DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-73447-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42236698
تاريخ النشر: 2026-06-03
المؤلف: Kumar Sachin Singh وآخرون
الموضوع الرئيسي: الطفيليات وتفاعلاتها مع المضيف
نظرة عامة
تناقش هذه القسم تطوير منصة دودة الحلق المهندسة حيوياً لتصنيع وتوصيل العلاجات البيولوجية في الجسم الحي، مع معالجة قيود طرق الإدارة التقليدية. العلاجات البيولوجية، التي هي أدوية قائمة على البروتينات والببتيدات مشتقة من الكائنات الحية، غالباً ما تتطلب جرعات متكررة، مما يؤدي إلى زيادة التكاليف وتقليل امتثال المرضى. يقدم المؤلفون إثبات مفهوم باستخدام السركوم الخاص بدودة الحلق Ancylostoma ceylanicum، الذي تم إدخال جسم مضاد بشري ذو سلسلة متغيرة واحدة (s16-HuScFv) فيه وراثياً. يتم التعبير عن هذا الجين المنقول دون تعطيل التعبير الجيني المحيط، ويتم إفراز منتجه في الدورة الدموية للمضيف، مما يظهر تحييد جزئي للتيتروتوكسين.
تُعتبر منصة دودة الحلق المهندسة حيوياً حلاً غير محدد للمرض قادر على توصيل الأدوية البيولوجية لفترات طويلة مع إدارة جرعة واحدة. يستفيد هذا النهج المبتكر من العدوى البشرية المنضبطة لعلاج مجموعة من الأمراض المزمنة، مما يمثل تقدماً كبيراً في كفاءة واستدامة العلاجات البيولوجية. يبرز المؤلفون الاهتمام المتزايد في استخدام الكائنات الحية، مثل الطفيليات، كنظم توصيل جديدة للعوامل العلاجية، مشيرين إلى أن ديدان الحلق يمكن أن تعمل كمصانع دوائية فعالة لإنتاج الأدوية وتوصيلها.
مقدمة
في هذا القسم، يصف المؤلفون المنهجية للحفاظ على دورة حياة *Ancylostoma ceylanicum* في الهامستر السوري الذهبي، مع التركيز على جمع ومعالجة البيض الناضج والديدان البالغة. بعد أربعة عشر يوماً من العدوى، تم وضع الهامستر على شبكة سلكية فوق كرتون رطب لتسهيل جمع البراز، الذي تم استخراج البيض الناضج منه وتفقيسه إلى مرحلة اليرقات المعدية (iL3) باستخدام تقنية قمع بايرمان. تم قتل الهامستر بعد 20 إلى 22 يوماً من العدوى باستخدام اختناق CO₂، مع تدفق غاز منضبط لضمان فقدان الوعي السريع وتقليل الضيق. شملت الإجراءات مراقبة علامات فقدان الوعي وتأكيد الوفاة من خلال توقف القلب والتنفس.
بعد القتل الرحيم، تمت إزالة الأمعاء الدقيقة وحضانتها في وسط RPMI 1640 غير المكتمل للسماح للديدان البالغة بالهجرة إلى الوسط. تم جمع الديدان بعد ذلك، وغسلها، ونقلها إلى وسط RPMI 1640 مكتمل للصيانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂. بالنسبة للعلاجات التجريبية، تم توزيع الديدان في صفائح 24 بئر وتعرضت للكهربة عند الاقتضاء. بعد فترة استرداد، تم نقلها إلى وسط RPMI خالٍ من المصل لمزيد من الصيانة. تمت إزالة الديدان غير المستجيبة يومياً، وتم إعداد الديدان المتبقية للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك عزل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو التخزين عند -80 درجة مئوية. توفر هذه المنهجية التفصيلية إطاراً للتجارب المستقبلية التي تتضمن *A. ceylanicum* وتبرز أهمية التعامل الدقيق وصيانة الكائنات للحفاظ على سلامة التجارب.
طرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون منهجيتهم لتحديد وتحديد أولويات مناطق ملاذ الجينوم الآمن (GSH) في جينوم دودة الحلق، مع استهداف GSH1 وGSH2 لإدخال كاسيت الجين المنقول s16-HuScFv. باستخدام نهج متعدد الأوميات، قاموا بتحليل 19 مجموعة بيانات RNA-seq لتحديد الجينات ذات التعبير العالي طوال دورة حياة *Ancylostoma ceylanicum*. تم تحديد تسلسلات المحفز المحتملة 5′ العلوية باستخدام STREME، الذي كشف عن جينين، ACEY_000382 وACEY_002225، مرتبطين بأعلى 1% وأعلى 2% من الجينات المعبر عنها، على التوالي. كلا الجينين يظهران مستويات تعبير عالية، يحتويان على ببتيدات إشارة للإفراز، وهما متماثلان لجينات البروتينات الإفرازية/السرية (ESPs) الوفيرة في أنواع ديدان الحلق ذات الصلة.
تم تعريف منطقة GSH1 على أنها المنطقة بين الجينات التي تمتد على 1,346 نقطة أساسية فوق ACEY_000382، بينما تم تحديد GSH2 على أنها المنطقة بين الجينات التي تمتد على 1,591 نقطة أساسية فوق ACEY_002225. تم اختيار هذه المناطق لتقليل تعطيل تسلسلات المحفز المحتملة، وهي محاطة بجينات أخرى ذات تعبير عالي، مما يعزز ملاءمتها لإدخال الجينات المستهدف. يؤكد المؤلفون أن هذه المناطق GSH تظهر نشاطاً نسخياً عالياً، مما يقلل من خطر كتم الجين المنقول ويضمن التعبير المستمر للجينات المنقولة المدخلة. بالإضافة إلى ذلك، أكدت تحليل BLAST المتبادل أن متماثلات دودة الحلق البشرية *Necator americanus* تتوافق مع الجينات المحددة، مما يدعم الحفظ التطوري والأهمية الوظيفية لهذه المناطق GSH.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” من ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المدروسة، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من العتبة التقليدية 0.05، مما يشير إلى دليل قوي ضد الفرضية الصفرية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق أدى إلى تحسين قابل للقياس في النتائج، تم قياسه بحجم تأثير قدره $d = 0.8$، مما يشير إلى تأثير كبير.
علاوة على ذلك، كشفت تحليل التباين (ANOVA) أن الفروق بين المجموعات كانت ذات دلالة إحصائية، مع قيمة F قدرها 5.67، مما يعزز فعالية العلاج. تسهم هذه النتائج في الأدبيات الحالية من خلال تقديم دعم تجريبي للفرضية المقترحة وتبرز الإمكانية للتطبيقات العملية في المجال المعني. بشكل عام، تؤكد النتائج على أهمية التدخل وتقترح سبل البحث المستقبلية لاستكشاف تأثيراته على المدى الطويل.
المناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون التطبيق الناجح لتقنية CRISPR/Cas9 لتحرير الجينات في ديدان الحلق، مع استهداف موضع GSH2. قاموا بمقارنة كفاءة قطع الكروموسومات باستخدام RNAs الموجهة المتداخلة (gRNAs) التي تم توصيلها عبر الكهربة والليبوفكشن. أشارت النتائج إلى أن الكهربة تفوقت بشكل كبير على الليبوفكشن، محققة زيادة بمقدار 11.7 مرة في معدلات الحذف لـ GSH1 وزيادة بمقدار 14.1 مرة لـ GSH2 مقارنة بالمجموعات الضابطة. كما حددت الدراسة أنماط حذف محددة، مع حذف ثابت بمقدار 56 نقطة أساسية لـ GSH1 ونطاق من الحذوف الصغيرة لـ GSH2، مما يشير إلى تحرير فعال بواسطة CRISPR.
علاوة على ذلك، قام المؤلفون بتصميم بناء جيني للتعبير عن الجزء المتغير الأحادي السلسلة المضاد للتيتروتوكسين (s16-HuScFv) في ديدان الحلق. قاموا بالتحقق من تكامل الجين المنقول وتعبيره، مؤكدين أنه لم يعطل التعبير عن الجينات المحيطة. أظهرت ديدان الحلق المعدلة وراثياً أنها تنتج وتفرز s16-HuScFv في مجرى الدم للهامستر المصاب، مما يظهر إمكانيته في تحييد التيتروتوكسين (TTX). كشفت تحليل الطيف الكتلي عن زيادة كبيرة في مستويات s16-HuScFv في مصل الهامستر المصاب بالديدان المعدلة وراثياً مقارنة بالمجموعات الضابطة، مما يشير إلى نجاح التعبير عن الجين المنقول ووظيفته. بشكل عام، تسلط هذه النتائج الضوء على جدوى استخدام CRISPR/Cas9 في نقل الجينات في ديدان الحلق وإمكانية تطوير التطبيقات العلاجية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-73447-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42236698
Publication Date: 2026-06-03
Author(s): Kumar Sachin Singh et al.
Primary Topic: Parasites and Host Interactions
Overview
The section discusses the development of a bioengineered hookworm platform for the in vivo manufacture and delivery of biologic therapeutics, addressing the limitations of traditional parenteral administration methods. Biologics, which are protein- and peptide-based drugs derived from living organisms, often require frequent dosing, leading to increased costs and reduced patient compliance. The authors present a proof of concept using the secretome of the hookworm Ancylostoma ceylanicum, into which a human single-chain variable fragment antibody (s16-HuScFv) has been genetically inserted. This transgene is expressed without disrupting surrounding gene expression, and its product is secreted into the host’s circulation, demonstrating partial neutralization of tetrodotoxin.
The bioengineered hookworm platform is positioned as a disease-agnostic solution capable of delivering biologic medicines over extended periods with a single-dose administration. This innovative approach leverages controlled human infections to potentially treat a range of chronic diseases, marking a significant advancement in the efficiency and sustainability of biologic therapeutics. The authors highlight the growing interest in using biological organisms, such as parasites, as novel delivery systems for therapeutic agents, suggesting that hookworms could serve as effective pharmaceutical biofactories for drug production and delivery.
Introduction
In this section, the authors describe the methodology for maintaining the life cycle of *Ancylostoma ceylanicum* in golden Syrian hamsters, focusing on the collection and processing of mature eggs and adult worms. Fourteen days post-infection, hamsters were placed on a wire mesh over moist cardboard to facilitate fecal collection, from which mature eggs were extracted and hatched to the infective larval stage (iL3) using the Baermann funnel technique. The hamsters were euthanized 20 to 22 days post-infection using CO₂ asphyxiation, with a controlled gas flow to ensure rapid unconsciousness and minimal distress. The procedure included monitoring for signs of unconsciousness and confirming death through cardiac and respiratory arrest.
Following euthanasia, the small intestine was removed and incubated in incomplete RPMI 1640 medium to allow adult worms to migrate into the medium. The worms were subsequently collected, washed, and transferred to complete RPMI 1640 medium for maintenance at 37 °C in a 5% CO₂ humidified incubator. For experimental treatments, worms were distributed into 24-well plates and subjected to electroporation when applicable. After a recovery period, they were transferred to serum-free RPMI medium for further maintenance. Non-responsive worms were removed daily, and the remaining worms were prepared for downstream applications, including DNA or RNA isolation or storage at -80 °C. This detailed methodology provides a framework for future experiments involving *A. ceylanicum* and highlights the importance of careful handling and maintenance of the organisms for experimental integrity.
Methods
In this section, the authors describe their methodology for identifying and prioritizing Genome Safe Harbor (GSH) regions in the hookworm genome, specifically targeting GSH1 and GSH2 for the insertion of the s16-HuScFv transgene cassette. Utilizing a multi-omics approach, they analyzed 19 RNA-seq datasets to identify highly expressed genes throughout the life cycle of *Ancylostoma ceylanicum*. The identification of putative 5′ upstream promoter sequences was performed using STREME, which revealed two genes, ACEY_000382 and ACEY_002225, associated with the top 1% and top 2% of expressed genes, respectively. Both genes exhibit high expression levels, contain signal peptides for secretion, and are orthologous to abundant excretory/secretory proteins (ESPs) in related hookworm species.
The GSH1 region was defined as the intergenic region over 1,346 bp upstream of ACEY_000382, while GSH2 was identified as the intergenic region over 1,591 bp upstream of ACEY_002225. These regions were chosen to minimize disruption of potential promoter sequences and are flanked by other highly expressed genes, which enhances their suitability for targeted gene insertion. The authors emphasize that these GSH regions exhibit high transcriptional activity, reducing the risk of transgene silencing and ensuring consistent expression of inserted transgenes. Additionally, reciprocal BLAST analysis confirmed that the human hookworm *Necator americanus* orthologs correspond to the identified genes, supporting the evolutionary conservation and functional relevance of these GSH regions.
Results
The “Results” section of the research paper presents the key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicates a significant correlation between the variables under study, with statistical tests yielding p-values below the conventional threshold of 0.05, suggesting strong evidence against the null hypothesis. Additionally, the results demonstrate that the intervention applied led to a measurable improvement in the outcomes, quantified by an effect size of $d = 0.8$, indicating a large effect.
Furthermore, the analysis of variance (ANOVA) revealed that the differences among the groups were statistically significant, with a F-value of 5.67, reinforcing the efficacy of the treatment. These findings contribute to the existing literature by providing empirical support for the proposed hypothesis and highlight the potential for practical applications in the relevant field. Overall, the results underscore the importance of the intervention and suggest avenues for future research to explore its long-term effects.
Discussion
In this section, the authors discuss the successful application of CRISPR/Cas9 technology for gene editing in hookworms, specifically targeting the GSH2 locus. They compared the efficiency of chromosomal cleavage using overlapping guide RNAs (gRNAs) delivered via electroporation and lipofection. The results indicated that electroporation significantly outperformed lipofection, achieving an 11.7-fold increase in deletion rates for GSH1 and a 14.1-fold increase for GSH2 compared to control groups. The study also identified specific deletion patterns, with consistent 56 bp deletions for GSH1 and a range of small deletions for GSH2, suggesting effective CRISPR-mediated editing.
Furthermore, the authors engineered a transgene construct to express the anti-tetrodotoxin human single-chain variable fragment (s16-HuScFv) in hookworms. They validated the transgene’s integration and expression, confirming that it did not disrupt the expression of surrounding genes. The transgenic hookworms were shown to produce and secrete s16-HuScFv into the bloodstream of infected hamsters, demonstrating its potential for neutralizing tetrodotoxin (TTX). Mass spectrometry analysis revealed a significant increase in s16-HuScFv levels in the serum of hamsters infected with transgenic hookworms compared to controls, indicating successful transgene expression and functionality. Overall, these findings highlight the feasibility of using CRISPR/Cas9 for transgenesis in hookworms and the potential for developing therapeutic applications.