الكلمات الرئيسية: اليوريا، فشل متعدد الأعضاء، رعاية مركزة، بروتين، نمذجة مشتركة

تم تحديد إنشاء الجرعة المثلى من البروتين كأولوية بحثية في مجال تغذية الرعاية الحرجة لإبلاغ الممارسة السريرية [1]. بينما يعتبر البروتين متطلبًا أساسيًا لتحفيز تخليق البروتين ووظيفة الخلايا والبقاء، لا تزال الأدلة الحالية غير كافية لتوصية بجرعة مثلى. الدراسات الملاحظة متضاربة مع بعض الدراسات التي تقود إلى فرضيات بأن الجرعات الأعلى من البروتين في المرضى المصابين بأمراض حرجة قد تؤدي إلى ضرر [2]. في دراسة شملت 85 مركزًا و1301 مريضًا، عشوّت تجربة EFFORT Protein المرضى إلى يوم أو أكثر من البروتين مقابل يوم أو أقل لمدة 28 يومًا [3]. لم يُلاحظ أي فائدة من الجرعات الأعلى من البروتين، مع إشارة إلى ضرر محتمل في مجموعة من مرضى وحدة العناية المركزة الذين يعانون من فشل متعدد الأعضاء. بينما تم الافتراض سابقًا بوجود علاقة بين تحميل البروتين والنتائج السريرية السلبية في المرضى الذين يعانون من فشل متعدد الأعضاء [4]، تسلط بيانات EFFORT Protein الضوء على الحاجة إلى التحقيق في هذه العلاقة بالتفصيل، لتحديد أي المرضى قد يتعرضون للضرر من جرعة البروتين العالية. تقدّر التجارب العشوائية المحكومة التأثير العام لتدخل ما، ولكن في تقديمها، قد يتم جمع بيانات مهمة حول الآلية التي من خلالها يمارس هذا التدخل تأثيره [5]. نحن ندرك بشكل متزايد أن الاستجابات غير المتجانسة للتدخلات تُرى في المرضى المصابين بأمراض حرجة نتيجة لعوامل أساسية متنوعة وعوامل مرتبطة بالمرض [6]. يمكن أن يساعد تحديد التوقيعات البيولوجية للفعالية (أو الضرر) من خلال الفهم الآلي لهذه التدخلات في إثراء السكان المستقبلي للدراسات اللاحقة [7]. قد يساعد تطبيق النمذجة المشتركة على البيانات الطولية المجمعة من التجارب السريرية في معالجة هذا، وفي حالة EFFORT Protein تمييز وعزل تأثيرات إنتاج اليوريا من تحميل البروتين على البقاء [8، 9]. تم ملاحظة زيادات في اليوريا في المصل باستمرار عبر أذرع التدخل من التجارب السريرية العشوائية للتغذية من مكملات الأحماض الأمينية [10، . يُقدّر أن قدرة المريض المصاب بأمراض حرجة على استخدام الأحماض الأمينية لتخليق بروتين العضلات أقل بمقدار من تلك الخاصة بالإنسان السليم [12].
البروتين الذي لا يتم امتصاصه بواسطة الأنسجة يتم تحليله إلى أحماض أمينية ويتم استقلابها لاحقًا إلى أمونيا ومن ثم إلى يوريا. الخطوة المحددة هي كربامويل فوسفات سينثيتاز 1، والتي تعتمد على ATP وقد تكون محدودة من خلال تغيير استخدام الركيزة [13، 14]. بينما تعتبر الأمونيا سامة، فإن قياسها غير موصى به في الغالبية العظمى من الإعدادات السريرية [15]. تظهر مستويات الأمونيا في المصل مزيدًا من التباين من معالجة العينات ومعالجتها، مما يجعل التقييمات متعددة المراكز غير موثوقة [16]. تعمل اليوريا كتوقيع بيولوجي لوظيفة دورة اليوريا والتخلص من الأمونيا، ويمكن قياسها على نطاق واسع، على سبيل المثال، في تجربة شملت 85 مركزًا عشوّت 1301 مريضًا. هناك كل من الأساس البيولوجي والبيانات الملاحظة
لإنتاج اليوريا نتيجة لنشاط دورة اليوريا المتغيرة أو الزائدة في فشل متعدد الأعضاء [17].

نفترض أن هناك علاقة سببية متسلسلة بين تقديم البروتين العالي، وزيادة تدفق دورة اليوريا وزيادة خطر الوفاة، مع عمل اليوريا كتوقيع بيولوجي لمنتجات إزالة الأمونيا السامة للبروتين. يسمح العشوائية الفعالة لإنتاج اليوريا الأعلى بفحص تأثير إنتاج اليوريا بشكل محدد. هدفنا هو تقدير ذلك من خلال نموذج مشترك لنتيجة الوقت للحدث (الوفيات بعد 30 يومًا) وعلامة طولية (اليوريا) باستخدام بيانات من EFFORT Protein. ستضيف هذه البيانات إلى الجسم المتزايد من الأدلة التي تدعم استهداف البيانات المجمعة بشكل روتيني لتوجيه العلاج الغذائي، بهدف تقليل التأثيرات الأيضية الضارة، وفي النهاية، تحسين نتائج المرضى.

تحليل استكشافي ثانوي لتجربة عشوائية محكومة بناءً على إرشادات STROBE.

تجربة سريرية متعددة المراكز، عملية، مدفوعة بالتطوع، قائمة على السجل، عشوائية، مفتوحة، تقارن جرعة أعلى من البروتين ( يوم) بجرعة أقل ( يوم) على الوقت حتى الخروج على قيد الحياة من المستشفى والوفيات بعد 60 يومًا. شملت التجربة 1301 مشاركًا بالغًا ( سنوات) مع خطر التغذية ويتطلبون التهوية الميكانيكية لمدة .[3، 18] تم استبعاد المرضى الذين لم يتلقوا تدخل الدراسة أو الذين كانت لديهم نتائج مستشفى مفقودة أو كانت لديهم قياسات يوريا واحدة فقط من هذا التحليل بعد الحدث.

تجربة EFFORT Protein مسجلة في clinicaltrials.gov (NCT03160547-2017-05-17). لم يتم تلقي تمويل أساسي لهذه الإعادة التحليلية. تم الموافقة على بروتوكول تجربة EFFORT Protein التي بدأها الباحثون من قبل لجان الأخلاقيات البحثية في جامعة كوين، كندا، ومجلس مراجعة مؤسسي مركزي (IRB) في جامعة فاندربيلت، ناشفيل، تينيسي، الولايات المتحدة الأمريكية الذي منح إعفاء من الموافقة المستنيرة للمواقع التي انضمت إلى هذا IRB المركزي. بخلاف ذلك، حيثما كان مطلوبًا من قبل مواقع الدراسة المحلية، تم الحصول على موافقة أخلاقية محلية، وتم أيضًا الحصول على الموافقة المستنيرة من وكلاء المرضى المعينين قبل العشوائية. جميع المواقع والأشخاص الذين شاركوا في جمع البيانات مدرجون في الملحق التكميلي للمخطوطة الرئيسية [3].

اعتبرنا جميع المرضى البالغ عددهم 1301 في تحليل النية المعدلة لعلاج تجربة EFFORT Protein الأساسية [3].

تم توضيح جمع البيانات الأساسية واليومية لتجربة EFFORT Protein بالتفصيل في بروتوكول التجربة [18]. تم جمع قياسات اليوريا لمدة 12 يومًا. تم تسجيل عجز الأعضاء المستمر (POD) يوميًا لمدة 30 يومًا لاستلام: التهوية الميكانيكية، العلاج بالضغط، والعلاج البديل الكلوي. تضمنت المتغيرات المشتركة تأثير العلاج لجرعة البروتين الأعلى والمتغيرات الأساسية التالية مسبقًا:

كانت النتيجة المشتركة الرئيسية هي معدل الوفيات خلال 30 يومًا واليوريا المتغيرة مع الوقت. كنا نتوقع أن تكون قياسات اليوريا مركزة في الأيام السبعة الأولى بعد العشوائية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت أعمالنا السابقة أن تغييرات اليوريا تحدث مبكرًا في حالات المرض الحرجة، وبالتالي كان هدفنا مسبقًا نمذجة الارتباطات مع اليوريا المتغيرة مع الوقت والوفاة ضمن إطار زمني مدته 30 يومًا [17، 21].

قدمنا بيانات وصفية عن الأساس والنتائج كوسائط مع نطاقات بين الربعين للبيانات العددية، وكأرقام مع نسب مئوية للبيانات الفئوية. يتم تقديم مسارات اليوريا الخام على مر الزمن لكلا مجموعتي العلاج. لوصف التباين في مسارات اليوريا على مر الزمن بشكل أكبر، قمنا بإجراء تجميع غير خاضع للإشراف على قياسات اليوريا المتكررة. استخدمنا نهج تجميع مسار k-means غير الخاضع للإشراف بناءً على قياسات اليوريا المتكررة المحولة لوغاريتميًا. تم اختيار عدد المجموعات بناءً على فحص عدة مؤشرات تقسيم وتفضيلنا لاختيار أقل عدد من المجموعات المنفصلة لتوضيح تباين المسار. لجدول من
الخصائص، تم تصنيف المرضى حسب مسار اليوريا باستخدام التجميع الطولي.

استخدمنا نموذجًا مشتركًا لتحديد تأثير العلاج من العشوائية إلى البروتين العالي من خلال ربط الوقت حتى الحدث والنتيجة الطولية. يمكن للنموذج المشترك تقدير تأثيرين لعشوائية البروتين: التأثير المباشر لعشوائية البروتين على البقاء، والتأثير غير المباشر لعشوائية البروتين على البقاء من خلال اليوريا المتغيرة مع الوقت. يتم دمج نتيجة البقاء (نموذج كوكس) وقياسات اليوريا الطولية (نموذج التأثيرات المختلطة الخطية) في نموذج مشترك واحد. على مر الزمن، يتم قياس اليوريا بشكل متقطع، ولها درجة من خطأ القياس، وتوقف الوفاة قياسات اليوريا. تسمح النماذج المشتركة بتقدير التأثير العشوائي المتغير مع الوقت، الخاص بالمريض للمتغير الداخلي (اليوريا) على نتيجة (معدل الوفيات خلال 30 يومًا) مع تعديل المتغيرات الأساسية مع الأخذ في الاعتبار الانسحابات غير العشوائية بسبب الوفاة أو الخروج على قيد الحياة [23،24].

قمنا بتكييف رسم بياني موجه غير دوري (DAG) لتوضيح المسارات السببية المحتملة التي تم اختبارها في النموذج المشترك [25]. كان DAG المفصل والمحدد مسبقًا قائمًا على رأي الخبراء والاحتمالية البيولوجية، الملف الإضافي 1: الشكل S1.

لبناء النموذج المشترك، اتبعنا خطوتين. أولاً، استخدمنا نموذج كوكس لمعدل الوفيات خلال 30 يومًا وضمنا المتغيرات كما تم تبريرها أعلاه والمحددة في DAG، الملف الإضافي 1: الشكل S1. ثانيًا، استخدمنا نموذج التأثيرات المختلطة الخطية لقياس اليوريا الطولية. تم تضمين مجموعة العشوائية، يوم القياس، وRRT كآثار ثابتة. تم منح تقاطعات ومنحدرات عشوائية لكل موضوع للسماح بمسارات مختلفة لليوريا على مر الزمن. كنا نتوقع أن يكون ارتفاع اليوريا أكبر في الأيام السبعة الأولى في مجموعة البروتين العالية وأدخلنا مصطلح تفاعل لعشوائية البروتين والوقت. بالإضافة إلى ذلك، تم تحويل اليوريا لوغاريتميًا لتحسين احتمالية تقارب النموذج. استخدمنا splines مكعبة للسماح بالتغيرات غير الخطية لليوريا اللوغاريتمية على مر الزمن. تعمل splines عن طريق تقسيم نطاق قياسات اليوريا الطولية إلى أجزاء يتم تعيينها بعد ذلك إلى ‘دالة أساسية’ أو ‘عقد’. تم اختيار ثلاث عقد لالتقاط الغالبية العظمى من عدم الخطية بناءً على تحليلات مجموعتنا السابقة [17، 26].

في التحليل الثانوي، قمنا بإجراء عدة امتدادات للنماذج المشتركة للتحقيق في أشكال مختلفة من الارتباط بين اليوريا ومعدل الوفيات خلال 30 يومًا. يقدر النموذج المشترك الرئيسي الارتباط بين القيمة الحالية لليوريا في الوقت ( ) مع خطر معدل الوفيات خلال 30 يومًا، الملف الإضافي 1: الشكل S2. ومع ذلك، قد لا يكون لدى المرضى الذين لديهم نفس قياس اليوريا في نفس الخطر اعتمادًا على تاريخ قياسات اليوريا السابقة، على سبيل المثال، مريض لديه يوريا متناقصة مقابل مريض لديه
يوريا متزايدة. لذلك، استكشفنا ما إذا كان خطر الوفاة في نقطة الوقت مرتبطًا بمسار اليوريا في (المحدد بواسطة المنحدر الذي يتضمن قياس اليوريا في اليوم السابق)، الملف الإضافي 1: الشكل S2B. بالإضافة إلى ذلك، استكشفنا التأثيرات التراكمية من خلال فحص الارتباط بين المساحة الكاملة تحت مسار اليوريا حتى مع نتيجة الوقت حتى الحدث، الملف الإضافي 1: الشكل S2C. تم إجراء تشخيصات النموذج من خلال الفحص البصري للرسوم البيانية التشخيصية. يتم تقديم النتائج كنسب خطر (HR) مع فترات ثقة ثنائية الجانب 95% (CrIs).

قمنا بإجراء عدة تحليلات حساسية. أولاً، أنشأنا نموذجًا مشتركًا لضبط المتغيرات الأساسية المحددة مسبقًا في تحليل تجربة EFFORT Protein: العمر، درجة APACHE II، درجة الضعف السريرية، الساركوبينيا (SARC-F)، نوع القبول، والمنطقة الجغرافية، حيث تم نمذجة جميع المتغيرات المستمرة كخطية.
ثانيًا، لاختبار الارتباط بين تغيير اليوريا وجرعة البروتين والوفيات بشكل أكبر، استخدمنا نموذجًا مشتركًا متعدد المتغيرات لتضمين درجة POD اليومية. اختبر هذا النموذج المشترك الارتباط بين درجة POD الطولية واليوريا مع معدل الوفيات خلال 30 يومًا. قمنا بإنشاء DAG لتوضيح هيكل النموذج المتعدد المتغيرات، الملف الإضافي 1: الشكل S3. في هذا التحليل المتعدد المتغيرات، توقعنا أن يبقى الارتباط بين اليوريا ومعدل الوفيات خلال 30 يومًا ولكن يكون أقل في الحجم مقارنة بالنموذج المشترك أحادي المتغير. وهذا من شأنه أن يشير إلى أن العمليات البيولوجية التي تربط اليوريا وPOD والنتيجة مترابطة، ولكن اليوريا ستستمر في تقديم معلومات إضافية حول خطر الوفاة [24].

ثالثًا، لمعالجة التأثير المحتمل المربك لـ AKI على ارتفاع اليوريا والوفيات، كررنا النموذج المشترك الرئيسي في مجموعة فرعية من المرضى الذين لا يعانون من AKI عند الأساس. بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا نموذجًا مشتركًا متعدد المتغيرات لتضمين حالة AKI في نفس نقطة قياس اليوريا (حتى اليوم 12). تم تعريف إصابة الكلى الحادة على أنها وجود AKI من المرحلة 1 أو أعلى وفقًا لمعايير الكرياتينين في المصل [27]. اختبر هذا النموذج المشترك الارتباط بين حالة AKI الطولية واليوريا مع معدل الوفيات خلال 30 يومًا. أخيرًا، للسماح بالمقارنة مع الأعمال السابقة التي تربط تغييرات نسبة اليوريا إلى الكرياتينين بجرعات مختلفة من الأحماض الأمينية، قمنا بنمذجة مسارات نسبة اليوريا إلى الكرياتينين على مر الزمن. [21]

وصفنا عدد قياسات اليوريا على مر الزمن. تعامل هيكل النموذج المشترك بشكل صريح مع فقدان العلامة الطولية لليوريا [24، 28]. في تحليل الحساسية، كانت هناك متغيرات أساسية مفقودة وتم استبعاد المرضى كما هو محدد في تحليل تجربة EFFORT Protein الرئيسي وتم الإبلاغ عن الأعداد المضمنة [3].

تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام (فريق R Core، مؤسسة R للحوسبة الإحصائية الإصدار 4.2) واستخدمت النمذجة المشتركة حزمة JMbayes2 [29].

من 17 يناير 2018 إلى 3 ديسمبر 2021، تم عشوائية 1329 مريضًا في تجربة EFFORT Protein. بسبب الوفاة المبكرة، أو الخروج، أو سحب الموافقة، تم استبعاد 28 مريضًا من التحليل. كانت الاستبعادات الإضافية: 4 مرضى لديهم نتائج مستشفى مفقودة و20 لديهم قياس واحد فقط لليوريا. تم تضمين 1277 مريضًا في التحليل الرئيسي، الملف الإضافي 1: الشكل S4. كان العدد الوسيط لقياسات اليوريا لكل مريض 12 [8-12].

تُعرض الخصائص الأساسية للمرضى والنتائج الرئيسية من تجربة EFFORT Protein في الجدول 1، مقسمة إلى مجموعات مسار اليوريا العالية والمتوسطة والمنخفضة كما تحددها مجموعات قياس اليوريا الطولية، الملف الإضافي 1: الشكل S5. في مجموعة مسار اليوريا العالية، كان 23% (70/311) من المرضى لديهم تشخيص مرض الكلى المزمن الموجود مسبقًا مقارنةً بـ و في المجموعات المنخفضة والمتوسطة، على التوالي. في المسار العالي، المجموعة تلقى RRT في يوم التوزيع العشوائي مقارنة بـ ( ) و (70/568) في المجموعات المنخفضة والمتوسطة. تُظهر ملفات اليوريا الطولية حسب مجموعة العشوائية في الملف الإضافي 1: الشكل S6. بحلول اليوم السادس، كانت الوسيط لليوريا أعلى في مجموعة البروتين العالي (95% CI 1.1-3.2)، مما يزيد إلى (95% CI 1.3-4.7) بحلول اليوم الثاني عشر. نماذج مختلطة خطية مع انحناءات، تظهر زيادة في قيم اليوريا في مجموعة البروتين العالي كما هو موضح في الشكل 1A.

مجموعات المسارات المخصصة بواسطة تجميع المسارات غير المراقب باستخدام خوارزمية k-means، الملف الإضافي 1: الشكل S5.

كان هناك 344 حالة وفاة بعد 30 يومًا من التوزيع العشوائي. كان متوسط عدد قياسات اليوريا لدى الذين توفوا والذين نجوا حتى اليوم 30 هو 11.0 و 11.5، على التوالي. اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب)، الملف الإضافي 1: الشكل S17. في نموذج كوكس، كانت تقديرات التأثير للتوزيع العشوائي إلى بروتين أعلى 1.08 ( CI 0.88-1.34، الملف الإضافي 1: الجدول S1، الشكل S8، تم تعديله حسب العمر، درجة SOFA الأساسية، RRT في يوم التوزيع العشوائي، ووجود AKI). في تحليل النموذج المشترك، كان الارتفاع في مستوى اليوريا المتغير مع الزمن مرتبطًا بزيادة خطر الوفاة خلال 30 يومًا، بحيث كان الارتفاع بمقدار الضعف في مستوى اليوريا مع مرور الوقت مرتبطًا بـ HR قدره 1.34، 95% CI 1.21-1.48، مع الأخذ في الاعتبار العمر، درجة SOFA الأساسية، RRT في يوم التوزيع العشوائي، ووجود AKI، الجدول 2.

يوضح الشكل 1B مخطط تأثيرات التدخل المقترحة في النموذج المشترك. التأثير غير المباشر المتغير مع الزمن

القيمة بالخط العريض تشير إلى الوسيط
c تمثل الربع الأدنى الوسيط والربع العلوي للمتغيرات المستمرة. يتم وصف المتغيرات الفئوية بواسطة العد والنسب المئوية. هو عدد القيم غير المفقودة. تقييم فيزيولوجيا الحادة والصحة المزمنة APACHE. وحدة العناية المركزة ICU. تقييم الفشل العضوي المتسلسل SOFA. تقييم خطر التغذية المعدل في درجة المرض الحاد mNUTRIC.
تشير إصابة الكلى الحادة إلى المرضى الذين استوفوا معايير KDIGO: المرحلة 1 هي على الأقل زيادة في مستوى الكرياتينين في المصل من الخط الأساسي خلال 48 ساعة أو أوقات الأساس خلال 7 أيام؛ المرحلة 2 هي المرحلة 3 هي ثلاث مرات أو أكثر من الخط الأساسي خلال 7 أيام أو زيادة إلى ما لا يقل عن مع زيادة حادة تزيد عن
محدد في الأمراض المصاحبة على أنها مرض كلوي معتدل: تصفية الكرياتينين ; وأمراض الكلى الشديدة: تصفية الكرياتينين أقل من وليس على غسيل الكلى
يظهر تأثير التدخل علاقة قوية بين البروتين العالي وزيادة اليوريا مع مرور الوقت. يتم دمج هذه العلاقة مع تقدير التأثير للعلامة الطولية على نتيجة البقاء لتلخيص التأثير غير المباشر للتدخل على نتيجة البقاء، من خلال اليوريا. بالنسبة لزيادة بنسبة 1% في اليوريا المتغيرة مع الوقت، هناك ( زيادة في معدل الوفيات خلال 30 يومًا، الشكل 2A. يشير نموذج البقاء إلى عدم وجود تأثير مباشر للبروتين العالي على نتيجة البقاء.

تمت ملاحظة ثلاث امتدادات. أولاً، قوة الارتباط بين اليوريا المتغيرة مع الزمن و30 يومًا
كانت الوفيات مستمرة طوال فترة المتابعة التي استمرت 30 يومًا (الشكل 2B). ثانيًا، كانت المسارات المتزايدة والقيم التراكمية الأعلى لليوريا مرتبطة بزيادة خطر الوفاة خلال 30 يومًا (الملف الإضافي 1: الجدول S2). حيث أن مضاعفة معدل ارتفاع اليوريا لدى المريض من اليوم السابق، تؤدي إلى زيادة مقدرة في خطر الوفاة (HR 3.42، 95% CrI 1.72-6.94). وبالمثل، قمنا بقياس تأثير تراكمي للتعرض لمستويات أعلى من اليوريا (المساحة تحت المنحنى)، الملف الإضافي 1: الجدول S2. كان هناك زيادة في خطر الوفاة (HR 1.42، 95% CrI 1.22-1.65) لمضاعفة المساحة تحت المنحنى لمسار اليوريا.

نموذج مشترك ثانٍ تم تعديله لتأثير العجز العضوي المستمر المتغير مع الزمن (POD) على العلاقة بين تغييرات اليوريا والوفيات. يتم عرض التغيير في درجة POD مع مرور الوقت في الملف الإضافي 1: الشكل S9. لزيادة في درجة POD المتغيرة مع الزمن بمقدار 1، كانت نسبة الخطر للوفاة 1.32 (95% CrI 1.20-1.45)، الجدول 2. في نفس النموذج، بعد الأخذ في الاعتبار تأثير POD، لــ

زيادة بنسبة 1% في اليوريا المتغيرة مع الزمن كان هناك تقدير زيادة في معدل الوفيات خلال 30 يومًا بنسبة (95% CrI 0.23-0.52)، الملف الإضافي 1: الشكل S10.

تم تقدير أن مستوى اليوريا المتغير مع الزمن مرتبط بوفاة المرضى خلال 30 يومًا في نموذج مشترك يستثني المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي الحاد عند البداية (نسبة المخاطر 1.38، فترة الثقة 95% 1.22-1.58، تم تعديلها لعوامل؛ العمر، درجة SOFA الأساسية، وعشوائية جرعة البروتين، الملف الإضافي 1: الجدول S3).

عدد الموضوعات: 1277؛ عدد الأحداث: 344 (26.9%)؛ عدد الملاحظات: 11,317. يسمح تحليل البقاء بالنمذجة المشتركة بتقدير التأثير العشوائي المتغير مع الزمن والمحدد لكل مريض للمتغير الداخلي (اليوريا) على النتيجة. تم تعديل النماذج المشتركة الأولية والثانوية للمتغيرات الأساسية (العمر، علاج استبدال الكلى، تقييم فشل الأعضاء المتسلسل، خلل الكلى، وتوزيع جرعة البروتين عشوائيًا). تم تعديل النموذج المشترك متعدد المتغيرات للمتغيرات الأساسية (العمر، علاج استبدال الكلى، خلل الكلى، وتوزيع جرعة البروتين عشوائيًا). تقدير التأثير هو لزيادة بمقدار الضعف في اليوريا المتغيرة مع الزمن مع فترات موثوقة. تقدير التأثير للنموذج المشترك متعدد المتغيرات هو لزيادة في خلل عضو مستمر واحد مع فترات موثوقة. كانت نسب المخاطر المعدلة هي النسب المعدلة المرتبطة بزيادة بمقدار 1-SD في المتغير المعطى. القيم الأعلى من 1 تشير إلى زيادة في الوفيات. كانت القيم المستخدمة للانحرافات المعيارية كما يلي: العمر، 16.7 سنة؛ ودرجة SOFA، 3.7.

كانت النتائج مشابهة في نموذج مشترك يستبعد المرضى الذين تطور لديهم AKI في الأيام الـ 12 الأولى بعد التوزيع العشوائي (الملف الإضافي 1: الجدول S3). كانت مسارات الكرياتينين في المصل وتطور مراحل AKI وفقًا لـ KDIGO خلال الأيام الـ 12 الأولى من دخول وحدة العناية المركزة مشابهة بين مجموعات التوزيع العشوائي، الملف الإضافي 1: الشكل S11. وجود AKI المتغير مع الزمن في الأيام من 1 إلى 12 زاد من خطر الوفاة (1.08 95%CrI 1.04-1.14، الملف الإضافي 1: الجدول S4). في نفس النموذج، لزيادة بمقدار في اليوريا المتغيرة مع الزمن، كان هناك تقدير لزيادة (95% CrI 0.29-0.54) في وفيات 30 يومًا، الملف الإضافي 1: الشكل S12.
في نموذج مشترك تم تعديله للمتغيرات الأساسية المحددة مسبقًا في نموذج وفيات البروتين EFFORT الأصلي، ظل الارتفاع في اليوريا المتغيرة مع الزمن مرتبطًا بوفيات 30 يومًا (HR 1.31، 95% CrI 1.19-1.47، تم تعديله لـ؛ العمر، درجة APACHE II، درجة الضعف السريرية، الساركوبينيا، نوع القبول، والمنطقة الجغرافية، الملف الإضافي 1: الجدول S3). في تحليل لاحق، تم تقدير أن اليوريا المتغيرة مع الزمن كانت مرتبطة بوفيات 30 يومًا في نموذج مشترك يشمل CKD الأساسية في المتغيرات المعدلة (HR 1.34، 95% CrI 1.21-1.51، تم تعديله للعمر، درجة SOFA الأساسية، RRT في يوم التوزيع العشوائي، وجود AKI، مرض الكلى المزمن، وتوزيع جرعة البروتين عشوائيًا، الملف الإضافي 1: الجدول S3).

نسبة اليوريا إلى الكرياتينين زادت أكثر في المرضى الذين تم توزيعهم عشوائيًا إلى بروتين أعلى، الملف الإضافي 1: الشكل S13.

في هذا التحليل الثانوي لتجربة EFFORT Protein، أدت الجرعات الأعلى من البروتين إلى مسارات يوريا أعلى والتي كانت بدورها مرتبطة بزيادة خطر وفيات 30 يومًا. وبالمثل، كانت زيادة معدل ارتفاع اليوريا والتعرض التراكمي لليوريا المرتفعة مرتبطين بزيادة خطر الوفاة. سمح التوزيع العشوائي الفعال لإنتاج يوريا أعلى بفحص تأثير اليوراجينيس بشكل محدد، وأن التأثير غير المباشر لعلاج البروتين عالي الجرعة الذي يسبب ضررًا تم تقديره أنه يتم عبر اليوراجينيس. استمرت هذه العلاقة في تحليلات الحساسية التي تأخذ في الاعتبار مختلف المتغيرات الأساسية والمتغيرة مع الزمن بما في ذلك خلل الأعضاء وAKI. تتوافق هذه البيانات مع تحليلات ثانوية سابقة مماثلة لمكملات الجلوتامين[17]، ومع فهمنا الحالي لفيزيولوجيا العضلات الهيكلية في الأمراض الحرجة وبشكل خاص خلل الأعضاء المتعدد [12]. تعمل اليوريا في المصل كعلامة بيولوجية للخلل الأيضي الذي يُرى في الأمراض الحرجة مما يؤدي إلى زيادة تحلل البروتين.

يعاني المرضى المصابون بأمراض حرجة من انخفاض في معدلات تخليق بروتين العضلات الأساسية واستجابة تخليقية مخففة لمقاومة البروتين الأيضي وزيادات اليوريا في المصل تعكس نزع الأمين الكبدي للأحماض الأمينية بدلاً من دمج الأنسجة [4، 12]. هذه العمليات المعتمدة على الطاقة بشكل كبير محدودة بفشل الطاقة الحيوية نتيجة لتغير استخدام الركائز [14]. تشير تحليلاتنا لدراسة EFFORT إلى أن توصيل البروتين للمرضى المصابين بأمراض حرجة يتطلب تعديلًا مسترشدًا باليوريا في المصل. بالإضافة إلى التقدير الذي يربط اليوريا المتغيرة مع الموت، كانت زيادة معدل ارتفاع اليوريا والتعرض التراكمي لمستويات يوريا أعلى مرتبطة بالموت. تدعم هذه الروابط المتسقة الفائدة المحتملة لاستراتيجيات توجيه اليوريا. أولاً، لتجنب جرعة بروتين أولية تعزز معدل ارتفاع اليوريا في الفشل العضوي المبكر. ثانيًا، للحد من التعرض التراكمي لمستويات يوريا مرتفعة من جرعات البروتين. ما إذا كانت هذه الطريقة تحسن نتائج المرضى تتطلب اختبارًا مستقبليًا. ومع ذلك، تمثل هذه الاستراتيجية طريقًا واعدًا لتحريك مجال إعادة تأهيل الرعاية الحرجة إلى الأمام من حيث اختيار المرضى وإشارات الفعالية.

بينما يمكن استخدام الأحماض الأمينية الداخلية والخارجية لتوليد ATP في حالة المجاعة (على سبيل المثال، عبر دورة كاهيل) فإن هذا ليس بالضرورة صحيحًا في حالة خلل الأعضاء المتعدد. نقص الأكسجة داخل العضلات وإشارات الالتهاب، وضعف نقل GLUT-4 ومقاومة الأنسولين

إما أن تحول العمليات الرئيسية أو توفر حلقات تغذية راجعة سلبية لمنع ذلك [10-12]. النتيجة النهائية هي تراكم المستقلبات السامة الوسيطة مثل الأمونيا من دورة اليوريا المثقلة. يمكن أن يتضمن خلل الأعضاء المتعدد خللًا طفيفًا في الكبد، مما قد يؤثر على مثل هذه المسارات في غياب فشل الكبد الواضح. كان قياس تأثير خلل الكبد على تدفق دورة اليوريا (وبالفعل تدفق دورة كاهيل) خارج نطاق إعادة التحليل، على الرغم من أن الاحتفاظ بالإشارة للضرر بعد التصحيح لخلل الأعضاء المستمر
يوحي بأن هذا قد تم أخذه في الاعتبار. في الأعمال السابقة، أظهرنا نحن وآخرون العلاقة بين الوفيات، والمراضة، والأمراض الحرجة المستمرة مع نسبة اليوريا إلى الكرياتينين [21]. زادت نسبة اليوريا إلى الكرياتينين في المرضى الذين تم توزيعهم عشوائيًا إلى بروتين أعلى مما يشير إلى زيادة في الكاتابوليزم. ومع ذلك، لم يتم تقييم فقدان توليد الكرياتينين المرتبط بهدر العضلات في هذا التحليل، حيث كان التركيز على العلاقة الأقرب بكثير بين جرعة البروتين واستقلاب اليوريا.

على الرغم من أن AKI هو سبب مستقل لليوريميا، فإن حقيقة أن التوزيع العشوائي إلى بروتين أعلى كان مرتبطًا بزيادة اليوريا وأن الضرر المرتبط بالبروتين عالي الجرعة كان مرتبطًا بوجود AKI تشير إلى أن السببين لليوريميا (انخفاض الإزالة وزيادة الإنتاج) قد يعززان في ارتباطاتهما مع النتائج السلبية. بالمقابل، يتم تحفيز الحاجة السريرية لبدء RRT من خلال عدم التوازن بين العرض والطلب فيما يتعلق بوظيفة الكلى والعبء الأيضي وبالتالي تعكس أيضًا كل من زيادة إنتاج اليوريا وعدم كفاية الإزالة. في هذه الدراسة، يسمح التوزيع العشوائي الفعال لإنتاج يوريا أعلى بفحص تأثير اليوراجينيس بشكل محدد. تشير تحليلاتنا إلى أن اعتبارات تحميل البروتين في الأمراض الحرجة قد تنطبق أيضًا على المرضى الذين يعانون من AKI، مع أو بدون RRT.

تعزز النتائج التي تشير إلى أساس بيولوجي لإمكانية الضرر الناتج عن جرعات البروتين العالية في المرضى المصابين بأمراض حرجة القضية بعدم تجاوز الجرعات الإرشادية الحالية من في أي مرحلة من مراحل المرض الحرج، خاصة في حالة ارتفاع أو زيادة اليوريا. أظهرت العديد من التجارب السريرية العشوائية زيادة في اليوريا مع جرعات مختلفة من الأحماض الأمينية أو التغذية المعززة. قد يتم تعديل الإرشادات السريرية لإزالة الجرعات العالية، أو للنظر في مستوى اليوريا في المصل قبل زيادة الجرعة. بشكل أكثر تحديدًا، يمكن تقييم اليوريا المتغيرة مع الوقت بعد بدء التغذية، لأخذ التباين الأساسي في الاعتبار. بينما تتطلب تفاصيل التنفيذ السريري لمثل هذه الطرق توضيحًا، يجب على الأطباء النظر في تعديل توصيل البروتين للمرضى في حالة حرجة عند ملاحظة زيادة اليوريا بعد تحميل البروتين. قد تركز الأبحاث المستقبلية على نشاط دورة اليوريا وآليات سمية الأمونيا في الأنسجة، وإذا كانت هذه هي الآلية التي تميز العمليات الخلوية المتغيرة التي تصف خلل الأعضاء المتعددة في المرض الحرج. بالإضافة إلى تحسين توصيف إخراج النيتروجين في خلل الأعضاء المتعددة، يجب أخذ هذه التأثيرات في الاعتبار جنبًا إلى جنب مع آليات أخرى محتملة للضرر الناتجة عن الأحماض الأمينية مثل تغيير الالتهام الذاتي. تشمل الطرق المحتملة تحليل مجموعات البيانات الكبيرة مع مقاييس النتائج الوظيفية، ودراسات الملاحظة التي تفحص سمية الأمونيا المعتمدة على الجرعة، أو الفحص القائم على الوساطة للتجارب السريرية.

تظل هذه التحليلات ثانوية بالنسبة للتحليل الرئيسي لتجربة EFFORT Protein ولها عدة قيود. تقديرنا للعلاقة السببية المحتملة بين اليوريا المتغيرة مع الوقت ومعدل الوفيات خلال 30 يومًا يعتمد على افتراض أنه تم أخذ العوامل المربكة المناسبة في الاعتبار. هذا الافتراض القوي
يشير إلى أنه تم معالجة التداخل الأساسي المتبقي والتداخل المتغير مع الوقت وأن الاعتماد المتبادل المشترك بين قياسات اليوريا الطولية ومعدل الوفيات خلال 30 يومًا يتم شرحه بواسطة تأثيرات عشوائية كامنة خاصة بالموضوع. إن استمرار العلاقة بين ارتفاع اليوريا والوفيات في النماذج المشتركة مع مجموعة متنوعة من هياكل الارتباط وفي النماذج التي تتضمن خلل الأعضاء المتغير مع الوقت، أو حالة الفشل الكلوي الحاد بشكل خاص، يضيف دعمًا لعلاقة سببية محتملة. في تحليلات الحساسية، تمكنا من اختبار العلاقة باستخدام مجموعة التعديل الأصلية لتجربة EFFORT Protein لتوفير التناسق مع العوامل المربكة ذات الصلة سريريًا التي تم اختيارها مسبقًا. أخيرًا، عندما أزلنا أي تأثير للفشل الكلوي الحاد الأساسي، وهي مجموعة فرعية مهمة بها إشارة للضرر في تجربة EFFORT Protein، ظلت زيادات اليوريا مرتبطة بالوفيات. تضيف هذه التحليلات دليلًا مهمًا لدعم اليوريا كبديل في المسار السببي لتأثير البروتينات على الوفيات.

القيود الثانية هي أن هذه التحليلات لم تكن ما تم تصميم تجربة EFFORT Protein من أجله وتظل معرضة لخطر التحيز المتبقي. لم يتم تحديد نهج النموذج المشترك ومجموعات التعديل مسبقًا ولا يزال هناك خطر من التداخل، خاصة من التداخل الإضافي الذي تم تقديمه من خلال فحص العلاقة مع بديل (اليوريا) على مر الزمن. ومع ذلك، عندما يكون الاهتمام هو فهم العملية التي تؤثر بها المعالجة على نتيجة البقاء من خلال مسار علامة حيوية، فإن النماذج المشتركة توفر إطارًا جذابًا ويمكن أن تميز بين تأثير المعالجة غير المباشر على نتيجة البقاء من خلال النتيجة الطولية، وتأثير المعالجة المباشر على نتيجة البقاء. ثالثًا، كدراسة عشوائية متعددة المراكز، لا توجد بيانات آلية من تجربة EFFORT Protein لتوضيح المسار البيولوجي المعني بين زيادة إنتاج اليوريا، وتلف الأعضاء، والوفيات. وبالتالي، يمكننا فقط تقديم إطار مفاهيمي بشأن الآليات المحتملة للضرر التي قد تشمل الأمونيا. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعدد المسارات المحتملة التي يمكن أن تؤثر على التمثيل الغذائي مثل الالتهاب والتثبيت لا يتم قياسها مباشرة وبالتالي تحد من تقييم اليوريا كعلامة على المقاومة الغذائية. ومع ذلك، عندما تم تضمين خلل الأعضاء المستمر والحاجة إلى دعم الأعضاء المستمر – نقاط نهاية بديلة واسعة ولكنها قوية نسبيًا لعلم الأمراض للمرض الحرج – في النماذج المشتركة، ظلت زيادات اليوريا مرتبطة بالضرر. رابعًا، ليس لدينا بيانات مفصلة عن حدوث النزيف المعوي الذي قد يكون زاد من اليوريا وأربك هذه التحليلات. أخيرًا، يوفر تصميم تجربة EFFORT Protein العشوائية القابلة للتطبيق تأثيرات علاجية متوسطة قوية (مثل زيادة البروتين مما يؤدي إلى زيادة مستويات اليوريا)، ولكن مدى قابلية تعميم هذه التأثيرات على
مستوى المريض الفردي مع اختلاف المخاطر الأساسية لا يزال غير معروف.

تم تقدير زيادة خطر الوفاة لدى المرضى الأكثر مرضًا الذين تم توزيعهم عشوائيًا إلى جرعة بروتين أعلى في تجربة EFFORT Protein على أنها متوسطة من خلال زيادة نشاط دورة اليوريا، والتي تعتبر اليوريا في المصل توقيعًا بيولوجيًا. يجب أخذ مستوى اليوريا في المصل في الاعتبار عند بدء واستمرار توصيل البروتين للمرضى في حالة حرجة.

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi. org/10.1186/s13054-024-04799-1.

ملف إضافي 1. ملحق البيانات عبر الإنترنت.

RH و JP و ZP و DH قاموا بتصميم هذه الدراسة الفرعية، وتفسير البيانات، وكتابة المسودة الأولى من المقال. قام DH و AD بتصميم وتنسيق دراسة EFFORT Protein الأصلية وقدموا الوصول إلى قاعدة البيانات وراجعوا خطة التحليل الإحصائي. كان DB قائدًا وطنيًا لدراسة EFFORT Protein. قام RH و JP بإجراء التحليلات. كان لدى ZP وصول كامل إلى جميع البيانات في الدراسة وكان لديه المسؤولية النهائية عن القرار بتقديمها للنشر. قام جميع المؤلفين بمراجعة المقال النهائي بشكل نقدي.

لم يكن هناك مصدر تمويل لهذه الدراسة.

البيانات التي تم جمعها لدراسة EFFORT Protein الأساسية لن تكون متاحة للجمهور ولكن يتم استخدامها داخليًا لأغراض ثانوية. قاموس البيانات أو أدوات الدراسة الأخرى متاحة من المؤلفين المنسقين (DKH و AD) عند الطلب.

تم تسجيل تجربة EFFORT Protein فيclinicaltrials.gov (NCT03160547). لم يتم تلقي تمويل أساسي لإعادة تحليل هذه البيانات. تم الموافقة على بروتوكول تجربة EFFORT Protein التي بدأها الباحث من قبل لجان الأخلاقيات البحثية في جامعة كوينز، كندا، ومجلس مراجعة مؤسسي مركزي (IRB) في جامعة فاندربيلت، ناشفيل، تينيسي، الولايات المتحدة الأمريكية الذي منح إعفاء من الموافقة المستنيرة للمواقع التي انضمت إلى هذا IRB المركزي. بخلاف ذلك، حيثما كان مطلوبًا من مواقع الدراسة المحلية، تم الحصول على موافقة أخلاقية محلية وتم أيضًا الحصول على الموافقة المستنيرة من وكلاء المرضى المعينين قبل التوزيع العشوائي. جميع المواقع والأشخاص الذين شاركوا في جمع البيانات مدرجون في الملحق الإضافي للمخطوطة الرئيسية.

تلقى DEB رسوم متحدثين، ودعم حضور مؤتمرات أو رسوم من مجلس استشاري من Baxter و Cardinal Health و Avanos. تلقى ZP أتعاب استشارية من GlaxoSmithKline و Lyric Pharmaceuticals و Faraday Pharmaceuticals و Fresenius-Kabi، ودعم تعليمي من Baxter و Nestle Health Science ورسوم متحدثين من Orion و Baxter و Sedana و Fresenius-Kabi و Nestle. لدى JP اتفاقيات استشارية حديثة مع Jaffron Biomedical و Mission Therapeutics و Paion Ltd. و Nephrolyx GmbH و Medibeacon Inc. و Baxter Inc و Nikkiso Europe GmbH، وتلقى رسوم متحدثين وضيافة من Baxter Inc و BBraun و Nikkiso Europe و Fresenius Medical Care وتلقى دعمًا بحثيًا من Astute Medical/ Biomerieux و Jaffron Biomedical. لم يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

وحدة العناية الحرجة للبالغين، مستشفى لندن الملكي، مؤسسة بارتس الصحية، طريق وايت تشابل، لندن E1 1BB، المملكة المتحدة. معهد ويليام هارفي للأبحاث، جامعة كوين ماري في لندن، لندن، المملكة المتحدة. قسم الطب الكلوي وزراعة الأعضاء، مستشفى لندن الملكي، مؤسسة بارتس الصحية، طريق وايت تشابل، لندن E1 1BB، المملكة المتحدة. وحدة تقييم الأبحاث السريرية، مركز كينغستون للعلوم الصحية، كينغستون، أونتاريو، كندا. أقسام الرعاية الحرجة والتغذية وعلوم الحميات، مؤسسة غايز وسانت توماس NHS، لندن، المملكة المتحدة. قسم طب الرعاية الحرجة، جامعة كوينز، كينغستون، أونتاريو، كندا.

تاريخ الاستلام: 1 نوفمبر 2023 تاريخ القبول: 4 يناير 2024
تم النشر على الإنترنت: 16 يناير 2024

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

Keywords Urea, Multi-organ failure, Intensive care, Protein, Joint modelling

Establishing the optimal dose of protein has been identified as a research priority in the field of critical care nutrition to inform clinical practice [1]. While protein is a fundamental requirement for stimulation of protein synthesis and cellular function and survival, the current evidence remains insufficient to recommend an optimum dose. Observational studies are conflicting with some leading to hypotheses that higher doses of protein in the critically patient may lead to harm [2]. In an 85 centre study of 1301 patients, the EFFORT Protein trial randomised patients to day or more of protein versus day or less for 28 days [3]. No benefit was seen from higher doses of protein, with a signal for potential harm in a cohort of ICU patients with multiorgan failure. While the association between protein load and adverse clinical outcomes in patients with multiorgan failure has been previously hypothesised [4], the EFFORT Protein data highlights the need for this association to be investigated in detail, to identify which patients may be harmed by high protein dose. Randomised controlled trials estimate the overall effect of an intervention, but in their delivery, important data on the mechanism through which this intervention exerts its effect may also be collected [5]. We are increasingly aware that heterogeneous responses to interventions are seen in critically ill patients as a result of diverse baseline and disease-related factors [6]. Identifying biological signatures of effectiveness (or harm) via mechanistic understandings of these interventions could aid the future population enrichment for subsequent studies [7]. Applying joint modelling to longitudinal data collected from clinical trials may address this, and in the case of EFFORT Protein distinguish and isolate the effects of ureagenesis from protein loading on survival [8, 9]. Serum urea increases have consistently been observed across the intervention arms of nutritional RCTs of amino acid supplementation [10, . The capacity for the critically ill patient to use amino acids for muscle protein synthesis is estimated to be lower than that of a healthy human [12].
Protein not taken up by tissues are degraded to amino acids and further metabolised to ammonia and thereafter into urea. The rate limiting step is carbamoyl phosphate synthetase 1 , which is ATP dependent and may therefore be limited by altered substrate utilisation [13, 14]. While ammonia is toxic, its measurement is not recommended in the majority of clinical settings [15]. Further serum ammonia levels show variability from sample handling and processing, making multicentre evaluations unreliable [16]. Urea acts as a biological signature of urea cycle function and ammonia disposal, and can be measured at scale, e.g. in an 85 centre trial randomising 1301 patients. There is both biological rationale and observational data
for ureagenesis as a result of altered or excess urea cycle activity in multi-organ failure [17].

We hypothesise that there is a sequential causal relationship between higher protein delivery, increased urea cycle flux and increased risk of death, with urea acting as a biological signature of toxic protein deamination products. Effective randomisation to higher urea production allows the effect of ureagenesis to be specifically examined. We aimed to estimate this via a joint model of the time-to-event outcome (30-day mortality) and a longitudinal maker (urea) using data from EFFORT Protein. This data will add to the increasing body of evidence supporting targeting of routinely collected data to guide nutritional therapy, aiming to reduce harmful metabolic effects and, ultimately, improve patient outcomes.

Exploratory secondary analysis of a randomised controlled trial based on STROBE guidance.

A multicentre, pragmatic, volunteer-driven, registrybased, randomised, open-label, clinical trial comparing a higher protein dose ( day ) to a lower ( day ) on time-to-discharge alive from hospital and 60-day mortality. The trial included 1301 adult ( years) participants with nutrition risk and requiring mechanical ventilation for .[3, 18] Patients who did not receive the study intervention had missing hospital outcomes or only had one urea measurement were excluded from this post-hoc analysis.

The EFFORT Protein trial is registered at clinicaltrials.gov (NCT03160547-2017-05-17). No core funding was received for this reanalysis. The investigator-initiated EFFORT Protein trial protocol was approved by the Research Ethics Committees of Queen’s University, Canada, and a central institutional review board (IRB) at Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA that granted waiver of informed consent for sites that acceded to this central IRB. Otherwise, where required by local study sites, local ethics approval was obtained, and informed consent was also obtained from designated patient surrogates before randomisation. All sites and personnel that participated in the data collection are listed in the Supplementary Appendix of the main manuscript [3].

We considered all 1301 patients of the modified intention to treat analysis of the primary EFFORT Protein trial [3].

Baseline and daily data collection for EFFORT Protein are outlined in detail in the trial protocol [18]. Urea measurements were collected for 12 days. Persistent organ dysfunction (POD) was scored daily for 30 days for receipt of: mechanical ventilation, vasopressor therapy, and renal replacement therapy. Covariables included the treatment effect of higher protein and the following a priori baseline covariates:

The co-primary outcome was 30 -day mortality and time-varying urea. We expected urea measurements to be concentrated in the first 7 days post-randomisation. In addition, our previous work demonstrated urea changes to occur early in critical illness and therefore a priori we aimed to model associations with time-varying urea and death within the 30 day time frame [17, 21].

We presented descriptive baseline and outcome data as medians with interquartile ranges for numerical data, and as numbers with percentages for categorical data. Raw urea trajectories are presented over time for both treatment groups. To further describe the heterogeneity in urea trajectories over time, we performed unsupervised trajectory clustering on repeated urea measurements. We used an unsupervised k -means trajectory clustering approach based on repeated log-transformed urea measurements. The number of clusters was chosen based on examination of several partition indices and our preference for selecting the smallest number of discrete clusters to illustrate trajectory variability. For a table of
characteristics, patients were stratified by urea trajectory using the longitudinal clustering.

We used a joint model to quantify treatment effect of randomisation to high protein by linking the time-to-event and longitudinal outcome. The joint model can estimate two effects of protein randomisation: The direct effect of protein randomisation on survival, and the indirect effect of protein randomisation on survival through time-varying urea. The survival outcome (Cox model) and longitudinal urea measurements (linear mixed effects model) are combined in one joint model. Over time, urea is intermittently measured, has a degree of measurement error, and death stops urea measurements. Joint models allow estimation of the time-varying, patient-specific random effect of the endogenous covariate (urea) on an outcome (30-day mortality) with adjustment for baseline covariates while accounting for non-random dropouts due to death or discharge alive [23,24].

We adapted a directed acyclic graph (DAG) to illustrate the potential causal paths tested in the joint model [25]. The elaborated, pre-specified DAG was based on expert opinion and biological plausibility, Additional file 1: Fig S1.

To build the joint model, we followed two steps. Firstly, we used a Cox model for 30-day mortality and included covariates as justified above and outlined in the DAG, Additional file 1: Fig S1. Secondly, we used a linear mixed effects model for longitudinal urea measurement. The randomisation group, measurement day, and RRT were included as fixed effects. Random intercepts and slopes were given to each subject to allow for different trajectories of urea over time. We expected urea rise to be greatest in the first 7 days in the higher protein group and introduced an interaction term for protein randomisation and time. In addition, urea was log transformed to improve likelihood of model convergence. We used cubic splines to allow for nonlinear changes of log-urea over time. The splines work by dividing the range of longitudinal urea measurements into parts that are then assigned a ‘basis function’ or ‘knots’. Three knots were chosen to capture the majority of nonlinearity based on our groups previous analyses [17, 26].

In secondary analysis, we performed several extensions of the joint models to investigate different forms of association between urea and 30-day mortality. The primary joint model estimates the association of the current value of urea at time ( ) with the hazard of 30-day mortality, Additional file 1: Fig S2. However, patients with the same urea measurement at may not have the same risk depending on the history of previous urea measurements, e.g. a patient with a decreasing urea versus a patient with
an increasing urea. Therefore, we explored whether the hazard of death at time point is associated with the trajectory of urea at (defined by the slope incorporating the previous day’s urea measurement), Additional file 1: Fig S2B. In addition, we explored the cumulative effects by examining the association of the whole area under the urea trajectory up to with the time-to-event outcome, Additional file 1: Fig S2C. Model diagnostics were done by visual inspection of the diagnostic plots. The results are presented as hazard ratios (HR) with corresponding two-sided 95% credible intervals (CrIs).

We performed several sensitivity analyses. Firstly, we made a joint model to adjust for baseline covariates pre-specified in the EFFORT Protein trial analysis: Age, APACHE II score, clinical frailty score, sarcopenia (SARC-F), admission type, and geographic region, where all continuous covariates were modelled as linear.
Secondly, to further test the association of urea change with protein dose and mortality, we used a multivariate joint model to include a daily POD score. This joint model tested the association of longitudinal POD score and urea with 30-day mortality. We constructed a DAG to elucidate the structure of the multivariate model, Additional file 1: Fig S3. In this multivariate analysis, we expected association of urea with 30-day mortality to remain but be smaller in magnitude than in the univariate joint model. This would suggest that the biological processes linking urea, POD, and outcome are interrelated, but that urea will continue to provide additional information on risk of death [24].

Thirdly, to address the potential confounding effect of AKI on urea rise and mortality, we repeated the primary joint model in a subgroup of patients with no AKI at baseline. Additionally, we made a multivariate joint model to include AKI status at the same time point of urea measurements (up to day 12). Acute kidney injury was defined as the presence of KDIGO stage 1 AKI or above using serum creatinine criteria [27]. This joint model tested the association of longitudinal AKI status and urea with 30-day mortality. Finally, to allow comparison with previous work linking urea-to-creatinine ratio changes to different amino acid doses, we modelled urea-to-creatinine ratio trajectories over time. [21]

We described the number of urea measurements over time. The joint model structure explicitly handled missingness of the longitudinal marker urea [24, 28]. In sensitivity analysis, there was missing baseline covariates and patients were excluded as specified in the main EFFORT Protein trial analysis and numbers included reported [3].

All statistical analyses were conducted using (R Core Team, R Foundation for Statistical Computing version 4.2) and joint modelling used the JMbayes2 package [29].

From January 17, 2018, to December 3, 2021, 1329 patients were randomised in the EFFORT Protein trial. Due to early death, discharge, or withdrawal of consent, 28 patients were excluded from the analysis. Additional exclusions were: 4 patients with missing hospital outcomes and 20 with only 1 urea measurement. 1277 patients were included in the primary analysis, Additional file 1: Fig S4. The median number of urea measurements per patient was 12 [8-12].

Baseline patient characteristics and primary outcomes from the EFFORT Protein trial are presented in Table 1, divided by high, medium, and low urea trajectory groups as determined by longitudinal urea measurement clusters, Additional file 1: Fig S5. In the high urea trajectory group, 23% (70/311) of patients had a diagnosis of preexisting CKD compared to and in the low and medium groups, respectively. In the high trajectory, group received RRT on the day of randomisation compared to ( ) and (70/568) in low and medium groups. Longitudinal urea profiles by randomisation group are shown in Additional file 1: Fig S6. By day 6, median urea was higher in the high protein group (95% CI 1.1-3.2), increasing to (95% CI 1.3-4.7) by day 12. Linear mixed models with splines, demonstrating increasing urea values in the high protein group as shown in Fig. 1A.

Trajectory groups allocated by unsupervised trajectory k-means clustering, Additional file 1: Fig S5.

There were 344 deaths at 30 days post-randomisation. Mean number of urea measurements in those that died and those that survived to day 30 were 11.0 and 11.5, respectively ( , Wilcoxon rank sum test), Additional file 1: Fig S17. In the Cox model, the effect estimate for randomisation to higher protein was 1.08 ( CI 0.88-1.34, Additional file 1: Table S1, Fig. S8, adjusted for age, baseline SOFA score, RRT on the day of randomisation, and presence of AKI). In the joint model analysis, an increase in time-varying urea was associated with an increased risk of 30-day mortality, such that a twofold increase in urea over time would be associated with a HR of 1.34, 95% CI 1.21-1.48, accounting for age, baseline SOFA score, RRT on the day of randomisation, and presence of AKI, Table 2.

A schematic of proposed intervention effects in the joint model is shown in Fig. 1B. The time-varying indirect

Bold value indicates median
c represent the lower quartile , the median , and the upper quartile for continuous variables. Categorical variables are described by counts and percentages. is the number of non-missing values. APACHE acute physiology and chronic health evaluation. ICU intensive care unit. SOFA sequential organ failure assessment. mNUTRIC modified nutrition risk assessment in critical illness score
*Acute kidney injury refers to patients who met the criteria of KDIGO: stage 1 is at least increase in serum creatinine from baseline within 48 h or times baseline within 7 days; stage 2 is times baseline within 7 days; stage 3 is three times or more baseline within 7 days or increase to at least with an acute increase of more than
Defined in comorbidities as moderate renal disease: creatinine clearance ; and severe renal disease: creatinine clearance less than and not on dialysis
intervention effect shows a strong relationship between high protein and increase in urea over time. This association is combined with the effect estimate of the longitudinal marker on the survival outcome to summarise the indirect effect of the intervention on the survival outcome, through urea. For a 1% increase in time-varying urea there is a ( ) increase in 30-day mortality, Fig. 2A. The survival sub-model suggests no direct effect of high protein on the survival outcome.

Three extensions were observed. Firstly, the strength of the association between time-varying urea and 30-day
mortality was persistent across the entire duration of 30-day follow-up (Fig. 2B). Secondly, increasing trajectories and higher cumulative values of urea were associated with higher risk of 30-day mortality (Additional file 1: Table S2). Whereby a doubling of the rate of rise of a patient’s urea from the previous day, results in an estimated increase in the hazard of death (HR 3.42, 95% CrI 1.72-6.94). Similarly, we measured a cumulative effect of exposure to higher urea levels (area under the curve), Additional file 1: Table S2. There was an increased risk of death (HR 1.42, 95% CrI 1.22-1.65) for a doubling of the area under the curve of the urea trajectory.

A second joint model adjusted for the time-varying effect of persistent organ dysfunction (POD) on the association of urea changes with mortality. Change in POD score over time is shown in Additional file 1: Fig. S9. For an increase in time-varying POD score of 1, the hazard ratio for death was 1.32 (95% CrI 1.20-1.45), Table 2. In the same model, after accounting for effect of POD, for a

1% increase in time-varying urea there was an estimated (95% CrI 0.23-0.52) increase in 30-day mortality, Additional file 1: Fig. S10.

Time-varying urea was estimated to be associated with 30 -day mortality in a joint model excluding patients with AKI at baseline (HR 1.38, 95% CrI 1.221.58, adjusted for; age, baseline SOFA score, and protein dose randomisation, Additional file 1: Table S3).

Number of subjects: 1277; number of events: 344 (26.9%); number of observations: 11,317 . Joint modelling survival analysis allows estimation of the time-varying, patient-specific random effect of the endogenous covariate (urea) on an outcome. Primary and secondary joint models were adjusted for baseline variables (age, renal replacement therapy, sequential organ failure assessment, kidney dysfunction, and protein dose randomisation). Multivariate joint model was adjusted for baseline variables (age, renal replacement therapy, kidney dysfunction, and protein dose randomisation). Effect estimate is for a twofold increase in time-varying urea with credible intervals. Effect estimate for the multivariate joint model is for an increase in one persistent organ dysfunction with credible intervals. The hazard ratios were the adjusted hazard ratios associated with a 1-SD increment in the given variable. Values higher than 1 indicate an increased mortality. The values used for standard deviations were as follows: age, 16.7 years; and SOFA score, 3.7.

Results were similar in a joint model excluding patients who developed AKI in the first 12 days post-randomisation (Additional file 1: Table S3). Trajectories of serum creatinine and evolution of KDIGO AKI stages over the first 12 days of ICU admission were similar between randomisation groups, Additional file 1: Fig. S11. The presence of time-varying AKI on days 1 to 12, increased the hazard of death (1.08 95%CrI 1.04-1.14, Additional file 1: Table S4). In the same model, for a increase in time-varying urea there was an estimated (95% CrI 0.29-0.54) increase in 30-day mortality, Additional file 1: Fig S12.
In a joint model adjusted for baseline covariates prespecified in the original EFFORT Protein mortality model, an increase in time-varying urea remained associated with 30 -day mortality (HR 1.31, 95% CrI 1.19-1.47, adjusted for; age, APACHE II score, clinical frailty score, sarcopenia, admission type, and geographic region, Additional file 1: Table S3). In a post hoc analysis, timevarying urea was estimated to be associated with 30-day mortality in a joint model including baseline CKD in the adjusted covariates (HR 1.34, 95% CrI 1.21-1.51, adjusted for age, baseline SOFA score, RRT on the day of randomisation, presence of AKI, chronic kidney disease, and protein dose randomisation, Additional file 1: Table S3).

Urea-to-creatinine ratio increased more in patients randomised to higher protein, Additional file 1: Fig S13.

In this secondary analysis of the EFFORT Protein trial, higher doses of protein resulted in higher urea trajectories which were in turn associated with an increased risk of 30-day mortality. Similarly, greater rate of rise of urea and higher cumulative exposure to urea were associated with an increased risk of death. Effective randomisation to higher urea production allowed the effect of ureagenesis to be specifically examined, and that the indirect treatment effect of high-dose protein causing harm was estimated to be mediated via ureagenesis. This relationship persisted in sensitivity analyses accounting for different baseline and time-varying confounders including organ dysfunction and AKI. These data are concordant with previous similar secondary analyses of glutamine supplementation[17], and with our current understanding of skeletal muscle physiology in critical illness and specifically multi-organ dysfunction [12]. Serum urea acts as a biological signature of the metabolic derangement seen in critical illness leading to increased protein degradation.

Critically ill patients exhibit both reduced baseline muscle protein synthetic rates and an attenuated synthetic response to protein-anabolic resistance and serum urea increases reflect amino acid hepatic deamination as opposed to tissue incorporation [4, 12]. These highly energy dependent processes are limited by bioenergetic failure as a result of altered substrate utilisation [14]. Our analysis of the EFFORT study suggests that protein delivery to critically ill patients requires modification guided by the serum urea. In addition to the estimate associating time-varying urea with death, the rate of rise of urea and the cumulative exposure to greater urea levels were associated with death. These consistent associations support the potential benefit of urea guided strategies. Firstly, to avoid a protein dose initially that amplifies the rate of rise of urea in early organ failure. Secondly, to limit the cumulative exposure to high urea levels from protein dosing. Whether this approach improves patient outcomes requires prospective testing. However, such a strategy represents a promising avenue to move the critical care rehabilitation field forward in terms of patient selection and efficacy signals.

While endogenous and exogenous amino acids can be used for ATP generation in starvation (e.g. via the Cahill cycle) this is not necessarily true in multi-organ dysfunction. Intramuscular hypoxia and inflammatory signalling, impaired GLUT-4 translocation and insulin resistance

either divert key processes or provide negative feedback loops to prevent this [10-12]. The end result is an accumulation of toxic intermediary metabolites such as ammonia from an overburdened urea cycle. Multi-organ dysfunction can include subtle liver dysfunction, which may affect such pathways in the absence of overt hepatic failure. Quantifying the effect of hepatic dysfunction on urea cycle flux (and indeed Cahill cycle flux) was outside the scope of the reanalysis, though the retention of the signal for harm following correction for persistent organ
dysfunction implies that this may have been accounted for. In previous work, ourselves and others have demonstrated the relationship between mortality, morbidity, and persistent critical illness with the urea-to-creatinine ratio [21]. Urea-to-creatinine ratio increased in patients randomised to higher protein suggesting an increase in catabolism. However, loss of creatinine generation related to muscle wasting was not assessed in this reanalysis, as the focus was on the much closer relationship between protein dose and urea metabolism.

Although AKI is an independent cause of uraemia, the fact that randomisation to higher protein was associated with higher urea and that harm associated with high-dose protein was associated with presence of AKI suggests that the two causes of uraemia (decreased elimination and increased production) may potentiate in their associations with adverse outcome. By contrast, clinical need to commence RRT is triggered by a supply demand imbalance with respect to renal function and metabolic burden and thus also reflects both excess urea generation and inadequate elimination. In this study, effective randomisation to higher urea production allows the effect of ureagenesis to be specifically examined. Our analyses suggest considerations for protein loading in critical illness may equally apply to patients with AKI, with or without RRT.

The findings of a biological basis for the potential for harm from high protein doses in the critically ill patient strengthens the case for not exceeding the current guidance doses of at any stage in critical illness, especially in the setting of a raised or rising urea. Multiple RCTs have demonstrated increases in urea with varying doses of amino acids or enhanced feeding [30]. Clinical guidelines may be revised to remove higher doses, or to consider serum urea prior to dose escalation. More specifically, time-varying urea could be assessed post initiation of nutrition, to account for baseline heterogeneity. While the nuances of clinical implementation of such methods require elucidating, clinicians should consider modifying protein delivery to critically ill patients when a rising urea is observed following protein loading. Future research might focus on urea cycle activity and the mechanisms of tissue ammonia toxicity, and indeed if this is the mechanism of the altered cellular processes characterising multi-organ dysfunction in critical illness. In addition to better characterisation of nitrogen excretion in multi-organ dysfunction, these effects need to be considered alongside other potential mechanisms of harm of amino acids such as altered autophagy [31]. Potential avenues include large dataset analyses with functional outcome measures, observational studies examining dose-dependent ammonia toxicity, or mediation-based examination of clinical trials.

These analyses remain secondary to the main analysis of the EFFORT Protein trial and have several limitations. Our estimate of the potential causal relationship between time-varying urea and 30 -day mortality remains dependent on the assumption that appropriate confounders have been accounted for. This strong
assumption suggests residual baseline and time-varying confounding has been addressed and the shared interdependencies between the longitudinal urea measurements and 30-day mortality are explained by latent, subject-specific random effects [23]. The persistence of the association between urea rise and mortality in joint models with a variety of association structures and in models incorporating time-varying organ dysfunction, or specifically AKI status, adds support to a putative causal relationship. In sensitivity analyses, we were able to test the association using the original EFFORT Protein adjustment set to provide consistency with preselected, clinically relevant confounders. Finally, when we removed any effect of baseline AKI, an important subgroup with a signal for harm in the EFFORT Protein, urea increases remained associated with mortality. These analyses add important evidence to support urea as a surrogate on the causal pathway in proteins’ effect on mortality [7].

A second limitation is that these analyses were not what the EFFORT Protein trial was designed for and remain at risk of residual bias. The joint model approach and adjustment sets were not pre-specified and there remains risk of confounding, especially from additional confounding introduced by examining a relationship with a surrogate (urea) over time [32]. However, when interest is to gain understanding into the process of how a treatment affects the survival outcome via a biomarker pathway, joint models provide an attractive framework and can potentially distinguish both the indirect treatment effect on the survival outcome through the longitudinal outcome, and the direct treatment effect on the survival outcome [9]. Third, as a pragmatic multicentre RCT, there are no mechanistic data from the EFFORT Protein trial to elucidate the biological pathway involved between excess ureagenesis, organ damage, and mortality. Consequently, we can only provide a conceptual framework regarding potential mechanisms of harm which may involve ammonia. In addition, the multitude of potential pathways that can impact catabolism such as inflammation and immobilisation[33] are not directly measured and therefore limit the assessment of urea as a marker of nutritional resistance. However, when persistent organ dysfunction and need for ongoing organ sup-port-broad but relatively robust surrogate endpoints of the pathophysiology of critical illness-were included in joint models, urea rises remained associated with harm. Fourth, we do not have detailed data on incidence of gastrointestinal bleeding which could have increased urea and confounded these analyses. Finally, EFFORT Proteins, pragmatic RCT design provides robust average treatment effects (such as higher protein causing higher urea levels), but how generalisable these effects are on
an individual patient level with differing baseline risk remains unknown.

The increased risk of death in sicker patients randomised to a higher protein dose in the EFFORT Protein trial was estimated to be mediated by increased urea cycle activity, of which serum urea is a biological signature. Serum urea should be taken into consideration when initiating and continuing protein delivery in critically ill patients.

The online version contains supplementary material available at https://doi. org/10.1186/s13054-024-04799-1.

Additional file 1. Online Data Supplement.

RH, JP, ZP, and DH conceptualized and designed this sub-study, interpreted data, and wrote the first draft of the article. DH and AD designed and coordinated the original EFFORT Protein study and provided access to the database and reviewed the statistical analysis plan. DB was a national leader of EFFORT Protein study. RH and JP did analyses. ZP had full access to all the data in the study and had final responsibility for the decision to submit for publication. All authors critically revised the final article.

There was no funding source for this study.

Data collected for the underlying EFFORT protein study will not be publicly available but are being used internally for secondary purposes. Data dictionary or other study tools are available from the coordinating authors (DKH and AD) upon request.

The EFFORT Protein trial is registered at clinicaltrials.gov (NCT03160547). No core funding was received for this reanalysis. The investigator-initiated EFFORT Protein trial protocol was approved by the Research Ethics Committees of Queen’s University, Canada, and a central institutional review board (IRB) at Vanderbilt University, Nashville, Tennessee, USA that granted waiver of informed consent for sites that acceded to this central IRB. Otherwise, where required by local study sites, local ethics approval was obtained and informed consent was also obtained from designated patient surrogates before randomisation. All sites and personnel that participated in the data collection are listed in the Supplementary Appendix of the main manuscript [3].

DEB has received speaker fees, conference attendance support or advisory board fees from Baxter, Cardinal Health and Avanos. ZP has received honoraria for consultancy from GlaxoSmithKline, Lyric Pharmaceuticals, Faraday Pharmaceuticals and Fresenius-Kabi, educational support from Baxter and Nestle Health Science and speaker fees from Orion, Baxter, Sedana, Fresenius-Kabi and Nestle. JP has recent Consultancy agreements with Jaffron Biomedical, Mission Therapeutics, Paion Ltd., Nephrolyx GmbH, Medibeacon Inc., Baxter Inc and Nikkiso Europe GmbH, received speaker’s fees and hospitality from Baxter Inc, BBraun, Nikkiso Europe and Fresenius Medical Care and received research support from Astute Medical/ Biomerieux and Jaffron Biomedical. The remaining authors have no competing interest to declare.

Adult Critical Care Unit, The Royal London Hospital, Barts Health NHS Trust, Whitechapel Road, London E1 1BB, UK. William Harvey Research Institute, Queen Mary University of London, London, UK. Department of Renal Medicine and Transplantation, The Royal London Hospital, Barts Health NHS Trust, Whitechapel Road, London E1 1BB, UK. Clinical Evaluation Research Unit, Kingston Health Science Center, Kingston, ON, Canada. Departments of Critical Care and Nutrition and Dietetics, Guy’s and St. Thomas’ NHS Foundation Trust, London, UK. Department of Critical Care Medicine, Queen’s University, Kingston, ON, Canada.

Received: 1 November 2023 Accepted: 4 January 2024
Published online: 16 January 2024

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.