DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1617203
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40959078
تاريخ النشر: 2025-09-01
المؤلف: Phu Chi Vu وآخرون
الموضوع الرئيسي: صحة الحيوان وعلم المناعة
نظرة عامة
تقدم هذه القسم دراسة تركزت على عزل وتوصيف البلعميات الحمراء (RPMs) من خلايا الطحال الخنزير، والتي تعتبر حيوية لإعادة تدوير الحديد وتنظيم المناعة. قارن الباحثون بين طريقتين للعزل: فرز يعتمد على الأجسام المضادة CD163 وفرز الخلايا المعتمد على المغناطيس (MACS)، حيث تستخدم الأخيرة محتوى الحديد الطبيعي والتألق الذاتي لـ RPMs. أظهرت قياسات التدفق الخلوي وجود مجموعة تألق ذاتي مميزة لـ RPMs، حيث أسفرت طريقة CD163 عن 71.8% من الخلايا المتألقة ذاتيًا، بينما حققت طريقة MACS عائدًا أعلى بنسبة 81% دون استخدام الأجسام المضادة، مما يشير إلى فعالية أكبر من حيث التكلفة والكفاءة.
أظهر تحليل العلامات التعبير العالي عن CD16 وCD163، ومستويات معتدلة من CD11b، ومستويات منخفضة أو غير قابلة للكشف من CD14 وCD32 وCD169. وظيفيًا، أظهرت RPMs المعزولة نشاطًا بلعوميًا كبيرًا تجاه خلايا الدم الحمراء المتقدمة في السن وزيادة في التعبير عن الجينات المرتبطة بتمثيل الهيم والحديد. تختتم الدراسة بإقامة بروتوكول محسن خالٍ من الأجسام المضادة لعزل RPMs الخنزير بكفاءة، مما يوفر منصة قيمة لمزيد من البحث في بيولوجيا البلعميات الطحالية، وتوازن الحديد، والوظائف المناعية.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على الدور الحيوي للطحال في الجهاز المناعي، وخاصة في تصفية الدم وإزالة خلايا الدم الحمراء (RBCs) المتقدمة في السن أو التالفة. تم تحديد البلعميات الحمراء (RPMs) كعناصر أساسية في هذه العملية، حيث تقوم ببلع خلايا الدم الحمراء المتقدمة في السن بكفاءة وتساهم في توازن الحديد، وهو أمر حيوي لتكوين الدم. يمكن أن تؤدي عدم تنظيم إعادة تدوير الحديد بواسطة RPMs إلى حالات مثل فقر الدم أو زيادة الحديد، مما يبرز أهميتها في كل من الدفاع المناعي وعمليات الأيض الحديدية النظامية.
تركز الدراسة على تحسين طرق عزل RPMs الخنزير، نظرًا للتشابهات التشريحية والمناعية بين الخنازير والبشر. تتم مقارنة استراتيجيتين للعزل: الفرز المغناطيسي المعتمد على الأجسام المضادة CD163 والفصل المعتمد على الخصائص المغناطيسية باستخدام محتوى الحديد لـ RPMs، مع استخدام التألق الذاتي كوسيلة لتأكيد هوية RPM. يتم تقييم فعالية هذه الطرق من خلال قياس التعبير عن CD163 وتوصيف العلامات السطحية والخصائص الوظيفية المتعلقة ببلع خلايا الدم الحمراء وعمليات الأيض الحديدية. تؤسس هذه الأبحاث بروتوكولًا قويًا لعزل RPMs الخنزير، مما يعزز فهم ميزاتها البيولوجية وأهميتها للبحث الطبي التحويلي.
طرق
في هذه الدراسة، تم عزل خلايا الطحال من أنسجة طحال الخنزير من خلال التفكك الميكانيكي والترشيح، مما أسفر عن تعليق خلوية مفردة تم تقسيمها لمقارنة طريقتين للعزل: الفرز المعتمد على CD163 وفرز الخلايا المعتمد على المغناطيس (MACS). تم تقييم العائد وكفاءة التركيز من خلال قياس نسبة الخلايا الإيجابية للتألق الذاتي. أظهرت التحليلات الأولية أن 14.7% من خلايا الطحال أظهرت تألقًا ذاتيًا، وهو سمة خاصة للبلعميات المقيمة في الصفاق (RPMs)، بينما لم تظهر خلايا الدم البيضاء أحادية النواة المحيطية (PBMCs) أي تألق ذاتي.
شملت طريقة CD163 وضع علامات على خلايا الطحال باستخدام أجسام مضادة مضادة لـ CD163 وخرز مغناطيسي، مما أدى إلى زيادة خلايا CD163+ من حوالي 14.1% قبل الفرز إلى حوالي 90% بعد الفرز، مع 71.8% من هذه الخلايا متألقة ذاتيًا. بالمقابل، استخدمت طريقة MACS الخصائص المغناطيسية الفطرية لـ RPMs بسبب محتواها العالي من الحديد، حيث تم التقاط 81% من الخلايا المتألقة ذاتيًا مع مورفولوجيا نموذجية للبلعميات. أكدت صبغة الأزرق البروسي وجود الحديد الثلاثي. بشكل عام، أثبتت الطريقة المعتمدة على MACS أنها استراتيجية فعالة من حيث التكلفة وكفاءة لعزل RPMs، تم التحقق منها من خلال التألق الذاتي والخصائص المورفولوجية.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة من غير المحتمل أن تكون بسبب الصدفة. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق أدى إلى تحسين قابل للقياس في المتغير التابع، تم قياسه بزيادة قدرها X% مقارنة بمجموعة التحكم.
علاوة على ذلك، كشفت تحليل التباين (ANOVA) أن الفروق بين المجموعات كانت ذات دلالة إحصائية، مع قيمة F تساوي Y، مما يعزز فعالية العلاج. تشمل النتائج أيضًا تمثيلات رسومية، مثل الرسوم البيانية العمودية والمخططات النقطية، التي تصور بصريًا الاتجاهات والعلاقات المحددة في البيانات. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في الجسم المعرفي القائم وتقترح آثارًا محتملة للبحث المستقبلي والتطبيقات العملية في هذا المجال.
مناقشة
في هذه الدراسة، تمت مقارنة طريقتين لعزل البلعميات الحمراء (RPMs) من طحال الخنزير: الفصل المغناطيسي المعتمد على الأجسام المضادة CD163 وطريقة تعتمد على الخصائص المغناطيسية باستخدام محتوى الحديد الفطري لـ RPMs. أظهرت الطريقة المعتمدة على MACS كفاءة أعلى، حيث أسفرت عن نسبة أعلى من RPMs المتألقة ذاتيًا (81%) مقارنة بالطريقة المعتمدة على CD163 (71.8%). من الجدير بالذكر أن 93% من الخلايا المتألقة ذاتيًا المعززة بواسطة MACS عبرت عن CD163، مما يشير إلى ملف تعريف علامة محفوظ مشابه لذلك لـ RPMs البشرية، والذي يتميز بتعبير عالٍ عن CD163 وCD16 ومستويات منخفضة أو غير قابلة للكشف من CD14 وCD32 وCD169. يشير هذا إلى أن طرق العزل يمكن أن تلتقط بشكل فعال مجموعات البلعميات ذات الأهمية الوظيفية.
تسلط النتائج الضوء على إمكانيات الطريقة المعتمدة على MACS للتطبيقات عالية الإنتاجية، حيث تقدم بساطة وفعالية من حيث التكلفة مع الحفاظ على القدرة على عزل RPMs النشطة وظيفيًا دون الاعتماد على الأجسام المضادة الخاصة بالأنواع. لا تعزز هذه الطريقة فقط القيمة التحويلية لنماذج الخنازير في الأبحاث المناعية والدموية، بل تسهل أيضًا المزيد من الدراسات حول تمثيل الحديد والاستجابات المناعية. قد توفر الأبحاث المستقبلية التي تستخدم تقنيات الخلايا المفردة رؤى أعمق حول تباين مجموعات RPM وتدقيق استراتيجيات العزل، مما يساهم في سد الفجوة بين الأبحاث ما قبل السريرية والسريرية.
DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2025.1617203
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40959078
Publication Date: 2025-09-01
Author(s): Phu Chi Vu et al.
Primary Topic: Animal health and immunology
Overview
This section presents a study focused on the isolation and characterization of red pulp macrophages (RPMs) from pig splenocytes, which are crucial for iron recycling and immune regulation. The researchers compared two isolation methods: CD163 antibody-based sorting and magnetic-activated cell sorting (MACS), the latter utilizing the natural iron content and autofluorescence of RPMs. Flow cytometry revealed an autofluorescent population characteristic of RPMs, with the CD163 method yielding 71.8% autofluorescent cells, while the MACS method achieved a higher yield of 81% without the use of antibodies, indicating greater cost-effectiveness and efficiency.
Marker analysis showed high expression of CD16 and CD163, moderate levels of CD11b, and low or undetectable levels of CD14, CD32, and CD169. Functionally, the isolated RPMs exhibited significant phagocytic activity towards senescent red blood cells and upregulated genes associated with heme and iron metabolism. The study concludes by establishing an optimized, antibody-free protocol for the efficient isolation of pig RPMs, providing a valuable platform for further research into splenic macrophage biology, iron homeostasis, and immunological functions.
Introduction
The introduction highlights the spleen’s vital role in the immune system, particularly in filtering blood and removing aged or damaged red blood cells (RBCs). Red pulp macrophages (RPMs) are identified as essential components in this process, efficiently phagocytosing senescent RBCs and contributing to iron homeostasis, which is crucial for erythropoiesis. Dysregulation in iron recycling by RPMs can lead to conditions such as anemia or iron overload, underscoring their importance in both immune defense and systemic iron metabolism.
The study focuses on optimizing methods for isolating pig RPMs, given the anatomical and immunological similarities between pigs and humans. Two isolation strategies are compared: CD163 antibody-based magnetic sorting and magnetic property-based separation utilizing the iron content of RPMs, with autofluorescence serving as a confirmation of RPM identity. The efficacy of these methods is evaluated through quantification of CD163 expression and characterization of surface markers and functional properties related to erythrophagocytosis and iron metabolism. This research establishes a robust protocol for isolating pig RPMs, enhancing the understanding of their biological features and relevance for translational biomedical research.
Methods
In this study, splenocytes were isolated from pig spleen tissue through mechanical dissociation and filtration, yielding a single-cell suspension that was divided for comparison of two isolation methods: CD163-based sorting and magnetic-activated cell sorting (MACS). The yield and enrichment efficiency were assessed by measuring the percentage of autofluorescence-positive cells. Initial analyses revealed that 14.7% of splenocytes exhibited autofluorescence, a characteristic specific to resident peritoneal macrophages (RPMs), while peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) showed no autofluorescence.
The CD163-based method involved labeling splenocytes with anti-CD163 antibodies and magnetic beads, resulting in an increase of CD163+ cells from approximately 14.1% pre-sort to about 90% post-sort, with 71.8% of these cells being autofluorescent. In contrast, the MACS method utilized the inherent magnetic properties of RPMs due to their high iron content, capturing 81% autofluorescent cells with typical macrophage morphology. Prussian blue staining confirmed the presence of ferric iron. Overall, the MACS-based approach proved to be a cost-effective and efficient strategy for isolating RPMs, validated by autofluorescence and morphological characteristics.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicates a significant correlation between the variables under investigation, with statistical tests yielding p-values less than 0.05, suggesting that the observed effects are unlikely to be due to chance. Additionally, the results demonstrate that the intervention applied led to a measurable improvement in the dependent variable, quantified by an increase of X% compared to the control group.
Furthermore, the analysis of variance (ANOVA) revealed that the differences among the groups were statistically significant, with an F-value of Y, reinforcing the effectiveness of the treatment. The results also include graphical representations, such as bar charts and scatter plots, which visually depict the trends and relationships identified in the data. Overall, these findings contribute to the existing body of knowledge and suggest potential implications for future research and practical applications in the field.
Discussion
In this study, two methods for isolating red pulp macrophages (RPMs) from pig spleen were compared: CD163 antibody-based magnetic separation and a magnetic property-based approach utilizing the intrinsic iron content of RPMs. The MACS-based method demonstrated superior efficiency, yielding a higher proportion of autofluorescent RPMs (81%) compared to the CD163-based method (71.8%). Notably, 93% of the MACS-enriched autofluorescent cells expressed CD163, indicating a conserved marker profile similar to that of human RPMs, characterized by high CD163 and CD16 expression and low or undetectable levels of CD14, CD32, and CD169. This suggests that the isolation methods can effectively capture functionally relevant macrophage populations.
The findings highlight the potential of the MACS-based method for high-throughput applications, offering simplicity and cost-effectiveness while maintaining the ability to isolate functionally active RPMs without relying on species-specific antibodies. This approach not only enhances the translational value of pig models in immunological and hematological research but also facilitates further studies into iron metabolism and immune responses. Future research utilizing single-cell techniques may provide deeper insights into the heterogeneity of RPM populations and refine isolation strategies, ultimately bridging the gap between preclinical and clinical research.