DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013135
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40493646
تاريخ النشر: 2025-06-10
المؤلف: Marissa L. Ledger وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم الأمراض القديمة والأمراض القديمة
نظرة عامة
تقيّم هذه الدراسة نهجًا متعدد الطرق في علم الطفيليات القديمة، يدمج بين المجهرية، واختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، وتحليل الحمض النووي القديم الرسوبي (sedaDNA) لتعزيز الكشف وإعادة بناء تنوع الطفيليات في السكان التاريخيين. من خلال تحليل 26 عينة من حوالي 6400 قبل الميلاد إلى 1500 ميلادي، كانت الأبحاث تهدف إلى مقارنة تنوع الطفيليات عبر فترات زمنية مختلفة، مع التركيز بشكل خاص على الإمبراطورية الرومانية. تشير النتائج إلى أن المجهرية كانت الطريقة الأكثر فعالية لتحديد بيض الديدان، حيث كشفت عن ثمانية أنواع، بينما أثبتت ELISA أنها الأكثر حساسية للكشف عن الأوليات، وخاصة *Giardia duodenalis*.
من الجدير بالذكر أنه تم استرداد الحمض النووي للطفيليات بنجاح من تسع عينات، ولم يتم العثور على أي حمض نووي في المواقع ما قبل الرومانية. كشف تحليل الحمض النووي الرسوبي عن وجود دودة السوط في موقع حيث كان يظهر فقط دودة مستديرة من خلال المجهرية، وحدد نوعين من دودة السوط (*Trichuris trichiura* و *Trichuris muris*) في موقع آخر. تشير النتائج إلى أن النهج متعدد الطرق يوفر فهمًا أكثر شمولاً لتنوع الطفيليات، مما يبرز تحولًا في الفترة ما قبل الرومانية يتميز بمزيج من الطفيليات الحيوانية ودودة السوط، والتي ترتبط بسوء الصرف الصحي. بالمقابل، أظهرت الفترات الرومانية والوسطى زيادة ملحوظة في الطفيليات المرتبطة بممارسات الصرف الصحي غير الفعالة، وخاصة الدودة المستديرة، ودودة السوط، والأوليات المسببة للإسهال.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على الأهمية المتزايدة للحمض النووي القديم (aDNA) في دراسة مسببات الأمراض البشرية القديمة، مما عزز فهمنا للأوبئة التاريخية والمسارات التطورية لمختلف الكائنات الدقيقة. بينما تركز الدراسات التقليدية للحمض النووي القديم بشكل أساسي على بقايا الهياكل العظمية، فإنها غالبًا ما تتجاهل الطفيليات، التي ساهمت تاريخيًا بشكل كبير في أعباء الأمراض. يؤكد المؤلفون على أن البراز القديم، أو المادة البرازية المحفوظة، يعد مصدرًا حيويًا لاسترداد الحمض النووي من مسببات الأمراض المعوية، بما في ذلك البكتيريا والطفيليات والفيروسات، مما يوفر رؤى حول صحة الإنسان الماضية وديناميات الأمراض.
تقترح الورقة نهجًا متعدد الطرق في علم الطفيليات القديمة يدمج تقنيات استخراج sedaDNA مع المجهرية واختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لاسترداد الطفيليات القديمة من عينات الرواسب المرتبطة بالمادة البرازية، مثل المراحيض والفضلات. يهدف هذا النهج إلى تعزيز فهم تنوع الطفيليات في أوروبا وشرق البحر الأبيض المتوسط خلال الإمبراطورية الرومانية، وكذلك في الفترات ما قبل وبعد الرومانية. من خلال استخدام طرق إثراء مستهدفة تزيد بشكل كبير من استرداد الحمض النووي القديم، تسعى الدراسة إلى تقديم استرداد تصنيفي أكثر شمولاً للطفيليات التي تصيب البشر، كاشفة عن اتجاهات ملحوظة في عدوى الطفيليات وتحولات في الأنواع السائدة خلال الفترة الرومانية.
طرق البحث
في هذه الدراسة، قمنا بتحليل الرواسب الأثرية من سياقات بشرية متنوعة، بما في ذلك ملء المراحيض، وملء المجاري، والفضلات، والتربة الحوضية من الهياكل العظمية، تمتد من العصر الحجري الحديث (حوالي 6400 قبل الميلاد) إلى الفترة الوسطى (حوالي 1500 ميلادي) عبر 14 موقعًا داخل الإمبراطورية الرومانية السابقة. تم فحص ما مجموعه 26 عينة، مع التركيز على تلك التي أسفرت سابقًا عن بيض الطفيليات. تضمنت المنهجية تقنيات المجهرية واختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) لتحديد بيض الديدان المحفوظة والأكياس الأولية، على التوالي. بالنسبة للمجهرية، تم تفكيك العينات وتصفيتها عبر المصفاة الدقيقة، بينما بالنسبة لـ ELISA، تم تركيز عينة فرعية واختبارها باستخدام مجموعات تجارية مصممة للكشف عن مستضدات أولية محددة.
بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا تقنيات استخراج sedaDNA في مرافق الحمض النووي القديمة المخصصة، مع الالتزام ببروتوكولات صارمة لمنع التلوث. تضمنت عملية الاستخراج التفكيك الفيزيائي والكيميائي للعينات، تلاها الطرد المركزي لإزالة المثبطات. تم إعداد مكتبات الحمض النووي للتسلسل باستخدام Illumina، مع تحقيق إثراء مستهدف لحمض نووي الطفيليات من خلال التقاط الهجين في المحلول باستخدام طعوم RNA مصممة من الجينومات الطفيلية الحديثة. تم إجراء التسلسل على منصة Illumina HiSeq 1500، وشملت التحليلات المعلوماتية الحيوية تقليم البيانات، ورسم الخرائط إلى تسلسلات مرجعية، وتعيين تصنيفي باستخدام بروتوكولات معتمدة. تم إيداع بيانات التسلسل الخام في أرشيف قراءة التسلسل NCBI (PRJNA1194279).
النتائج
تشير نتائج الدراسة إلى أن تطبيق تسلسل الحمض النووي القديم (aDNA) باستخدام تقنية الشوتغن على مجموعة فرعية من أربع عينات لم يسفر عن أي حمض نووي طفيلي قابل للتحديد. ومع ذلك، نجح نهج الإثراء المستهدف في استرداد الحمض النووي للطفيليات من 9 من 26 عينة. كانت الطفيل السائد الذي تم تحديده هو الدودة المستديرة (Ascaris sp.)، إلى جانب أنواع أخرى مثل دودة الكبد الشوكية (Dicrocoelium dendriticum) ودودة السوط (Trichuris spp.). من الجدير بالذكر أنه لم يتم الكشف عن بيض دودة السوط مجهرًا في عينة واحدة (MP57 من مورتولا، البرتغال)، مما يبرز القيمة المضافة لتحليل الحمض النووي القديم في تحديد أنواع إضافية.
أكدت الدراسة التعرف المجهرية على Ascaris sp. في ست من إحدى عشر عينة من الفترة الرومانية وأكدت وجود الحمض النووي لـ Ascaris sp. في ثلاث من خمس عينات من الفترة الوسطى حيث تم أيضًا تحديد البيض مجهرًا. وجدت الأبحاث أن ثلاث عينات فقط تحتوي على بيض Ascaris sp. المحفوظ جيدًا، وهو أمر حاسم للتعرف الدقيق. تم استرداد هذه البيض من مواقع في أرلون (بلجيكا)، وفيميناكيوم (صربيا)، وحفرة صرف من فترة المماليك في القدس. أظهر التحليل أن العينات التي تحتوي على تركيزات أعلى من بيض Ascaris sp. تتوافق مع نسبة أكبر من القراءات المعينة لحمض نووي Ascaris sp.، بينما عادةً ما لم تسفر العينات التي تحتوي على تركيزات بيض تبلغ 30 بيضة لكل جرام أو أقل عن الحمض النووي. تم تأكيد صحة قراءات تسلسل Ascaris sp. من خلال تحليل mapDamage، الذي أظهر أنماط إزالة الأمين المتوقعة وتوزيعات طول الشظايا المميزة للحمض النووي القديم. لم يكن التحليل الإحصائي للأنواع الأخرى ممكنًا بسبب عدم كفاية عدد القراءات.
المناقشة
تؤكد قسم المناقشة في الورقة البحثية على أهمية النهج متعدد الطرق في علم الطفيليات القديمة، مشددة على كيف تساهم تقنيات مختلفة في فهم شامل لتنوع الطفيليات القديمة. أثبت التحليل المجهرية أنه أكثر فعالية في الكشف عن الطفيليات القديمة في عينات العصر الحجري الحديث والعصر البرونزي، كاشفًا عن تنوع أكبر من الأنواع، بما في ذلك الطفيليات النادرة مثل *Schistosoma sp.* و *Echinostoma sp.*، التي لم يتم استردادها من خلال طرق الحمض النووي القديم (aDNA). وجدت الدراسة أن الغالبية العظمى من الحمض النووي المسترد من هذه العينات كان بكتيريًا، دون تحديد تسلسلات الحمض النووي للطفيليات، مما يشير إلى قيود محتملة في نهج الالتقاط المستهدف لبعض الأنواع.
بالمقابل، أظهرت الفترات الرومانية والوسطى نطاقًا أكثر تقييدًا من الأنواع الطفيلية، تهيمن عليها الديدان الطفيلية المنقولة عبر التربة مثل *Ascaris sp.* و *Trichuris trichiura*. لاحظت الدراسة زيادة كبيرة في انتشار *Ascaris sp.* من الفترة ما قبل الرومانية إلى الفترة الرومانية، مما يشير إلى ارتباطها بعوامل مثل التحضر وتغيرات في ممارسات الصرف الصحي. كما كشفت النتائج أنه بينما يمكن لطرق الحمض النووي القديم تأكيد وجود *Ascaris sp.* حتى في البيض المتدهور، إلا أن الاسترداد العام لحمض نووي الطفيليات ظل منخفضًا، مما يبرز الحاجة إلى مزيد من التقدم المنهجي. تدعو الدراسة إلى الاستمرار في استخدام المجهرية كطريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة، مع الاعتراف أيضًا بالدور التكميلي للحمض النووي القديم وELISA في تعزيز فهم العدوى الطفيلية القديمة.
DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0013135
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40493646
Publication Date: 2025-06-10
Author(s): Marissa L. Ledger et al.
Primary Topic: Paleopathology and ancient diseases
Overview
This study evaluates a multimethod approach in paleoparasitology, integrating microscopy, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and sedimentary ancient DNA (sedaDNA) analysis to enhance the detection and reconstruction of parasite diversity in historical populations. Analyzing 26 samples from approximately 6400 BCE to 1500 CE, the research aimed to compare parasite diversity across different time periods, particularly focusing on the Roman Empire. The findings indicate that microscopy was the most effective method for identifying helminth eggs, revealing eight taxa, while ELISA proved most sensitive for detecting protozoa, particularly *Giardia duodenalis*.
Notably, parasite DNA was successfully recovered from nine samples, with no DNA found in pre-Roman sites. Sedimentary DNA analysis uncovered whipworm at a site where only roundworm was visible through microscopy and identified two species of whipworm (*Trichuris trichiura* and *Trichuris muris*) at another site. The results suggest that the multimethod approach yields a more comprehensive understanding of parasite diversity, highlighting a shift in the pre-Roman period characterized by a mix of zoonotic parasites and whipworm, which is associated with poor sanitation. In contrast, the Roman and medieval periods exhibited a marked increase in parasites linked to ineffective sanitation practices, particularly roundworm, whipworm, and diarrheal protozoa.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the growing significance of ancient DNA (aDNA) in the study of ancient human pathogens, which has enhanced our understanding of historical epidemics and the evolutionary trajectories of various microorganisms. While traditional aDNA studies primarily focus on skeletal remains, they often overlook parasites, which have historically contributed significantly to disease burdens. The authors emphasize that paleofeces, or preserved fecal material, serves as a crucial source for recovering DNA from enteric pathogens, including bacteria, parasites, and viruses, thereby providing insights into past human health and disease dynamics.
The paper proposes a multimethod approach to paleoparasitology that integrates sedaDNA extraction techniques with microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to recover ancient parasites from sediment samples associated with fecal material, such as latrines and coprolites. This approach aims to enhance the understanding of parasite diversity in Europe and the Eastern Mediterranean during the Roman Empire, as well as in pre- and post-Roman periods. By employing targeted enrichment methods that significantly increase aDNA recovery, the study seeks to provide a more comprehensive taxonomic recovery of human-infecting parasites, revealing notable trends in parasite infections and shifts in dominant species during the Roman period.
Methods
In this study, we analyzed archaeological sediments from various human contexts, including latrine fill, drain fill, coprolites, and pelvic soil from skeletons, spanning from the Neolithic (ca. 6400 BCE) to the medieval period (ca. 1500 CE) across 14 sites within the former Roman Empire. A total of 26 samples were examined, with a focus on those that previously yielded parasite eggs. The methodology involved microscopy and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniques to identify preserved helminth eggs and protozoan cysts, respectively. For microscopy, samples were disaggregated and microsieved, while for ELISA, a subsample was concentrated and tested using commercial kits designed for detecting specific protozoan antigens.
Additionally, we employed sedaDNA extraction techniques in dedicated ancient DNA facilities, adhering to strict contamination prevention protocols. The extraction process involved physical and chemical disintegration of samples, followed by centrifugation to remove inhibitors. DNA libraries were prepared for Illumina sequencing, with targeted enrichment for parasite DNA achieved through in-solution hybridization capture using RNA baits designed from modern parasite genomes. The sequencing was performed on an Illumina HiSeq 1500 platform, and bioinformatics analysis included trimming, mapping to reference sequences, and taxonomic assignment using established protocols. The raw sequence data has been deposited in the NCBI Sequence Read Archive (PRJNA1194279).
Results
The results of the study indicate that the application of ancient DNA (aDNA) shotgun sequencing on a subset of four samples did not yield any identifiable parasite DNA. However, a targeted enrichment approach successfully recovered parasite DNA from 9 out of 26 samples. The predominant parasite identified was roundworm (Ascaris sp.), alongside other taxa such as the lancet liver fluke (Dicrocoelium dendriticum) and whipworm (Trichuris spp.). Notably, whipworm eggs were not detected microscopically in one sample (MP57 from Mértola, Portugal), highlighting the added value of aDNA analysis in identifying additional taxa.
The study corroborated the microscopic identification of Ascaris sp. in six out of eleven Roman period samples and confirmed the presence of Ascaris sp. DNA in three out of five medieval period samples where eggs were also identified microscopically. The research found that only three samples contained well-preserved mamillated Ascaris sp. eggs, which are crucial for accurate identification. These eggs were recovered from sites in Arlon (Belgium), Viminacium (Serbia), and a Mamluk period cesspit in Jerusalem. The analysis revealed that samples with higher concentrations of Ascaris sp. eggs corresponded to a greater percentage of reads assigned to Ascaris sp. DNA, while samples with egg concentrations of 30 eggs per gram or less typically did not yield DNA. The authenticity of the Ascaris sp. sequence reads was confirmed through mapDamage analysis, which demonstrated expected deamination patterns and fragment length distributions characteristic of aDNA. Statistical analysis for other taxa was not feasible due to insufficient read counts.
Discussion
The discussion section of the research paper emphasizes the importance of a multimethod approach in paleoparasitology, highlighting how various techniques contribute to a comprehensive understanding of ancient parasite diversity. Microscopic analysis proved more effective in detecting ancient parasites in Neolithic and Bronze Age samples, revealing a greater diversity of taxa, including rare parasites like *Schistosoma sp.* and *Echinostoma sp.*, which were not recovered through ancient DNA (aDNA) methods. The study found that the majority of DNA recovered from these samples was bacterial, with no parasite DNA sequences identified, indicating potential limitations in the targeted capture approach for certain species.
In contrast, the Roman and medieval periods exhibited a more restricted range of parasite taxa, predominantly soil-transmitted helminths such as *Ascaris sp.* and *Trichuris trichiura*. The study noted a significant increase in the prevalence of *Ascaris sp.* from the pre-Roman to the Roman period, suggesting a correlation with factors like urbanization and changes in sanitation practices. The findings also revealed that while aDNA methods could confirm the presence of *Ascaris sp.* even in degraded eggs, the overall recovery of parasite DNA remained low, underscoring the need for further methodological advancements. The study advocates for the continued use of microscopy as a cost-effective and reliable method, while also recognizing the complementary role of aDNA and ELISA in enhancing the understanding of ancient parasitic infections.