DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.5c19599
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41885601
تاريخ النشر: 2026-03-26
المؤلف: Anton Natter Perdiguero وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات تخليق RNA والبروتين
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة التقدم في مجال توسيع الشيفرة الجينية، مع التركيز بشكل خاص على دمج الأحماض الأمينية غير التقليدية (ncAAs) في البروتينات. يبرز المؤلفون أهمية الهيستيدين في الوظائف الإنزيمية، مشيرين إلى أدواره كحمض وقاعدة ونيوكليوفيل وموصل. ومع ذلك، يشيرون إلى القيود في تنوع الأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين التي يمكن استخدامها حاليًا.
لمعالجة هذه الفجوة، يقدم الباحثون مجموعة أدوات تتكون من تسعة أزواج جديدة من الأحماض الأمينية-التيرنا (aaRS)/التيرنا، مما يمكّن من الدمج المحدد للموقع لـ 12 حمضًا أمينيًا غير تقليدي شبيه بالهيستيدين. تظهر هذه الأحماض الأمينية خصائص كيميائية متنوعة، بما في ذلك قيم pKaH نيتروجين متباينة وهياكل هتروسكلية بديلة. يوضح المؤلفون ملف تعريف التخصص الفرعي لهذه الأزواج من aaRS/التيرنا، كاشفين عن العديد من التخصصات المتبادلة، والتي يتحققون منها من خلال ستة تركيبات من الأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين. يتوقع المؤلفون أن تسهل مجموعة أدواتهم المزيد من الدراسات حول بقايا الهيستيدين في التحفيز وتعزز جهود هندسة وتصميم الإنزيمات.
مقدمة
في المقدمة، يبرز المؤلفون الخصائص التحفيزية الفريدة للهيستيدين بين الأحماض الأمينية التقليدية، مؤكدين على دوره متعدد الوظائف في التفاعلات الإنزيمية بسبب سلسلة الجانبية الإيميدازولية، التي تحتوي على ذرتين من النيتروجين (Nτ و Nπ). تعتبر طرق الطفرات التقليدية غير كافية لدراسة دور الهيستيدين في التحفيز، مما يدفع لاستكشاف الأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين (ncAAs) كبدائل. بينما تم استخدام طرق الاستبدال العالمية، فإنها تفتقر إلى التخصص، مما أدى إلى تطوير تقنيات توسيع الشيفرة الجينية التي تسمح بالدمج المحدد للموقع للأحماض الأمينية غير التقليدية باستخدام أنظمة aaRS والتيرنا المهندسة.
يبلغ المؤلفون عن نجاح هندسة تسعة أنظمة aaRS/التيرنا التي تسهل الدمج المحدد للموقع لـ 12 حمضًا أمينيًا غير تقليدي شبيه بالهيستيدين في *E. coli*. تظهر هذه الأحماض الأمينية تنوعًا في pKaH النيتروجيني، والهياكل الهتروسكلية، وأنماط الاستبدال، بما في ذلك دمج Nτ-methyl-L-histidine (τMH) الذي كان elusive سابقًا. تكشف الدراسة أيضًا عن تركيبات فرعية متبادلة لعدة أحماض أمينية غير تقليدية، مما يوسع مجموعة الأدوات المتاحة للتحقيق في بقايا الهيستيدين في التحفيز ويعزز جهود هندسة الإنزيمات. تؤكد النتائج على إمكانية هذه الأنظمة المهندسة في تعزيز الفهم والتلاعب بالبروتينات المحتوية على الهيستيدين.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام تقنيات تحليلية متنوعة للتحقيق في خصائص البروتينات والجزيئات الصغيرة. تم إجراء قياسات الامتصاص والفلورية باستخدام نظام Tecan Infinite M Nano+، بينما تم تسجيل طيف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) على مطياف Bruker AV-AV-400 في مذيبات مختلفة، مع الإشارة إلى التحولات الكيميائية بإشارات المذيب. تم إجراء كروماتوغرافيا العمود الفلاش الآلي وكروماتوغرافيا السائل عالية الأداء التحضيرية (HPLC) باستخدام أنظمة Biotage ومعدات Agilent، على التوالي، لتنقية المركبات ذات الاهتمام. شملت طرق مطيافية الكتلة (MS) كروماتوغرافيا السائل عالية الإنتاجية-مطيافية الكتلة (LC-MS) للفحص الأولي وLC-MS عالية الدقة للتحقق من البروتينات، باستخدام نظام Agilent 1290 Infinity II LC المتصل بمطياف كتلة رباعي القطب مفرد.
لتحليل البروتين، تم إخضاع العينات لـ LC-MS/MS لتأكيد دمج مستوى الببتيد، مع بروتوكول هضم مفصل يتضمن التربسين والمساعدة الميكروويف. تم تحليل الببتيدات الناتجة على جهاز Waters M-class UPLC المتصل بمطياف كتلة Q-Exactive، باستخدام طريقة اكتساب تعتمد على البيانات. شمل التحليل مسح كامل للكتلة وقطع تفكيك التصادم عالي الطاقة (HCD)، مع إعدادات محددة للدقة وطاقة التصادم. تمت معالجة البيانات باستخدام برنامج Byonic، مما يسمح بتحديد الطفرات والدمج الخاطئ، على الرغم من الملاحظات المحدودة في الكمية بسبب التباين في كفاءات التأين وفعالية الهضم. بشكل عام، قدمت هذه الطرق نهجًا شاملاً لوصف البروتينات والجزيئات الصغيرة المعنية في الدراسة.
نتائج
في هذا القسم، يناقش المؤلفون نتائجهم حول توسيع الشيفرة الجينية لتشمل الأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين (ncAAs) ذات الخصائص المحسنة للطفرات. لقد حددوا عدة ميزات حاسمة كانت تفتقر إليها مجموعة الأدوات الحالية، بما في ذلك مجموعة متنوعة من الهتروسكلات لضبط التفاعل، والأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين مع تكوينات نيتروجينية محفوظة (N π و N τ) ولكن مع قيم pKaH متغيرة، ومشتقات الهيستيدين المستبدلة بـ N τ. من الجدير بالذكر أن ncAA الحالي المستبدل بـ N τ مثقل بمجموعة واقية قابلة للانفصال كبيرة، مما يحد من تطبيقه في هندسة الإنزيمات.
لتجاوز هذه القيود، اختار الباحثون مجموعة متنوعة من الأحماض الأمينية المستهدفة التي تمتد عبر نطاق واسع من pKaH وتتمتع بخصائص مرغوبة. تشمل هذه المجموعة أحماض أمينية غير تقليدية جديدة هتروسكلية تقدم تفاعلية بديلة للإيميدازولات، ومتماثلات ضوئية للتحكم الاتجاهي في النيتروجين التفاعلي، وحلقات إيميدازول مستبدلة لضبط pKaH. بالإضافة إلى ذلك، قدموا اثنين من الأحماض الأمينية غير التقليدية الشبيهة بالهيستيدين المستبدلة بـ N τ و τMH الذي تم البحث عنه لفترة طويلة. الهدف النهائي هو تسهيل توسيع الشيفرة الجينية من خلال تطوير أزواج aaRS/التيرنا المتبادلة، مما يمكّن من الدمج الانتقائي لهذه الأحماض الأمينية غير التقليدية في البروتينات.
مناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون هندسة الأحماض الأمينية-التيرنا (aaRS) لدمج الأحماض الأمينية غير التقليدية (ncAAs) في البروتينات، مع التركيز بشكل خاص على تطوير أزواج جديدة من aaRS/التيرنا من خلال الهندسة التقليدية وطرق تحليل الركيزة. استخدموا مكتبات الطفرات المشبعة بالموقع (SSM) المستمدة من Methanosarcina mazei PylRS (MmPylRS) ومتغير شيميري (chPylRS E7) لتحديد aaRSs القادرة على دمج ncAAs المختلفة. شملت الدراسة عدة جولات من الاختيار الإيجابي والسلبي، تلتها فحص لكبح ncAA المعتمد في sfGFP150TAG، مؤكدة الدمج من خلال تحليل LC-MS. من الجدير بالذكر أن المؤلفين حققوا كفاءات دمج تتراوح بين 30% إلى 85% لعدة ncAAs، مع معدلات دمج خاطئ منخفضة، خاصة بالنسبة لـ 123Trz-4A و3PzA و2E5MH، مما يدل على دقة عالية في الأنظمة المهندسة.
استكشف المؤلفون أيضًا تخصص الركيزة والتعددية بين تركيبات aaRS/ncAA المختلفة، كاشفين أنه بينما أظهرت العديد من aaRSs المهندسة تخصصًا عاليًا لأحماضها الأمينية غير التقليدية، فإن بعضها أظهر تسامحًا أوسع مع الركائز. كان هذا واضحًا بشكل خاص في حالة MmPylRS 123Trz-4A، الذي دمج بكفاءة عدة أحماض أمينية غير تقليدية مشابهة هيكليًا. كما سلطت الدراسة الضوء على التحديات التي واجهت دمج بعض الأحماض الأمينية غير التقليدية، مثل τMH، التي تطلبت استراتيجيات طفرات مبتكرة في الجسم الحي للتغلب على القيود في الأحماض الأمينية والدمج. في النهاية، تشير هندسة أزواج aaRS/التيرنا المتبادلة الناجحة إلى إمكانية الدمج المزدوج لأحماض أمينية غير تقليدية متميزة، مما يمهد الطريق لتطبيقات أكثر تعقيدًا في هندسة البروتين.
DOI: https://doi.org/10.1021/jacs.5c19599
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41885601
Publication Date: 2026-03-26
Author(s): Anton Natter Perdiguero et al.
Primary Topic: RNA and protein synthesis mechanisms
Overview
This section discusses advancements in the field of genetic code expansion, specifically focusing on the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into proteins. The authors highlight the significance of histidine in enzymatic functions, noting its roles as an acid, base, nucleophile, and coordinating ligand. However, they point out the limitations in the variety of histidine-like ncAAs that can currently be utilized.
To address this gap, the researchers present a toolkit comprising nine novel aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs, enabling the site-specific incorporation of 12 new histidine-like ncAAs. These ncAAs exhibit diverse chemical properties, including varied nitrogen pKaH values and alternative heterocyclic structures. The authors detail their profiling of the substrate specificity of these synthetase/tRNA pairs, revealing many mutually orthogonal specificities, which they validate through six combinations of dual-encoded histidine-like ncAAs. The authors anticipate that their toolkit will facilitate further studies on histidine residues in catalysis and enhance enzyme engineering and design efforts.
Introduction
In the introduction, the authors highlight the unique catalytic properties of histidine among canonical amino acids, emphasizing its multifunctional role in enzymatic reactions due to its imidazole side chain, which contains two nitrogen atoms (Nτ and Nπ). Traditional mutagenesis methods are inadequate for studying histidine’s role in catalysis, prompting the exploration of histidine-like non-canonical amino acids (ncAAs) as substitutes. While global replacement methods have been employed, they lack specificity, leading to the development of genetic code expansion techniques that allow for site-specific incorporation of ncAAs using engineered aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) and tRNA pairs.
The authors report the successful engineering of nine aaRS/tRNA systems that facilitate the site-specific incorporation of twelve diverse histidine-like ncAAs in *E. coli*. These ncAAs exhibit variations in nitrogen pKaH, heterocyclic structures, and substitution patterns, including the incorporation of the previously elusive Nτ-methyl-L-histidine (τMH). The study also reveals orthogonal substrate combinations for double-encoding several ncAAs, thereby expanding the toolkit available for investigating histidine residues in catalysis and enhancing enzyme engineering efforts. The findings underscore the potential for these engineered systems to advance the understanding and manipulation of histidine-containing proteins.
Methods
In this study, various analytical techniques were employed to investigate the properties of proteins and small molecules. Absorbance and fluorescence measurements were conducted using a Tecan Infinite M Nano+ system, while nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were recorded on a Bruker AV-AV-400 spectrometer in different solvents, with chemical shifts referenced to solvent signals. Automated flash column chromatography and preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) were performed using Biotage systems and Agilent equipment, respectively, to purify the compounds of interest. Mass spectrometry (MS) methods included high-throughput liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) for initial screening and high-resolution LC-MS for verification of proteins, utilizing an Agilent 1290 Infinity II LC system coupled to a single quadrupole mass spectrometer.
For protein analysis, samples were subjected to LC-MS/MS to confirm peptide-level incorporation, with a detailed digestion protocol involving trypsin and microwave assistance. The resulting peptides were analyzed on a Waters M-class UPLC coupled to a Q-Exactive mass spectrometer, employing a data-dependent acquisition method. The analysis included full scan MS and higher-energy collision dissociation (HCD) fragmentation, with specific settings for resolution and collision energy. The data were processed using Byonic software, allowing for the identification of mutations and misincorporations, albeit with noted limitations in quantitation due to variability in ionization efficiencies and digestion efficacy. Overall, these methods provided a comprehensive approach to characterizing the proteins and small molecules involved in the study.
Results
In this section, the authors discuss their findings on expanding the genetic code to include histidine-like non-canonical amino acids (ncAAs) with enhanced properties for mutagenesis. They identified several critical features that were lacking in the existing toolkit, including a variety of heterocycles for fine-tuning reactivity, histidine-like ncAAs with preserved nitrogen configurations (N π and N τ) but with varying pKaH values, and N τ-substituted histidine derivatives. Notably, the current N τ-substituted ncAA is encumbered by a large photocleavable protecting group, which limits its application in enzyme engineering.
To overcome these limitations, the researchers selected a diverse panel of target ncAAs that span a broad pKaH range and possess desirable properties. This panel includes new heterocyclic ncAAs that offer alternative reactivity to imidazoles, stereoisomers for directional control of reactive nitrogen, and substituted imidazole rings for pKaH tuning. Additionally, they introduced two new N τ-substituted histidine-like ncAAs and the long-sought τMH. The ultimate goal is to facilitate genetic code expansion through the development of orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS)/tRNA pairs, enabling site-selective incorporation of these ncAAs into proteins.
Discussion
In this section, the authors discuss the engineering of aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) to incorporate non-canonical amino acids (ncAAs) into proteins, specifically focusing on the development of new aaRS/tRNA pairs through classical engineering and substrate profiling methods. They utilized site-saturation mutagenesis (SSM) libraries derived from Methanosarcina mazei PylRS (MmPylRS) and a chimeric variant (chPylRS E7) to identify aaRSs capable of incorporating various ncAAs. The study involved multiple rounds of positive and negative selection, followed by screening for ncAA-dependent suppression in sfGFP150TAG, confirming incorporation via LC-MS analysis. Notably, the authors achieved incorporation efficiencies ranging from 30% to 85% for several ncAAs, with low misincorporation rates, particularly for 123Trz-4A, 3PzA, and 2E5MH, indicating high fidelity in the engineered systems.
The authors further explored substrate specificity and polyspecificity among different aaRS/ncAA combinations, revealing that while many engineered aaRSs displayed high specificity for their cognate ncAAs, some exhibited broader substrate tolerance. This was particularly evident in the case of MmPylRS 123Trz-4A, which efficiently incorporated multiple structurally similar ncAAs. The study also highlighted the challenges faced in incorporating certain ncAAs, such as τMH, which required innovative in vivo mutagenesis strategies to overcome limitations in aminoacylation and incorporation. Ultimately, the successful engineering of mutually orthogonal aaRS/tRNA pairs suggests potential for dual incorporation of distinct ncAAs, paving the way for more complex protein engineering applications.