبيقات الصيدلانية والتحليلية الحيوية لتوصيف ON، مما يضعها كبديل تنافسي للطرق التقليدية.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على الأهمية المتزايدة للأوليغونيوكليوتيدات (ONs) كعوامل علاجية، خاصة في استهداف البروتينات المسببة للأمراض وتعديل التعبير الجيني للاضطرابات الوراثية التي لم يكن بالإمكان علاجها سابقًا. منذ أول موافقة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على دواء أوليغونيوكليوتيدي في عام 1998، كان هناك زيادة ملحوظة في الموافقات، حيث تم اعتماد 20 دواءً، 14 منها تمت الموافقة عليها منذ عام 2018. تؤكد هذه الزيادة على الاهتمام المتزايد بأشكال مختلفة من ONs، بما في ذلك الأوليغونيوكليوتيدات المضادة (ASOs)، والأحماض النووية الصغيرة المتداخلة (siRNAs)، والأبتاميرات، التي تتراوح عادة من 18 إلى 40 نيوكليوتيد في الطول. لقد دفعت التقدمات في هندسة الجينوم، خاصة من خلال تكنولوجيا CRISPR/Cas9، البحث في ONs الاصطناعية الأكبر، مثل الأحماض النووية الموجهة الفردية (sgRNAs).
يطرح تحليل ONs تحديات فريدة بسبب قطبيتها العالية والعديد من الشحنات السلبية، مما يتطلب طرق تحليلية قوية لتوصيفها. تم تأسيس كروماتوغرافيا السائل العكسي مع تزاوج الأيونات (IP-RPLC) كمعيار ذهبي لتوصيف ON، باستخدام عوامل تزاوج الأيونات لتعزيز الاحتفاظ على مراحل الكروماتوغرافيا الثابتة. بينما يمكن تطبيق كروماتوغرافيا تبادل الأنيونات أيضًا، إلا أنها محدودة بسبب عدم توافقها مع مطيافية الكتلة (MS). لقد اكتسبت كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC) زخمًا كتقنية مكملة لتحليل المركبات المحبة للماء، بما في ذلك ONs، بسبب عدم وجود عوامل تزاوج الأيونات في المرحلة المتحركة. تهدف هذه المراجعة إلى تقييم الحالة الحالية لـ HILIC لتحليل ON، مع التركيز على ONs الاصطناعية وsgRNAs، مع مناقشة سلوكها الكروماتوغرافي، وآليات الاحتفاظ، ودمج HILIC مع MS، إلى جانب التحديات والاتجاهات المستقبلية في هذا المجال المتطور.
مناقشة
تتناول قسم المناقشة في الورقة السلوك الكروماتوغرافي للأوليغونيوكليوتيدات (ONs) في كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC)، وهي تقنية أسسها ألبرت في عام 1990. تتميز HILIC بآلية الاحتفاظ الخاصة بها، التي تنطوي بشكل أساسي على التقسيم المحب للماء بين مرحلة ثابتة قطبية ومرحلة متحركة عضوية عالية، غالبًا ما تهيمن عليها الأسيتونيتريل. بينما يعد التقسيم المحب للماء عاملاً رئيسيًا، يتأثر احتفاظ ONs أيضًا بتفاعلات إضافية، مثل الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الكهروستاتيكية، خاصة عند مستويات مختلفة من الرقم الهيدروجيني للمرحلة المتحركة وقوى الأيونات. تبرز الدراسة أن احتفاظ ONs قد يكون مدفوعًا أكثر بهذه التفاعلات من التقسيم المحب للماء، خاصة عند تحليل ONs بمحتوى مائي يتجاوز 35% في المرحلة المتحركة.
تناقش الورقة أيضًا آثار استخدام تركيبات مختلفة للمرحلة المتحركة وكيمياء الأعمدة على الاحتفاظ والفصل بين ONs. تشير إلى أنه بينما تم استخدام HILIC بنجاح لتحليل ONs، بما في ذلك فصل الشوائب من التخليق الصلب، لا تزال هناك تحديات تتعلق بامتصاص ONs على الأجهزة الكروماتوغرافية، مما قد يؤثر على الحساسية وشكل القمة. يؤكد المؤلفون على أهمية استخدام مواد غير نشطة حيويًا للتخفيف من هذه المشكلات المتعلقة بالامتصاص. بالإضافة إلى ذلك، يتم استكشاف دمج HILIC مع مطيافية الكتلة (MS)، مما يكشف أنه بينما يمكن أن تعزز HILIC بعض جوانب حساسية MS، قد تؤدي أيضًا إلى تقليل الإشارة بسبب ارتباط أيونات القلوي. تختتم القسم بمناقشة التطبيقات الحديثة لـ HILIC لتحليل ON، خاصة في سياق الأوليغونيوكليوتيدات المضادة والتحديات المستمرة في فصل الدياستريوميرات، والتي تعتبر حاسمة لفهم الفعالية الدوائية لـ ONs المعدلة.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.trac.2024.117758
Publication Date: 2024-05-15
Author(s): Honorine Lardeux et al.
Primary Topic: Analytical Chemistry and Chromatography
Overview
The review discusses the significant advancements in the use of hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry (HILIC-MS) for the analysis of therapeutic oligonucleotides (ONs). Since 2018, the FDA has approved 14 ON drugs, underscoring the urgent need for robust analytical methods. While ion-pairing reversed-phase liquid chromatography (IP-RPLC) remains the gold standard, HILIC has emerged as a viable alternative. The review emphasizes the importance of optimizing chromatographic conditions, including the retention mechanisms influenced by ON characteristics such as chain length and chemical modifications.
Furthermore, the development of bioinert HILIC hardware is highlighted as essential to prevent issues like adsorption, peak tailing, and sensitivity loss. The systematic optimization of conditions to enhance negative ionization and fine-tuning of mass spectrometry parameters have shown promise in improving HILIC-MS performance. Although IP-RPLC-MS currently offers superior sensitivity, advancements in technology, including miniaturization, may enhance HILIC-MS capabilities. Overall, the review illustrates HILIC-MS’s growing significance in pharmaceutical and bioanalytical applications for ON characterization, positioning it as a competitive alternative to traditional methods.
Introduction
The introduction highlights the growing significance of oligonucleotides (ONs) as therapeutic agents, particularly in targeting disease-causing proteins and modulating gene expression for previously untreatable genetic disorders. Since the first FDA approval of an ON drug in 1998, there has been a notable increase in approvals, with 20 drugs sanctioned, 14 of which were approved since 2018. This surge underscores the expanding interest in various forms of ONs, including antisense oligonucleotides (ASOs), small interfering RNAs (siRNAs), and aptamers, typically ranging from 18 to 40 nucleotides in length. Advances in genome engineering, particularly through CRISPR/Cas9 technology, have further propelled research into larger synthetic ONs, such as single guide RNAs (sgRNAs).
The analysis of ONs poses unique challenges due to their high polarity and numerous negative charges, necessitating robust analytical methods for their characterization. Ion-pairing reversed-phase liquid chromatography (IP-RPLC) is established as the gold standard for ON characterization, utilizing ion-pairing agents to enhance retention on chromatographic stationary phases. While anion exchange chromatography is also applicable, it is limited by its incompatibility with mass spectrometry (MS). Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) has gained traction as a complementary technique for analyzing hydrophilic compounds, including ONs, due to its absence of ion-pairing agents in the mobile phase. This review aims to assess the current state of HILIC for ON analysis, focusing on synthetic ONs and sgRNAs, while discussing their chromatographic behavior, retention mechanisms, and the integration of HILIC with MS, alongside the challenges and future directions in this evolving field.
Discussion
The discussion section of the paper elaborates on the chromatographic behavior of oligonucleotides (ONs) in Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC), a technique established by Alpert in 1990. HILIC is characterized by its retention mechanism, which primarily involves hydrophilic partitioning between a polar stationary phase and a highly organic mobile phase, typically dominated by acetonitrile. While hydrophilic partitioning is a key factor, the retention of ONs is also influenced by additional interactions, such as hydrogen bonding and electrostatic interactions, particularly at varying mobile phase pH levels and ionic strengths. The study highlights that the retention of ONs is likely driven more by these interactions than by hydrophilic partitioning, especially when analyzing ONs with a water content exceeding 35% in the mobile phase.
The paper further discusses the implications of using different mobile phase compositions and column chemistries on the retention and separation of ONs. It notes that while HILIC has been successfully employed for the analysis of ONs, including the separation of impurities from solid-phase synthesis, challenges remain regarding the adsorption of ONs to chromatographic hardware, which can affect sensitivity and peak shape. The authors emphasize the importance of using bioinert materials to mitigate these adsorption issues. Additionally, the integration of HILIC with mass spectrometry (MS) is explored, revealing that while HILIC can enhance certain aspects of MS sensitivity, it may also lead to reduced signal due to alkali ion adduction. The section concludes by discussing recent applications of HILIC for ON analysis, particularly in the context of antisense oligonucleotides and the ongoing challenges in separating diastereomers, which are critical for understanding the pharmacological efficacy of modified ONs.