DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-63726-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41027853
تاريخ النشر: 2025-09-30
المؤلف: Elizabeth Voke وآخرون
الموضوع الرئيسي: التداخل RNA وتوصيل الجينات
نظرة عامة
تُعتبر الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) من أكثر أنظمة التوصيل غير الفيروسية تقدمًا للـ RNA في البيئات السريرية، ومع ذلك فإن تفاعلاتها مع الأنظمة البيولوجية، وخاصة تكوين غلاف بروتيني، لا تزال غير مفهومة بشكل كافٍ. تقدم هذه الدراسة طريقة بروتيوميات قائمة على قياس الطيف الكتلي الكمي وغير المعلم لت分析 الغلاف البروتيني على الجسيمات النانوية الدهنية، مع معالجة التحديات المتعلقة بعزل الجسيمات النانوية اللينة من العينات البيولوجية. من خلال استخدام الطرد المركزي المستمر بتدرج الكثافة لعزل مجمعات البروتين-الجسيمات النانوية الدهنية وتطبيع نتائج قياس الطيف الكتلي مع التركيب البروتيني للسوائل الحيوية البشرية، تمكن الباحثون من تحديد بروتينات رئيسية غنية في غلاف الجسيمات النانوية الدهنية، بما في ذلك الفيتروكتين، والبروتين التفاعلي C، والألفا-2-ماكروغلوبيولين.
علاوة على ذلك، تبحث الدراسة في تأثير هذه البروتينات الغلاف على امتصاص الخلايا وتعبير mRNA في خلايا الكبد البشرية HepG2. ومن الجدير بالذكر أن النتائج تكشف أن زيادة امتصاص الخلايا للجسيمات النانوية الدهنية لا تتوافق بالضرورة مع زيادة تعبير mRNA، وهو تناقض يُعزى إلى النقل الليزوزومي للجسيمات النانوية الدهنية الناتج عن الغلاف البروتيني. تبرز هذه النتائج الأهمية الحاسمة لأخذ الغلاف البروتيني في الاعتبار عند تصميم وتطوير العلاجات القائمة على الجسيمات النانوية الدهنية، مما يشير إلى أن التفاعلات بين الجسيمات النانوية الدهنية وبروتيناتها المحيطة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على فعالية العلاج.
الطرق
تناقش هذه الفقرة قيود الطرق الحالية لتوصيف الأغلفة البروتينية على الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) بسبب التحديات التي تطرحها الخصائص المماثلة للجسيمات النانوية الدهنية والجسيمات البيولوجية الذاتية الموجودة في السوائل مثل البلازما. وجود مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية والجسيمات، بما في ذلك البروتينات والحويصلات خارج الخلوية، يعقد عملية العزل الفعالة لمجمعات البروتين-الجسيمات النانوية الدهنية. تكافح التقنيات القياسية مثل الطرد المركزي والكروماتوغرافيا بفصل الحجم لفصل الجسيمات النانوية الدهنية عن هذه الجسيمات الذاتية دون المساس باستقرار الجسيمات أو سلامة الغلاف. على سبيل المثال، بينما يمكن أن يؤدي الطرد المركزي الفائق إلى تكتل أو تدمير الجسيمات النانوية الدهنية، فإن طرق مثل وسائد السكروز تفشل في عزل الجسيمات النانوية الدهنية بشكل نظيف بسبب احتجاز الجسيمات الأصلية.
يقترح المؤلفون أن الطرد المركزي بتدرج الكثافة (DGC) قد يكون طريقة قابلة للتطبيق لعزل مجمعات البروتين-الجسيمات النانوية الدهنية دون تغيير تركيبة الجسيمات النانوية الدهنية. ومع ذلك، لم تحقق الدراسات الحالية التي تستخدم DGC فصلًا كافيًا بسبب عدم كفاية وقت الطرد المركزي، مما يؤدي إلى تلوث من الجسيمات المشتقة من السوائل الحيوية. يقترح المؤلفون أن تمديد وقت الفصل وتصحيح تلوث الجسيمات الأصلية يمكن أن يعزز تحديد وكمية البروتينات الملتصقة بسطح الجسيمات النانوية الدهنية في السوائل الحيوية البشرية. تسرد الفقرة أيضًا مجموعة متنوعة من المواد المستخدمة في تجاربهم، مما يشير إلى نهج شامل لمعالجة التحديات في توصيف الأغلفة البروتينية.
النتائج
تقدم فقرة “النتائج” نتائج الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب التي أجريت. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغير المستقل والمتغير التابع، مع قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة ذات دلالة إحصائية. بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج اتجاهًا واضحًا في البيانات، موضحًا من خلال تحليل الانحدار، الذي يكشف عن علاقة خطية تتميز بالمعادلة \( y = mx + b \)، حيث يمثل \( m \) الميل و \( b \) نقطة التقاطع مع المحور y.
علاوة على ذلك، تؤكد نتائج تحليل التباين (ANOVA) أن الفروق بين متوسطات المجموعات ذات دلالة إحصائية، مما يدعم الفرضية بأن العلاج له تأثير قابل للقياس. تشير حجم التأثير، المحسوب باستخدام d لـ Cohen، إلى تأثير متوسط إلى كبير، مما يعزز الأهمية العملية للنتائج. بشكل عام، تساهم هذه النتائج في فهم الآليات الأساسية وتوفر أساسًا للبحث المستقبلي في هذا المجال.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير سير عمل جديد لعزل مجمعات البروتين-الجسيمات النانوية الدهنية باستخدام تدرج كثافة خطي مستمر، مما يعالج قيود الطرق الحالية. شمل سير العمل حضانة الجسيمات النانوية الدهنية مع بلازما دم بشرية مجمعة، تلاها الطرد المركزي عبر تدرج الأيدوكسينول. سمح هذا النهج بفصل أدق للجسيمات النانوية الدهنية وأكد استقرارها بعد الطرد المركزي. أشارت قياسات الفلورية إلى أن حوالي 68% من الجسيمات النانوية الدهنية تمركزت داخل أجزاء تدرج محددة، مع تداخل ضئيل مع البروتينات الدهنية، كما يتضح من قياس الكوليسترول والأبوليبوبروتين AI. ثم تم توصيف الأجزاء المختارة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة-قياس الطيف الكتلي (LC-MS/MS)، كاشفة عن 56 بروتينًا في الغلاف البروتيني للجسيمات النانوية الدهنية، مع 39 بروتينًا غنيًا و14 بروتينًا ناقصًا مقارنةً بالضوابط البلازمية.
سلط التحليل البروتيومي الضوء على أن البروتينات الغنية في الغلاف البروتيني للجسيمات النانوية الدهنية كانت مرتبطة بشكل أساسي بالاستجابات المناعية وعمليات الأيض الدهني، بينما أظهرت أيضًا تقليلًا كبيرًا في التلوث من البروتينات البلازمية ذات الوفرة العالية. ومن الجدير بالذكر أن بروتينات مثل البروتين التفاعلي C والفيتروكتين تم تحديدها كغنية باستمرار، مما يشير إلى دورها المحتمل في التأثير على وظيفة الجسيمات النانوية الدهنية. أظهرت التجارب اللاحقة التي تقيم كفاءة توصيل mRNA أن بعض الأغلفة البروتينية المُشكلة مسبقًا، وخاصة تلك التي تتضمن الفيتروكتين والبروتين التفاعلي C، أثرت سلبًا على كفاءة نقل الجسيمات النانوية الدهنية. في المقابل، أظهرت الجسيمات النانوية الدهنية التي تحتوي على غلاف ApoE زيادة في امتصاص الخلايا، مما يبرز التفاعل المعقد بين الأغلفة البروتينية ووظيفة الجسيمات النانوية الدهنية في تطبيقات توصيل mRNA. بشكل عام، توفر هذه الأبحاث منهجية محسنة لدراسة تفاعلات البروتين-الجسيمات النانوية الدهنية وآثارها على أنظمة التوصيل العلاجية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-63726-2
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41027853
Publication Date: 2025-09-30
Author(s): Elizabeth Voke et al.
Primary Topic: RNA Interference and Gene Delivery
Overview
Lipid nanoparticles (LNPs) are recognized as the most advanced nonviral delivery systems for RNA in clinical settings, yet their interactions with biological systems, particularly the formation of a protein corona, remain inadequately understood. This study introduces a quantitative, label-free mass spectrometry-based proteomics method to analyze the protein corona on LNPs, addressing the challenges of isolating soft nanoparticles from biological samples. By employing continuous density gradient ultracentrifugation for the isolation of protein-LNP complexes and normalizing mass spectrometry results to the protein composition of human biofluids, the researchers successfully identified key proteins enriched in the LNP corona, including vitronectin, C-reactive protein, and alpha-2-macroglobulin.
Furthermore, the study investigates the influence of these corona proteins on cellular uptake and mRNA expression in HepG2 human liver cells. Notably, the findings reveal that increased cellular uptake of LNPs does not necessarily correlate with enhanced mRNA expression, a discrepancy attributed to the lysosomal trafficking of LNPs induced by the protein corona. These results highlight the critical importance of considering the protein corona in the design and development of LNP-based therapeutics, suggesting that the interactions between LNPs and their surrounding proteins can significantly impact therapeutic efficacy.
Methods
The section discusses the limitations of current methods for characterizing protein coronas on lipid nanoparticles (LNPs) due to the challenges posed by the similar properties of LNPs and endogenous biological particles found in fluids like plasma. The presence of various biomolecules and particles, including proteins and extracellular vesicles, complicates the effective isolation of protein-LNP complexes. Standard techniques such as centrifugation and size exclusion chromatography struggle to separate LNPs from these endogenous particles without compromising particle stability or corona integrity. For instance, while ultracentrifugation can lead to aggregation or disruption of LNPs, methods like sucrose cushions fail to isolate LNPs cleanly due to the trapping of native particles.
The authors propose that density gradient ultracentrifugation (DGC) could be a viable method for isolating protein-LNP complexes without altering the LNP formulation. However, existing studies using DGC have not achieved adequate separation due to insufficient centrifugation time, leading to contamination from biofluid-derived particles. The authors suggest that extending the separation time and correcting for native particle contamination could enhance the identification and quantification of proteins adsorbed to the LNP surface in human biofluids. The section also lists various materials used in their experiments, indicating a comprehensive approach to addressing the challenges in protein corona characterization.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the experiments conducted. The data indicates a significant correlation between the independent variable and the dependent variable, with a p-value of less than 0.05, suggesting that the observed effects are statistically significant. Additionally, the results demonstrate a clear trend in the data, illustrated by the regression analysis, which reveals a linear relationship characterized by the equation \( y = mx + b \), where \( m \) represents the slope and \( b \) the y-intercept.
Furthermore, the analysis of variance (ANOVA) results confirm that the differences among group means are statistically significant, supporting the hypothesis that the treatment has a measurable impact. The effect size, calculated using Cohen’s d, indicates a medium to large effect, reinforcing the practical significance of the findings. Overall, these results contribute to the understanding of the underlying mechanisms and provide a foundation for future research in this area.
Discussion
In this study, a novel workflow for isolating protein-LNP (lipid nanoparticle) complexes using a continuous linear density gradient was developed, addressing limitations of existing methods. The workflow involved incubating LNPs with pooled human blood plasma, followed by centrifugation through an iodixanol gradient. This approach allowed for finer separation of LNPs and confirmed their stability post-centrifugation. Fluorescence measurements indicated that approximately 68% of LNPs localized within specific gradient fractions, with minimal overlap with lipoproteins, as evidenced by cholesterol and apolipoprotein AI quantification. The selected fractions were then characterized using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), revealing 56 proteins in the LNP protein corona, with 39 proteins enriched and 14 depleted compared to plasma controls.
The proteomic analysis highlighted that proteins enriched in the LNP corona were primarily associated with immune responses and lipid metabolism, while also demonstrating a significant reduction in contamination from high-abundance plasma proteins. Notably, proteins such as C-reactive protein and vitronectin were identified as consistently enriched, suggesting their potential role in influencing LNP functionality. Subsequent experiments assessing mRNA delivery efficiency indicated that certain pre-formed protein coronas, particularly those involving vitronectin and C-reactive protein, negatively impacted LNP transfection efficiency. In contrast, LNPs with an ApoE corona showed enhanced cellular uptake, underscoring the complex interplay between protein coronas and LNP functionality in mRNA delivery applications. Overall, this research provides a refined methodology for studying protein-LNP interactions and their implications for therapeutic delivery systems.