الهيدروجيل القابل للحقن مع إطلاق الدواء المحفز بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية يمكّن من التوصيل المشترك لعامل مضاد للبكتيريا وجزيئات نانوية مضادة للالتهابات لعلاج التهاب اللثة Injectable hydrogels with ROS-triggered drug release enable the co-delivery of antibacterial agent and anti-inflammatory nanoparticle for periodontitis treatment

المجلة: Journal of Nanobiotechnology، المجلد: 23، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12951-025-03275-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40075491
تاريخ النشر: 2025-03-12

الهيدروجيل القابل للحقن مع إطلاق الدواء المحفز بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية يمكّن من التوصيل المشترك لعامل مضاد للبكتيريا وجزيئات نانوية مضادة للالتهابات لعلاج التهاب اللثة

يوجينغ زو , زيليانغ شيو , شياوكسي جيانغ , هويفانغ تشانغ , شياوفينغ , يونرو فنغ , بوجيانغ لي , روي كاي , تشونهوي و غانغ تاو

الملخص

التهاب اللثة، وهو مرض التهابي مزمن تسببه البكتيريا، يتميز بتراكم أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في مناطق محددة، مما يؤدي إلى استجابة التهابية، والتي بدورها تؤدي إلى تدمير الأنسجة الداعمة للثة. لذلك، فإن استخدام مضادات البكتيريا، والتخلص من ROS، وتقليل الاستجابة الالتهابية، وتنظيم البيئة الدقيقة للثة، وتخفيف امتصاص العظم السنخي هي طرق فعالة لعلاج التهاب اللثة. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير هلام قابل للحقن يستجيب لـ ROS عن طريق تعديل حمض الهيالورونيك بحمض الفينيل بورونيك (PBA) والتفاعل معه مع بولي (الكحول الفينيل) (PVA) لتشكيل رابطة بورات. بالإضافة إلى ذلك، احتوى الهلام القابل للاستجابة لـ ROS على العامل المضاد للبكتيريا مينو سيكلين هيدروكلوريد (MH) والجزيئات النانوية المضادة للالتهابات فيرو-كويرسيتين (Fe-Que NPs) لإطلاق الدواء عند الطلب استجابةً لبيئة التهاب اللثة. أظهر هذا الهلام (HP-PVA@MH/Fe-Que) خصائص مضادة للبكتيريا فعالة للغاية. علاوة على ذلك، من خلال تعديل مسار Nrf2/NF-kB، قضى بشكل فعال على ROS وعزز استقطاب البلعميات إلى النمط الظاهري M2، مما قلل الالتهاب وزاد من القدرة على التمايز العظمي لخلايا جذع الرباط السني البشري (hPDLSCs) في البيئة الدقيقة للثة. أظهرت الدراسات الحيوانية أن HP-PVA@MH/Fe-Que قلل بشكل كبير من فقدان العظم السنخي وزاد من تعبير عوامل التمايز العظمي من خلال قتل البكتيريا وتثبيط الالتهاب. وبالتالي، كان لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que قدرات فعالة في مكافحة البكتيريا، والتخلص من ROS، ومكافحة الالتهاب، وتخفيف امتصاص العظم السنخي، مما يظهر إمكانات تطبيق ممتازة لعلاج التهاب اللثة.

المقدمة

التهاب اللثة، أحد أكثر الأمراض السنية شيوعًا، هو مرض التهابي مزمن تسببه البكتيريا يؤدي إلى انفصال اللثة، وتكوين جيوب لثوية، وامتصاص العظم السنخي [1]. إذا لم يتم علاج التهاب اللثة بسرعة وفعالية، فسوف يدمر تدريجياً الأنسجة الداعمة للأسنان وفي النهاية يؤدي إلى فقدان الأسنان [2]. حاليًا، تتضمن العلاج الرئيسي لالتهاب اللثة إزالة البكتيريا والجير السني ميكانيكيًا من خلال التنظيف والتخطيط الجذري (SRP) [3]. ومع ذلك، بسبب التركيب التشريحي المعقد للأسنان، لا يمكن أن تزيل إزالة الأنسجة الميكانيكية بالكامل البكتيريا المسببة للأمراض تحت اللثة وموادها الأيضية [4]. بالإضافة إلى ذلك، فإن العدوى المحلية والالتهاب من الصعب القضاء عليهما، مما يؤدي إلى قدرة تجديد محدودة لأنسجة العظام اللثوية وصعوبة إعادة بناء هيكل الأنسجة اللثوية [5]. لذلك، فإن تطوير استراتيجية للعمل السريع المضاد للبكتيريا، وتخفيف الالتهاب بشكل فعال، وتعزيز تجديد العظام والأنسجة هو محور علاج التهاب اللثة.
يمكن أن تنتج مسببات الأمراض اللثوية مجموعة متنوعة من الإنزيمات والسموم والمواد الأيضية السامة، والتي
تتسبب لاحقًا في تلف الأنسجة وتحفيز ردود فعل التهابية، مما يؤدي إلى تدمير الأنسجة اللثوية، مثل فقدان العظام وفقدان الارتباط [6،7]. لذلك، فإن القضاء السريع على البكتيريا المسببة للأمراض اللثوية هو شرط أساسي لعلاج التهاب اللثة. تتوفر مجموعة متنوعة من الأدوية لإزالة البكتيريا المسببة للأمراض اللثوية، مثل المضادات الحيوية، والببتيدات المضادة للميكروبات، والجزيئات النانوية المعتمدة على المعادن [8-11]. في الممارسة السريرية، يُعتبر مينو سيكلين هيدروكلوريد (MH) عاملًا موضعيًا شائع الاستخدام للجيوب اللثوية. لا يتمتع MH فقط بنشاط مضاد للبكتيريا عالي ضد مسببات الأمراض اللثوية، ولكنه أيضًا يمتلك خصائص مثبطة للكولاجيناز. أظهرت العديد من الدراسات أن الجرعات المنخفضة من MH يمكن أن تقلل بشكل كبير من الالتهاب في موقع اللثة، مما يحسن من نجاح علاج التهاب اللثة [12، 13]. لذلك، يُعتبر MH دواءً مثاليًا لعلاج التهاب اللثة بالمضادات الحيوية. ومع ذلك، فإن استخدام MH بمفرده له العديد من القيود، مثل فقدان الدواء السريع، مما لا يمكنه تحقيق إطلاق بطيء وتأثير مضاد للبكتيريا سريع. لذلك، من الضروري تحميل MH في حامل مثل الجزيئات النانوية، أو الكريات الدقيقة، أو الهلامات.
الهلام هو شبكة ثلاثية الأبعاد ناعمة ومرنة، مشابهة للهيكل المسامي للمصفوفة خارج الخلوية (ECM)، مما يسهل إصلاح الأنسجة المتجددة [14]. يمكن حقن الهلامات القابلة للحقن المصنوعة من مصفوفات متوافقة حيويًا وقابلة للتحلل في جيوب لثوية غير منتظمة الشكل لإطلاق الدواء بشكل مستدام ومستقر بعد احتواء الجزيئات الحيوية النشطة والأدوية [15]. في السنوات الأخيرة، تم تطوير “الهلامات الذكية” لتمكين العلاجات المستهدفة والفعالة من خلال إدخال مجموعات حساسة للتحفيز تستجيب للبيئات الدقيقة الخاصة بالأمراض (مثل نقص الأكسجين، ودرجة الحموضة المنخفضة، وارتفاع مستويات ROS) [16]. لذلك، بالنسبة لبيئة ROS العالية في التهاب اللثة، يمكن للهلام القابل للاستجابة لـ ROS تحقيق إطلاق دواء دقيق عند الطلب في موقع آفات التهاب اللثة، مما يقلل من تكرار الجرعات والآثار الجانبية [17]. يمكن أن تشكل أحماض الفينيل بورونيك، وهي عضو في مجموعة الأحماض لويس، روابط استر بورونية قابلة للعكس وديناميكية مع المركبات التي تحتوي على مجموعات 1،3-ديول [18، 19]. الروابط الاسترية البورونية حساسة لـ ROS، وفي بيئة ROS العالية في التهاب اللثة، تتحلل الهلامات المعتمدة على الروابط الاسترية البورونية، مما يؤدي إلى تسريع إطلاق الدواء [17]. لذلك، نود تحميل الدواء المضاد للبكتيريا MH في هلام يعتمد على الروابط البورونية لتحقيق إطلاق استجابة لـ MH في بيئة ROS العالية في التهاب اللثة.
يت disrupted التوازن بين البكتيريا والمضيف في موقع آفات التهاب اللثة. يتم إنتاج ROS الزائدة، مما ينشط مسارات الإشارة الالتهابية المتعددة، مما يؤدي إلى زيادة نسبة البلعميات M1 إلى M2 وإنتاج عدد كبير من السيتوكينات الالتهابية، مثل إنترلوكين-6 (IL-6)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF- )، وإنترلوكين-1 (IL-1 ) [20-22]. تفرز البلعميات M1 السيتوكينات الالتهابية لتعزيز امتصاص العظام ولديها القدرة على التمايز إلى بُلّعميات ناضجة [23-26]. على العكس، تعزز البلعميات M2 تمايز خلايا الجذع الميزانشيمي (MSCs) إلى بُلّعميات ناضجة وتعزز من تكلس العظام [27، 28]. بالإضافة إلى ذلك، فإن بيئة ROS العالية تحفز الشيخوخة الخلوية، مما يؤدي بدوره إلى موت MSC، مما يؤثر في النهاية على القدرة التجديدية للأنسجة [29، 30]. لذلك، فإن تنظيم مستويات ROS في البيئة الدقيقة للثة، وحماية hPDLSCs من أضرار الإجهاد التأكسدي، وإنقاذ قدرتها على التمايز العظمي، وتعزيز استقطاب البلعميات M2 أمر ضروري لعلاج التهاب اللثة. الكويرسيتين (Que) هو مركب فلافونويد متعدد الفينول موجود في البصل، والعنب، والتوت، والكرز، والبروكلي، والفواكه الحمضية [31]. بفضل هيكله المخفض الفطري، مثل مجموعات الكاتيكول، يتمتع Que بأنشطة مضادة للالتهابات ومضادة للأكسدة بارزة، مما يمكنه من القضاء بشكل فعال على ROS وتثبيط استقطاب البلعميات إلى النمط الظاهري M1 بينما يعزز استقطابها إلى
النمط الظاهري M2، مما يقلل من الأضرار التأكسدية ويسهل تجديد الأنسجة [32-34]. ومع ذلك، فإن Que لديه قابلية ذوبان ضعيفة في الماء، وتوافر حيوي منخفض، واستقرار ضعيف، مما يحد من استخدامه في علاج التهاب اللثة [35]. وُجد أن تنسيق Que مع أيونات المعادن لتخليق الجزيئات النانوية (NPs) يحسن من ذوبانها واستقرارها [36، 37]. بالإضافة إلى ذلك، Nrf2 (عامل النواة المرتبط بالعامل 2) وNF- تلعب (عامل النسخ النووي كابا ب) دورًا حاسمًا في تنظيم الإجهاد التأكسدي والاستجابات الالتهابية، والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على توازن الأكسدة والاختزال الخلوي والاستجابة للالتهاب. لذلك، نأمل في دمج جزيئات Que-metal النانوية كعوامل مضادة للالتهابات في الهلاميات الحساسة لROS لاستكشاف إمكانياتها في علاج التهاب اللثة عبر مسار إشارة Nrf2/NF-кB.
في هذه الدراسة، كما هو موضح في المخطط 1، تم تشكيل جزيئات نانوية فائقة الصغر من Fe-Que أولاً من خلال تنسيق الكيرسيتين مع أيونات الحديد منخفضة السمية. بالإضافة إلى ذلك، تم تطعيم حمض الهيالورونيك (HA) مع 3-أمينوفينيل بورات (HA-PBA، HP)، والذي تفاعل بعد ذلك مع مجموعة 1،3-ديول من بولي (الفينيل الكحول) (PVA) لتشكيل رابطة بورات، مما أدى إلى بناء هيدروجيل بخصائص استجابة ROS. تم إدخال MH وFe-Que لتحضير نظام هيدروجيل HP-PVA (HP-PVA@MH/Fe-Que). في بيئة ROS العالية لالتهاب اللثة، تم كسر رابطة البورات، مما أدى إلى تسريع إطلاق MH وFe-Que. الجزيء الصغير MH يقتل البكتيريا بسرعة، ثم تقوم جزيئات Fe-Que بالتخلص من ROS، وتقليل الاستجابة الالتهابية للأنسجة اللثوية، وتخفيف امتصاص العظم السنخي. تم تقييم الخصائص الفيزيائية، وخصائص إطلاق الدواء، والنشاط المضاد للبكتيريا، والتوافق الحيوي لمركب HP-PVA@MH/Fe-Que بالتفصيل. أظهرت هذه الدراسة أن هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que قام في البداية بسرعة بتثبيط نمو البكتيريا من خلال MH. بعد ذلك، قامت Fe-Que بالتخلص من ROS عبر مسار Nrf2/NF-кB، وتنظيم استقطاب البلعميات لتقليل العوامل المؤيدة للالتهاب وزيادة العوامل المضادة للالتهاب، بينما حمت أيضًا hPDLSCs من الأضرار الناتجة عن ROS وعززت التمايز العظمي تحت الضغط التأكسدي. تم تأكيد قدرة هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que على التخلص من ROS وتخفيف الالتهاب وامتصاص العظم السنخي أيضًا في نموذج التهاب اللثة المزمن SD. لذلك، مع فعالية علاجية ملحوظة في المختبر وفي الجسم الحي، قد يكون لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que إمكانات كبيرة لعلاج التهاب اللثة.

المواد والأساليب

المواد

كلوريد الحديد (III) الثلاثي سداسي الماء تم شراء بولي فينيل بيروليدون (PVP، الوزن الجزيئي: 10000 دالتون) وحمض 3-أمينوفينيل بورونيك (PBA)
المخطط 1 الرسم التخطيطي لعملية تخليق هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que وعلاج التهاب اللثة. (أ) عملية تصنيع جزيئات نانوية Fe-Que. (ب) تحضير هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que. (ج) إطلاق العوامل العلاجية عند الطلب المحفز بواسطة ROS في هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que. (د) هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que له خصائص متعددة الوظائف، بما في ذلك مضاد للبكتيريا، وتنظيم مسار Nrf2/NF-rB لتثبيط الالتهاب وتخفيف امتصاص العظام لعلاج التهاب اللثة.
من علاء الدين (شنغهاي، الصين). تم الحصول على الكيرسيتين (Que) من شركة موست للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (تشينغدو، الصين). تم شراء حمض الهيالورونيك (HA، الوزن الجزيئي: 100000-200000 دالتون) وكحول البولي فينيل (PVA، الوزن الجزيئي: 31000-50000 دالتون) من ماكلين (شنغهاي، الصين). تم الحصول على 1-(3-دايميثيل أمينوبروبيل)-3-إيثيل كاربودييميد هيدروكلوريد (EDC) وN-هيدروكسي سكسينيميد (NHS) من هيونز (تيانجين، الصين). تم شراء هيدروكلوريد المينوسكلين (MH) من مييلون بايو (لياونينغ، الصين). -وسيط إيجل المعدل ( -MEM)، وسط دوبوك المعدل لإيجل عالي الجلوكوز (DMEM عالي الجلوكوز)، وسط RPMI 1640، تريبسين-EDTA، و تم شراء مصل الجنين البقري (FBS) من جيبكو (كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). حي/ميت تم الحصول على مجموعة صلاحية الخلايا ومجموعات صبغ البكتيريا الحية/الميتة من شركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك (ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). مجموعة عد الخلايا-8، البنسلين-ستربتوميسين، و تم شراء البارافورمالدهيد من بييوتيم (بكين، الصين). تم الحصول على 2’،7′-ديكلوروفلورسئين داي أستات (DCFH-DA)، 2،2-ثنائي الفينيل-1-(2،4،6-ثلاثي نيتروفينيل) هيدرازيد (DPPH)، 2،2′-أزينو-بيس (3-إيثيل بنزثيازولين-6-سلفونيك أسيد) (ABTS) من سولار بيو (بكين، الصين).

تركيب وتوصيف جزيئات نانوية من الحديد-كيو

كانت جزيئات Fe-Que هي تنسيق أيونات الحديد مع الكيرسيتين. أولاً، 20 ملغ من تم إذابة 1 مل من الميثانول، وتم إذابة 66 ملغ من PVP في 5 مل من الميثانول، على التوالي. تم خلط المحلولين وتحريكه لمدة 5 دقائق. ثم، تم إضافة 10 ملغ من Que إلى 1 مل من الميثانول وخلطه لمدة 5 دقائق. أخيرًا، تم إضافة محلول Que إلى المحلول المختلط أعلاه وتحريكه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات. تم وضع المحلول في شرائط غسيل الكلى وتم غسله طوال الليل بالماء النقي لإزالة أيونات الحديد الزائدة، مما أدى إلى الحصول على نانو جزيئات Fe-Que. تم تجفيفها بالتجميد في مجفف بالتجميد (Sientz-12 N، نينغبو، الصين) وتم تخزينها في للاستخدام اللاحق.
تم فحص الشكل والحجم لجزيئات نانو الحديد-كيو باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM، JEM-2100، طوكيو، اليابان). تم قياس توزيع أحجام الجسيمات باستخدام تقنية تشتت الضوء الديناميكي (DLS) (مالفرن، نانو ZS، المملكة المتحدة). تم استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (TU-1810، شنغهاي، الصين) لتحديد طيف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية بالقرب من الأشعة تحت الحمراء (UV-vis-NIR). تم الحصول على طيف الأشعة تحت الحمراء باستخدام تحويل فورييه (FTIR) لجزيئات Que وFe-Que باستخدام مطياف FTIR (WQF-530، بكين، الصين) لتقييم المجموعات الوظيفية السطحية. تم تحديد الحالات الكيميائية بواسطة مطياف الأشعة السينية للألكترونات (XPS، شيمادزو كراتوس AXIS Ultra DLD، ناغويا، اليابان).

تركيب وتوصيف HA المعدل بواسطة PBA (HAPBA، المسمى HP)

تم الحصول على السائل A عن طريق خلط 5.8 مل من حمض الأسيتيك في 1 لتر من الماء النقي للغاية، والسائل B كان 8.2 جرام من خلات الصوديوم مذابة في 1 لتر من الماء النقي للغاية بشكل منفصل. خذ 29.6 مل من السائل. من الكحول B، و100.0 مل من الماء النقي، وامزجهم جيدًا للحصول على محلول عازل حمض الأسيتيك مع تم إذابته في 100 مل من محلول العازلة ( ) تحت التحريك المستمر، تلا ذلك إضافة 0.891 جرام من NHS، 1.495 جرام من EDC، و0.684 جرام من PBA. تم تحريك جميع خلطات التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات. بعد انتهاء التفاعل، تم غسيل المنتج في ماء نقي للغاية لمدة 48 ساعة، مع استبدال الماء مرتين يوميًا لإزالة الأملاح والمواد غير المتفاعلة من المحلول. أخيرًا، تم تجفيف المنتج بالتجميد للحصول على HP الأبيض الفلوقولي.
تم قياس طيف UV-vis-NIR لـ HA و PBA و HP باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (TU1810، شنغهاي، الصين). تم قياس أطياف FTIR لـ HA و PBA و HP باستخدام مطياف FTIR (WQF-530، بكين، الصين). تم تحليل الهياكل الكيميائية لـ HA و HP بواسطة الرنين المغناطيسي النووي للبروتون. تم إجراء التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) على جهاز Bruker Avance III بتردد 400 ميغاهيرتز (MA، الولايات المتحدة الأمريكية). علاوة على ذلك، تم تحديد درجة الاستبدال من خلال نسبة تكامل البروتونات العطرية من مجموعة حمض الفينيل بورونيك المترافق. ) إلى تكامل قمة بروتون الميثيل HA (عند ).

تحضير وتوصيف الهلاميات المائية

تم تشكيل الهيدروجيل من خلال الروابط الديناميكية لإستر البورون. باختصار، HP ( ) و PVA ( تم تحضيرها في ماء نقي للغاية لتشكيل خليط متجانس، على التوالي. ثم يتم خلطها بنسبة حجم 3:1 في درجة حرارة الغرفة لتشكيل هيدروجيل HP-PVA. تم توزيع MH في محلول PVA لتحضير الهيدروجيل المسمى HP-PVA@MH. تم توزيع جزيئات نانو Fe-Que بشكل متجانس في محلول HP لتحضير الهيدروجيل المسمى HP-PVA@Fe-Que. ثم تم تحضير هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que عن طريق تحميل جزيئات نانو Fe-Que ومحلول MH في نفس الوقت. كانت التركيز النهائي لجزيئات نانو Fe-Que في الهيدروجيل هو مل، والتركيز النهائي لـ MH كان تمت ملاحظة الهلاميات المائية بشكل ماكروسكوبي باستخدام “طريقة الزجاجة المقلوبة” للإثبات على تشكيل الهلام المائي. تم تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد في جهاز التجفيف بالتجميد لإجراء التجارب اللاحقة.
تم تثبيت العينات على قاعدة معدنية ورشها بالذهب تحت فراغ. ثم تم ملاحظة الهياكل الدقيقة للعينات بصريًا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح بالانبعاث الميداني (SEM، Sigma 300، ZEISS، ألمانيا)، وعناصر سطح العينات.
تم الكشف عن التركيب والتوزيع بواسطة صور مطياف الطاقة المشتتة (EDS).

خصائص القابلية للحقن، والتكيف مع الشكل، واللصق، والشفاء الذاتي للهلاميات المائية

لتحليل قابلية الحقن ومراقبة شكل الهيدروجيل، تم حقن هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que بإبرة حقن، وكتب “SWMU” على قطعة من الورق للملاحظة الكلية. ولتأكيد قابلية الحقن للهيدروجيل، تم تحليل قوة الحقن باستخدام آلة اختبار ميكانيكية (نموذج إنستران 5965). تم إجراء التحليلات الريولوجية للهيدروجيل، بما في ذلك معامل التخزين ( ), معامل الفقد (G “)، واللزوجة تحت ظروف مختلفة (مسح التردد، مسح الإجهاد، ومعدل القص)، باستخدام ريو متر (Discovery HR-2، TA Instrument، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اختبار العينة بوضعها بين لوحين متوازيين (قطر 20 مم، فجوة 1 مم) عند . تم تقييم التغيرات في و عند تردد ثابت ( ) لتقييم تأثيرات الإجهادات المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل اعتماد التردد على و عند إجهاد ثابت ( ) عبر مجموعة من الترددات الزاوية . تم قياس لزوجة الهيدروجيل عبر نطاق معدل القص من 0.1 إلى لتقييم سلوكه في التخفيف عند القص. بعد ذلك، تم حقن هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que في القالب. تم ملاحظة حالة تكيفه مع القالب كل 30 ثانية، وتم تسجيل شكل الهيدروجيل الأصلي (0 دقيقة) والهيدروجيل المتكيف مع البيئة (2 دقيقة). تم تقييم الخصائص اللاصقة للهيدروجيل من خلال ملاحظة ما إذا كانت تلتصق بالقلب، الكبد، الط spleen، الرئتين، والكلى من الفئران SD وأسنان تقويم الأسنان البشرية بعد ترطيبها في PBS لمدة دقيقة واحدة. علاوة على ذلك، تم تقييم التصاق الهيدروجيل باللثة الخنازير الطازجة ومينا الأسنان البشرية بشكل كمي [41]. تم عزل اللثة الخنازير (الطول: 70 مم، العرض: 10 مم) وغسلها بمحلول PBS. ثم تم ربط قطعتين من لثة الخنازير معًا باستخدام الهيدروجيل على مساحة
10 مم، وتركت اللثة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. تم تثبيت العينات المربوطة بعد ذلك على نظام اختبار المواد (INSTRON، الولايات المتحدة الأمريكية) بمعدل لاختبار القص اللصق لتقييم قوة الالتصاق النهائية. بالإضافة إلى ذلك، تم تضمين الأسنان البشرية في الجبس بنفس الطريقة الموضحة أعلاه. الصيغة لحساب إجهاد الالتصاق هي كما يلي: حيث
وS هما القيمة القصوى للقوة على منحنى الإجهاد ومنطقة الالتصاق للثلاث لثة الخنازير أو مينا الأسنان البشرية، على التوالي. ثم تم تقييم خاصية الشفاء الذاتي باستخدام هيدروجيل HP-PVA، الذي تم تقسيمه إلى قسمين وصبغه بالأحمر والأخضر باستخدام محاليل صبغ الطعام. ثم تم ضغط الأقسام معًا لضمان الالتصاق الكامل في المقطع العرضي. بعد دقيقة واحدة، تم ملاحظة الهيدروجيل وتصويره لتحديد ما إذا كان قد انكسر عند تمديده من الجانبين.
خصائص الاستجابة لـ ROS للهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que

تم تحميل 2 مل من هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que في زجاجة عينة. ثم، تم إضافة 1 مل من تركيزات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين (

، و ، و ). تم تصوير وتسجيل التغيرات في الهيدروجيل بعد 3 ساعات. تم التخلص من السائل في الزجاجة، وتم تجفيف الهيدروجيل بالتجميد تحت ظروف فراغ. تم ملاحظة التغيرات الميكروهيكلية للهيدروجيل بواسطة SEM (Sigma 300، ZEISS، ألمانيا).

سلوك التحلل للهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que في المختبر

تم حقن 1 مل من هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que المحضر حديثًا في قنينة زجاجية تحتوي على محاليل PBS بتركيزات مختلفة من (0، 100، و . في فترات زمنية مختلفة، تم تصوير العينات.

إطلاق الدواء في المختبر استجابة لمستويات ROS من هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que

تم تحديد إطلاق MH من هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que تحت تركيزات مختلفة من المحاليل في المختبر. تم وضع 2 مل من هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que في زجاجة العينة، مع 5 مل من المحاليل ، وتم جمع وسط الإطلاق في نقاط زمنية مختلفة. تم قياس الامتصاص عند 364 نانومتر بواسطة مطياف الأشعة فوق البنفسجية (TU-1810، شنغهاي، الصين) لتقييم معدل إطلاق MH.

اختبارات النشاط المضاد للبكتيريا للهيدروجيل في المختبر

تم تقييم الهيدروجيل لنشاطه المضاد للبكتيريا ضد المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus)، الإشريكية القولونية (E. coli)، وبورفيروموناس جينجيفاليس (P. gingivalis). تم وضع هيدروجيل HP-PVA، HP-PVA@Fe-Que، HP-PVA@MH، وHP-PVA@MH/Fe-Que على ألواح 24 بئر. بعد ذلك، تم إضافة 1 مل من تعليق البكتيريا ( ) إلى سطح الهيدروجيل وتم زراعته معًا عند لمدة ساعتين. كانت معالجة PBS هي مجموعة التحكم. ثم، تم جمع تعليقات البكتيريا ، وتم طلاء . aureus و . coli على وسط LB الصلب، مع . gingivalis مطليًا على طبق دم، وزرعها عند لمدة 24 ساعة لتشكيل وحدات مستعمرة مرئية. تم التقاط صور لألواح LB أو الدم، وتم عد عدد المستعمرات.
علاوة على ذلك، تم صبغ التعليقات باستخدام مجموعات صبغ البكتيريا الحية/الميتة (Thermo Fisher Scientific، MA، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير المحلول العامل عن طريق إضافة SYTO ويديد البروبيلي (PI، ) إلى 1 مل من PBS. تم الحصول على راسب البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لتعليق البكتيريا أعلاه عند لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تم حضنه مع المحلول العامل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة قبل أن يتم ملاحظته تحت المجهر الفلوري (DMI8، لايكا، ألمانيا).
لتقييم النشاط المضاد للبكتيريا للهيدروجيل بشكل أكبر، تم إجراء اختبار منطقة التثبيط (ZOI). بالإضافة إلى S. aureus، تم اختبار E. coli، P. gingivalis، والجرثومة الرئيسية ستربتوكوكوس موتانس (S. mutans)، المرتبطة بتكوين الأغشية الحيوية الفموية، لتقييم فعالية الهيدروجيل ضد البكتيريا الخاصة بالفم. تم غمر الهيدروجيل المعقم في PBS عند لمدة 24 ساعة للحصول على مستخلصات الهيدروجيل [8]. تم توزيع جزء من مخزون البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي (S. aureus، E. coli، P. gingivalis، وS. mutans) بالتساوي على ألواح الأجار. تم تحضير أقراص ورقية معقمة (قطر 6 مم) باستخدام مثقاب جلد دائري وتم نقعها في مستخلصات الهيدروجيل المعنية. تم وضع الأقراص الضابطة المنقوعة في PBS وتلك المنقوعة في مستخلصات الهيدروجيل على ألواح الأجار الملقحة باستخدام ملاقط معقمة. تم حضن الألواح عند لمدة 24 ساعة تحت ظروف هوائية ( . aureus، E. coli، وS. mutans) أو ظروف لاهوائية (P. gingivalis). بعد الحضانة، تم قياس قطر مناطق التثبيط باستخدام مسطرة، وتم التقاط صور لألواح الأجار. تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات، وتم تحديد النشاط المضاد للبكتيريا بناءً على متوسط قطر (مم) مناطق التثبيط التي تشكلت حول الأقراص الورقية.

اختبار التوافق الحيوي للهيدروجيل

زراعة الخلايا

تم استخدام HPDLSCs، الألياف الليفية اللثوية البشرية (HGFs)، RAW264.7، L929، وخلايا البشرة البشرية الخالدة (HaCaTs) كخلايا نموذجية لتقييم السمية الخلوية للهيدروجيل. تم زراعة خلايا L929 في RPMI 1640، بينما تم زراعة RAW264.7، HGFs، وHaCaTs في وسط DMEM عالي الجلوكوز، مع FBS و بنسلين-ستربتوميسين. تم حضن جميع الثقافات عند في جو رطب من و رطوبة نسبية. تم استبدال وسط الخلايا كل 3 أيام وتم معالجته بـ تريبسين-EDTA عندما وصلت الخلايا إلى التقاء.
تم الحصول على hPDLSCs من الأضراس الدائمة الصحية لمرضى تقويم الأسنان الذين تتراوح أعمارهم بين 12-18 عامًا. تم أخذ جميع الأسنان الدائمة الشابة المستخدمة في هذه الدراسة من المستشفى السنية التابع لجامعة الطب الجنوبي الغربي، مع موافقة مستنيرة من المرضى والأوصياء، وموافقة من لجنة الأخلاقيات
(20220819002). تم نقع الأنسجة السنية وغسلها عدة مرات بمحلول PBS يحتوي على تركيزات مختلفة من بنسلين-ستربتوميسين. ثم، تم كشط الثلث الأوسط من الأنسجة اللثوية في الجذر باستخدام شفرة معقمة، وتم الطرد المركزي، ونقلها إلى زجاجة زراعة مقلوبة، وزرعها في حاضنة خلايا تحتوي على عند ، وتم قلبها بعد 4 ساعات. كانت الوسط الكامل المطلوب لزراعة الخلايا هو -MEM يحتوي على 10% FBS و بنسلين-ستربتوميسين. بعد أن تسلقت الخلايا من الأنسجة، تم تغيير الوسط كل 3 أيام وتم تمريرها عندما وصلت الخلايا إلى التوافق. تم استخدام تحليل تدفق الخلايا (FACSCalibur، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتقييم إمكانيات تمايز خلايا hPDLSCs باستخدام أجسام مضادة ضد CD34 وCD45 وCD90 وCD105 (BioLegend، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). استخدمت جميع التجارب اللاحقة خلايا من الجيل الثالث إلى الخامس في مرحلة النمو اللوغاريتمي.

توافق الخلايا مع الهيدروجيلات

تم تقييم حيوية الخلايا بواسطة اختبار CCK-8 وصبغة الحياة/الموت لخلايا hPDLSCs وHGFs وRAW264.7 وL929 وHaCaTs لتقييم السمية الخلوية للهيدروجيل. أولاً، تم تعريض الهيدروجيل (HP-PVA، HP-PVA@MH، HP-PVA@ Fe-Que، HP-PVA@MH/Fe-Que) للأشعة فوق البنفسجية طوال الليل، ثم تم نقعها في الكحول لمدة 0.5 ساعة، وغسلها ثلاث مرات بمحلول PBS. بعد ذلك، تم غمر الهيدروجيل في وسائط كاملة مختلفة (RPMI 1640، DMEM عالي الجلوكوز، -MEM) لمدة 24 ساعة، وتم تصفية العصارات من خلال مرشحات معقمة للحصول على المستخلصات.
تم زراعة HPDLSCs و HGFs و RAW264.7 و L929 و HaCaTs بكثافة من الخلايا/بئر على أطباق 96 بئر. بعد يوم واحد، تم استبدال الوسط الكامل بمستخلصات الهيدروجيل، واستمرت الحضانة لمدة اليوم الأول، الثالث، والخامس، على التوالي، لإجراء الاختبار باستخدام مجموعة اختبار CCK-8 (بيوتايم، الصين). بعد الغسل بمحلول PBS، تمت إضافة محلول العمل CCK-8 إلى الوسط، وتم زراعة الخلايا معًا في لمدة 1.5 ساعة في الظلام. ثم، تم قياس قيمة الامتصاص (قيمة OD) عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكرو بلايت (TECAN Infinite M200PRO، الصين).
بالإضافة إلى ذلك، تم زراعة الخلايا بكثافة الخلايا/بئر على أطباق 24 بئر. بعد يوم واحد، تم استبدال الوسط الكامل بمستخلصات الهيدروجيل وتم زراعتها معًا في اليوم الأول والثالث والخامس. ثم، تم حضن الخلايا لمدة 0.5 ساعة مع صبغة الخلايا الحية/الميتة في الظلام وتمت ملاحظتها تحت المجهر الفلوري (لايكا، DMi8، ألمانيا). علاوة على ذلك، تم زراعة hPDLSCs مع الهيدروجيل لمدة 24 ساعة (لم يتم زراعة مجموعة التحكم مع الهيدروجيل). بعد ذلك، تم تحديد التوافق والشكل باستخدام صبغة الخلايا الحية/الميتة، واختبار CCK-8، وصبغة FITC.

اختبار التوافق الحيوي للهيدروجيل

تم تقييم توافق الدم للهيدروجيل مع كريات الدم الحمراء للأرانب. أولاً، تم وضع دم الأرنب في أنبوب طرد مركزي يحتوي على محلول سترات الصوديوم، وتم طرده عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق للحصول على كريات الدم الحمراء، ثم تم غسلها بمحلول PBS ثلاث مرات وتخفيفها إلى تركيز نهائي من تم دمج الهيدروجيل وتعليق كريات الدم الحمراء في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وتم حضنه في لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، تم طرد الخليط في جهاز الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تم نقل السائل العلوي إلى لوحة 96 بئرًا مع 100 لكل بئر. تم قياس قيمة الامتصاص (قيمة OD) عند 545 نانومتر بواسطة قارئ الميكرو بلايت (TECAN Infinite M200PRO، الصين)، وتم التقاط الصور البصرية تحت ميكروسكوب الفلورية (لايكا، DMi8، ألمانيا). كانت مجموعة التحكم الإيجابية هي كان مجموعة التحكم السلبية تتكون من PBS، بينما كان Triton X-100.

قدرة امتصاص الجذور الحرة والقدرة المضادة للأكسدة للهلاميات

اختبار امتصاص الجذور الحرة DPPH و ABTS

تم تحليل أداء استئصال الجذور الحرة للهلاميات باستخدام مجموعات DPPH و ABTS. تم تحضير محاليل العمل لـ DPPH و ABTS، ومزجها مع مستخلص الهلام، وتم حضنها لمدة 0.5 ساعة في الظلام. كانت فيتامين C (VC) هي مجموعة التحكم الإيجابية، بينما كان المستخلص المقدم مع المجموعة هو المجموعة الفارغة.
ثم تم تقييم معدلات إزالة الجذور الحرة DPPH للمواد الهلامية المختلفة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (TU-1810، شنغهاي، الصين) لتسجيل قيم OD عند 515 نانومتر وطيف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية والأشعة تحت الحمراء القريبة في النطاق من . بعد ذلك، تم تسجيل قيم OD عند 405 نانومتر لكل عينة، وتم الحصول على طيف UV-vis-NIR في النطاق من كانوا مصممين على تقييم معدلات التخلص من الجذور الحرة ABTS.
أين هو امتصاص 1 مل من محلول العمل بالإضافة إلى من الماء، هو الامتصاص لـ 1 مل من محلول العمل المضاف إلى حل رأس المال المخاطر ( هو الامتصاص لـ 1 مل من محلول العمل المضاف إلى من السائل العلوي للعينة، و هو الامتصاص لـ 1 مل من الإيثانول المضاف إلى 50 من السائل العلوي للعينة.

تأثيرات الحماية الخلوية ضد الإجهاد التأكسدي

تم تقييم DCFH-DA لقدرة مجموعات مختلفة من الهلاميات على القضاء على ROS داخل الخلايا، وتأثير ذلك
تم تقييم قدرة إنقاذ الخلايا من الإجهاد التأكسدي واستعادة حيويتها من خلال صبغة الخلايا الحية/الميتة واختبار CCK-8. باختصار، تم زراعة خلايا L929 و RAW264.7 بكثافة الخلايا/بئر في أطباق 24 بئر وتم حضنها لمدة يوم واحد. ثم، تم استبدال وسط الثقافة بمستخلصات الهيدروجيل. بعد الاستمرار في الثقافة لمدة تمت الإضافة لمدة ساعتين. تم إضافة محلول العمل DCFHDA (1:1000) أو محلول صبغة الخلايا الحية/الميتة، وتم حضنه لمدة 0.5 ساعة في الظلام، وتمت ملاحظته تحت المجهر الفلوري. قامت ImageJ بتقدير شدة الفلورة لصبغة DCFH-DA. ثم تم قياس فلورة ROS في قنوات FITC بواسطة تحليل تدفق الخلايا (ACEA NovoCyteTM 2070R، الولايات المتحدة الأمريكية). علاوة على ذلك، تم زراعة خلايا RAW264.7 في أطباق 96 بئر، وتم إخضاعها للعلاج الموصوف سابقًا، واستبدالها بمحلول العمل CCK-8 المحضر. بعد الحضانة لمدة 1.5 ساعة، تم الكشف عن قيمة OD عند 450 نانومتر بواسطة قارئ الألواح الدقيقة (TECAN Infinite M200PRO، الصين).
علاوة على ذلك، تم تقييم قدرة الهيدروجيل المختلفة على القضاء على أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من خلال قياس شدة الفلورسنت باستخدام نظام تصوير حي متعدد الأوضاع للحيوانات الصغيرة (ABL X6، تانون). تم زراعة خلايا RAW264.7 بكثافة الخلايا/بئر على أطباق 12 بئر وتم معالجة الخلايا كما فعلنا من قبل. ثم تم إجراء تصوير الفلورية أيضًا باستخدام نظام التصوير الحي متعدد الأوضاع للحيوانات الصغيرة (فلتر الإثارة، فلتر الانبعاثات، ).

تقييم استقطاب البلعميات للهيدروجيلات

تم استخدام صبغة المناعة الفلورية (IF) وقياس التدفق الخلوي للكشف عن التأثيرات المناعية المختلفة للهيدروجيلات على أنماط خلايا RAW264.7. تم زراعة خلايا RAW264.7 على أطباق 24 بئرًا بكثافة خلايا/بئر. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة، تم استبدال التحفيز الكامل بـ LPS (سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية) أو IL-4 (Peprotech، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 24 ساعة، تليها معالجة مع مستخلصات الهيدروجيل لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم تثبيتها في بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة وتم معالجته بـ ترايتون X-100 لمدة 10 دقائق. تم حجبهم بـ مصل الماعز لمدة 1.5 ساعة ثم تم حضنه طوال الليل في مع الأجسام المضادة الأولية المضادة لـ iNOS (1:100، بروتين تك، الصين) أو المضادة لـ CD206 (1:100، بروتين تك، الصين). بعد إعادة التسخين لمدة 0.5 ساعة في اليوم الثاني، تم تحضين الأجسام المضادة المعلمة بـ FITC من الماعز المضادة للأرنب IgG (1:200، تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 60 دقيقة في الظلام. ثم، تم صبغ DAPI لمدة 10 دقائق، وتم إغلاق مانع الفلورية وتخزينه في الظلام عند تم الحصول على صور المناعة الفلورية بواسطة المجهر الضوئي الماسح بالليزر (CLSM600، تكنولوجيا سوني البصرية، الصين)، وتم تقييم خرائط الحرارة ثلاثية الأبعاد باستخدام ImageJ.
علاوة على ذلك، تم زراعة خلايا RAW264.7 في طبق يحتوي على ستة آبار وتم معالجتها وفقًا لما ذُكر أعلاه.
ثم تم هضم الخلايا باستخدام تم استخدام Tryp-sin-EDTA وتم الطرد المركزي بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، مع PBS مبرد مسبقًا 3 مرات. بعد ذلك، تم الاحتفاظ بالخلايا في الظلام لمدة 15 دقيقة مع مضاد CD86 (105005، Biolgend) و CD206 (147105، Biolgend). أخيرًا، تم الكشف عن العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي (ACEA NovoCyteTM 2070R، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم تحليل البيانات بواسطة FlowJo.

آلية مضادات الأكسدة ومضادات الالتهاب في الهيدروجيل في المختبر من خلال تنظيم مسار Nrf2/NF-кB

تم فحص تعبير عامل النووية المرتبط بالحديد 2 (Nrf2) وعامل النووية كابا-B (NF-кB) بواسطة صبغة IF. تم زراعة خلايا RAW264.7 على أطباق 24 بئرًا بكثافة خلايا/بئر. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة، تم استبدال التحفيز الكامل بـ تم معالجة خلايا RAW264.7 بـ LPS (سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 24 ساعة، تليها معالجة بمستخلصات الهيدروجيل لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، تم استخدام الأجسام المضادة لـ Nrf2 (1:100، تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية) و NF-кB (1:100، تكنولوجيا الإشارة الخلوية، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت إجراءات تلوين IF الأخرى كما هو موضح أعلاه. تم التقاط الصور، وتم تقييم خرائط الحرارة ثلاثية الأبعاد باستخدام ImageJ.
ثم تم الكشف عن مستويات التعبير لعوامل الالتهاب و جينات إنزيمات مضادات الأكسدة في خلايا RAW264.7 بواسطة تقنية PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). باختصار، تم زراعة خلايا RAW264.7 بكثافة من خلايا/بئر في صفائح 6 آبار وتمت معالجتها كما هو موضح في هذا القسم. تم عزل RNA الكلي باستخدام مجموعة استخراج RNA السريعة SteadyPure (AG21023، Agbio، الصين) وتحويله إلى cDNA بواسطة مجموعة Evo M-MLV RT (AG11728، Agbio، الصين). ثم تم إجراء qRT-PCR على نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي CFX96 Touch (BioRad Laboratories، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام SYBR Green Pro Tap HS Premix (AG11701، Agbio، الصين). باستخدام -أكتين كجين مرجعي داخلي، تم حساب مستويات التعبير النسبي لكل جين مستهدف باستخدام طريقة . تم تقديم تسلسلات البرايمر لجينات ، IL-10، Arg-1، SOD-1، و CAT في الجدول S1.
علاوة على ذلك، تم إجراء تحليل Western blot (WB) لتقييم مستويات التعبير المرتبطة بالبروتينات المضادة للأكسدة (Nrf2)، وبروتينات مسار الإشارات NF-кB (NF-кB و )، و -أكتين. تم معالجة خلايا البلعميات بنفس الطريقة كما في qRT-PCR. ثم تم استخراج البروتينات الكلية باستخدام محلول RIPA (EpiZyme، الصين) الذي يحتوي على مثبطات البروتيناز والفوسفاتاز (1:100، Beyotime، الصين) على الثلج. تم تكسير المستخلصات المستخرجة بمحلول RIPA باستخدام الموجات فوق الصوتية ثم تم الطرد المركزي عند . بعد ذلك، تم قياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة اختبار البروتين BCA (EpiZyme، الصين). تم تحميل كمية متساوية من هضم البروتين المغلي على هلام الصوديوم دوديسيل سلفات-بوليميديل أكريلاميد
للفصل البروتيني، تلاها نقل إلى غشاء بولي فينيليدين فلوريد (PVDF). بعد حجب في درجة حرارة الغرفة باستخدام محلول حجب سريع خالي من البروتين (EpiZyme، الصين)، تم تعريض الأغشية بعد ذلك للأجسام المضادة الأولية ضد Nrf2 (1:1000، Cell Signaling Technology)، NF-кB (1:1000، Cell Signaling Technology) p-NF-кB (1:1000، Cell Signaling Technology) و -أكتين (1:5000، Proteintech، الصين) عند طوال الليل. بعد ذلك، تم حاضنة الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية بعد غسلها ثلاث مرات، تلاها تصور لشرائط البروتين المناعية باستخدام OI600 MF Touch (BIO-OI، الصين).

تقييم التمايز العظمي في المختبر للهلامات

تم زراعة hPDLSCs على صفيحة 12 بئر مغطاة بـ الجيلاتين مسبقًا. ثم تم استبدال وسط الثقافة بمستخلصات الهلام. بعد الاستمرار في الثقافة لمدة تم إضافة لمدة ساعتين. بعد ذلك، تم استبدال وسط الثقافة بمحلول تحفيز التمايز العظمي المحضر. بعد 5 أيام من الثقافة، تم تثبيتها بـ الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة، وتمت إضافة محلول العمل BCIP/NBT الفوسفاتاز القلوي المحضر، وتم صبغها لمدة 0.5 ساعة في الظلام، ثم تم ملاحظتها باستخدام ميكروسكوب نوع (SZN71، Sunny Optical Technology، الصين). بعد الثقافة لمدة 21 يومًا، تم صبغ العقيدات الكالسيومية بمحلول ARS.
بالإضافة إلى ذلك، تم زراعة hPDLSCs على صفائح 24 بئر وتمت معالجة الخلايا كما فعلنا من قبل. تم صبغ العينات المجمعة لمدة 7 أيام لـ Runx2، بينما تم صبغ تلك المزروعة لمدة 21 يومًا لبروتين التمايز العظمي المتأخر أوستيوكالسين (OCN). بالنسبة لـ IF، تم إجراء hPDLSCs باستخدام مضاد RUNX2 (1:100، Cell Signaling Technology، الولايات المتحدة الأمريكية) ومضاد OCN (1:100، Proteintech، الصين). علاوة على ذلك، تم ملاحظة شكل الهيكل الخلوي بعد معالجة باستخدام ميكروسكوب الفلورسنت. تم تثبيتها بـ الفورمالديهايد لمدة 20 دقيقة وتمت معالجتها بـ Triton X-100 لمدة 10 دقائق. ثم تم حاضنتها مع FTIC (1:100، Cytoskeleton) لمدة ساعة، وتم صبغها بـ DAPI، وتم إغلاقها مع مثبط الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، تم زراعة hPDLSCs والهلامات معًا في وجود بيروكسيد الهيدروجين لملاحظة التغيرات الشكلية للخلايا. كانت مجموعة التحكم تتكون من hPDLSCs المزروعة في وسط كامل بدون معالجة . في مجموعة ، تم إضافة 300 إلى وسط الثقافة لتحفيز الإجهاد التأكسدي. تم زراعة هلامات HP/PVA، HP/PVA@MH، HP/PVA@ Fe-Que، و HP/PVA@MH/Fe-Que مع hPDLSCs، مع إضافة في نفس الوقت. بعد 24 ساعة، تم وسم الخلايا بـ DAPI وصبغ الفلورسنت FITC، وتمت ملاحظة التصاقها وشكلها على أسطح الهلام
باستخدام المجهر الضوئي الليزري. أخيرًا، تم استخدام المجهر الضوئي الفلوري لتصور صور IF، وتم تقييم الخرائط الطبوغرافية ثلاثية الأبعاد باستخدام ImageJ.

العلاج في نموذج التهاب اللثة في الجسم الحي إنشاء نموذج التهاب اللثة في الفئران

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة الطب بجنوب غرب الصين وتمت وفقًا للإرشادات التي وضعتها لجنة رعاية الحيوانات (رقم الوثيقة 20230705005). بعد أسبوع من التغذية التكيفية، تم تخصيص ثلاثين فأرًا من نوع Sprague-Dawley الذكور، بعمر 6 أسابيع ووزن يتراوح بين 180 و 220 جرام، عشوائيًا إلى ست مجموعات: (1) مجموعة التحكم: بدون علاج، (2) مجموعة التهاب اللثة: تم علاجها بالتثبيت وحقن . gingivalis، (3) مجموعة HP-PVA: التهاب اللثة المعالج بهلامات HPPVA، (4) مجموعة HP-PVA@MH: التهاب اللثة المعالج بهلامات HP-PVA@MH، (5) مجموعة HP-PVA@FeQue: التهاب اللثة المعالج بهلامات HP-PVA@Fe-Que، (6) مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que: التهاب اللثة المعالج بهلامات HP-PVA@MH/Fe-Que. تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلورين ( في الأكسجين)، وتم وضع سلك قوسي بسمك 0.2 مم بشكل آمن تحت اللثة من الأضراس العلوية الأولى الثنائية. تم حقن P. gingivalis في اللثة الحنكية بين الأضراس الأولى والثانية كل ثلاثة أيام. بعد أسبوعين، تم إزالة السلك المثبت، وتم حقن الهلامات أو محلول ملحي ( ) في الشق اللثوي الحنكي للأضراس العلوية كل ثلاثة أيام.

خاصية مضادة للأكسدة في الجسم الحي

بعد أسبوع من علاج الهلام، تم تخدير الفئران. تم حقن DCFH-DA ( ) في اللثة الحنكية بين الأضراس العلوية الأولى والثانية. بعد 30 دقيقة، تم الحصول على الصور بواسطة نظام تصوير حي متعدد الأوضاع للحيوانات الصغيرة (مرشح الإثارة، ؛ مرشح الانبعاث، ).

تحليل Micro-CT

بعد 2 و 4 أسابيع، تم جمع الحيوانات من أجل فكها العلوي، الذي تم جمعه وتثبيته في الفورمالديهايد لمدة أسبوع. ثم تم مسح العينات باستخدام نظام micro-CT (nanoVoxel-100، تيانجين، الصين). تم تقييم النماذج الرقمية ثلاثية الأبعاد والصور الرقمية ثنائية الأبعاد وإعادة بنائها باستخدام برنامج RediAnt DiCOM Viewer. تم قياس المسافة بين تقاطع المينا والعظم السنخي (CEJ-ABC) لتقدير مدى فقدان العظم السنخي البوكالي والسهمي.

علم الأنسجة و المناعية

تم تثبيت العينات العلوية المجمعة في الفورمالديهايد، وتم إزالة الكالسيوم في 10% حمض الإيثيلين ثنائي الأمين
رباعي الأسيتيك (EDTA) لمدة شهر، وتم تجفيفها في كحول متدرج، وتم تضمينها في البارافين. بعد ذلك، تم عمل هذه العينات البارافينية إلى مقاطع بسمك . تم إجراء صبغ الهيماتوكسيليين والإيوزين (H&E) وصبغ ماسون وفقًا للتعليمات. تم تقييم التعبير عن IL- و TNF- في الأنسجة اللثوية باستخدام طريقة المناعية. تم مسح الشرائح باستخدام ماسح شرائح علم الأمراض الرقمي (KF-PRO-002، الصين)، وتمت ملاحظتها باستخدام K-Viewer (1.7.0.23) X64. علاوة على ذلك، تم قياس صبغ IF، بما في ذلك iNOS، CD206، Nrf2، P65، Runx2، و OCN. تم تصور الصبغ باستخدام CaseViewer. تم اختيار مناطق الملاحظة بين جذور الأضراس الأولى والثانية.

تحليل إحصائي

تم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD) وتم فحص الأهمية بين المجموعات المتعددة بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام GraphPad Prism 9.0. تشمل القيم ذات الدلالة الإحصائية ، ** ، *** ، و **** .

النتائج والمناقشة

تخليق وتوصيف جزيئات Fe-Que NPs

في تخليق جزيئات نانوية من Fe-Que، تم إذابة الكيرسيتين في الميثانول وإضافته إلى محلول PVP يحتوي على أيونات الحديد لتحسين تشتت جزيئات Fe-Que (الشكل 1A). خضع المحلول لتغيير سريع في اللون من الأصفر إلى الأسود عند إضافة الكيرسيتين، مما يدل على التنسيق الناجح بين أيونات الحديد والمجموعة الفينولية من الكيرسيتين. تم غسيل محلول الميثانول الذي يحتوي على جزيئات Fe-Que نانوية طوال الليل للتخلص من أيونات الحديد الزائدة. بعد ذلك، تم الحصول على جزيئات Fe-Que نانوية ذات قابلية ذوبان عالية في الماء واستقرار ناجح (الشكل 1B). أظهر تحليل TEM أن جزيئات Fe-Que نانوية كانت كروية، وذات حجم صغير للغاية مع توزيع موحد وحجم أقل من 10 نانومتر (الشكل 1C). أشار تحليل حجم الجسيمات اللاحق إلى نطاق من 1 إلى 3 نانومتر لجزيئات Fe-Que نانوية (الشكل 1D). بالإضافة إلى ذلك، كانت قياسات متوسط حجم الجسيمات بواسطة DLS حوالي , كما هو موضح في الشكل S1. تم تقديم طيف UV-vis لأيونات الحديد، الكيرسيتين، وجزيئات Fe-Que نانوية في الشكل 1E. أظهر الكيرسيتين قمم امتصاص واضحة عند 248 نانومتر و368 نانومتر، بينما أظهر الكيرسيتين امتصاصًا عند 256 نانومتر و370 نانومتر، في حين انخفضت شدة قمة جزيئات Fe-Que نانوية بشكل ملحوظ في نطاق [37]. أظهر تحليل الطيف FTIR لجزيئات Fe-Que نانوية أن شدة قمم الاهتزاز عند التي تتوافق مع مجموعة HO-C الوظيفية قد انخفضت (الشكل 1F)، مما يدل على أن تم تنسيقه بنجاح مع جزيء HO-C من الكيرسيتين [36]. بالإضافة إلى ذلك، تم تحليل التركيب الكيميائي وحالة جزيئات Fe-Que نانوية باستخدام XPS. كشف الطيف الكامل لـ XPS أن
الشكل 1 تخليق وتوصيف جزيئات Fe-Que نانوية و HP. (A) الرسم التخطيطي لتخليق جزيئات Fe-Que نانوية. (B) صورة للمواد الاصطناعية، بما في ذلك Fe-PVP، Que، وجزيئات Fe-Que نانوية. (C) TEM و(D) حجم حبة جزيئات Fe-Que نانوية. (E) أطياف امتصاص UV-vis لـ , Que، وجزيئات Fe-Que نانوية. (F) أطياف FTIR لـ Que وجزيئات Fe-Que نانوية. (G) الطيف الكامل لـ XPS لجزيئات Fe-Que نانوية. (H) الأطياف عالية الدقة لأيونات الحديد في جزيئات Fe-Que نانوية. (I) أطياف امتصاص UV-vis و(J) أطياف FTIR لـ HA، PBA، وHP. (K) أطياف NMR لـ HA وHP
تتكون جزيئات Fe-Que نانوية بشكل رئيسي من الكربون، الأكسجين، والحديد (الشكل 1G). علاوة على ذلك، أظهر الشكل 1H قمتين بارزتين لطاقة الربط عند 709 eV و724 eV تتوافقان مع و المدارات لأيونات الحديد، مما يشير إلى أن حالة أكسدة أيونات الحديد في جزيئات Fe-Que نانوية ظلت دون تغيير. أظهرت النتائج من الدراسات المذكورة أعلاه مجتمعة التحضير الناجح لجزيئات Fe-Que نانوية.

تخليق وتوصيف HP

أولاً، تم تخليق HP عن طريق ربط HA مع حمض 3-أمينوفينيل بورونيك. تظهر أطياف UV-vis لـ HA، PBA، وHP في الشكل 1I. لم يظهر HA أي قمة امتصاص في نطاق , بينما عرض PBA قمة امتصاص عند 232 نانومتر تتوافق مع حلقة البنزين، بالإضافة إلى قمة امتصاص ملحوظة عند تُعزى إلى مجموعة الأمين ونظام الربط بين حلقة البنزين . أظهر HP قمة امتصاص مميزة لحلقة البنزين عند 242 نانومتر مشابهة لتلك الخاصة بـ PBA. ومع ذلك، اختفت قمة الامتصاص عند تقريبًا بسبب تأثير الربط الضعيف بين مجموعة الأمين وحلقة البنزين بعد الربط على HA. أكدت هذه النتيجة أن PBA تم ربطه بنجاح على جزء HA. من أجل مزيد من توصيف التغيرات في هيكل HA بعد التعديل، تم تحليله بواسطة أطياف FTIR (الشكل 1)). عند مقارنة الطيف تحت الأحمر لـ HA، لا يوجد تغيير واضح في قمة الامتصاص المميزة لـ HP، ولكن يمكن ملاحظة اهتزازات الشد العطرية لـ و عند و ، على التوالي. اهتزاز الشد B-O عند ، أكد مرة أخرى ربط حمض 3-أمينوفينيل بورونيك ونجاح تفاعل الأميد [39]. تم تقديم أطياف NMR لـ HA وHP قبل وبعد تفاعل الربط في الشكل 1 K. عند الانزياحات الكيميائية 1.9 ppm و ، أظهر كل من HA وHP قمم امتصاص بروتون متطابقة تتوافق مع مجموعات الميثيل والميثيلين على HA، على التوالي. أكدت ظهور قمة بروتون جديدة بين 7.0 ppm و8.0 ppm الربط الناجح لـ PBA على HA [42]. تم تحديد درجة الاستبدال من خلال حساب النسبة بين تكامل بروتونات العطرية من مجموعة phenylboronic acid المترابطة (بين 7.0 و ) إلى تلك الخاصة ببروتونات الميثيل من HA ( )، مما أسفر عن كفاءة ربط محسوبة لمجموعات phenylboronic acid على HP بحوالي .

تحضير وتوصيف هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que

نظرًا لمستوى ROS العالي في بيئة التهاب اللثة، تم تصميم هيدروجيل ذكي يستجيب لـ ROS في هذه الدراسة لتحقيق توصيل مزدوج للمضادات الحيوية وجزيئات نانوية مضادة للالتهابات صغيرة جدًا،
والتي يمكن أن تحسن الأداء المضاد للبكتيريا، وتسريع إزالة ROS وتخفيف الالتهاب وامتصاص العظام. كما هو موضح في الشكل 2A، تم تشكيل شبكة هيدروجيل من خلال إنشاء روابط استر البورات الديناميكية (الحساسة للغاية لـ ROS) بين هياكل مجموعة الديول على PVA ومجموعات حمض phenylboronic على HP. يظهر الشكل 2B حالة هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que قبل وبعد التجلط. بعد ذلك، تم ملاحظة الشكل المجهري للهيدروجيل بواسطة SEM. كما هو موضح في الشكل 2C، أظهرت جميع الهيدروجيل مسام مترابطة وهياكل مسامية ثلاثية الأبعاد موحدة، مما يسهل احتواء الجزيئات النشطة بيولوجيًا وحمايتها من التحلل. علاوة على ذلك، ضمنت النقل الفعال للمواد الغذائية والأكسجين، مما يعزز اختراق الخلايا، والتكاثر، وتكوين الأنسجة الجديدة. علاوة على ذلك، كشفت تحليل خريطة EDS عن توزيع متجانس للعناصر C وN وO وB وFe في جميع أنحاء هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que (الشكل 2D)، مما يوفر دليلًا على التحميل الناجح وتشتت جزيئات Fe-Que النانوية داخل الهيدروجيل.
القدرة على الحقن، التكيف، الالتصاق، وخصائص الشفاء الذاتي هي خصائص أساسية للهيدروجيل لتوصيل الأدوية محليًا في جيوب التهاب اللثة [43]. تسهل ميزة الحقن اختراق الهيدروجيل بكفاءة في جيوب التهاب اللثة الضيقة والعميقة، مما يوفر تحكمًا مكانيًا وزمنيًا في إطلاق الدواء العلاجي من خلال تحلل المادة وانتشار الدواء [8]. أظهر الشكل 2E أن هيدروجيل HP-PVA@MH/FeQue يمكن نقله بسهولة إلى حقنة وضغطه من إبرة ( ) لتشكيل شكل “SWMU” دون أي انسداد. أظهر الشكل S2A الإعداد حيث تم تثبيت الحقنة في مقبض الشد السفلي، وتم ضغط مكبس الحقنة باستخدام منصة الضغط العلوية. تم التحكم في معدل الحقن عن طريق ضبط السرعة العرضية لمنصة الضغط لتحقيق سرعة حقن قدرها دقيقة. تم قياس قوة المكبس باستخدام خلية تحميل . كما هو موضح في الشكل S2B، كانت أقصى قوة حقن لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que عند سرعة حقن قدرها هي 21.88 N. أظهر الشكل S3A أن معامل التخزين (G’) لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que كان أكبر من معامل الفقد ( ) عبر نطاق إجهاد . كما هو موضح في الشكل S3B، كانت G’ جميعها أعلى بكثير من G” عبر مجموعة من الترددات الزاوية ( )، مما يدل على استقرار هيكلي جيد بعد التجلط [44]. علاوة على ذلك، ضمن نطاق معدل القص من ، انخفضت لزوجة هيدروجيل HP-PVA@MH/FeQue بشكل كبير مع زيادة معدل القص، مما يظهر سلوكًا نموذجيًا للقص الرقيق (الشكل S3C). يظهر هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que قدرة حقن ممتازة، ومرونة ملائمة، وسلوك قص رقيق، واستقرار هيكلي مناسب، مما يلبي
الشكل 2 تحضير وتوصيف هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que. (A) الرسم التخطيطي لتخليق الهيدروجيل. (B) صور لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que قبل (يسار) وبعد (يمين) التجلط. (C) صور SEM للهيدروجيل المختلفة. (D) رسم خرائط EDS لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que. صور لـ القدرة على الحقن، (F) التكيف مع الشكل، و الالتصاق لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que. (H) صور لخصائص الشفاء الذاتي لهيدروجيل HP-PVA
متطلبات الاستقرار المحلي والعلاج الدقيق أثناء علاج التهاب اللثة.
في التهاب اللثة، يتم تدمير الأنسجة اللثوية بشكل غير منتظم. يمتلك الهيدروجيل مرونة شبيهة بالهلام وسوائل، مما يظهر تكيفًا ممتازًا مع الشكل، مما يمكّن الهيدروجيل من التكيف تمامًا مع الأنسجة اللثوية التالفة والتكيف مع العيوب اللثوية غير المنتظمة. كما هو موضح في الشكل 2F، يمكن إعادة تشكيل هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que إلى أشكال مختلفة، مما يمكن استخدامه لملء عيوب مختلفة وكان له تكيف جيد. بعد حقنه في جيب اللثة، يتعرض الهيدروجيل لغسل مستمر بواسطة سائل اللثة واللعاب، لذا يجب أن يمتلك خصائص لاصقة معينة للالتصاق بالأنسجة اللثوية وإطالة وقت احتباسه داخل جيب اللثة. أظهر هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que التصاقًا قويًا بشق الأسنان والأعضاء الداخلية، بما في ذلك القلب والكبد والطحال والرئتين والكلى وجذر السن الأول للضرس. لتقييم التصاق الأنسجة للهيدروجيل بشكل أكبر، تم إجراء اختبار قص قياسي في المختبر باستخدام لثة الخنازير، وتم تقييم التصاق الهيدروجيل بمينا الأسنان. أظهرت النتائج أن تحميل MH وFe-Que لم يؤثر على خصائص التصاق الهيدروجيل، وكانت قوة التصاق HP-PVA@MH/Fe-Que بلثة الخنازير حوالي ، وكان المينا حوالي (الشكل S4C و S4F). علاوة على ذلك، عندما يتم ملء الهيدروجيل في المناطق المعيبة من الأنسجة اللثوية، قد تتسبب القوى الخارجية في كسر الهيدروجيل، لكن القدرة السريعة على الشفاء الذاتي تساعد في تحسين تكيف الهيدروجيل مع أنماط العيوب المعقدة [47]. الشكل 2 H عرض أداء الشفاء الذاتي لهيدروجيل HP-PVA. تم قطع هيدروجيل HP-PVA إلى قطعتين وتم صبغهما بالأحمر والأخضر، على التوالي. بعد دقيقة واحدة، تم شد الهيدروجيل المعاد تجميعه، وحافظ على شكله الكامل دون أن ينكسر، مما يدل على أن الهيدروجيل لديه أداء جيد في الشفاء الذاتي.

ديناميكية إطلاق الأدوية المستجيبة لـ ROS وسلوك التحلل في المختبر للهيدروجيلات

يمكن أن يؤدي عدم التوازن بين أنواع الأكسجين التفاعلية ونظام الدفاع المضاد للأكسدة إلى الإجهاد التأكسدي، وهو جزيء إشارة رئيسي في تطور التهاب اللثة. خلال تطور التهاب اللثة، كانت مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بدرجة تلف الأنسجة في الأنسجة اللثوية. لذلك، قد يكون تصميم هيدروجيل يستجيب لأنواع الأكسجين التفاعلية كنظام توصيل دوائي استراتيجية فعالة للعلاج الموضعي لالتهاب اللثة. من خلال الاستجابة لمستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل البيئة اللثوية، يمكن للهيدروجيل تحقيق إطلاق دقيق للدواء عند الطلب وتقليل أنواع الأكسجين التفاعلية بشكل فعال في الميكروبيئة اللثوية لتسريع شفاء اللثة. يمكن أن تتأكسد روابط البورات بواسطة عند المستوى الفسيولوجي
درجة الحموضة ودرجة الحرارة [50]. الشكل S5A يوضح آلية تفاعل الهيدروجيل مع أنواع الأكسجين التفاعلية. لذلك، قمنا بمعالجة الهيدروجيلات بطرق مختلفة التركيزات ( 0,100 ، و ) للتحقيق في تدهور وإطلاق الدواء من الهيدروجيل لدراسة تأثيراتها العلاجية على التهاب اللثة. كما هو موضح في الشكل S5B، تم ملاحظة العينات مع اختلاف التركيزات ( 0,100 و لمدة 3 ساعات. كان السائل في زجاجة العينة يحتوي على درجات مختلفة من اللون الأصفر، حيث كان اللون الأصفر الأعمق يشير إلى تركيز أعلى من . هذه النتيجة تشير إلى أن زاد من أكسدة رابطة البورات وأدى إلى تفكك الهيدروجيل. أظهرت صورة SEM للعينة المجففة بالتجميد (الشكل S5C) أنه مع زيادة تركيز مع زيادة الحجم، يزداد حجم المسام في الهيدروجيل، وتبدأ الهيكلية ثلاثية الأبعاد للهيدروجيل في التفكك تدريجياً في البيئة المؤكسدة. تشير هذه النتيجة أيضًا إلى أن روابط الإستر البورات في الهيدروجيل تتدهور في البيئة المؤكسدة، مما يؤدي إلى انخفاض درجة الترابط وزيادة حجم المسام في الهيدروجيل. بدون العلاج، يتم إطلاق الدواء بسبب التحلل المائي لروابط البورات داخل الهيدروجيل مع مرور الوقت. ومع ذلك، في وجود ، يظهر الهيدروجيل كسرًا استجابةً بسبب أكسدة روابط البورات، مما يسرع من إطلاق الدواء (الشكل S5D). بالإضافة إلى ذلك، سلوك التحلل لهيدروجيلات HP-PVA@MH/Fe-Que في PBS التي تحتوي على تركيزات مختلفة من ، و تم التحقيق في ذلك. أظهرت النتائج أن شكل الهيدروجيل تغير بشكل ملحوظ مع زيادة تركيزات ووقت التفاعل، مما يثبت استجابته لمستويات ROS (الشكل S6). باختصار، يمكن لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que تحقيق تحلل استجابة لـ ROS وتسريع إطلاق الدواء، مما كان مفيدًا لعلاج التهاب اللثة.

اختبارات النشاط المضاد للبكتيريا في المختبر للهلامات المائية

البكتيريا هي واحدة من العوامل التي تسبب التهاب اللثة، ومنتجاتها الأيضية يمكن أن تحفز امتصاص الأنسجة اللثوية بشكل مدمر. حتى بعد العلاج القياسي لالتهاب اللثة، غالبًا ما تستمر بعض العوائل البكتيرية على سطح الجذر وتحتاج إلى علاج موضعي بالمضادات الحيوية. تم استخدام MH على نطاق واسع في العلاج السريري. لدراسة تأثير الهلاميات على البكتيريا، تم تحديد الأداء المضاد للبكتيريا للهلاميات من خلال طريقة طلاء الأطباق، وطريقة صبغ البكتيريا الحية/الميتة، واختبار منطقة التثبيط (ZOI). تظهر الشكل 3A أن هلاميات HP-PVA و HP-PVA@Fe-Que لم يكن لها خصائص مضادة للميكروبات ملحوظة مقارنة بمجموعة التحكم، كما يتضح من عدد المستعمرات. ومع ذلك، لم يكن هناك سوى عدد قليل من المستعمرات يمكن رؤيتها في مجموعات HP-PVA@MH و HP-PVA@MH/Fe-Que لبكتيريا S. aureus و E. coli و P. gingivalis. تم عرض نتائج عد المستعمرات البكتيرية في الشكل 3B و C.
الشكل 3 النشاط المضاد للبكتيريا في المختبر لهلامات HP-PVA@MH/Fe-Que. (A) صور تمثيلية لوحدات تشكيل مستعمرات S. aureus و E. coli و P. gingivalis. البيانات الإحصائية ذات الصلة لتقدير مستعمرات البكتيريا لـ (B) S. aureus و (C) E. coli و (D) P. gingivalis. (E) صور صبغ الخلايا الحية/الميتة لـ S. aureus و E. coli و P. gingivalis. معدل النشاط المضاد للبكتيريا لـ المكورات العنقودية الذهبية إي. كولاي ب. اللثة
و D. أظهرت النتائج أن مجموعات HP-PVA@MH و HP-PVA@MH/Fe-Que أظهرت نشاطًا مضادًا للبكتيريا واسع الطيف ضد كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسلبية الجرام، بالإضافة إلى البكتيريا الهوائية المسببة للأمراض المسؤولة عن التهاب اللثة. بعد ذلك، تم إجراء تجربة صبغ الفلورسنت للبكتيريا الحية/الميتة لتوضيح فعالية الهلامات المضادة للبكتيريا بصريًا. كما هو موضح في الشكل 3E، أظهرت مجموعات التحكم و HP-PVA و HP-PVA@Fe-Que بشكل رئيسي فلوروسنت خضراء، مما يشير إلى وجود بكتيريا حية؛ ومع ذلك، عرضت مجموعات HP-PVA@MH و HP-PVA@MH/Fe-Que كمية كبيرة من الفلورسنت الحمراء (مما يشير إلى بكتيريا ميتة). علاوة على ذلك، تم دعم هذه الاستنتاجات من خلال تحليلات شدة الفلورسنت الحية/الميتة لبكتيريا S. aureus و E. coli و P. gingivalis، على التوالي (الشكل 3F، G، H). لتقييم النشاط المضاد للبكتيريا للهلامات بشكل أكبر، تم إجراء اختبار ZOI باستخدام S. aureus و E. coli و P. gingivalis، والجرثومة الفموية الرئيسية S. mutans. النتائج
أشارت النتائج إلى أن الهيدروجيل HP-PVA و HP-PVA@Fe-Que لم يشكلا مناطق تثبيط ملحوظة، بينما أظهرت مجموعات HP-PVA@MH و HP-PVA@MH/Fe-Que مناطق تثبيط واضحة ضد جميع البكتيريا المختبرة، بما في ذلك S. mutans (الشكل S7). كانت هذه النتائج متسقة مع نتائج عدّ مستعمرات البكتيريا. لذلك، كان الهيدروجيل المحمّل بمضاد الميكروبات MH يتمتع بقدرة مضادة للميكروبات ممتازة وعمل على المحفزات المسببة لالتهاب اللثة لتحقيق تأثير علاجي كبير.

اختبار التوافق الحيوي للهلاميات المائية

التوافق الحيوي الجيد ضروري لمنع الآثار السلبية لمواد الهيكل الحيوي على الأنسجة والخلايا اللثوية الطبيعية [53]. تم استخدام مستخلصات الهلاميات الحيوية لزراعة الخلايا، وتم اختبار التأثيرات على حيوية الخلايا وتكاثرها. أظهرت صبغة الحياة/الموت للخلايا في 1 و3 و5 أيام (الشكل 4A وC، S8A، S8C، S8E) أن معظم خلايا hPDLSCs وHGFs وRAW264.7 وL929 وHaCaTs كانت حية، مع وجود عدد قليل فقط من الخلايا الميتة.
الشكل 4 التوافق الحيوي لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que. صور صبغة الحياة/الموت لـ (A) hPDLSCs و(C) خلايا RAW264.7 لمدة 1 و3 و5 أيام، على التوالي. اختبارات CCK-8 لـ (B) hPDLSCs و(D) خلايا RAW264.7 لمدة 1 و3 و5 أيام. (E) نسبة انحلال الدم لخلايا الدم الحمراء بعد الحضانة مع الهلاميات.
بالإضافة إلى ذلك، زاد عدد الخلايا تدريجياً مع مرور الوقت، دون اختلاف عن مجموعة التحكم، مما يشير إلى أن الهلاميات لم تتمكن من تثبيط تكاثر الخلايا. علاوة على ذلك، أظهرت نتائج CCK-8 في 1 و3 و5 أيام عدم وجود فرق ذو دلالة إحصائية في حيوية الخلايا بين مجموعات معالجة الهلام ومجموعة التحكم، وهو ما يتماشى مع نتائج اختبار صبغة الحياة/الموت (الشكل 4B وD، S8B، S8D، S8F).
بالإضافة إلى ذلك، من أجل إظهار حيوية الخلايا مباشرة في وجود الهلاميات لتحليل التفاعل البيولوجي بدقة، قمنا بزراعة خلايا hPDLSCs على هلام HP-PVA@MH/Fe-Que. كما هو موضح في الشكل S9A وS9B، لم يظهر الهلام أي سمية واضحة تجاه hPDLSCs وأظهر توافقاً حيوياً جيداً. علاوة على ذلك، من خلال صبغة DAPI وFITC الفلورية المدمجة مع المجهر الضوئي التداخل الليزري، لوحظ أن الخلايا كانت موزعة بالتساوي على سطح الهلام وأظهرت شكل مغزلي منتشر بشكل جيد، مما يدل على التصاق ممتاز (الشكل S9C). وبالتالي، كان للهلام توافق جيد مع الخلايا.
نزيف اللثة هو عرض سريري مهم لالتهاب اللثة [9]. أثناء علاج التهاب اللثة، يلتصق الهلام لتدمير سطح الأنسجة في جيب اللثة. من منظور التوافق الحيوي، يجب أن يكون له مستوى عالٍ من توافق الدم. مقارنة بمجموعة التحكم، لم يكن هناك ضرر واضح لخلايا الدم الحمراء في مجموعة معالجة الهلام، بينما كانت خلايا الدم الحمراء في مجموعة معالجة Triton X-100 ممزقة (الشكل S10A، B). أظهر الشكل 4E أن معدل انحلال الدم لمجموعة معالجة الهلام كان أقل من ( هو توافق دم جيد)، مما يشير إلى أن الهلام كان له توافق دم جيد.

قدرة الهلاميات على التخلص من الجذور الحرة والقدرة المضادة للأكسدة

يمكن أن تؤدي ROS الزائدة إلى آثار سامة للخلايا وتفعيل عوامل التهابية، مما يؤدي بشكل مباشر أو غير مباشر إلى تدمير الأنسجة اللثوية [54]. لذلك، فإن التخلص من ROS الزائدة أمر حاسم لعلاج التهاب اللثة والتخفيف من الضرر الذي يلحق بالأنسجة اللثوية [55]. أولاً، تم استخدام اختبار التخلص من الجذور الحرة DPPH لتقييم الأداء المضاد للأكسدة للهلاميات (الشكل 5A). يحتوي جذر DPPH الحر على إلكترون واحد، وحلوله الكحولية ذات لون أرجواني مع امتصاص قوي عند 515 نانومتر. في وجود مضادات الأكسدة، يتم تحييد جذر DPPH الحر، مما يتسبب في تفتيح لون المحلول وانخفاض الامتصاص عند 515 نانومتر [56]. إلى حد ما، يعكس التغيير في الامتصاص مدى التخلص من الجذور الحرة. أظهرت مجموعة التحكم أعلى امتصاص وظهرت باللون الأرجواني، بينما كانت المجموعة الإيجابية لديها أقل امتصاص وعرضت لوناً أصفر قليلاً. أظهرت مجموعات HP-PVA وHP-PVA@MH قدرة ضئيلة
على التخلص من الجذور الحرة DPPH. على العكس من ذلك، أظهرت كل من مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que مستويات امتصاص منخفضة بشكل ملحوظ، مع عرض لون متوسط بين مجموعة التحكم والمجموعة الإيجابية (الشكل 5B). يوضح الشكل 5C نشاط التخلص من الجذور الحرة DPPH لمجموعات الهلام المختلفة. أشارت النتائج إلى أن مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que كانت لديها معدلات تخلص متفوقة من DPPH عند و ، على التوالي.
ثانياً، يتعرض ABTS للأكسدة، مما يشكل جذر كاتيوني أخضر مستقر مع ذروة امتصاصه عند 405 نانومتر [57]. عند إدخال العينة إلى محلول جذر ABTS، تتفاعل المركبات المضادة للأكسدة مع جذور ABTS، مما يؤدي إلى تغيير لون نظام التفاعل وانخفاض الامتصاص عند 405 نانومتر (الشكل 5D). بالإضافة إلى ذلك، فإن تغيير امتصاصه ضمن نطاق معين يتناسب مع درجة التخلص من الجذور الحرة. كما أظهر الشكل 5E، كان امتصاص مجموعة التحكم هو الأعلى وظهر باللون الأخضر، بينما عرضت المجموعة الإيجابية أقل امتصاص بلون شفاف. أظهرت مجموعات HP-PVA وHP-PVA@MH قدرة ضئيلة على التخلص من الجذور الحرة ABTS. على العكس من ذلك، عرضت مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que لوناً متوسطاً بين مجموعات التحكم والإيجابية، مع عرض مستويات امتصاص منخفضة بشكل ملحوظ. كانت معدلات التخلص من الجذور الحرة ABTS متسقة كما هو موضح أعلاه (الشكل 5F).
بالإضافة إلى ذلك، تم إثبات قدرة الهلاميات على التخلص من ROS بشكل أكبر من خلال صبغة DCFH-DA داخل الخلايا [58]. في مجموعة التحكم، أظهرت خلايا RAW264.7 أقل كثافة فلورية، بينما كانت كثافة الفلورة لـ ، HP-PVA، ومجموعات HP-PVA@MH أقوى، مما يدل على وجود كميات كبيرة من ROS. ومع ذلك، أظهرت مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que كثافة فلورية منخفضة، مما يدل على قدرة قوية على التخلص من ROS (الشكل 5G، H). تم ملاحظة نتيجة مماثلة أيضاً في خلايا L929 (الشكل S11). من المهم أن نتائج تحليل تدفق الخلايا أظهرت أن مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que قللت بشكل كبير من مستوى ROS في خلايا RAW264.7، وهو ما يتماشى بشكل كبير مع استنتاجات الملاحظة المجهرية، وأكدت قدرة التخلص الممتازة من الجذور الحرة (الشكل S12). افترضنا أن هلام HP-PVA@MH/Fe-Que يظهر كفاءة عالية في التخلص من ROS، والتي تعزى إلى وجود مجموعات الفينول والكيتون في هيكل الكيرسيتين.
علاوة على ذلك، تم تقييم القدرة الحامية للهلام ضد تلف الخلايا الناتج عن الإجهاد التأكسدي وقدرتها على استعادة حيوية الخلايا باستخدام صبغة الحياة/الموت واختبار CCK-8. كما هو موضح في الشكل 5I، كانت هناك كثافة كبيرة من الفلورة الحمراء
الشكل 5 قدرة التخلص من الجذور الحرة والقدرة المضادة للأكسدة لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que في بيئة الإجهاد التأكسدي. (A) مخطط يوضح اختبار التخلص من الجذور الحرة DPPH. (B) الامتصاص، الصورة، و(C) نسبة التخلص من DPPH للهلاميات المختلفة. (D) مخطط يوضح اختبار التخلص من الجذور الحرة ABTS. (E) الامتصاص، الصورة، و(F) نسبة التخلص من ABTS للهلاميات المختلفة. (G) صبغة DCFH-DA، (H) النتائج الكمية الفلورية، (I) صبغة الحياة/الموت، و(J) اختبار CCK-8 لخلايا RAW264.7
(مؤشر على الخلايا الميتة) لوحظت في مجموعات ، HP-PVA، ومجموعات HP-PVA@MH. ومع ذلك، كان عدد الخلايا الميتة منخفضاً بشكل ملحوظ في مجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que. كانت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل CCK-8 متسقة مع صبغة حيوية الخلايا، مما يكشف عن انخفاض كبير في حيوية الخلايا لمجموعات ، HP-PVA، ومجموعات HP-PVA@MH، بينما كان الانتعاش واضحاً لمجموعات HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que (الشكل 5J). أظهرت هذه النتائج أن هلام HP-PVA@Fe-Que وHP-PVA@MH/Fe-Que يمتلك خصائص حامية ملحوظة قادرة على التخفيف من تدهور حيوية الخلايا الناتج عن ROS.

تأثير تنظيم نمط الخلايا البلعمية للهلاميات

ت activates ROS المفرطة مسارات مضادة للالتهابات متعددة في التهاب اللثة، مما يؤدي إلى زيادة نسبة البلعميات M1 إلى البلعميات M2. إن تثبيط تحول نمط البلعميات إلى نمط البلعميات M1 (المؤيدة للالتهابات) وتعزيز الاستقطاب نحو نمط البلعميات M2 (المضادة للالتهابات) مفيد لتخفيف الالتهاب وتعزيز تمايز الخلايا العظمية، مما يمثل نهجًا علاجيًا أساسيًا لعلاج التهاب اللثة. لذلك، لتقييم تأثير الهيدروجيلات المختلفة على استقطاب البلعميات، استخدمنا LPS لتعزيز الاستقطاب نحو نمط البلعميات M1 و IL-4 لدفع الاستقطاب نحو نمط البلعميات M2. أظهرت مجموعة التحكم بدون تحفيز شكل دائري منتظم. في المقابل، أظهرت البلعميات المحفزة بواسطة LPS شكلًا قصيرًا وخيطيًا من الزوائد الكاذبة، بينما أظهرت البلعميات المحفزة بواسطة IL-4 شكلًا مطولًا.
تم إجراء تجارب صبغ IF في البداية على البلعميات لتحديد البلعميات من النوع M1 التي تعبر عن إنزيم أكسيد النيتريك المحفز (iNOS) والبلعميات من النوع M2 التي تعبر عن مستقبل المانوز (CD206). كما هو موضح في الشكل 6C، زادت تعبير iNOS في خلايا RAW264.7 بشكل ملحوظ بعد معالجة LPS. بالمقارنة مع مجموعة LPS، لم يتم ملاحظة فرق كبير في تعبير iNOS في هيدروجيل HP-PVA و HP-PVA@MH. ومع ذلك، لوحظ انخفاض كبير في تعبير iNOS في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que. كما هو موضح في الشكل 6E، زاد تعبير CD206 في خلايا RAW264.7 بعد معالجة IL-4. وبالمثل، لم يتم ملاحظة أي تغيير كبير في تعبير CD206 بين هيدروجيل HP-PVA و HP-PVA@MH مقارنة بمجموعة IL-4؛ ومع ذلك، لوحظ زيادة كبيرة في تعبير CD206 داخل مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que. بعد ذلك، تم إجراء تحليل إضافي باستخدام تقنية قياس التدفق لتقييم استقطاب البلعميات (الشكل 6D، F). أظهرت النتائج أن
الهيدروجيل HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que قاموا بفعالية بتثبيط استقطاب البلعميات نحو M1 بينما عززوا استقطاب البلعميات نحو M2، مما سهل حل الالتهاب وإصلاح الأنسجة في التهاب اللثة.

آلية مضادات الأكسدة ومضادات الالتهاب في الهيدروجيل في المختبر من خلال تنظيم مسار Nrf2/NF-кB

تلعب مسارات الإجهاد التأكسدي دورًا حاسمًا في تطوير وتقدم مختلف الأمراض. يُعتبر Nrf2 منظمًا رئيسيًا للإجهاد التأكسدي، حيث يقوم بزيادة تعبير مجموعة متنوعة من إنزيمات مضادات الأكسدة (مثل SOD-1 و CAT) من خلال الارتباط بعنصر الاستجابة لمضادات الأكسدة لالتقاط ROS الزائد، وبالتالي حماية الخلايا من الضرر التأكسدي. يرتبط Nrf2 أيضًا باستقطاب البلعميات ومسار NF-кB. يُعتبر تنشيط مسار NF-кB أمرًا حاسمًا في الالتهاب المزمن، حيث يعزز استقطاب البلعميات نحو النوع M1 ويزيد من تعبير السيتوكينات المؤيدة للالتهاب (مثل IL-1). و TNF- ) [61]. تشير نتائج “تأثير تنظيم نمط البلعميات لهلام الهيدروجيل” إلى أن هلام HP-PVA@MH/Fe-Que يمكن أن يتوسط في استقطاب البلعميات. لذلك، يمكن استنتاج أن هلام HP-PVA@MH/Fe-Que قد ينظم مسار Nrf2/NF-кB لقمع الإجهاد التأكسدي، مما يمنع استقطاب البلعميات نحو النوع M1 ويعزز الاستقطاب نحو النوع M2. للتحقيق في الدور المحتمل للآليات المضادة للأكسدة والمضادة للالتهابات لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que، قمنا بإجراء صبغة IF، وqRT-PCR، وwestern blot للتحقق من هذه الفرضية.
كما هو موضح في الشكل 7A، بعد الالتهاب الناتج عن LPS، أظهرت البلعميات شدة فلورية أقل لنظام Nrf2، كما أظهرت مجموعات HP-PVA و HP-PVA@MH شدة فلورية مشابهة؛ ومع ذلك، كانت إشارة الفلورة لنظام Nrf2 أعلى بشكل ملحوظ في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que مقارنة بمجموعة LPS. على العكس من ذلك، بالنسبة لنظام NF-кB، كانت إشارة الفلورة في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que أقل من مجموعة LPS (الشكل 7B). وفقًا للنتائج الموضحة في الشكل 7C-H، مقارنة بمجموعة LPS، أظهرت مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que اتجاهًا هبوطيًا في تعبير السيتوكينات المؤيدة للالتهاب. و واتجاه تصاعدي في تعبير السيتوكينات المضادة للالتهابات وأيضًا، تم تعزيز تعبير إنزيمات مضادات الأكسدة SOD-1 و CAT في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que. تشير هذه النتائج إلى أن الهلاميات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que تمتلك قدرات عالية في مضادات الأكسدة ومضادات الالتهاب.
علاوة على ذلك، أظهرت نتائج الويسترن بلوت أنه بعد إضافة LPS، انخفض تعبير Nrf2،
الشكل 6 هلام HP-PVA@MH/Fe-Que يمنع استقطاب البلعميات نحو النمط الظاهري M1 بينما يسهل استقطابها نحو النمط الظاهري M2. (A) مخطط يوضح تأثير هلام HP-PVA@MH/Fe-Que على استقطاب البلعميات. (B) منظر مجهرى للبلعميات. صور IF لـ (C) M1 (iNOS) و (E) M2 (CD206) علامات البلعميات. تحليل تدفق الخلايا لـ (D) M1 (CD86) و (F) M2 (CD206) علامات البلعميات.
الشكل 7 هلامات HP-PVA@MH/Fe-Que تنظم مسار Nrf2/NF-kB لت exert تأثيرات مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات في المختبر. صور IF لخلايا RAW264.7 لـ (A) Nrf2 و (B) NF-kB. تحليل QRT-PCR لمستوى mRNA النسبي لـ (C، D) الجينات المؤيدة للالتهابات IL-1ß، TNF-a؛ (E، F) الجينات المضادة للالتهابات IL-10، Arg-1؛ ( جينات إنزيمات مضادات الأكسدة SOD-1 و CAT. (I) الكشف عن Nrf2 و P65 و p-P65 باستخدام تقنية Western blot، مع β-actin كعنصر تحكم داخلي. (J) تم تقديم آلية مضادات الأكسدة ومضادات الالتهاب لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que كرسم تخطيطي.
بينما زادت تعبير Nrf2 في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que. على العكس، كان تعبير P65 في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que أضعف من ذلك في مجموعة LPS، وكذلك p-P65 (الشكل 7I). تشير هذه النتيجة إلى أن HP-PVA@MH/Fe-Que يمكن أن تعزز تعبير Nrf2 بينما تقلل من مستويات P65 و p-P65. بشكل عام، يمكن لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que تنظيم مسار Nrf2/NF-кB وتأثيره على استقطاب البلعميات، مما يخفف من الإجهاد التأكسدي (الشكل 7J).

تقييم التمايز العظمي في المختبر للهلامات المائية

تمتلك خلايا السدادات السنية البشرية (HPDLSCs) القدرة على التمايز متعدد الاتجاهات، مما يفيد في تجديد العظم السنخي [20]. كما هو موضح في الشكل S13، أظهرت خلايا hPDLSCs شكلًا مغزليًا مطولًا أو شكل مغزل، وكانت مشابهة من الناحية الشكلية للخلايا الليفية. كشفت تحليل تدفق الخلايا عن مستويات عالية من التعبير عن CD90 (99.97%) وCD105 (99.5%)، بينما كانت مستويات التعبير عن CD34 (0.08%) وCD45 (0.25%) منخفضة. تشير هذه النتائج إلى أن خلايا hPDLSCs المعزولة كانت خلايا جذعية ميزانشيمية متمايزة جيدًا مستمدة من الأنسجة اللثوية، مع دلالات هامة لتجديد وإصلاح الأنسجة اللثوية. ومع ذلك، فإن زيادة مستويات الجذور الحرة للأكسجين (ROS) في البيئة الدقيقة اللثوية تسبب إجهادًا أكسديًا، مما يثبط بشكل كبير التمايز العظمي لخلايا hPDLSCs ويدمر الأنسجة اللثوية [62]. لذلك، من الضروري التخفيف من مستويات ROS المفرطة والحفاظ على قدرة التمايز العظمي لخلايا hPDLSCs من أجل إصلاح الأنسجة اللثوية بنجاح.
كما هو موضح في الشكل 8A، أظهر هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que قدرته على حماية خلايا hPDLSCs من التمايز العظمي. تم تقييم الشكل الخلوي لكل مجموعة هيدروجيل تحت بيئة الإجهاد التأكسدي المستحث (الشكل 8B). أظهرت مجموعة التحكم خلايا شبيهة بالأرومة الليفية ذات شكل مغزلي أو مغزلي ممدود، مع نوى تقع في المنتصف، وبنية سيتوبلازمية دائرية أو بيضاوية. على العكس، كانت الخلايا في , HP-PVA، و HP-PVA@ MH أظهرت شكلًا متقلصًا ومُنكمشًا تحت ظروف الإجهاد التأكسدي. على العكس من ذلك، استعاد الخلايا في HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que شكلها المغزلي أو الشبيه بالأسطوانة، مما خفف بشكل فعال من الآثار السلبية للإجهاد التأكسدي على شكل hPDLSCs. بالإضافة إلى ذلك، تم زراعة hPDLSCs والهلاميات معًا في وجود بيروكسيد الهيدروجين لمراقبة التغيرات الشكلية للخلايا (الشكل S14). أظهرت مجموعة التحكم خلايا بشكل مغزلي جيد. في المجموعة، كان شكل الخلايا غير طبيعي بشكل ملحوظ. ومن الجدير بالذكر أن هلاميات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que، التي تحتوي على
جزيئات نانوية مضادة للالتهابات Fe-Que، أظهرت توافقًا خلويًا متفوقًا من خلال تعزيز التصاق الخلايا وانتشارها من خلال إزالة ROS بشكل فعال. بعد ذلك، تم إجراء تحفيز عظمى ضمن بيئة ميكروية مؤكسدة للتحقيق في تأثير الإجهاد التأكسدي على سلوك التحفيز العظمي لـ hPDLSCs تحت علاجات الهلام. الفوسفاتاز القلوي (ALP)، وهو علامة مبكرة للتكوين العظمي، يعمل كمرآة لمستوى تمايز الخلايا العظمية [63]. تشير زيادة نشاط ALP إلى تمايز أكثر وضوحًا من الخلايا العظمية الأولية إلى الخلايا العظمية الناضجة. تعتبر العقد المعدنية مؤشرًا رئيسيًا على تمايز ونضوج الخلايا العظمية؛ لذلك، يتم استخدام Alizarin Red S (ARS) لتلوين أو تحديد رواسب الكالسيوم في الأنسجة من خلال تشكيل مركب برتقالي-أحمر مع أملاح الكالسيوم الموجودة في كربونات الكالسيوم أو هيدروكسيباتيت [64]. تم تقليل نشاط ALP بشكل ملحوظ في , HP-PVA، و HP-PVA@MH مقارنة بمجموعة التحكم، كما هو موضح في الشكل 8C. ومع ذلك، في HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que، كان هناك استعادة جزئية لنشاط ALP بين مجموعة التحكم و المجموعات. تم ملاحظة نتائج مماثلة في تحليل ARS.
بالإضافة إلى ذلك، للتحقيق بشكل أكبر في قدرة هلام HP-PVA@MH/Fe-Que على إنقاذ تمايز hPDLSCs العظمي، تم إجراء تلوين مناعي فلوري لتقييم مستويات التعبير عن Runx2 و OCN. يلعب Runx2 دورًا حاسمًا في تمايز الخلايا العظمية وتشكيل الهيكل العظمي، حيث يظهر تعبيرًا عاليًا مبكرًا وتوطينًا نوويًا [65]. OCN هو بروتين يتم إفرازه من الخلايا العظمية يعكس نشاطها وقدرتها على تشكيل العظام، ويعمل كعلامة في مرحلة متأخرة للتكوين العظمي [66]. مقارنة بمجموعة التحكم، تم تقليل تعبيرات كل من Runx2 و OCN بشكل ملحوظ في , HP-PVA، و HP-PVA@MH؛ ومع ذلك، تم استعادتها جزئيًا في مجموعات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que (الشكل 8D). تشير النتائج إلى أن قدرة hPDLSCs على التمايز العظمي كانت متأثرة بشكل كبير تحت ظروف الإجهاد التأكسدي، بينما أظهرت هلاميات HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que تأثير إنقاذ جزئي على القدرة على التمايز العظمي، مما يعزز تجديد العظام لتحقيق أهداف تجديد الأنسجة اللثوية.

قدرة إزالة ROS للهلاميات في الجسم الحي

نظرًا للتأثيرات القوية المضادة للبكتيريا، ومضادة للأكسدة، ومضادة للالتهابات لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que على خلايا RAW264.7 وتأثيره الإيجابي على التمايز العظمي لـ hPDLSCs تحت ظروف مؤكسدة، قمنا بإنشاء نماذج التهاب دواعم الأسنان التجريبية في الجرذان باستخدام مزيج من الأسلاك المربوطة وحقن . gingivalis لتقييم التأثيرات العلاجية لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que (الشكل S15). يتم تقديم مخطط التدفق التجريبي للدراسات في الجسم الحي
الشكل 8 هلاميات HP-PVA@MH/Fe-Que حمت hPDLSCs من هجوم ROS وعززت التمايز العظمي في البيئة الميكروية المؤكسدة. (A) مخطط يوضح تأثير HP-PVA@MH/Fe-Que على قدرة hPDLSCs على التمايز العظمي تحت ظروف الإجهاد التأكسدي. (B) شكل الخلايا لـ hPDLSCs تحت ظروف الإجهاد التأكسدي. (C) تلوين ALP في اليوم السابع وتلوين ARS في اليوم الحادي والعشرين لـ hPDLSCs. (D) صور تلوين IF لـ Runx2 و OCN في hPDLSCs
في الشكل S16A. لتوضيح الخصائص المضادة للأكسدة في الجسم الحي، تم الكشف عن ROS باستخدام نظام تصوير حي متعدد الأوضاع للحيوانات الصغيرة. بعد إنشاء نموذج التهاب دواعم الأسنان، تم وضع الهلاميات بين الضرس الأول والثاني العلوي. بعد أسبوع، تم حقن مسبار فلوري ROS في موقع التهاب دواعم الأسنان. كما هو موضح في الشكل S16B، أظهرت مجموعة التهاب دواعم الأسنان إشارات فلورية مرتفعة، مما يشير إلى تراكم ROS في الأنسجة اللثوية. كانت إشارة الفلورة في مجموعة HP-PVA أقل قليلاً من تلك في مجموعة التحكم، مما يشير إلى أن الهلام لديه استجابة لـ ROS ويمكنه إزالة جزء من ROS. كانت شدة الفلورة في مجموعات HP-PVA@MH و HP-PVA@Fe-Que و HP-PVA@MH/Fe-Que أقل بكثير من تلك الخاصة بمجموعة التهاب دواعم الأسنان، وكانت شدة الفلورة لـ HP-PVA@MH/Fe-Que هي الأدنى. أكدت البيانات الإحصائية في الشكل S16C النتائج، مما يشير إلى أن HP-PVA لديه قدرة جزئية على إزالة ROS، وأن HP-PVA@MH/Fe-Que لديه قدرة ممتازة على إزالة ROS في الجسم الحي. علاوة على ذلك، تم اختبار قدرة هلاميات HP-PVA@MH/Fe-Que على إزالة نشاط ROS في خلايا RAW264.7 في المختبر. أظهرت النتائج مرة أخرى أن هلاميات HP-PVA@MH/Fe-Que كانت لديها كفاءة ملحوظة في إزالة ROS (الشكل S16D، E).

تقييم تجديد العظام للهلاميات في الجسم الحي

لتقييم التأثير العلاجي لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que على امتصاص العظام في الجسم الحي، تم الحصول على عينات من العظام الفكية للتحليل باستخدام Micro-CT بعد أسبوعين وأربعة أسابيع من علاج الهلام (الشكل 9A). تم استخدام صور ثنائية وثلاثية الأبعاد لتصور إعادة بناء العظام السنخية، مما يظهر تدمير العظام السنخية وامتصاص عند تباعد الجذر، مما يعكس العملية الالتهابية لنموذج مرض دواعم الأسنان. تم قياس مدى فقدان العظام في العظام السنخية من خلال قياس المسافة الخطية من نقطة التقاء المينا (CEJ) للضرس الأول إلى قمة قمة العظام السنخية (ABC). كما هو موضح في الشكل 9B و C، أظهرت مجموعة التهاب دواعم الأسنان فقدانًا كبيرًا للعظام بين الضرسين الأول والثاني، متجاوزة قطر السلك المرن المربوط . علاوة على ذلك، وصل امتصاص العظام السنخية إلى حوالي ثلث طول الجذر، مما يؤكد النجاح في إنشاء نموذج التهاب دواعم الأسنان. أظهرت الجرذان SD المعالجة بـ HP-PVA و HP-PVA@MH و HP-PVA@Fe-Que تحسينًا في تجديد العظام في العظام السنخية. علاوة على ذلك، كان تجديد العظام أكثر وضوحًا عند المعالجة بـ HP-PVA@MH/Fe-Que. تم رسم النتائج الكمية المقابلة في الشكل 9D-G. من بينها، عند تقييم الأسبوع الثاني من عيب العظام السنخية الجانبية، وجدنا أن فقدان العظام السنخية في مجموعة التهاب دواعم الأسنان
كان مرتفعًا بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعة التحكم . مقارنة بمجموعة التهاب دواعم الأسنان، أظهرت الجرذان المعالجة بـ HP-PVA , HP-PVA@MH ( )، و HP-PVA@Fe-Que ( ) تقليلًا في فقدان العظام السنخية، وأظهرت الجرذان المعالجة بـ HP-PVA@MH/Fe-Que ( ) أفضل استعادة للعظام السنخية. في الأسبوع الرابع، كان عيب العظام السنخية الجانبية للسيطرة، التهاب دواعم الأسنان، HP-PVA، HP-PVA@MH، HP-PVA@Fe-Que، ومجموعات HP-PVA@MH/Fe-Que , و . أظهرت جميع المؤشرات الأخرى أن العظام السنخية استعدت جزئيًا بعد علاج هلام HP-PVA@MH/Fe-Que، مما يؤكد باستمرار أن HP-PVA@MH/Fe-Que أنقذت فقدان العظام السنخية في الأمراض الالتهابية وكان لها تأثيرات علاجية جيدة على التهاب دواعم الأسنان في الجسم الحي.

إعادة تشكيل وتجديد الأنسجة اللثوية في التهاب دواعم الأسنان في الجسم الحي

بعد التحقق من النشاط الاستعادي لـ HP-PVA@MH/Fe-Que من خلال تحليل Micro-CT، قمنا بإجراء تحليل نسيجي للتحقق من التغيرات المرضية في الأنسجة اللثوية. في مجموعة التحكم، كان الالتصاق الظهاري طبيعيًا بعد أسبوعين، ولم تتشكل جيوب لثوية، وكان تسرب الخلايا الالتهابية ضئيلًا، وكانت ألياف الكولاجين موجهة بشكل جيد، وكانت ألياف أسنان القرش مدخلة عموديًا في العظم. في مجموعة التهاب اللثة، كان هناك فقدان في الالتصاق الظهاري في اللثة، وامتصاص للعظم السنخي نحو قمة الجذر، وتسلل واسع للخلايا الالتهابية، وترتيب غير منظم لألياف الكولاجين، مما يشير إلى التهاب كبير داخل الأنسجة اللثوية. بالمقابل، بعد العلاج بـ HP-PVA@MH/Fe-Que، تم استعادة الالتصاق الظهاري الجزئي، وتم تقليل تسرب الخلايا الالتهابية، وتم استعادة ارتفاع ABC جزئيًا (الشكل S17A). تم تقييم كفاءة علاج التهاب اللثة من خلال صبغة ماسون ثلاثية الألوان (المنطقة الزرقاء تمثل صبغة الكولاجين)، والتي أظهرت أن مستوى ترسب الكولاجين قد انخفض في مجموعة التهاب اللثة، وكانت بنية ألياف الكولاجين غير منظمة وغير منتظمة (الشكل S17B). بعد العلاج بـ HP-PVA@MH/FeQue، كانت ألياف الكولاجين أكثر كثافة وتنظيمًا. يمكن أيضًا تأكيد هذه النتائج من خلال النتائج الكمية لمحتوى الخلايا الالتهابية والكولاجين في الشكل S17D، E.
في 4 أسابيع، لاحظنا استعادة محدودة لفقدان العظم في مجموعة التهاب اللثة، مع هيكل نسيج ضام غير منظم (الشكل 10A، B). في مجموعة علاج HP-PVA، كان هناك استعادة طفيفة في النسيج الضام وارتفاع العظم السنخي، دون تأثير كبير على علاج التهاب اللثة. كان تسرب الخلايا الالتهابية أقل بكثير في مجموعة HP-PVA@Fe-Que و
الشكل 9 أظهرت هلاميات HP-PVA@MH/Fe-Que تقليل فقدان العظم السنخي في نماذج الفئران لالتهاب اللثة. (A) توضيح تخطيطي لإجراء العلاج للدراسة الحية. (B) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد، صور ساجيتال للعظم السنخي بعد أسبوعين (الخط المنقط العلوي: CEJ، الخط المنقط السفلي: ABC، الخط الأحمر: فقدان العظم). (C) صور في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد ومنظر ساجيتال ثنائي الأبعاد تم التقاطها بعد أربعة أسابيع من الزرع. (D) تقييم ارتفاع فقدان العظم الجانبي في مصطلحات كمية و(E) فقدان العظم الساجيتال بعد أسبوعين. (F) تقييم كمي لارتفاع فقدان العظم الجانبي و(G) فقدان العظم الساجيتال بعد 4 أسابيع.
الشكل 10 خففت هلاميات HP-PVA@MH/Fe-Que عدم توازن استتباب العظم اللثوي في نماذج الفئران لالتهاب اللثة بعد 4 أسابيع من العلاج. (A) صور لصبغة H&E. (B) صور صبغة ماسون ثلاثية الألوان للعظم السنخي. (C) صبغة IF لمؤشر التحفيز العظمي OCN في العظم السنخي. R: الجذر، PDL: الرباط اللثوي، AB: العظم السنخي.
كانت مستويات ارتفاع العظم السنخي في مجموعة HP-PVA@MH أفضل من مجموعة التهاب اللثة بعد العلاج، وتم استعادة ارتفاع العظم السنخي بشكل كبير. أظهرت مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que أفضل تأثير، حيث اقتربت بنية اللثة والرباط اللثوي والعظم السنخي من الوضع الطبيعي. يمكن أيضًا تأكيد هذه النتائج من خلال النتائج الكمية لمحتوى الخلايا الالتهابية والكولاجين في الشكل S18A، B. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن HP-PVA@MH/Fe-Que كان له تأثير علاجي كبير على نموذج التهاب اللثة الناتج عن البكتيريا، مما يقلل من الاستجابات الالتهابية في الأنسجة اللثوية ويسرع من استعادة التهاب اللثة.
للتحقق من النشاط العظمي لـ HP-PVA@MH/FeQue في مرحلة تجديد الأنسجة بعد الالتهاب، تم استخدام Runx2 (بعد أسبوعين) وOCN (بعد 4 أسابيع) للتحقق من التعبير العظمي المحتمل أثناء تكوين العظم من خلال صبغة IF (الشكل S17C، 10 C). كان التعبير عن Runx2 وOCN منخفضًا في مجموعة التهاب اللثة، مما يشير إلى أن القدرة على تجديد العظم كانت منخفضة خلال التهاب اللثة (الشكل S17F، S18C). مقارنةً بمجموعة التهاب اللثة، كان التعبير عن Runx2 وOCN مرتفعًا بعد العلاج بهلام HP-PVA@MH/Fe-Que، مما يظهر أن علاج هلام HP-PVA@MH/Fe-Que كان له تأثير تنظيمي إيجابي على استعادة نسيج العظم اللثوي.

التأثير المضاد للالتهابات للهلاميات في الجسم الحي

أظهر HP-PVA@MH/Fe-Que تأثيرات واقية ضد تلف الأنسجة؛ لذلك، استكشفنا آلياتها العلاجية المحتملة. قمنا بتقييم مستويات السيتوكينات المرتبطة بالالتهابات باستخدام صبغة المناعية النسيجية (IHC) وصبغة IF في الجسم الحي. أظهرت صبغة IHC أن مناطق الصبغ الإيجابية لعوامل الالتهاب IL-1 و TNF- كانت أقل قليلاً في مجموعة HP-PVA مقارنةً بمجموعة التهاب اللثة، وتم تقليل مناطق الصبغ الإيجابية بشكل أكبر بعد العلاج بـ HP-PVA@MH وHP-PVA@Fe-Que؛ بينما لوحظت أقل منطقة صبغ إيجابية في مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que (الشكل 11A، D، E). تشير هذه النتائج إلى أن HP-PVA يمكن أن يزيل جزءًا من ROS ويخفف الالتهاب قليلاً بسبب استجابته لـ ROS. بعد العلاج بـ HP-PVA@MH وHP-PVA@Fe-Que، تم تقليل الاستجابة الالتهابية بشكل أكبر. ومع ذلك، بسبب إطلاق العامل المضاد للبكتيريا MH والجزيئات النانوية المضادة للالتهابات Fe-Que NPs المستحثة بواسطة ROS، أزال HP-PVA@MH/Fe-Que البكتيريا المحلية في الجيوب اللثوية وكبح الالتهاب، مما أعاد الأنسجة اللثوية.
في التهاب اللثة، تتكاثر البلعميات M1 بشكل مفرط وتطلق عوامل التهابية مختلفة، مما يزيد من حدة الالتهاب. بعد ذلك، قمنا بتقييم وظيفة تعديل المناعة للهلام. قمنا بإجراء صبغة IF للبلعميات M1 وM2 مع
iNOS وCD206، على التوالي. أظهر الشكل 11B أن شدة الفلورسنت لـ iNOS في مجموعة التهاب اللثة كانت الأعلى، مما يشير إلى زيادة كبيرة في التعبير، بينما كان التعبير عن CD206 أقل. بعد العلاج بهلام HP-PVA@MH/Fe-Que، انخفضت شدة الفلورسنت للبلعميات M1 بشكل كبير، بينما زادت شدة الفلورسنت للبلعميات M2 بشكل كبير (الشكل 11F، G)، مما يشير إلى أن مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que يمكن أن تثبط استقطاب البلعميات M1 وتعزز استقطاب البلعميات M2، مع وظيفة تعديل مناعي جيدة.
يمكن أن يعزز Nrf2 مقاومة الإجهاد التأكسدي لتقليل الاستجابات الالتهابية من خلال تنشيط جينات معينة مثل NF-кB في التهاب اللثة [40]. بناءً على نتائج نموذج LPS السابقة في المختبر (الشكل 7A، B، I)، استكشفنا المزيد من التعبير عن Nrf2 وNF-кB في الجسم الحي. كما هو موضح في الشكل 11C، كان تعبير Nrf2 منخفضًا في مجموعة التهاب اللثة، بينما كان مستوى بروتين Nrf2 أعلى في مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que مقارنةً بمجموعة التهاب اللثة (الشكل 11H). تشير هذه النتيجة إلى أن HP-PVA@MH/Fe-Que كان له قدرة أفضل على مكافحة الأكسدة. بالإضافة إلى ذلك، مقارنةً بمجموعة التحكم، كان مستوى بروتين P65 أعلى في مجموعة التهاب اللثة، مما يشير إلى أن مسار إشارات NF- تم تنشيطه. ومع ذلك، كان مستوى بروتين P65 أقل في مجموعة HP-PVA@MH/Fe-Que مقارنةً بمجموعة التهاب اللثة (الشكل 11I)، مما يشير إلى أن HP-PVA@MH/Fe-Que كان له قدرة جيدة على تثبيط مسار إشارات NF-кB وتقليل الالتهاب.
باختصار، كان لهلام HP-PVA@MH/Fe-Que تأثير علاجي كبير على نموذج التهاب اللثة الناتج عن البكتيريا، والذي يمكن أن يزيل ROS ويخفف من الإجهاد التأكسدي في الأنسجة اللثوية. ثانيًا، عزز التعبير عن Nrf2 وكبح التعبير عن P65، منظمًا مسار Nrf2/NF-кB لتحقيق تعديل مناعي، مثبطًا استقطاب البلعميات M1 ومروجًا لاستقطاب البلعميات M2، مما يخفف من الاستجابة الالتهابية في الأنسجة اللثوية. علاوة على ذلك، تم أيضًا زيادة التعبير عن عوامل مضادة للالتهابات وجينات تشكيل العظام. تعمل جميع هذه العوامل معًا على خلق بيئة ميكروبية مناعية ملائمة لحل التهاب اللثة وتجديد الأنسجة اللثوية.

الخلاصة

في هذه الدراسة، قمنا بتصميم هيدروجيل يستجيب لـ ROS بنجاح يمكنه تحميل عوامل مضادة للبكتيريا وجزيئات نانوية مضادة للالتهابات بكفاءة لعلاج التهاب اللثة. يتمتع هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que بخصائص فيزيائية ممتازة ويمكن استخدامه لتوصيل الأدوية محليًا في جيوب اللثة غير المنتظمة التي تتميز ببيئة ميكروية غنية بـ ROS. التجربة المعملية
الشكل 11 هيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que خفف التهاب أنسجة اللثة في نماذج الفئران لالتهاب اللثة. (أ) صور تلوين IHC التمثيلية لأنسجة اللثة، بما في ذلك IL-1 و TNF- . (ب) صور تلوين المناعية الفلورية لـ iNOS و CD206 في منطقة الحاجز السنخي. (ج) صور تلوين المناعية الفلورية لـ Nrf2 و P65 في منطقة الحاجز السنخي. (د-ي) التحليل الكمي المقابل لـ IL-1 , TNF-a، iNOS، CD206، Nrf2، و P65
تظهر النتائج أن HP-PVA@MH/Fe-Que له تأثيرات مضادة للبكتيريا قوية، وقدرة ممتازة على التخلص من ROS، ويمكنه تنظيم مسار Nrf2/NF-кB لاستقطاب البلعميات، وكبح التعبير عن عوامل الالتهاب، وتعزيز التعبير عن عوامل مضادة للالتهابات وإنزيمات مضادة للأكسدة، وفي النهاية إنقاذ hPDLSCs من التمايز العظمي تحت ظروف الإجهاد التأكسدي. في نموذج حيواني لالتهاب اللثة في الفئران، يمكن لهيدروجيل HP-PVA@MH/Fe-Que إزالة ROS بفعالية، وتخفيف الالتهاب، واستعادة التوازن في اللثة، وتعزيز إصلاح عيوب العظام السنخية. لذلك، فإن هذه الاستراتيجية للاستجابة لمستوى ROS العالي في البيئة الميكروية لتحفيز إطلاق الأدوية وتسهيل توصيل عوامل مضادة للبكتيريا جنبًا إلى جنب مع جزيئات نانوية مضادة للالتهابات تحمل وعدًا كبيرًا لعلاج التهاب اللثة وتعزيز تجديد أنسجة اللثة.

معلومات إضافية

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة على https://doi.or g/10.1186/s12951-025-03275-4.
المادة الإضافية 1

مساهمات المؤلفين

YZ: التصور، المنهجية، تنظيم البيانات، كتابة المسودة الأصلية. ZX: التحليل الرسمي، التجربة، المنهجية. XJ: التحليل الرسمي، التحقيق، التجربة، المنهجية، التصور. HZ: التحقيق، البرمجيات، التصور. XL: البرمجيات، التحقق، التصور. YF: التحقق، التصور. BL: البرمجيات، التحقق. RC و CL و GT: التصور، إدارة المشروع، كتابة المراجعة والتحرير، الحصول على التمويل. راجع جميع المؤلفين المخطوطة.

التمويل

تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج العلوم والتكنولوجيا في سيتشوان (2024NSFSC1655، 2022YFS0634)، برنامج العلوم والتكنولوجيا في لوزهو (2024JYJ035، 2023SYF101)، مشروع البحث الابتكاري للشباب الطبي في مقاطعة سيتشوان (Q23010)، مؤسسة البحث العلمي لجامعة الطب في جنوب غرب الصين (2023ZD002)، مشروع معهد طب الأسنان في جامعة الطب في جنوب غرب الصين (2021XJYJS01)، مؤسسة البحث العلمي للمستشفى التابع لطب الأسنان في جامعة الطب في جنوب غرب الصين (2024KQZX04، 2023BS01، 2023KQ03، 2023Z01).

توفر البيانات

لم يتم إنشاء أو تحليل أي مجموعات بيانات خلال الدراسة الحالية.

الإعلانات

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية في جامعة الطب في جنوب غرب الصين (رقم الوثيقة 20230705-005).
يوافق جميع المؤلفين على النشر.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

تفاصيل المؤلف

مختبر لوزهو الرئيسي لإعادة بناء الوجه والفكين وتجديده، المستشفى التابع لطب الأسنان، جامعة الطب في جنوب غرب الصين، لوزهو 646000، الصين
قسم أمراض اللثة وأمراض الغشاء المخاطي الفموي، المستشفى التابع لطب الأسنان، جامعة الطب في جنوب غرب الصين، لوزهو 646000، الصين
قسم أمراض اللثة وأمراض الغشاء المخاطي الفموي، مستشفى دويانغ لطب الأسنان، دويانغ 618000، الصين
معهد طب الأسنان، جامعة الطب في جنوب غرب الصين، لوزهو 646000، الصين
تاريخ الاستلام: 29 نوفمبر 2024 / تاريخ القبول: 24 فبراير 2025
تم النشر عبر الإنترنت: 12 مارس 2025

References

  1. Armitage GC. Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases. Periodontol 2000. 2004;34:9-21. https://doi.org/10.1046/j.0906-6713.20 02.003421.x.
  2. Williams DW, Greenwell-Wild T, Brenchley L, Dutzan N, Overmiller A, Sawaya AP, Webb S, Martin D, Genomics NN, Computational Biology C, et al. Human oral mucosa cell atlas reveals a stromal-neutrophil axis regulating tissue immunity. Cell. 2021;184:4090-e41044015. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021. 05.013.
  3. Kinane DF, Stathopoulou PG, Papapanou PN. Periodontal diseases. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17038. https://doi.org/10.1038/nrdp.2017.38.
  4. Tonetti MS, Chapple ILC. Biological approaches to the development of novel periodontal therapies- Consensus of the seventh European workshop on periodontology. J Clin Periodontol. 2011;38:114-8. https://doi.org/10.1111/j. 1 600-051X.2010.01675.x.
  5. Hathaway-Schrader JD, Novince CM. Maintaining homeostatic control of periodontal bone tissue. Periodontol. 2000. 2021;86:157-187. https://doi.org/ 10.1111/prd. 12368
  6. Feng Z, Weinberg A. Role of bacteria in health and disease of periodontal tissues. Periodontol. 2000. 2006:40:50-76. https://doi.org/10.1111/j.1600-0757 .2005.00148.x
  7. Yin Y, Yang S, Ai D, Qin H, Sun Y, Xia X, Xu X, Ji W, Song J. Rational design of bioactive hydrogels toward periodontal delivery: from pathophysiology to therapeutic applications. Adv Funct Mater. 2023;33:2301062. https://doi.org/1 0.1002/adfm.202301062.
  8. Zhao X, Yang Y, Yu J, Ding R, Pei D, Zhang Y, He G, Cheng Y, Li A. Injectable hydrogels with high drug loading through B-N coordination and ROS-triggered drug release for efficient treatment of chronic periodontitis in diabetic rats. Biomaterials. 2022;282:121387. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials. 202 2.121387.
  9. Pan S, Zhong W, Lan Y, Yu S, Yang L, Yang F, Li J, Gao X, Song J. Pathol-ogy-Guided cell Membrane-Coated polydopamine nanoparticles for efficient multisynergistic treatment of periodontitis. Adv Funct Mater. 2024;34:202312253. https://doi.org/10.1002/adfm. 202312253.
  10. Yang S, Zhu Y, Ji C, Zhu H, Lao A, Zhao R, Hu Y, Zhou Y, Zhou J, Lin K, Xu Y. A five-in-one novel MOF-modified injectable hydrogel with thermo-sensitive and adhesive properties for promoting alveolar bone repair in periodontitis: antibacterial, hemostasis, immune reprogramming, pro-osteo-/angiogenesis and recruitment. Bioact Mater. 2024;41:239-56. https://doi.org/10.1016/j.bioa ctmat.2024.07.016.
  11. Dong Z, Lin Y, Xu S, Chang L, Zhao X, Mei X, Gao X. NIR-triggered tea polyphenol-modified gold nanoparticles-loaded hydrogel treats periodontitis by inhibiting bacteria and inducing bone regeneration. Mater Design. 2023;225:111487. https://doi.org/10.1016/j.matdes.2022.111487.
  12. Wang P, Wang L, Zhan Y, Liu Y, Chen Z, Xu J, Guo J, Luo J, Wei J, Tong F, Li Z. Versatile hybrid nanoplatforms for treating periodontitis with chemical/ photothermal therapy and reactive oxygen species scavenging. Chem Eng J. 2023;463:142293. https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.142293.
  13. Wang L, Li Y, Ren M, Wang X, Li L, Liu F, Lan Y, Yang S, Song J. pH and lipase-responsive nanocarrier-mediated dual drug delivery system to treat periodontitis in diabetic rats. Bioactive Mater. 2022;18:254-66. https://doi.org /10.1016/j.bioactmat.2022.02.008.
  14. Lou J, Mooney DJ. Chemical strategies to engineer hydrogels for cell culture. Nat Reviews Chem. 2022;6:726-44. https://doi.org/10.1038/s41570-022-0042 0-7.
  15. Ye B, Xiang R, Luo F. Hydrogel-Based drug delivery systems for diabetes bone defects. Chem Eng J. 2024;497:154436. https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154 436.
  16. Huang M, Huang Y, Liu H, Tang Z, Chen Y, Huang Z, Xu S, Du J, Jia B. Hydrogels for the treatment of oral and maxillofacial diseases: current research, challenges, and future directions. Biomater Sci. 2022;10:6413-46. https://doi.org/ 10.1039/d2bm01036d.
  17. Gan Z, Xiao Z, Zhang Z, Li Y, Liu C, Chen X, Liu Y, Wu D, Liu C, Shuai X, Cao Y. Stiffness-tuned and ROS-sensitive hydrogel incorporating complement C5a receptor antagonist modulates antibacterial activity of macrophages for periodontitis treatment. Bioact Mater. 2023;25:347-59. https://doi.org/10.101 6/j.bioactmat.2023.01.011.
  18. Wu Y, Wang Y, Long L, Hu C, Kong Q, Wang Y. A Spatiotemporal release platform based on ROS stimuli-responsive hydrogel in wound repairing. J Control Release. 2022;341:147-65. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2021.11.0 27.
  19. Zhang L, Bei Z, Li T, Qian Z. An injectable conductive hydrogel with dual responsive release of Rosmarinic acid improves cardiac function and promotes repair after myocardial infarction. Bioact Mater. 2023;29:132-50. https:/ /doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.07.007.
  20. Ming P, Liu Y, Yu P, Jiang X, Yuan L, Cai S, Rao P, Cai R, Lan X, Tao G, Xiao J. A biomimetic Se-nHA/PC composite microsphere with synergistic Immunomodulatory and osteogenic ability to activate bone regeneration in periodontitis. Small. 2024;20:e2305490. https://doi.org/10.1002/smll. 2023054 90.
  21. Bai X, Peng W, Tang Y, Wang Z, Guo J, Song F, Yang H, Huang C. An NIRpropelled janus nanomotor with enhanced ROS-scavenging, Immunomodulating and biofilm-eradicating capacity for periodontitis treatment. Bioact Mater. 2024;41:271-92. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.07.014.
  22. Peng S, Fu H, Li R, Li H, Wang S, Li B, Sun J. A new direction in periodontitis treatment: biomaterial-mediated macrophage immunotherapy. J Nanobiotechnol. 2024;22:359. https://doi.org/10.1186/s12951-024-02592-4.
  23. Liu X, Wan X, Sui B, Hu Q, Liu Z, Ding T, Zhao J, Chen Y, Wang ZL, Li L. Piezoelectric hydrogel for treatment of periodontitis through bioenergetic activation. Bioact Mater. 2024;35:346-61. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat. 2024.02.011.
  24. He Z, Liu Y, Zheng ZL, Lv JC, Liu SB, Zhang J, Liu HH, Xu JZ, Li ZM, Luo E. Periodic Lamellae-Based nanofibers for precise Immunomodulation to treat inflammatory bone loss in periodontitis. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303549. https://doi.org/10.1002/adhm.202303549.
  25. Cai G, Ren L, Yu J, Jiang S, Liu G, Wu S, Cheng B, Li W, Xia J. A Microenviron-ment-Responsive, controlled release hydrogel delivering Embelin to promote bone repair of periodontitis via Anti-Infection and Osteo-Immune modulation. Adv Sci. 2024;11:e202403786. https://doi.org/10.1002/advs.202403786.
  26. Yang S, Yin Y, Sun Y, Ai D, Xia X, Xu X, Song J. AZGP1 aggravates macrophage M1 polarization and pyroptosis in periodontitis. J Dent Res. 2024;103:631-41. https://doi.org/10.1177/00220345241235616.
  27. Li J, Wang Y, Tang M, Zhang C, Fei Y, Li M, Li M, Gui S, Guo J. New insights into nanotherapeutics for periodontitis: a triple concerto of antimicrobial activity, Immunomodulation and periodontium regeneration. J Nanobiotechnol. 2024;22:19. https://doi.org/10.1186/s12951-023-02261-y.
  28. Lei M, Wan H, Song J, Lu Y, Chang R, Wang H, Zhou H, Zhang X, Liu C, Qu X. Programmable Electro-Assembly of collagen: constructing porous Janus films with customized dual signals for Immunomodulation and tissue regeneration in periodontitis treatment. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2305756. https://d oi.org/10.1002/advs.202305756.
  29. Xie Y, Xiao S, Huang L, Guo J, Bai M, Gao Y, Zhou H, Qiu L, Cheng C, Han X. Cascade and ultrafast artificial antioxidases alleviate inflammation and bone resorption in periodontitis. ACS Nano. 2023;17:15097-112. https://doi.org/10. 1021/acsnano.3c04328.
  30. Xin X, Liu J, Liu X, Xin Y, Hou Y, Xiang X, Deng Y, Yang B, Yu W. MelatoninDerived carbon Dots with free radical scavenging property for effective periodontitis treatment via the Nrf2/HO-1 pathway. ACS Nano. 2024;18:8307-24. https://doi.org/10.1021/acsnano.3c12580.
  31. Yang GG, Zhou DJ, Pan ZY, Yang J, Zhang DY, Cao Q, Ji LN, Mao ZW. Multifunctional low-temperature photothermal nanodrug with in vivo clearance, ROSScavenging and anti-inflammatory abilities. Biomaterials. 2019;216:119280. ht tps://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119280.
  32. Yang SY, Hu Y, Zhao R, Zhou YN, Zhuang Y, Zhu Y, Ge XL, Lu TW, Lin KL, Xu YJ. Quercetin-loaded mesoporous nano-delivery system remodels osteoimmune microenvironment to regenerate alveolar bone in periodontitis via the miR-21a-5p/PDCD4/NF-kappaB pathway. J Nanobiotechnol. 2024;22:94. https ://doi.org/10.1186/s12951-024-02352-4.
  33. Wang Y, Li C, Wan Y, Qi M, Chen Q, Sun Y, Sun X, Fang J, Fu L, Xu L, et al. Quercetin-Loaded ceria nanocomposite potentiate Dual-Directional
    immunoregulation via macrophage polarization against periodontal inflammation. Small. 2021;17:e2101505. https://doi.org/10.1002/smll. 202101505.
  34. Zhu H, Cai C, Yu Y, Zhou Y, Yang S, Hu Y, Zhu Y, Zhou J, Zhao J, Ma H, et al. Quercetin-Loaded bioglass injectable hydrogel promotes m6A alteration of Per1 to alleviate oxidative stress for periodontal bone defects. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2403412. https://doi.org/10.1002/advs. 202403412.
  35. Li Y, Li J, Chang Y, Zhang J, Wang Z, Wang F, Lin Y, Sui L. Mitochondria-targeted drug delivery system based on tetrahedral framework nucleic acids for bone regeneration under oxidative stress. Chem Eng J. 2024;496:153723. https://do i.org/10.1016/j.cej.2024.153723.
  36. Gui S, Tang W, Huang Z, Wang X, Gui S, Gao X, Xiao D, Tao L, Jiang Z, Wang X. Ultrasmall coordination polymer nanodots Fe-Quer nanozymes for preventing and delaying the development and progression of diabetic retinopathy. Adv Funct Mater. 2023;33:2300261. https://doi.org/10.1002/adfm.202300261.
  37. Han Z, Gao X, Wang Y, Cheng S, Zhong X, Xu Y, Zhou X, Zhang Z, Liu Z, Cheng L. Ultrasmall iron-quercetin metal natural product nanocomplex with antioxidant and macrophage regulation in rheumatoid arthritis. Acta Pharm Sin B. 2023;13:1726-39. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.11.020.
  38. Xu Y, Luo Y, Weng Z, Xu H, Zhang W, Li Q, Liu H, Liu L, Wang Y, Liu X, et al. Microenvironment-Responsive Metal-Phenolic nanozyme release platform with antibacterial, ROS scavenging, and osteogenesis for periodontitis. ACS Nano. 2023;17:18732-46. https://doi.org/10.1021/acsnano.3c01940.
  39. Zhu S, Zhao B, Li M, Wang H, Zhu J, Li Q, Gao H, Feng Q, Cao X. Microenvironment responsive nanocomposite hydrogel with NIR photothermal therapy, vascularization and anti-inflammation for diabetic infected wound healing. Bioact Mater. 2023;26:306-20. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.00 5.
  40. Tian Y, Li Y, Liu J, Lin Y, Jiao J, Chen B, Wang W, Wu S, Li C. Photothermal therapy with regulated Nrf2/NF-kappaB signaling pathway for treating bacteria-induced periodontitis. Bioact Mater. 2022;9:428-45. https://doi.org/1 0.1016/j.bioactmat.2021.07.033.
  41. Boda SK, Fischer NG, Ye Z, Aparicio C. Dual oral tissue adhesive nanofiber membranes for pH -Responsive delivery of antimicrobial peptides. Biomacromolecules. 2020;21:4945-61. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01163.
  42. Qiao B, Wang J, Qiao L, Maleki A, Liang Y, Guo B. ROS-responsive hydrogels with Spatiotemporally sequential delivery of antibacterial and anti-inflammatory drugs for the repair of MRSA-infected wounds. Regenerative Biomaterials. 2023;11:rbad110. https://doi.org/10.1093/rb/rbad110.
  43. Luo Q, Yang Y, Ho C, Li Z, Chiu W, Li A, Dai Y, Li W, Zhang X. Dynamic hydrogel-metal-organic framework system promotes bone regeneration in periodontitis through controlled drug delivery. J Nanobiotechnol. 2024;22:287. https://d oi.org/10.1186/s12951-024-02555-9.
  44. Wu Y, Wang Y, Long L, Hu C, Kong Q, Wang Y. A Spatiotemporal release platform based on pH/ROS stimuli-responsive hydrogel in wound repairing. J Controlled Release. 2022;341:147-65. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2021.1 1.027.
  45. Qiao B, Wang J, Qiao L, Maleki A, Liang Y, Guo B. ROS-responsive hydrogels with Spatiotemporally sequential delivery of antibacterial and anti-inflammatory drugs for the repair of MRSA-infected wounds. Regenerative Biomaterials. 2024;11. https://doi.org/10.1093/rb/rbad110.
  46. Dong Z, Sun Y, Chen Y, Liu Y, Tang C, Qu X. Injectable adhesive hydrogel through a microcapsule Cross-Link for periodontitis treatment. ACS Appl Bio Mater. 2019;2:5985-94. https://doi.org/10.1021/acsabm.9b00912.
  47. Guo H, Huang S, Yang X, Wu J, Kirk TB, Xu J, Xu A, Xue W. Injectable and Self-Healing hydrogels with Double-Dynamic bond tunable mechanical, Gel-Sol transition and drug delivery properties for promoting periodontium regeneration in periodontitis. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13:61638-52. h ttps://doi.org/10.1021/acsami.1c18701.
  48. Zhang C, Yan R, Bai M, Sun Y, Han X, Cheng C, Ye L. Pt-Clusters-Equipped Antioxidase-Like biocatalysts as efficient ROS scavengers for treating periodontitis. Small. 2024;20:e2306966. https://doi.org/10.1002/smll. 202306966.
  49. Wang Y, Yuan Y, Wang R, Wang T, Guo F, Bian Y, Wang T, Ma Q, Yuan H, Du Y, et al. Injectable thermosensitive gel CH-BPNs-NBP for effective periodontitis treatment through ROS-Scavenging and jaw vascular unit protection. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2400533. https://doi.org/10.1002/adhm.202400533.
  50. Liu Y, Yan J, Chen L, Liao Y, Huang L, Tan J. Multifunctionalized and DualCrosslinked hydrogel promotes inflammation resolution and bone regeneration via NLRP3 Inhibition in periodontitis. Small Struct. 2024;5. https://doi.org /10.1002/sstr.202300281.
  51. Gong J, Wang S, Liu J, Zhang Y, Li J, Yang H, Liang K, Deng Y. In situ oxygengenerating bio-heterojunctions for enhanced anti-bacterial treatment of
    anaerobe-induced periodontitis. Chem Eng J. 2024;498. https://doi.org/10.10 16/j.cej.2024.155083.
  52. Xia P, Yu M, Yu M, Chen D, Yin J. Bacteria-responsive, Cell-recruitable, and osteoinductive nanocomposite microcarriers for intelligent bacteriostasis and accelerated tissue regeneration. Chem Eng J. 2023;465:142972. https://d oi.org/10.1016/j.cej.2023.142972.
  53. Thananukul K, Kaewsaneha C, Opaprakasit P, Lebaz N, Errachid A, Elaissari A. Smart gating porous particles as new carriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2021;174:425-46. https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.04.023.
  54. Zhu B, Wu J, Li T, Liu S, Guo J, Yu Y, Qiu X, Zhao Y, Peng H, Zhang J, et al. A glutathione Peroxidase-Mimicking nanozyme precisely alleviates reactive oxygen species and promotes periodontal bone regeneration. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2302485. https://doi.org/10.1002/adhm. 202302485.
  55. Guo J, Xing Z, Liu L, Sun Y, Zhou H, Bai M, Liu X, Adeli M, Cheng C, Han X. Antioxidase-Like nanobiocatalysts with ultrafast and reversible RedoxCenters to secure stem cells and periodontal tissues. Adv Funct Mater. 2023;33:202211778. https://doi.org/10.1002/adfm. 202211778.
  56. Xu Z, Zhu Y, Xie M, Liu K, Cai L, Wang H, Li D, Chen H, Gao L. Mackinawite nanozymes as reactive oxygen species scavengers for acute kidney injury alleviation. J Nanobiotechnol. 2023;21:281. https://doi.org/10.1186/s12951-02 3-02034-7.
  57. Zhang Y, Zhang H, Zhao F, Jiang Z, Cui Y, Ou M, Mei L, Wang Q. Mitochondrialtargeted and ROS-responsive nanocarrier via nose-to-brain pathway for ischemic stroke treatment. Acta Pharm Sin B. 2023;13:5107-20. https://doi.or g/10.1016/j.apsb.2023.06.011.
  58. Hu S, Wang L, Li J, Li D, Zeng H, Chen T, Li L, Xiang X. Catechol-Modified and -Nanozyme-Reinforced hydrogel with improved antioxidant and antibacterial capacity for periodontitis treatment. ACS Biomater Sci Eng. 2023;9:5332-46. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.3c00454.
  59. Tian M, Chen G, Xu J, Lin Y, Yi Z, Chen X, Li X, Chen S. Epigallocatechin gallatebased nanoparticles with reactive oxygen species scavenging property for effective chronic periodontitis treatment. Chem Eng J. 2022;433:132197. http s://doi.org/10.1016/j.cej.2021.132197.
  60. Liu X, Hou Y, Yang M, Xin X, Deng Y, Fu R, Xiang X, Cao N, Liu X, Yu W, et al. N-Acetyl-I-cysteine-Derived carbonized polymer Dots with ROS scavenging
    via Keap1-Nrf2 pathway regulate alveolar bone homeostasis in periodontitis. Adv Healthc Mater. 2023;12:e2300890. https://doi.org/10.1002/adhm. 202300 890.
  61. Yang G, Fan M, Zhu J, Ling C, Wu L, Zhang X, Zhang M, Li J, Yao Q, Gu Z, Cai . A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages, massively deplete intracellular , and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osteoarthritis. Biomaterials. 2020;255:120155. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
  62. Liu S, Wang W, Wu P, Chen Z, Pu W, Li L, Li G, Zhang J, Song J. PathogenesisGuided engineering of Multi-Bioactive hydrogel Co-Delivering InflammationResolving nanotherapy and Pro-Osteogenic protein for bone regeneration. Adv Funct Mater. 2023;33:2301523. https://doi.org/10.1002/adfm.202301523.
  63. Sun H, Xu J, Wang Y, Shen S, Xu X, Zhang L, Jiang Q. Bone microenvironment regulative hydrogels with ROS scavenging and prolonged oxygen-generating for enhancing bone repair. Bioact Mater. 2023;24:477-96. https://doi.org/ 10.1016/j.bioactmat.2022.12.021.
  64. Wang H, Zhang Y, Zhang Y, Li C, Zhang M, Wang J, Zhang Y, Du Y, Cui W, Chen W. Activating macrophage continual efferocytosis via microenvironment biomimetic short fibers for reversing inflammation in bone repair. Adv Mater. 2024;36:e2402968. https://doi.org/10.1002/adma.202402968.
  65. Bai L, Feng M, Li Q, Zhao Y, Zhang G, Cai Z, Xiao J, Lin Y. Curcumin delivery using tetrahedral framework nucleic acids enhances bone regeneration in osteoporotic rats. Chem Eng J. 2023;472:144978. https://doi.org/10.1016/j.cej. 2023.144978.
  66. Dos Santos DM, Moon JI, Kim DS, Bassous NJ, Marangon CA, CampanaFilho SP, Correa DS, Kang MH, Kim WJ, Shin SR. Hierarchical Chitin Nano-crystal-Based 3D printed dual-Layer membranes hydrogels: A dual drug delivery Nano-Platform for periodontal tissue regeneration. ACS Nano. 2024;18:24182-203. https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05558.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
  1. *المراسلة:
    روي كاي
    cairui@swmu.edu.cn
    تشونهوي لي
    Ich10221022@163.com
    غانغ تاو
    taogang@swmu.edu.cn
    القائمة الكاملة لمعلومات المؤلف متاحة في نهاية المقال

Journal: Journal of Nanobiotechnology, Volume: 23, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12951-025-03275-4
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40075491
Publication Date: 2025-03-12

Injectable hydrogels with ROS-triggered drug release enable the co-delivery of antibacterial agent and anti-inflammatory nanoparticle for periodontitis treatment

Yujing Zhu , Ziliang Xiu , Xiaoxi Jiang , Huifang Zhang , Xiaofeng , Yunru Feng , Bojiang Li , Rui Cai , Chunhui and Gang Tao

Abstract

Periodontitis, a chronic inflammatory disease caused by bacteria, is characterized by localized reactive oxygen species (ROS) accumulation, leading to an inflammatory response, which in turn leads to the destruction of periodontal supporting tissues. Therefore, antibacterial, scavenging ROS, reducing the inflammatory response, regulating periodontal microenvironment, and alleviating alveolar bone resorption are effective methods to treat periodontitis. In this study, we developed a ROS-responsive injectable hydrogel by modifying hyaluronic acid with 3-amino phenylboronic acid (PBA) and reacting it with poly(vinyl alcohol) (PVA) to form a borate bond. In addition, the ROS-responsive hydrogel encapsulated the antibacterial agent minocycline hydrochloride (MH) and Fe-Quercetin anti-inflammatory nanoparticles (Fe-Que NPs) for on-demand drug release in response to the periodontitis microenvironment. This hydrogel (HP-PVA@MH/Fe-Que) exhibited highly effective antibacterial properties. Moreover, by modulating the Nrf2/NF-kB pathway, it effectively eliminated ROS and promoted macrophage polarization to the M 2 phenotype, reducing inflammation and enhancing the osteogenic differentiation potential of human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) in the periodontal microenvironment. Animal studies showed that HP-PVA@MH/Fe-Que significantly reduced alveolar bone loss and enhanced osteogenic factor expression by killing bacteria and inhibiting inflammation. Thus, HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel had efficient antibacterial, ROS-scavenging, anti-inflammatory, and alveolar bone resorption-alleviation abilities, showing excellent application potential for periodontitis healing.

Introduction

Periodontitis, one of the most common dental diseases, is a chronic inflammatory disease caused by bacteria that leads to gum detachment, periodontal pocket formation, and alveolar bone resorption [1]. If periodontitis is not treated promptly and effectively, it will gradually destroy the supporting tissues of the teeth and eventually lead to tooth loss [2]. Currently, the primary therapy for periodontitis involves the mechanical removal of bacteria and dental calculus through scaling and root planing (SRP) [3]. However, due to the complex anatomical structure of teeth, mechanical debridement cannot wholly remove subgingival pathogenic bacteria and their metabolites [4]. Additionally, local infections and inflammation are challenging to eliminate, leading to limited regenerative capacity of periodontal bone tissue and difficulty reconstructing periodontal tissue structure [5]. Therefore, developing a strategy for rapid antibacterial action, effective inflammation relief, and promoting bone and tissue regeneration is central to periodontitis therapy.
Periodontal pathogens can produce a variety of enzymes, toxins, and toxic metabolites, which
subsequently damage tissues and trigger inflammatory reactions, leading to periodontal tissue destruction, such as bone loss and attachment loss [6,7]. Therefore, rapid elimination of periodontal pathogenic bacteria is a prerequisite for treating periodontitis. Various drugs are available to remove periodontal pathogenic bacteria, such as antibiotics, antimicrobial peptides, and metal-based nanoparticles [8-11]. In clinical practice, minocycline hydrochloride (MH) is a commonly used topical agent for periodontal pockets. MH not only has high antibacterial activity against periodontal pathogens but also has colla-genase-inhibiting properties. Many studies have shown that low doses of MH can significantly reduce inflammation at the periodontal site, thereby improving the success of periodontitis treatment [12, 13]. Therefore, MH is an ideal drug for the antibiotic treatment of periodontitis. However, the use of MH alone has many limitations, such as rapid drug loss, which cannot achieve a slow release and rapid antibacterial effect. Therefore, loading the MH into a carrier such as nanoparticles, microspheres, or hydrogels is necessary.
Hydrogel is a soft and flexible three-dimensional network, similar to the porous structure of extracellular matrix (ECM), thus facilitating regenerative tissue repair [14]. Injectable hydrogels made from biocompatible and biodegradable matrices can be injected into irregularly shaped periodontal pockets for sustained and stable drug release after encapsulating bioactive molecules and drugs [15]. In recent years, “smart hydrogels” have been developed to enable targeted and effective therapies by introducing stimulus-sensitive groups that respond to disease-specific microenvironments (e.g., hypoxia, low pH , and high levels of ROS) [16]. Therefore, for the high ROS microenvironment of periodontitis, the ROSresponsive hydrogel can achieve accurate on-demand drug release at the site of periodontitis lesions, reducing the frequency of dosing and side effects [17]. Phenylboronic acids, a member of the Lewis acid group, can form reversible and dynamic boronic ester bonds with compounds containing 1,3-diol groups [18, 19]. Boron ester bonds are susceptible to ROS, and in the high ROS environment of periodontitis, hydrogels based on boron ester bonds degrade, leading to accelerated drug release [17]. Therefore, we would like to load the antimicrobial drug MH into a hydrogel based on borate bonding to achieve responsive release of MH in the high ROS environment of periodontitis.
The balance between bacteria and host is disrupted at the site of periodontitis lesions. Excess ROS are produced, which activates multiple pro-inflammatory signaling pathways, leading to an increase in the ratio of M1 to M2 macrophages and the production of a large number of pro-inflammatory cytokines, such as interleu-kin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-alpha (TNF- ), and interleukin-1 (IL-1 ) [20-22]. M1 macrophages secrete pro-inflammatory cytokines to promote bone resorption and have the potential to differentiate into mature osteoclasts [23-26]. Conversely, M2 macrophages promote the differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into mature osteoblasts and enhance bone mineralization [27, 28]. In addition, a high ROS environment induces cellular senescence, which in turn leads to MSC death, ultimately affecting the regenerative potential of the tissue [29, 30]. Therefore, regulating ROS levels in the periodontal microenvironment, protecting hPDLSCs from oxidative stress damage, rescuing their osteogenic capacity, and promoting M2 macrophage polarization is essential for treating periodontitis. Quercetin (Que) is a polyphenolic flavonoid compound found in onions, grapes, berries, cherries, broccoli, and citrus fruits [31]. Attributed to its inherent reducing structure, such as catechol groups, Que has outstanding anti-inflammatory and antioxidant activities, which can effectively eliminate ROS and inhibit the polarization of macrophages to the M1 phenotype while promoting their polarization to the
M2 phenotype, thus reducing oxidative damage and facilitating tissue regeneration [32-34]. However, Que has poor water solubility, low bioavailability, and poor stability, which limits its use in the treatment of periodontitis [35]. It was found that Que coordination with metal ions to synthesize nanoparticles (NPs) improves their solubility and stability [36, 37]. Additionally, Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) and NF- (Nuclear factor kappa B) play a crucial role in regulating oxidative stress and inflammatory responses, which are essential for maintaining cellular redox balance and responding to inflammation [38-40]. Therefore, we hope to incorporate Que-metal nanoparticles as anti-inflammatory agents into ROS-sensitive hydrogels to explore their potential for treating periodontitis via the Nrf2/NF-кB signaling pathway.
In this study, as shown in Scheme 1, the ultra-small Fe-Que NPs were first formed by the coordination of quercetin with low-toxicity iron ions. In addition, hyaluronic acid (HA) was grafted with 3-aminophenyl borate (HA-PBA, HP), which was further reacted with the 1,3diol group of poly (vinyl alcohol) (PVA) to form a borate bond, resulting in the construction of hydrogels with ROS-responsive properties. MH and Fe-Que were introduced to prepare the HP-PVA hydrogel system (HP-PVA@MH/Fe-Que). In the high ROS environment of periodontitis, the borate bond was broken, accelerating the release of MH and Fe-Que. The small molecule MH rapidly kills bacteria, and then the Fe-Que NPs scavenge ROS, reduce the inflammatory response of periodontal tissue, and alleviate alveolar bone resorption. The physical properties, drug release characteristics, antibacterial activity, and biocompatibility of the HP-PVA@MH/ Fe-Que compound were evaluated in detail. This study demonstrated that the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel initially rapidly inhibited bacterial growth through MH. Subsequently, Fe-Que scavenged ROS via the Nrf2/ NF-кB pathway, regulated macrophage polarization to reduce pro-inflammatory factors and up-regulate antiinflammatory factors, while also protecting hPDLSCs from ROS-induced damage and promoting osteogenic differentiation under oxidative stress. The ability of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel to scavenge ROS and alleviate inflammation and alveolar bone resorption was also confirmed in a chronic periodontitis SD model. Therefore, with remarkable in vitro and in vivo therapeutic efficacy, HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel may have great potential for treating periodontitis.

Materials and methods

Materials

Ferric (III) trichloride hexahydrate , Polyvinylpyrrolidone (PVP, molecular weight: 10000 Da ), and 3-amino phenylboronic acid (PBA) were purchased
Scheme 1 Schematic diagram of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel synthesis and treatment of periodontitis. (A) Synthetic process of Fe-Que NPs. (B) Preparation of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel. (C) ROS-triggered on-demand release of therapeutic agents in HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel. (D) HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel has multifunctional properties, including antibacterial, regulating Nrf2/NF-rB pathway to inhibit inflammatory and bone absorption relief for treating periodontitis
from Aladdin (Shanghai, China). Quercetin (Que) was obtained from Must Bio-Technology Co., Ltd (Chengdu, China). Hyaluronic acid (HA, molecular weight: 100000200000 Da ) and Polyvinyl alcohol (PVA, molecular weight: 31000-50000 Da) were purchased from Macklin (Shanghai, China). 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) were obtained from Heowns (Tianjin, China). Minocycline hydrochloride (MH) was purchased from MeilunBio (Liaoning, China). -modified Eagle’s Medium ( -MEM), high-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (High glucose DMEM), RPMI 1640 Medium, Trypsin-EDTA, and Fetal Bovine Serum (FBS) were purchased from Gibco (CA, USA). Live/Dead Viability Kit and Live/Dead bacterial staining kits were obtained from Thermo Fisher Scientific (MA, USA). Cell Counting Kit-8, penicillin-streptomycin, and paraformaldehyde were purchased from Beyotime (Beijing, China). 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazide (DPPH), 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) were obtained from Solarbio (Beijing, China).

Synthesis and characterization of Fe-Que NPs

Fe-Que NPs were the coordination of iron ions with quercetin. Firstly, 20 mg of was dissolved in 1 mL of methanol, and 66 mg of PVP was dissolved in 5 mL of methanol, respectively. The two solutions were mixed and stirred for 5 min . Then, 10 mg of Que was added to 1 mL of methanol and mixed for 5 min . Finally, the Que solution was added to the above-mixed solution and stirred at room temperature for 3 h . The solution was placed in dialysis strips and dialyzed overnight with ultrapure water to remove excess iron ions, resulting in Fe-Que NPs. They were lyophilized in a freeze-dryer (Sientz-12 N, Ningbo, China) and stored at for subsequent use.
The morphology and size of Fe-Que NPs were examined using transmission electron microscopy (TEM, JEM-2100, Tokyo, Japan). Dynamic light scattering (DLS) measurements of particle size distributions (Malvern, Nano ZS, UK). The UV-visible spectrophotometer (TU-1810, Shanghai, China) was used to determine the UV-visible near-infrared (UV-vis-NIR) spectra of , Que, and Fe-Que NPs, respectively. The Fourier transform infrared (FTIR) spectra of Que and Fe-Que NPs were obtained using an FTIR spectrometer (WQF-530, Beijing, China) to evaluate the surface functional groups. The chemical states were determined by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS, Shimadzu Kratos AXIS Ultra DLD, Nagoya, Japan).

Synthesis and characterization of HA modified by PBA (HAPBA, named HP)

Liquor A was obtained by mixing 5.8 mL of acetic acid in 1 L of ultrapure water, and liquor B was 8.2 g of sodium acetate dissolved in 1 L of ultrapure water separately. Take 29.6 mL of liquor of liquor B , and 100.0 mL of ultrapure water, and mix them well to get the acetic acid buffer solution with was dissolved in 100 mL of buffer solution ( ) under constant stirring, followed by adding 0.891 g of NHS, 1.495 g of EDC, and 0.684 g of PBA. All reaction mixtures were stirred at room temperature for 4 h . After the reaction was completed, the product was dialyzed in ultrapure water for 48 h , with the water being replaced twice daily to remove salts and unreacted substances from the solution. Finally, the product was freeze-dried to obtain the white flocculent HP.
The UV-vis-NIR spectrum of HA, PBA, and HP was measured using the UV-visible spectrophotometer (TU1810, Shanghai, China). The FTIR spectra of HA, PBA, and HP were measured using the FTIR spectrometer (WQF-530, Beijing, China). The chemical structures of HA and HP were analyzed by proton nuclear magnetic resonance ( NMR), carried out on a 400 MHz Bruker Avance III (MA, USA). Furthermore, the degree of substitution was determined by the ratio of the integral of aromatic protons from the conjugated phenylboronic acid group (between ) to the integral of the HA methyl proton peak (at ).

Preparation and characterization of the hydrogels

Hydrogels were formed through boron ester dynamic bonding. Briefly, HP ( ) and PVA ( ) were prepared in ultrapure water to form a homogeneous mixture, respectively. Then, it is mixed in a volume ratio of 3:1 at room temperature to form HP-PVA hydrogels. The MH was dispersed in the PVA solution to prepare the hydrogel named HP-PVA@MH. The Fe-Que NPs were homogeneously dispersed in the HP solution to prepare the hydrogel named HP-PVA@Fe-Que. Then, HP-PVA@ MH/Fe-Que hydrogels were prepared by simultaneously loading Fe-Que NPs and MH solution. The final concentration of Fe-Que NPs in the hydrogels was mL , and the final concentration of MH was . The hydrogels were observed macroscopically using the “inverted bottle method” to testify to the hydrogel formation. The hydrogels were lyophilized in the freeze-dryer for subsequent experiments.
The samples were fixed on a metal base and sprayed with gold under vacuum. Then, the microstructures of the samples were visually observed by field-emission scanning electron microscopy (SEM, Sigma 300, ZEISS, Germany), and the samples’ surface elements
composition and distribution were detected by energy dispersive spectrometer (EDS) images.

The injectability, shape-adaptive, adhesive, and selfhealing properties of the hydrogels

To analyze the injectability and observe the morphology of the hydrogel, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was injected with a syringe needle, and “SWMU” was written on a piece of paper for macroscopic observation. To further validate the injectability of the hydrogel, the injection force was analyzed using a mechanical testing machine (Instron Model 5965). The rheological analyses of the hydrogel, including storage modulus ( ), loss modulus ( G “), and viscosity under different conditions (frequency sweep, strain sweep, and shear rate), were conducted using a rheometer (Discovery HR-2, TA Instrument, USA). The sample was tested by placing it between parallel plates ( 20 mm diameter, 1 mm gap) at . and changes were evaluated at a fixed frequency ( ) to assess the effects of different strains. Additionally, the frequency dependence of and was analyzed at a fixed strain ( ) across a range of angular frequencies . The viscosity of the hydrogel was measured across a shear rate range from 0.1 to to evaluate its shear-thinning behavior.
Next, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was injected into the mold. The state of its adaptation to the mold was observed every 30 s , and the shape of the original hydrogel ( 0 min ) and the hydrogel adapted to the environment ( 2 min ) was recorded. The adhesive properties of the hydrogels were assessed by observing whether they adhered to the heart, liver, spleen, lungs, and kidneys of SD rats and human orthodontic teeth after being moistened in PBS for 1 min . Moreover, the adhesion of hydrogels to fresh porcine gingiva and human premolar enamel was quantitatively assessed [41]. The porcine gingiva (length: 70 mm , width: 10 mm ) was isolated and washed with PBS. Two pieces of porcine gingiva were then bonded together with hydrogel over an area of 10 mm , and the gingivae were left at room temperature for 15 min . The bonded samples were subsequently fixed on a materials testing system (INSTRON, USA) with a rate of for the lap shear test to evaluate the ultimate adhesive strength. In addition, human premolars were embedded in plaster in the same way as described above. The formula for calculating the adhesion stress is as follows:
Where and S are the maximum value of the force on the stress curve and the adhesion area of the two porcine gingivae or human premolar teeth enamel, respectively. Then, the self-healing property was evaluated using the
HP-PVA hydrogel, which was divided into two sections and dyed red and green with food dye solutions. The sections were then pressed together to ensure complete adhesion in the cross-section. After 1 min , the hydrogel was observed and photographed to determine if it fractured when stretched on both sides.

ROS-responsive properties of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels

2 mL of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was loaded into a sample bottle. Then, 1 mL of different concentrations of hydrogen peroxide ( , and ) was added. The changes in the hydrogel were photographed and recorded after 3 h . The liquid in the bottle was discarded, and the hydrogels were freeze-dried under vacuum conditions. The hydrogel microstructural changes were observed by SEM (Sigma 300, ZEISS, Germany).

Degradation behavior of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels in vitro

1 mL of freshly prepared HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was injected into a glass vial containing PBS solutions with different concentrations ( 0,100 , and . At various time intervals, the samples were photographed.

In vitro drug release in response to ROS levels from the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels

The release of MH from HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel under different concentrations of solutions was determined in vitro. 2 mL of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was put into the sample bottle, with 5 mL of solutions , and the release medium was collected at different time points. The absorbance at 364 nm was measured by a UV-visible spectrophotometer (TU-1810, Shanghai, China) to evaluate the release rate of MH .

In vitro antibacterial activity assays of the hydrogels

Hydrogels were evaluated for their antibacterial activity against Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli), and Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). The HP-PVA, HP-PVA@Fe-Que, HP-PVA@MH, and HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels were placed on 24-well plates. Next, 1 mL bacterial suspension ( ) was added to the surface of the hydrogels and co-cultured at for 2 h . The PBS treatment was the control group. Then, the bacterial suspensions were collected, and . aureus and . coli were coated on LB solid medium, with . gingivalis coated on a blood plate, cultured at for 24 h to form visual colony units. Photos of LB or blood plates were taken, and the number of colonies was counted.
Moreover, the suspensions were stained using bacterial live/dead staining kits (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). The working solution was prepared by adding SYTO and propyl iodide (PI, ) to 1 mL of PBS. The bacterial precipitate was obtained by centrifuging the above bacterial suspension at for 10 min . Subsequently, it was incubated with the working solution at room temperature in the dark for 15 min before being observed under the fluorescence microscope (DMI8, Leica, Germany).
To further evaluate the antibacterial activity of the hydrogels, a zone of inhibition (ZOI) assay was conducted. In addition to S. aureus, E. coli, P. gingivalis, and the key pathogen Streptococcus mutans (S. mutans), which is associated with oral biofilm formation, was tested to assess the effectiveness of the hydrogels against oral-specific bacteria. The sterilized hydrogels were immersed in PBS at for 24 h to obtain hydrogel extracts [8]. A aliquot of bacterial stock in the logarithmic growth phase (S. aureus, E. coli, P. gingivalis, and S. mutans) was evenly spread onto agar plates. Sterile filter paper discs ( 6 mm diameter) were prepared using a round leather punch and soaked in the respective hydrogel extracts. Control discs soaked in PBS and those soaked in hydrogel extracts were placed onto the inoculated agar plates using sterile tweezers. The plates were incubated at for 24 h under aerobic conditions ( . aureus, E. coli, and S. mutans) or anaerobic conditions (P. gingivalis). After incubation, the diameter of the inhibition zones was measured using a ruler, and images of the agar plates were captured. All experiments were performed in triplicate, and the antibacterial activity was determined based on the average diameter (mm) of the inhibition zones formed around the paper discs.

The biocompatibility test of the hydrogels

Cell culture

HPDLSCs, human gingival fibroblasts (HGFs), RAW264.7, L929, and human immortalized epidermal cells (HaCaTs) were used as model cells to assess the cytotoxicity of hydrogels. L929 cells were cultured in RPMI 1640, while RAW264.7, HGFs, and HaCaTs were cultured in high-glucose DMEM medium, with FBS and penicillin-streptomycin. All cultures were incubated at in a humidified atmosphere of and relative humidity. The cell medium was replaced every 3 days and treated with Trypsin-EDTA when the cells reached confluency.
The hPDLSCs were derived from healthy premolars of orthodontic patients aged 12-18. All the young permanent teeth used in this study were taken from The Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University, with informed consent of patients and guardians, and approved by the Ethics Committee
(20220819002). The dental tissue was soaked and repeatedly rinsed with PBS containing different concentrations of penicillin-streptomycin. Then, the middle-third of the periodontal tissue in the root was scraped with a sterile blade, centrifuged, transferred to an inverted culture bottle, cultured in a cell incubator containing at , and turned over after 4 h . The complete medium required for cell culture was -MEM containing 10% FBS and penicillin-streptomycin. After the cells climbed out of the tissue, the medium was changed every 3 days and passaged when the cell reached confluency. Flow cytometry (FACSCalibur, CA, USA) was utilized to evaluate the differentiation potential of hPDLSCs using antibodies against CD34, CD45, CD90, and CD105 (BioLegend, CA, USA). All the subsequent experiments used the 3rd to 5th generation cells in the logarithmic growth phase.

The cytocompatibility of the hydrogels

The cell viability was evaluated by CCK-8 assay and live/ dead staining of hPDLSCs, HGFs, RAW264.7, L929, and HaCaTs to assess the cytotoxicity of the hydrogel. Firstly, the hydrogels (HP-PVA, HP-PVA@MH, HP-PVA@ Fe-Que, HP-PVA@MH/Fe-Que) were irradiated under ultraviolet light overnight, soaked in alcohol for 0.5 h , and washed three times with PBS. Next, of hydrogel was immersed in different complete media (RPMI 1640, high-glucose DMEM, -MEM) for 24 h , and the leachates were filtered through sterile filters to obtain the extracts.
HPDLSCs, HGFs, RAW264.7, L929, and HaCaTs, were seeded at a density of cells/well on 96-well plates. After 1 day, the complete medium was replaced with the hydrogel leachates, and the incubation was continued for the 1st, 3rd, and 5th days, respectively, for assay using the CCK-8 assay kit (Beyotime, China). After washing with PBS, the CCK-8 working solution was added to the medium, and the cells were co-cultured at for 1.5 h in the dark. Then, the absorbance value (OD value) at 450 nm was detected using a microplate reader (TECAN Infinite M200PRO, China).
In addition, the cells were seeded at a density of cells/well on 24 -well plates. After 1 day, the complete medium was replaced with the hydrogel extracts and co-cultured for the 1st, 3rd, and 5th days. Then, the cells were incubated for 0.5 h with the configured cell live/ dead stain in the dark and observed under a fluorescence microscope (Leica, DMi8, Germany). Moreover, hPDLSCs were co-cultured with the hydrogel for 24 h (the Control group was not co-cultured with the hydrogel). Subsequently, compatibility and morphology were determined using live/dead cell staining, CCK-8 assay, and FITC staining.

The hemocompatibility test of the hydrogels

The blood compatibility of hydrogel was evaluated with rabbit red blood cells. First, rabbit blood was put into a centrifuge tube containing sodium citrate solution, centrifuged at 1000 rpm for 10 min to obtain red blood cells, then washed with PBS 3 times and diluted to a final concentration of . Hydrogels and red blood cell suspension were combined in a 1.5 mL centrifuge tube and incubated at for 1 h . Following this, the mixture was centrifuged at 1000 rpm for 10 min . Next, the supernatant was transferred to a 96-well plate with 100 per well. The absorbance value (OD value) at 545 nm was detected by a microplate reader (TECAN Infinite M200PRO, China), and the optical images were taken under a fluorescence microscope (Leica, DMi8, Germany). The positive control group was Triton X-100, while the negative control group consisted of PBS.

Free radical scavenging ability and antioxidant capacity of the hydrogels

DPPH and ABTS radical scavenging assay

The radical scavenging performance of the hydrogels was analyzed using DPPH and ABTS kits. The DPPH and ABTS working solutions were prepared, mixed with the hydrogel extract, and incubated for 0.5 h in the dark. Vitamin C (VC) served as the positive control group, while the extract provided with the kit was the blank group.
Then, the DPPH free radical scavenging rates of different hydrogels were assessed using the UV-visible spectrophotometer (TU-1810, Shanghai, China) to record the OD values at 515 nm and the UV-vis-NIR spectra in the range of . Next, the OD values at 405 nm of each sample were recorded, and the UV-vis-NIR spectra in the range of were determined to evaluate the ABTS free radical scavenging rates.
Where is the absorbance of 1 mL of working solution plus of water, is the absorbance of 1 mL of working solution added to of a VC solution ( is the absorbance of 1 mL of working solution added to of the supernatant of the sample, and is the absorbance of 1 mL of ethanol added to 50 of the supernatant of the sample.

Cytoprotective effects against oxidative stress

DCFH-DA evaluated the ability of different groups of hydrogels to eliminate intracellular ROS, and the effect
of rescuing cells from oxidative stress and restoring their vitality was assessed by cell live/dead staining and the CCK-8 assay. In short, L929 and RAW264.7 cells were plated at a density of cells/well in 24 -well plates and incubated for 1 day. Then, the culture medium was swapped with the hydrogel extracts. After continuing the culture for was added for 2 h . DCFHDA working solution (1:1000) or cell live/dead dye solution was added, incubated for 0.5 h in the dark, and observed under a fluorescence microscope. ImageJ quantified the fluorescence intensity of DCFH-DA staining. Then, ROS fluorescence in FITC channels was measured by flow cytometry (ACEA NovoCyteTM 2070R, USA). Furthermore, RAW264.7 cells were plated in 96-well plates, subjected to the previously described treatment, and replaced with the prepared CCK-8 working solution. After incubation for 1.5 h , the OD value at 450 nm was detected by a microplate reader (TECAN Infinite M200PRO, China).
Moreover, the capacity of various hydrogels to eliminate ROS was assessed by measuring fluorescence intensity using a Multimodal Small Animal Live Imaging System (ABL X6, Tanon). RAW264.7 cells were seeded at a density of cells/well on 12-well plates and treated the cells as we did before. Then, fluorescence imaging was also performed using the Multimodal Small Animal Live Imaging System (excitation filter, ; emission filter, ).

Macrophage polarization assessment of the hydrogels

Immunofluorescence (IF) staining and flow cytometry were used to detect the immunoregulatory effects of different hydrogels on RAW264.7 cell phenotypes. RAW264.7 cells were seeded on 24 -well plates at a density of cells/well. After incubation for 12 h , the complete induction was replaced with LPS (Sigma-Aldrich, USA) or IL-4 (Peprotech, USA) for 24 h , followed by treatment with hydrogel extracts for 24 h . Next, they were fixed in paraformaldehyde for 20 min and treated with Triton X-100 for 10 min . They were blocked with goat serum for 1.5 h and then incubated overnight at with anti-iNOS (1:100, Proteintech, China) or anti-CD206 (1:100, Proteintech, China) primary antibodies. After rewarming for 0.5 h on the second day, FITC-labelled goat anti-rabbit IgG (1:200, Cell Signaling Technology, USA) was incubated for 60 min in the dark. Then, DAPI was stained for 10 min , and the anti-fluorescence quencher was sealed and stored in the dark at . Immunofluorescence images were obtained by laser scanning confocal microscope (CLSM600, Sunny Optical Technology, China), and 3D heatmaps were evaluated using ImageJ.
Moreover, RAW264.7 cells were planted in a sixwell plate and treated according to the aforementioned
method. Then, the cells were digested with Tryp-sin-EDTA and centrifuged at 1000 rpm for 5 min , with pre-cooled PBS 3 times. Subsequently, the cells were kept in the dark for 15 min with anti-CD86 (105005, Biolgend) and CD206 (147105, Biolgend). Finally, the samples were detected by flow cytometry (ACEA NovoCyteTM 2070R, USA), and FlowJo analyzed the data.

In vitro antioxidant and anti-inflammatory mechanism of the hydrogels through the regulation of the Nrf2/NF-кB pathway

The expression of nuclear factor erythroid- 2 related factor 2 (Nrf2) and nuclear factor kappa-B (NF-кB) were examined by IF staining. RAW264.7 cells were seeded on 24 -well plates at a density of cells/well. After incubation for 12 h , the complete induction was replaced with LPS (Sigma-Aldrich, USA) for 24 h , followed by treatment with hydrogel extracts for 24 h . Next, RAW264.7 cells were performed using anti-Nrf2 (1:100, Cell Signaling Technology, USA) and NF-кB (1:100, Cell Signaling Technology, USA). Other IF staining procedures were the same as above. Images were captured, and 3D heatmaps were evaluated using ImageJ.
Then, the expression levels of inflammatory factors and antioxidant enzyme genes in RAW264.7 cells were detected by Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). In brief, RAW264.7 cells were seeded at a density of cells/well in 6-well plates and treated as described in this section. Total RNA was isolated using a SteadyPure quick RNA extraction kit (AG21023, Agbio, China) and converted into cDNA by the Evo M-MLV RT Kit (AG11728, Agbio, China). Then, qRT-PCR was conducted on a CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories, California, USA) using SYBR Green Pro Tap HS Premix (AG11701, Agbio, China). Using -actin as the internal reference gene, the relative expression levels of each target gene were calculated using the method. The primer sequences for the , IL-10, Arg-1, SOD-1, and CAT genes are presented in Table S1.
Further, western blot (WB) analysis was performed to evaluate the related expression levels of antioxidant protein (Nrf2), NF-кB signaling pathway proteins (NF-кB and ), and -actin. Macrophage cells were processed in the same manner as for qRT-PCR. Then, total proteins were extracted with Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA) buffer (EpiZyme, China) containing proteinase and phosphatase inhibitors (1:100, Beyotime, China) on ice. Lysates extracted with RIPA buffer were sonicated and then centrifuged at . Subsequently, the protein concentrations were quantified by using the BCA protein assay kit (EpiZyme, China). An equal amount of boiled protein digest was loaded onto the Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE) for protein separation, followed by transfer to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. Following a block at room temperature using Protein Free Rapid Blocking Buffer (EpiZyme, China), the membranes were subsequently exposed to primary antibodies against Nrf2 (1:1000, Cell Signaling Technology), NF-кB (1:1000, Cell Signaling Technology) p-NF-кB (1:1000, Cell Signaling Technology) and -actin (1:5000, Proteintech, China) at overnight. Next, the membranes were incubated with secondary antibodies after washing three times, followed by visualization of the immunoreactive protein bands using OI600 MF Touch (BIO-OI, China).

In vitro osteogenic differentiation assessment of the hydrogels

The hPDLSCs were planted on the 12 -well plate coated with gelatin in advance. Then, the culture medium was swapped with the hydrogel extracts. After continuing the culture for was added for 2 h . Next, the culture medium was substituted with the prepared osteogenic induction solution. After 5 days of culture, they were fixed with paraformaldehyde for 20 min , added with the configured BCIP/NBT alkaline phosphatase working solution, stained for 0.5 h in the dark, and then observed with a type microscope (SZN71, Sunny Optical Technology, China). After culture for 21 days, the calcium nodules were stained with ARS solution.
In addition, the hPDLSCs were seeded on 24-well plates and treated the cells as we did before. Samples collected for 7 days were stained for Runx2, whereas those cultured for 21 days were stained for the late osteogenic protein osteocalcin (OCN). For IF, hPDLSCs were performed using anti-RUNX2 (1:100, Cell Signaling Technology, USA) and anti-OCN (1:100, Proteintech, China). Moreover, the cytoskeleton morphology after treatment was observed by fluorescence microscope. They were fixed with paraformaldehyde for 20 min and treated with Triton X-100 for 10 min . Then, they were incubated with FTIC (1:100, Cytoskeleton) for 1 h , stained with DAPI, and sealed with an anti-fluorescence quencher. In addition, the hPDLSCs and hydrogels were co-cultured in the presence of hydrogen peroxide to observe the morphological changes of the cells. The control group consisted of hPDLSCs cultured in a complete medium without treatment. In the group, 300 was added to the culture medium to induce oxidative stress. HP/PVA, HP/PVA@MH, HP/PVA@ Fe-Que, and HP/PVA@MH/Fe-Que hydrogels were co-cultured with hPDLSCs, with added simultaneously. After 24 h , cells were labeled with DAPI and FITC fluorescence staining, and their adhesion and morphology on the hydrogel surfaces were observed
using laser confocal microscopy. Finally, the fluorescence microscope was used to visualize the IF images, and 3D topographic maps were evaluated using ImageJ.

In vivo treatment in periodontitis model In vivo establishment of periodontitis model in rats

All animal experiments were approved by the Ethics Committee of Southwest Medical University and conducted according to the guidelines established by the Animal Care Committee (Document No. 20230705005). Following 1 week of acclimatized feeding, thirty male Sprague-Dawley rats, aged 6 weeks and weighing between 180 and 220 g , were randomly allocated into six groups: (1) Control group: no treatment, (2) Periodontitis group: treated with ligation and an injection of . gingivalis, (3) HP-PVA group: periodontitis treated with HPPVA hydrogels, (4) HP-PVA@MH group: periodontitis treated with HP-PVA@MH hydrogels, (5) HP-PVA@FeQue group: periodontitis treated with HP-PVA@Fe-Que hydrogels, (6) HP-PVA@MH/Fe-Que group: periodontitis treated with HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels. Rats were anesthetized using isoflurane ( in oxygen), and a 0.2 mm archwire was securely placed beneath the gums of the bilateral maxillary first molars. P. gingivalis was injected into the palatal gingiva between the first and second molars every three days. After 2 weeks, the ligated archwire was removed, and hydrogels or saline ( ) were injected into the palatal gingival sulcus of the maxillary molar every three days.

In vivo antioxidant property

One week following the hydrogel treatment, the rats were anesthetized. DCFH-DA ( ) was injected into the palatal gingiva between the first and second maxillary molars. After 30 min , images were obtained by a Multimodal Small Animal Live Imaging System (excitation filter, ; emission filter, ).

Micro-CT analysis

After 2 and 4 weeks, the animals were harvested for their maxilla, which was collected and fixed in paraformaldehyde for one week. The samples were then scanned using a micro-CT system (nanoVoxel-100, Tianjin, China). The three-dimensional digitized models and twodimensional digitized images were evaluated and reconstructed using the RediAnt DiCOM Viewer software. The distance between the cementoenamel junction and the alveolar bone crest (CEJ-ABC) was measured to estimate the extent of the buccal and sagittal alveolar bone loss.

Histology and immunohistochemistry

The collected maxillary samples were fixed in paraformaldehyde, decalcified in 10% ethylene diamine
tetraacetic acid (EDTA) for one month, dehydrated in gradient alcohol, and embedded in paraffin. Afterward, these paraffin samples were made into sections at thickness. Hematoxylin and eosin staining (H&E) and Masson staining were performed according to instructions. The IL- and TNF- expression in the periodontal tissue were evaluated using an immunohistochemistry method. Slides were scanned with a digital pathology slide scanner (KF-PRO-002, China), and observed using K-Viewer (1.7.0.23) X64. Moreover, IF staining, including iNOS, CD206, Nrf2, P65, Runx2, and OCN, was measured. Staining was visualized using CaseViewer. The observation areas were selected between the roots of the first and second molars.

Statistical analysis

All data were presented as mean ± standard deviation (SD) and the significance among multiple groups was examined by the one-way analysis of variance (ANOVA) using GraphPad Prism 9.0. Statistically significant values include , ** , *** , and **** .

Results and discussion

Synthesis and characterization of Fe-Que NPs

In the synthesis of Fe-Que NPs, quercetin was dissolved in methanol and added to a PVP solution containing iron ions to improve the dispersion of Fe-Que NPs (Fig. 1A). The solution underwent a rapid color change from yellow to black upon adding quercetin, indicating successful coordination between the iron ions and the phenolic group of quercetin. The methanol solution containing Fe-Que NPs was dialyzed overnight to eliminate excess iron ions. Subsequently, Fe-Que NPs with high water solubility and stability were successfully obtained (Fig. 1B). TEM analysis revealed that Fe-Que NPs were spherical, ultra-small particles with uniform distribution and a size of less than 10 nm (Fig. 1C). Subsequent particle size analysis indicated a range of 1 to 3 nm for Fe-Que NPs (Fig. 1D). In addition, the mean particle size measurements by DLS were approximately , as illustrated in Fig. S1. The UV-vis spectra for iron ions, quercetin, and Fe-Que NPs were presented in Fig. 1E. Free exhibited clear absorption peaks at 248 nm and 368 nm , Quercetin showed absorbance at 256 nm and 370 nm , while the peak intensity of Fe-Que NPs notably decreased in the range of [37]. The FTIR spectral analysis of Fe-Que NP showed that the intensity of the vibrational peaks at corresponding to the HO-C functional group decreased (Fig. 1F), which indicated that was successfully coordinated with the quercetin HO-C molecule [36]. In addition, the chemical composition and state of Fe-Que NPs were analyzed using XPS. The full XPS spectrum revealed that
Fig. 1 Synthesis and characterization of Fe-Que NPs and HP. (A) Schematic diagram of the synthesis of Fe-Que NPs. (B) Picture of the synthetic materials, including Fe-PVP, Que, and Fe-Que NPs. (C) TEM and (D) Grain size of Fe-Que NPs. (E) UV-vis absorption spectra of , Que, and Fe-Que NPs. (F) FTIR spectra of Que and Fe-Que NPs. (G) Full XPS spectrum of Fe-Que NPs. (H) High-resolution spectra of ferric ions in Fe-Que NPs. (I) UV-vis absorption spectra and (J) FTIR spectra of HA, PBA, and HP. (K) NMR spectra of HA and HP
Fe-Que NPs mainly comprise carbon, oxygen, and iron (Fig. 1G). Furthermore, Fig. 1H showed two prominent binding energy peaks at 709 eV and 724 eV corresponding to the and orbitals of iron ions, suggesting that the oxidation state of iron ions in the Fe-Que NPs remained unchanged. The results from the aforementioned studies collectively demonstrated the successful preparation of Fe-Que NPs.

Synthesis and characterization of HP

Firstly, HP was synthesized by grafting HA with 3 -aminophenyl boronic acid. The UV-vis spectra of HA, PBA, and HP are shown in Fig. 1I. HA exhibited no UV-vis absorption peak in the range of , while PBA displayed an absorption peak at 232 nm corresponding to the benzene ring, as well as a noticeable absorption peak at attributed to the amino and benzene ring conjugate system. HP showed a characteristic absorption peak of the benzene ring at 242 nm similar to that of PBA. However, the absorption peak at almost disappeared due to the weakened conjugation effect between the amino group and benzene ring after grafting onto HA. This result confirmed that PBA was successfully grafted onto the HA segment. In order to further characterize the changes in the HA structure after modification, it was analyzed by FTIR spectra (Fig. 1)). Comparing the infrared spectrum of HA, there is no obvious change in the characteristic absorption peak of HP, but the aromatic and stretching vibration can be observed at and , respectively. The B-O stretching vibration at , further verified the grafting of 3 -aminophenyl boronic acid and the success of the amidation reaction [39]. The NMR spectra of HA and HP before and after the grafting reaction are presented in Fig. 1 K . At chemical shifts of 1.9 ppm and , both HA and HP exhibited identical proton absorption peaks corresponding to the methyl and methylene groups on HA, respectively. The appearance of a new proton peak between 7.0 ppm and 8.0 ppm confirmed the successful grafting of PBA onto HA [42]. The degree of substitution was determined by calculating the ratio between the integral of aromatic protons from the conjugated phenylboronic acid group (between 7.0 and ) to that of methyl protons from HA ( ), resulting in a calculated grafting efficiency of phenylboronic acid groups onto HP at approximately .

The Preparation and characterization of the HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogels

Considering the high ROS level in the periodontitis microenvironment, in this study, a ROS-responsive smart hydrogel was designed to achieve dual delivery of antibiotics and anti-inflammatory ultra-small NPs,
which can improve antibacterial performance, accelerate the removal of ROS and alleviate inflammation and bone resorption. As depicted in Fig. 2A, a hydrogel network was formed by establishing dynamic borate ester bonds (highly sensitive to ROS) between the diol group structures on PVA and the phenylboronic acid groups on HP. Figure 2B shows the state of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel before and after gelation. Next, the microscopic morphology of the hydrogels was observed by SEM. As depicted in Fig. 2C, all the hydrogels exhibited interconnected pores and uniform three-dimensional porous structures, facilitating the encapsulation of biologically active molecules and protecting them from degradation. Moreover, it ensured efficient nutrient and oxygen transport, promoting cellular penetration, proliferation, and new tissue formation. Furthermore, EDS map analysis revealed a homogeneous distribution of elements C , N, O, B, and Fe throughout the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel (Fig. 2D), providing evidence for the successful loading and dispersion of Fe-Que nanoparticles within the hydrogel.
Injectability, adaptability, adhesion, and self-healing properties are essential properties of hydrogels for local drug delivery in periodontal pockets [43]. The injectability feature facilitates the efficient penetration of hydrogels into narrow and deep periodontal pockets, providing spatiotemporal control of therapeutic drug release through material degradation and drug diffusion [8]. Figure 2E showed that the HP-PVA@MH/FeQue hydrogel could be easily transferred into a syringe and extruded from a needle ( ) to form an “SWMU” shape without any clogging. Fig. S2A showed the setup where the syringe was fixed in the lower tensile grip, and the syringe’s piston was compressed using the upper compression platform. The injection rate was controlled by adjusting the transverse speed of the compression platform to achieve an injection speed of min . The plunger force was measured using a load cell. As shown in Fig. S2B, the maximum injection force for the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel at an injection speed of was 21.88 N . Fig. S3A showed that the storage modulus (G’) of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel were greater than the loss modulus ( ) across the strain range of . As shown in Fig. S3B, G’ were all significantly higher than G” across a range of angular frequencies ( ), indicating good structural stability after gelation [44]. Moreover, within a shear rate range of , the viscosity of HP-PVA@MH/FeQue hydrogel significantly decreased with increasing shear rate, demonstrating typical shear-thinning behavior (Fig. S3C). The HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel exhibits excellent injectability, favorable elasticity, shear-thinning behavior, and appropriate structural stability, meeting
Fig. 2 Preparation and characterization of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels. (A) Schematic diagram of the synthesis of hydrogels. (B) Photographs of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel before (left) and after (right) gelation. (C) SEM images of the different hydrogels. (D) EDS mapping of the HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogel. Photographs of the injectability, (F) shape-adaptability, and adhesion of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel. (H) Photographs of the self-healing properties of the HP-PVA hydrogel
the requirements for local stability and precise treatment during periodontal therapy.
In periodontitis, periodontal tissue is destroyed irregularly. Hydrogel possesses both gel-like elasticity and fluidity, exhibiting excellent shape adaptability, which enables the hydrogel to fit perfectly with the damaged periodontal tissue and adapt to irregularly shaped periodontal defects [45]. As shown in Fig. 2F, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel could be reshaped into different shapes, which could be used to fill different defects and had good adaptability. After being injected into the periodontal pocket, the hydrogel is subjected to constant washing by gingival fluid and saliva, so it should have certain adhesion properties to adhere to the periodontal tissue and prolong its retention time within the periodontal pocket [46]. The HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel exhibited a firm adhesion to the dental sulcus and internal organs, including the heart, liver, spleen, lungs, kidneys, and the root of the first premolar tooth (Fig. 2G). To further evaluate the tissue adhesion of the hydrogel, a standardized in vitro lapshear test was conducted using porcine gingiva, and the hydrogel’s adhesion to tooth enamel was assessed (Fig. S4A, S4B, S4D, and S4E). The results showed that MH and Fe-Que loading did not affect the adhesive properties of the hydrogel, and the adhesion strength of HP-PVA@ MH/Fe-Que to pig gingiva was about , and to enamel was about (Fig. S4C and S4F). Furthermore, when the hydrogel is filled in the defective areas of the periodontal tissue, external forces may cause the hydrogel to break, but the rapid self-healing ability helps improve the hydrogel’s adaptability to complex defect patterns [47]. Figure 2 H visualized the self-healing performance of the HP-PVA hydrogel. The HP-PVA hydrogel was cut into 2 pieces and dyed red and green, respectively. After 1 min , the reassembled hydrogel was stretched, and it maintained its complete shape without breaking, indicating that the hydrogel had a good selfhealing performance

ROS-responsive behavior drug release kinetics, and in vitro degradation behavior of the hydrogels

The imbalance between ROS and the antioxidant defense system can lead to oxidative stress, a key signal molecule in the development of periodontitis [48]. During the development of periodontitis, the ROS levels were closely related to the degree of tissue damage in the periodontal tissue [49]. Therefore, designing a ROSresponsive hydrogel as a drug delivery system may be an effective strategy for the local treatment of periodontitis. By responding to ROS levels within the periodontal environment, the hydrogel can achieve precise on-demand drug release and effectively reduce ROS in the periodontal microenvironment to accelerate periodontal healing. Borate bonds can be oxidized by at physiological
pH and temperature [50]. Fig. S5A shows the reaction mechanism of hydrogel to ROS. Therefore, we treated the hydrogels with different concentrations ( 0,100 , and ) to investigate the degradation and drug release of the hydrogels to study their therapeutic effects on periodontitis. As shown in Fig. S5B, the samples were observed with different concentrations ( 0,100 , and for 3 h . The liquid in the sample bottle had different intensities of yellow, with the deeper the yellow indicating a higher concentration of . This result suggested that increased the oxidation of the borate bond and led to the disintegration of the hydrogel. The SEM image of the frozen-dried sample (Fig. S5C) showed that as the concentration of increases, the pore size of the hydrogel increases, and the three-dimensional network structure of the hydrogel gradually disintegrates in the oxidative environment. This result also indicated that the borate ester bonds in the hydrogel degraded in the oxidative environment, resulting in a decrease in the degree of cross-linking and an increase in the pore size of the hydrogel. Without treatment, the drug is released due to the hydrolysis of borate bonds within the hydrogel over time. However, in the presence of , the hydrogel exhibits a responsive fracture due to oxidation of borate bonds, thereby accelerating drug release (Fig. S5D). In addition, the degradation behavior of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels in PBS containing different concentrations of , and was investigated. The results showed that the hydrogel morphology changed significantly with increasing concentrations and reaction time, validating its responsiveness to ROS levels (Fig. S6). In summary, the HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogel could achieve ROS-responsive degradation and accelerate drug release, which was beneficial for treating periodontitis.

In vitro antibacterial activity assays of the hydrogels

Bacteria are one of the factors that cause periodontitis, and their metabolic products can induce destructive resorption of periodontal tissues [51]. Even after standard periodontal treatment, certain bacterial hosts often persist on the root surface and need to be locally treated with antibiotics [52]. The MH has been widely used in clinical treatment. To study the effect of hydrogels on bacteria, the antibacterial performance of hydrogels was determined by the plate coating method, bacterial live/ dead staining method and zone of inhibition (ZOI) assay. Figure 3A shows that the HP-PVA and HP-PVA@Fe-Que hydrogels did not have significant antimicrobial properties compared to the control group, as evidenced by the colony counts. However, only a few colonies could be seen in the HP-PVA@MH and HP-PVA@MH/Fe-Que groups for S. aureus, E. coli, and P. gingivalis. The results of bacterial colony counting were shown in Fig. 3B, C,
Fig. 3 In vitro antibacterial activity of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels. (A) Representative images of S. aureus, E. coli, and P. gingivalis colony-forming units. The pertinent statistical data for the quantification of bacterial colonies of (B) S. aureus, (C) E. coli, and (D) P. gingivalis. (E) The live/dead staining images of S. aureus, E. coli and P. gingivalis. Antibacterial rate of S. aureus, E. coli and P. gingivalis
and D . The results demonstrated that the HP-PVA@MH and HP-PVA@MH/Fe-Que groups exhibited broad-spectrum antibacterial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as the main pathogenic anaerobic bacteria responsible for periodontitis. Next, the bacterial live/dead fluorescence staining experiment was conducted to visually illustrate the hydrogels’ antibacterial efficacy. As depicted in Fig. 3E, the control, HP-PVA, and HP-PVA@Fe-Que groups predominantly exhibited green fluorescence, indicating live bacteria presence; however, the HP-PVA@MH and HP-PVA@ MH/Fe-Que groups displayed a significant amount of red fluorescence (indicating dead bacteria). Furthermore, these conclusions were supported by the live-dead fluorescence intensity analyses of S. aureus, E. coli, and P. gingivalis bacteria, respectively (Fig. 3F, G, H). To further evaluate the antibacterial activity of the hydrogels, a ZOI assay was conducted using S. aureus, E. coli, P. gingivalis, and the key oral pathogen S. mutans. The results
indicated that the HP-PVA and HP-PVA@Fe-Que hydrogels did not form notable inhibition zones, while the HPPVA@MH and HP-PVA@MH/Fe-Que groups exhibited clear inhibition zones against all tested bacteria, including S. mutans (Fig. S7). These findings were consistent with the bacterial colony counting results. Therefore, the hydrogel loaded with antimicrobial MH had outstanding antimicrobial capacity and acted on the initiators of periodontitis to achieve a great therapeutic effect.

The biocompatibility test of the hydrogels

Good biocompatibility is essential to prevent adverse effects of bio-scaffold materials on normal periodontal tissues and cells [53]. The extracts of the hydrogels were used to culture cells, and the effects on cell viability and proliferation were tested. The live/dead staining of cells at 1,3 , and 5 days (Fig. 4A and C, S8A, S8C, S8E) showed that most hPDLSCs, HGFs, RAW264.7, L929, and HaCaTs were alive, with only a few dead cells present.
Fig. 4 Biocompatibility of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels. The Live/Dead staining images of (A) hPDLSCs and (C) RAW264.7 cells for 1,3 , and 5 days, respectively. The CCK-8 assays of (B) hPDLSCs and (D) RAW264.7 cells for 1, 3, and 5 days. (E) Hemolysis ratio of erythrocyte after incubating with the hydrogels
In addition, the number of cells increased gradually over time, with no difference from the control group, indicating that the hydrogels could not inhibit cell proliferation. Furthermore, the CCK-8 results on 1,3, and 5 days showed no statistically significant difference in cell viability between the hydrogel treatment groups and the control group, which was consistent with the findings of the live/dead staining assay (Fig. 4B and D, S8B, S8D, S8F).
In addition, in order to show cell viability directly in the presence of the hydrogels for accurate biological interaction analysis, we co-cultured hPDLSCs on HP-PVA@ MH/Fe-Que hydrogels. As shown in Fig. S9A and S9B, the hydrogel exhibited no apparent toxicity to hPDLSCs and demonstrated good biocompatibility. Furthermore, through DAPI and FITC fluorescence staining combined with laser confocal microscopy, it was observed that the cells were evenly distributed on the surface of the hydrogel and exhibited a well-spread spindle-shaped morphology, indicating excellent adhesion (Fig. S9C). Hence, the hydrogel had good cell compatibility.
Gingival bleeding is an important clinical symptom of periodontitis [9]. During the treatment of periodontitis, the hydrogel adheres to destroy the tissue surface in the periodontal pocket. From the perspective of biocompatibility, it must have a high level of blood compatibility. Compared with the control group, there was no obvious damage to the red blood cells in the hydrogel-treated group, while the red blood cells in the Triton X-100treated group were ruptured (Fig. S10A, B). Figure 4E showed that the hemolysis rate of the hydrogel-treated group was less than ( is good blood compatibility), indicating that the hydrogel had good blood compatibility.

Free radical scavenging ability and antioxidant capacity of the hydrogels

Excessive ROS can exert cytotoxic effects and activate inflammatory factors, leading directly or indirectly to periodontal tissue destruction [54]. Therefore, scavenging excessive ROS is crucial for treating periodontitis and mitigating the damage to periodontal tissues [55]. Firstly, the DPPH free radical scavenging assay was used to evaluate the antioxidant performance of the hydrogels (Fig. 5A). The DPPH free radical has a single electron, and its alcohol solution is purple with strong absorption at 515 nm . In the presence of antioxidants, the DPPH free radical is neutralized, causing the solution to lighten in color and the absorbance at 515 nm to diminish [56]. To a certain degree, the change in absorbance reflects the extent of free radical scavenging. The control group showed the highest absorbance and appeared purple, whereas the positive group had the lowest absorbance and exhibited a slightly yellow color. The HP-PVA and HP-PVA@MH groups demonstrated negligible capacity
for DPPH free radical scavenging. Conversely, both the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups exhibited significantly reduced absorbance levels, displaying a color intermediate between that of the control and positive groups (Fig. 5B). Figure 5C illustrates the DPPH free radical scavenging activity of different hydrogel groups. The results indicated that the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups had superior DPPH scavenging rates at and , respectively.
Secondly, ABTS undergoes oxidation, forming a stable green cationic radical with its peak absorption at 405 nm [57]. When the sample is introduced to the ABTS radical solution, the antioxidant compounds interact with the ABTS radicals, resulting in a color change in the reaction system and a reduction in absorbance at 405 nm (Fig. 5D). Besides, the change of its absorbance within a certain range is proportional to the degree of free radicals being scavenged. As Fig. 5E showed, the absorbance of the control group exhibited the highest value and appeared green, while the positive group displayed the lowest absorbance with transparent color. The HPPVA and HP-PVA@MH groups demonstrated negligible capacity for ABTS free radical scavenging. Conversely, the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups displayed a color intermediate between the control and positive groups, exhibiting significantly reduced absorbance levels. The ABTS free radical scavenging rates were consistent as described above (Fig. 5F).
In addition, the ability of hydrogels to scavenge ROS was further demonstrated by intracellular DCFH-DA staining [58]. In the control group, RAW264.7 cells showed the lowest fluorescence intensity, while the fluorescence intensity of the , HP-PVA, and HP-PVA@ MH groups was stronger, indicating the presence of large amounts of ROS. However, the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups showed reduced fluorescence intensity, indicating a strong ROS-scavenging ability (Fig. 5G, H). A similar result was also observed in L929 cells (Fig. S11). Importantly, the results of flow cytometry showed that the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups significantly reduced the ROS level in the RAW264.7 cells, which was highly consistent with the conclusions of microscopic observation, and further verified the excellent free radical scavenging ability (Fig. S12). We hypothesized that the HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogels exhibit a high efficiency in scavenging ROS, which is attributed to the presence of phenolic and ketone groups in the quercetin structure.
Furthermore, the cytoprotective potential of hydrogel against oxidative stress-induced cell damage and their ability to restore cellular vitality was evaluated using live/dead cell staining and CCK-8 assay. As depicted in Fig. 5I, the substantial presence of red fluorescence
Fig. 5 Free radical scavenging ability and antioxidant capacity of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels under oxidative stress environment. (A) Schematic diagram showing the DPPH free radical scavenging assay. (B) Absorbance, photograph, and (C) DPPH scavenging ratio of the different hydrogels. (D) Schematic diagram showing the ABTS free radical scavenging assay. (E) Absorbance, photograph, and (F) ABTS scavenging ratio of the different hydrogels. (G) DCFH-DA staining, (H) fluorescent quantitative results, (I) Live/dead staining, and (J) CCK-8 assay of the RAW264.7 cell
(indicative of dead cells) was observed in the , HPPVA, and HP-PVA@MH groups. However, the number of dead cells was significantly reduced in the HP-PVA@ Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups. The results obtained from the CCK-8 analysis were consistent with the cell viability staining, revealing a significant decline in cell viability for the , HP-PVA, and HP-PVA@MH groups, while recovery was evident for the HP-PVA@FeQue and HP-PVA@MH/Fe-Que groups (Fig. 5J). These findings showed that HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@ MH/Fe-Que hydrogels possessed remarkable cytoprotective properties capable of mitigating ROS-mediated deterioration in cellular vitality.

Macrophage phenotype regulation effect of the hydrogels

Excessive ROS activates multiple anti-inflammatory pathways in periodontitis, resulting in an increased ratio of M1 macrophages to M2 macrophages [59]. Inhibiting the transformation of macrophage phenotype to M1 macrophage phenotype (pro-inflammatory) and promoting the polarization to M2 macrophage phenotype (antiinflammatory) is beneficial for alleviating inflammation and promoting osteoblast differentiation, which represents an essential therapeutic approach for the treatment of periodontitis. Therefore, to evaluate the effect of different hydrogels on macrophage polarization, we used LPS to promote polarization toward the M1 macrophage phenotype and IL-4 to drive polarization toward the M2 macrophage phenotype (Fig. 6A). The control group without induction exhibited regular circular morphology. In contrast, LPS-stimulated macrophages displayed short and filamentous pseudopodia morphology, and IL-4-stimulated macrophages demonstrated elongated morphology (Fig. 6B).
IF staining experiments were initially performed on macrophages to label M1 macrophages expressing inducible nitric oxide synthase (iNOS) and M2 macrophages expressing mannose receptor (CD206). As shown in Fig. 6C, the expression of iNOS in RAW264.7 cells significantly increased after LPS treatment. Compared to the LPS group, no significant difference in iNOS expression was observed in HP-PVA and HP-PVA@MH hydrogels. However, a significant reduction in iNOS expression was observed in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/ Fe-Que groups. As shown in Fig. 6E, the expression of CD206 in RAW264.7 cells increased after IL-4 treatment. Similarly, there was no significant variation observed in CD206 expression between the HP-PVA and HP-PVA@ MH hydrogels compared with the IL-4 group; however, a substantial increase was observed in CD206 expression within the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/ Fe-Que groups. Subsequently, additional flow cytometry analysis was performed to assess macrophage polarization (Fig. 6D, F). The findings demonstrated that the
HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels effectively inhibited macrophage polarization towards M1 while promoting macrophage polarization towards M2, thereby facilitating inflammation resolution and tissue repair in periodontitis.

In vitro antioxidant and anti-inflammatory mechanism of the hydrogels by regulating the Nrf2/NF-кB pathway

Oxidative stress pathways play a crucial role in developing and progressing various diseases. Nrf2 is considered a key regulator of oxidative stress, which upregulates the expression of various antioxidant enzymes (such as SOD-1 and CAT) by binding to the antioxidant response element to scavenge excessive ROS, thus protecting cells from oxidative damage [60]. Nrf2 is also associated with macrophage polarization and the NF-кB pathway. Activation of the NF-кB pathway is crucial in chronic inflammation, promoting macrophage polarization towards the M1 type and increasing the expression of pro-inflammatory cytokines (such as IL-1 and TNF- ) [61]. The “Macrophage phenotype regulation effect of the hydrogels” results suggested that HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel could mediate macrophage polarization. Therefore, it can be inferred that HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel may regulate the Nrf2/NF-кB pathway to suppress oxidative stress, inhibiting macrophage polarization towards the M1 type and promoting polarization towards the M2 type. To investigate the potential role of the antioxidant and anti-inflammatory mechanisms of HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogel, we conducted IF staining, qRT-PCR, and western blot to validate this hypothesis.
As shown in Fig. 7A, after LPS-induced inflammation, macrophages exhibited weaker Nrf2 fluorescence intensity, and the HP-PVA and HP-PVA@MH groups also showed similar fluorescence intensity; however, the Nrf2 fluorescence signal was significantly higher in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups than in the LPS group. Conversely, for NF-кB, the fluorescence signal in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@ MH/Fe-Que groups was lower than in the LPS group (Fig. 7B). According to the results shown in Fig. 7C-H, compared with the LPS group, the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups exhibited a downward trend in pro-inflammatory cytokine expression of and , and an upward trend in anti-inflammatory cytokine expression of and Arg-1. Additionally, the expression of antioxidant enzymes SOD-1 and CAT was also enhanced in HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@ MH/Fe-Que groups. These results suggested that the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels possessed high antioxidant and anti-inflammatory capabilities.
Furthermore, western blot results showed that after the addition of LPS, the expression of Nrf2 decreased,
Fig. 6 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels inhibit the polarization of macrophages toward the M1 phenotype while facilitating their polarization toward the M2 phenotype. (A) Schematic diagram showing the effect of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels on macrophage polarization. (B) Microscopic view of macrophages. IF images of (C) M1 (iNOS) and (E) M2 (CD206) macrophages maker. Flow cytometry analysis of (D) M1 (CD86) and (F) M2 (CD206) macrophage markers
Fig.7 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels regulate the Nrf2/NF-kB pathway to exert antioxidant and anti-inflammatory effects in vitro. IF images of RAW264.7 cells for (A) Nrf2 and (B) NF-kB. QRT-PCR analysis of the relative mRNA level of (C, D) pro-inflammatory genes IL-1ß, TNF-a; (E, F) anti-inflammatory genes IL-10, Arg-1; ( ) antioxidant enzyme genes SOD-1, CAT. (I) Western blot detection of Nrf2, P65, and p-P65, with β-actin as the internal control. (J) The antioxidant and anti-inflammatory mechanism of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel was presented as a schematic diagram
while the expression of Nrf2 in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups increased. Conversely, the expression of P65 in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups was weaker than that of the LPS group, as well as p-P65 (Fig. 7I). This result indicated that HP-PVA@MH/Fe-Que could enhance the expression of Nrf2 while reducing the levels of P65 and p-P65. Overall, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel can regulate the Nrf2/NF-кB pathway and influence the polarization of macrophages, thereby alleviating oxidative stress (Fig. 7J).

In vitro osteogenic differentiation assessment of the hydrogels

HPDLSCs have the potential for multidirectional differentiation, which is beneficial for alveolar bone regeneration [20]. As shown in Fig. S13, hPDLSCs displayed an elongated fusiform or spindle-shaped morphology and were morphologically comparable to the fibroblastic cells. Flow cytometric analysis revealed high expression levels of CD90 (99.97%) and CD105 (99.5%), while low expression levels of CD34 (0.08%) and CD45 (0.25%). These results indicated that the isolated hPDLSCs were well-differentiated mesenchymal stem cells derived from the periodontal tissue, with significant implications for periodontal tissue regeneration and repair. However, elevated ROS in the periodontal microenvironment induces oxidative stress, significantly inhibiting the osteogenic differentiation of hPDLSCs and destroying periodontal tissue [62]. Therefore, it is imperative to mitigate excessive ROS levels and preserve the osteogenic differentiation capacity of hPDLSCs to successfully repair periodontal tissue.
As illustrated in Fig. 8A, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel demonstrated its ability to protect hPDLSCs from osteogenic differentiation. The cellular morphology of each hydrogel group was evaluated under an induced oxidative stress microenvironment (Fig. 8B). The control group displayed fibroblast-like cells with elongated spindle or fusiform shape, centrally located nuclei, and round or oval cytoplasmic structure. Conversely, the cells in the , HP-PVA, and HP-PVA@ MH manifested a contracted and shrunken morphology under oxidative stress conditions. On the contrary, the cells in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que regained their elongated spindle or fusiform shape, effectively mitigating the adverse effects of oxidative stress on hPDLSCs morphology. In addition, the hPDLSCs and hydrogels were co-cultured in the presence of hydrogen peroxide to observe the morphological changes of the cells (Fig. S14). The control group exhibited well-spindleshaped cells. In the group, cell morphology was significantly abnormal. Notably, the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels, incorporating
Fe-Que anti-inflammatory nanoparticles, exhibited superior cell compatibility by further enhancing cell adhesion and spreading through efficient ROS scavenging. Subsequently, osteogenic induction was performed within an oxidative microenvironment to investigate the impact of oxidative stress on the osteogenic behavior of hPDLSCs under hydrogel treatments. Alkaline phosphatase (ALP), an early marker for osteogenesis, serves as a reflection of osteoblast differentiation level [63]. Higher ALP activity indicates more pronounced differentiation from preosteoblasts into mature osteoblasts. Mineralized nodules serve as a key indicator of the differentiation and maturation of osteoblasts; therefore, Alizarin Red S (ARS) is used to stain or locate calcium deposits in tissues by forming an orange-red complex with calcium salts present in calcium carbonate or hydroxyapatite [64]. The ALP activity was significantly reduced in the , HP-PVA, and HP-PVA@MH compared to the control group, as shown in Fig. 8C. However, in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que, there was a partial recovery of ALP activity between the control and groups. Similar results were observed in the ARS analysis.
In addition, to further investigate the ability of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel in rescuing hPDLSCs’ osteogenic differentiation, immunofluorescence staining was conducted to evaluate the expression levels of Runx2 and OCN. Runx2 plays a crucial role in osteoblast differentiation and skeletal morphogenesis, exhibiting early high expression and nuclear localization [65]. OCN is an osteoblast’s secreted protein that reflects its activity and bone formation capacity, serving as a late-stage marker for osteogenesis [66]. Compared to the control group, both Runx2 and OCN expressions were significantly reduced in the , HP-PVA, and HP-PVA@MH; however, they were partially restored in the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que groups (Fig. 8D). The results suggested that the osteogenic differentiation capacity of hPDLSCs was significantly impaired under the conditions of oxidative stress, whereas the HP-PVA@Fe-Que and HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels exhibited a partial rescue effect on the osteogenic differentiation potential, thereby enhancing bone regeneration for achieving periodontal tissue regeneration goals.

ROS removal ability of the hydrogels in vivo

Given the strong antibacterial, antioxidant, and antiinflammatory effects of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel on RAW264.7 cells and its favorable effect on osteogenic differentiation of hPDLSCs under oxidative conditions, we established models of experimental periodontitis in rats by using a combination of ligated archwires and injections of . gingivalis to evaluate the therapeutic effects of HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel (Fig. S15). The experimental flowchart for in vivo studies is presented
Fig. 8 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels protected hPDLSCs from ROS attack and promoted osteogenic differentiation in the oxidative microenvironment. (A) Schematic diagram showing the effect of the HP-PVA@MH/Fe-Que on the hPDLSCs’osteogenic differentiation potential under oxidative stress conditions. (B) Cell morphology of hPDLSCs under oxidative stress condition. (C) ALP staining on day 7 and ARS staining on day 21 of hPDLSCs. (D) IF staining images of Runx2 and OCN in hPDLSCs
in Fig. S16A. To elucidate antioxidant properties in vivo, ROS was detected using a Multimodal Small Animal Live Imaging System. Following the establishment of the periodontitis model, the hydrogels were positioned between the upper first molar and second molar. One week later, a ROS fluorescent probe was injected into the periodontitis site. As shown in Fig. S16B, the periodontitis group exhibited elevated fluorescence signals, suggesting an accumulation of ROS in the periodontal tissue. The fluorescence signal in the HP-PVA group was slightly lower than that in the control group, suggesting that the hydrogel has ROS responsiveness and can remove part of the ROS. The fluorescence intensity of the HP-PVA@MH, HP-PVA@Fe-Que, and HP-PVA@MH/Fe-Que groups were significantly lower than that of the periodontitis group, and the fluorescence intensity of HP-PVA@MH/ Fe-Que was the lowest. The statistical data in Fig. S16C confirmed the results, indicating that HP-PVA has partial ROS removal ability, and HP-PVA@MH/Fe-Que has excellent ROS removal ability in vivo. Furthermore, the ability of the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels to scavenge ROS activity in RAW264.7 cells was tested in vitro. The results again showed that the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels had a remarkable ROS scavenge efficiency (Fig. S16D, E).

Bone regeneration evaluation of the hydrogels in vivo

To evaluate the therapeutic effect of HP-PVA@MH/ Fe-Que hydrogels on bone resorption in vivo, samples from the maxillary bone were obtained for analysis using Micro-CT at 2 weeks and 4 weeks following the hydrogel treatment (Fig. 9A). 2D and 3D images were used for visualization of the reconstruction of the alveolar bone, showing the destruction of the alveolar bone and resorption at the root divergence, reflecting the inflammatory process of the periodontal disease model. The extent of bone loss in the alveolar bone was quantified by measuring the linear distance from the distal cementoenamel junction (CEJ) of the first molar to the apex of the alveolar bone crest (ABC). As shown in Fig. 9B and C , the periodontitis group exhibited significant bone loss between the first and second molars, surpassing the diameter of the ligated elastic wire . Furthermore, the alveolar bone resorption reached approximately one-third of the root length, confirming the successful establishment of the periodontitis model. The SD rats treated with HP-PVA, HP-PVA@MH, and HP-PVA@Fe-Que showed improved bone regeneration in the alveolar bone. Furthermore, the bone regeneration was more noticeable when treated with HP-PVA@MH/ Fe-Que. Corresponding quantitative results are plotted in Fig. 9D-G. Among them, when evaluating the second week of the lateral alveolar bone defect, we found that the alveolar bone loss in the periodontitis group
was significantly increased compared with the control group . Compared with the periodontitis group, the rats treated with HP-PVA , HP-PVA@MH ( ), and HP-PVA@Fe-Que ( ) showed the reduction in alveolar bone loss, and the rats treated with HP-PVA@ MH/Fe-Que ( ) showed the best alveolar bone restoration. In the fourth week, the buccal lateral alveolar bone defect of control, periodontitis, HP-PVA, HP-PVA@MH, HP-PVA@Fe-Que, and HP-PVA@MH/ Fe-Que groups were , and . All other indicators showed that the alveolar bone partially recovered after HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels treatment, consistently confirming that HP-PVA@MH/Fe-Que saved the alveolar bone loss in inflammatory diseases and had good therapeutic effects on periodontitis in vivo.

Remodeling and regeneration of periodontal tissues in periodontitis in vivo

After verifying the restorative activity of HP-PVA@ MH/Fe-Que through Micro-CT analysis, we conducted histological analysis to further validate the pathological changes in periodontal tissues. In the control group, epithelial attachment was normal at 2 weeks, no periodontal pockets were formed, inflammatory cell filtration was minimal, collagen fibers were well oriented, and shark teeth fibers were vertically inserted into the bone. In the periodontitis group, there was a loss of epithelial attachment in the gingiva, resorption of alveolar bone towards the root apex, extensive infiltration of inflammatory cells, and a disorganized arrangement of collagen fibers, all indicating significant inflammation within the periodontal tissue. In contrast, after treatment with HP-PVA@MH/Fe-Que, the junctional epithelial attachment was partially restored, inflammatory cell infiltration was reduced, and the ABC height was partially restored (Fig. S17A). The efficiency of periodontitis treatment was evaluated by Masson trichrome staining (the blue area represents collagen staining), which showed that the collagen deposition level was reduced in the periodontitis group, and the collagen fiber structure was disordered and irregular (Fig. S17B). After treatment with HP-PVA@MH/FeQue, the collagen fibers were more compact and ordered. These results can also be confirmed by the quantitative results of inflammatory cell and collagen content in Fig. S17D, E.
In 4 weeks, we observed limited bone loss recovery in the periodontitis group, with disordered connective tissue structure (Fig. 10A, B). In the HP-PVA treatment group, there was slight recovery of the connective tissue and alveolar bone height, with no significant effect on the treatment of periodontitis. The inflammatory cell infiltration was significantly less in the HP-PVA@Fe-Que and
Fig. 9 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels reduced alveolar bone loss in rat models of periodontitis. (A) Schematic illustration of the treatment procedure for the in vivo study. (B) 3D reconstruction, sagittal images of the alveolar bone in 2 weeks (upper dashed line: CEJ, lower dashed line: ABC, red line: bone loss). (C) Images in 3D reconstruction and 2D sagittal view taken four weeks post-implantation. (D) Assessment of the height of lateral buccal bone loss in quantitative terms and (E) sagittal bone loss of 2 weeks. (F) Quantitative evaluation lateral buccal bone loss height and (G) sagittal bone loss of 4 weeks
Fig. 10 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels alleviated the imbalance of periodontal bone homeostasis in rat models of periodontitis after 4 weeks of treatment. (A) Images of H&E staining. (B) Masson’s trichrome staining images of the alveolar bone. (C) IF staining of osteoinductive marker OCN in the alveolar bone. R: root, PDL: periodontal ligament, AB : alveolar bone
HP-PVA@MH groups than in the periodontitis group after treatment, and the alveolar bone heights were significantly restored. The HP-PVA@MH/Fe-Que group showed the best effect, with the gingiva, periodontal ligament, and alveolar bone structure approaching normal. These results can also be confirmed by the quantitative results of inflammatory cell and collagen content in Fig. S18A, B. These results collectively indicate that HP-PVA@MH/Fe-Que had a significant therapeutic effect on the bacteria-induced periodontitis model, reducing inflammatory responses in periodontal tissues and accelerating the recovery of periodontitis.
To verify the osteogenic activity of HP-PVA@MH/FeQue in the post-inflammatory tissue regeneration stage, Runx2 (2 weeks) and OCN (4 weeks) were used to verify the potential osteogenic expression during bone formation by IF staining (Fig. S17C, 10 C ). The expression of Runx2 and OCN was downregulated in the periodontitis group, indicating that the ability to regenerate bone was reduced during periodontitis (Fig. S17F, S18C). Compared with the periodontitis group, the expression of Runx2 and OCN was upregulated after treatment with HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel, showing that HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel treatment had a positive regulatory effect on the restoration of periodontal bone tissue.

Anti-inflammatory effect of the hydrogels in vivo

HP-PVA@MH/Fe-Que exhibited protective effects against tissue damage; therefore, we explored their potential therapeutic mechanisms. We evaluated the levels of inflammation-related cytokines using immunohistochemistry (IHC) staining and IF staining in vivo. IHC staining showed that the positive staining areas for pro-inflammatory factors IL-1 and TNF- were slightly lower in the HP-PVA group compared to the periodontitis group, and the positive staining areas were further reduced after treatment with HP-PVA@MH and HP-PVA@Fe-Que; while the lowest positive staining area was observed in the HP-PVA@MH/Fe-Que group (Fig. 11A, D, E). These results indicate that HP-PVA could scavenge part of the ROS and slightly alleviate inflammation due to its ROS responsiveness. After treatment with HP-PVA@ MH and HP-PVA@Fe-Que, the inflammatory response was further reduced. However, due to the ROS-triggered release of antibacterial agent MH and anti-inflammatory nanoparticles Fe-Que NPs, HP-PVA@MH/Fe-Que eliminated the local bacteria in the periodontal pockets and inhibited inflammation, restoring periodontal tissue.
In periodontitis, M1 macrophages proliferate excessively and release various pro-inflammatory factors, further aggravating the inflammation. Next, we evaluated the immune-modulating function of the hydrogel. We performed IF staining of M1 and M2 macrophages with
iNOS and CD206, respectively. Figure 11B showed that the fluorescence intensity of iNOS in the periodontitis group was the highest, indicating a significant increase in expression, while the expression of CD206 was lower. After treatment with HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel, the fluorescence intensity of M1 macrophages significantly decreased, while the fluorescence intensity of M2 macrophages significantly increased (Fig. 11F, G), indicating that the HP-PVA@MH/Fe-Que group can inhibit the polarization of M1 macrophages and promote the polarization of M2 macrophages, and with good immune modulating function.
Nrf2 can enhance the antioxidant stress resistance to reduce inflammatory responses by activating specific genes such as NF-кB in periodontitis [40]. Based on the previous LPS model results in vitro (Fig. 7A, B, I), we further explored the expression of Nrf2 and NF-кB in vivo. As shown in Fig. 11C, Nrf2 expression was low in the periodontitis group, while the Nrf2 protein level was higher in the HP-PVA@MH/Fe-Que group than in the periodontitis group (Fig. 11H). This result indicated that HP-PVA@MH/Fe-Que had better antioxidant capacity. Additionally, compared with the control group, the P65 protein level was higher in the periodontitis group, indicating that the NF- signaling pathway was activated. However, the P65 protein level was lower in the HP-PVA@MH/Fe-Que group than in the periodontitis group (Fig. 11I), indicating that HP-PVA@MH/Fe-Que had good potential to inhibit the NF-кB signaling pathway and reduce inflammation.
In summary, the HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel had a significant therapeutic effect on the bacteria-induced periodontitis model, which could scavenge ROS and alleviate oxidative stress in periodontal tissues. Secondly, it promoted the expression of Nrf2 and inhibited the expression of P65, regulating the Nrf2/NF-кB pathway to achieve immune modulation, inhibiting the polarization of M1 macrophages and promoting the polarization of M2 macrophages, thereby alleviating the inflammatory response in periodontal tissues. Furthermore, the expression of anti-inflammatory factors and bone-forming genes was also upregulated. All these factors work together to create an immune microenvironment favorable for the resolution of periodontitis and the regeneration of periodontal tissues.

Conclusion

In this study, we successfully designed a ROS-responsive hydrogel that can efficiently load antibacterial agents and anti-inflammatory nanoparticles to treat periodontitis. The HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogel has excellent physical properties and can be used for local drug delivery in irregular periodontal pockets characterized by a high ROS microenvironment. The in vitro experimental
Fig. 11 HP-PVA@MH/Fe-Que hydrogels relieved periodontal tissue inflammation in rat models of periodontitis. (A) Representative IHC staining images of periodontal tissues, including IL-1 and TNF- . (B) Immunofluorescence staining images of iNOS and CD206 in the area of the alveolar septal region. (C) Immunofluorescence staining images of Nrf2 and P65 in the region of the alveolar septum. (D-I) The corresponding quantitative analysis of IL-1 , TNF-a, iNOS, CD206, Nrf2, and P65
results show that HP-PVA@MH/Fe-Que has strong antibacterial effects, excellent ROS scavenging, and can regulate the Nrf2/NF-кB pathway to polarize macrophages, inhibit pro-inflammatory factor expression, promote anti-inflammatory factor and antioxidant enzyme expression, and ultimately save hPDLSCs from osteogenic differentiation under oxidative stress conditions. In an animal model of periodontitis in rats, the HP-PVA@ MH/Fe-Que hydrogel can effectively remove ROS, alleviate inflammation, restore periodontal homeostasis, and promote the repair of alveolar bone defects. Therefore, this strategy of responding to the high ROS level microenvironment to trigger drug release and facilitate the synergistic delivery of antibacterial agents alongside antiinflammatory nanoparticles holds significant promise for treating periodontitis and enhancing the regeneration of periodontal tissues.

Supplementary Information

The online version contains supplementary material available at https://doi.or g/10.1186/s12951-025-03275-4.
Supplementary Material 1

Author contributions

YZ: Conceptualization, Methodology, Data curation, Writing-Original Draft. ZX: Formal analysis, Experiment, Methodology. XJ: Formal analysis, Investigation, Experiment, Methodology, Visualization. HZ: Investigation, Software, Visualization. XL: Software, Validation, Visualization. YF: Validation, Visualization. BL: Software, Validation. RC, CL and GT: Conceptualization, Project administration, Writing-Review & Editing, Funding acquisition. All authors reviewed the manuscript.

Funding

This work was funded by Sichuan Science and Technology Program (2024NSFSC1655, 2022YFS0634), Luzhou Science and Technology Program (2024JYJ035, 2023SYF101), Sichuan Province Medical Youth Innovation Research Project (Q23010), Scientific Research Foudation of Southwest Medical University (2023ZD002), Project of Stomatological Institute of Southwest Medical University (2021XJYJS01), Scientific Research Foundation of the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University (2024KQZX04, 2023BS01, 2023KQ03, 2023Z01).

Data availability

No datasets were generated or analysed during the current study.

Declarations

All animal experiments were approved by the animal ethics committee of Southwest Medical University (Document No. 20230705-005).
All authors agree for publication.

Competing interests

The authors declare no competing interests.

Author details

Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration of Luzhou Key Laboratory, The Affiliated Stomatological Hospital, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China
Department of Periodontics & Oral Mucosal Diseases, The Affiliated Stomatological Hospital, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China
Department of Periodontics & Oral Mucosal Diseases, Deyang Stomatological Hospital, Deyang 618000, China
Institute of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China
Received: 29 November 2024 / Accepted: 24 February 2025
Published online: 12 March 2025

References

  1. Armitage GC. Periodontal diagnoses and classification of periodontal diseases. Periodontol 2000. 2004;34:9-21. https://doi.org/10.1046/j.0906-6713.20 02.003421.x.
  2. Williams DW, Greenwell-Wild T, Brenchley L, Dutzan N, Overmiller A, Sawaya AP, Webb S, Martin D, Genomics NN, Computational Biology C, et al. Human oral mucosa cell atlas reveals a stromal-neutrophil axis regulating tissue immunity. Cell. 2021;184:4090-e41044015. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021. 05.013.
  3. Kinane DF, Stathopoulou PG, Papapanou PN. Periodontal diseases. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17038. https://doi.org/10.1038/nrdp.2017.38.
  4. Tonetti MS, Chapple ILC. Biological approaches to the development of novel periodontal therapies- Consensus of the seventh European workshop on periodontology. J Clin Periodontol. 2011;38:114-8. https://doi.org/10.1111/j. 1 600-051X.2010.01675.x.
  5. Hathaway-Schrader JD, Novince CM. Maintaining homeostatic control of periodontal bone tissue. Periodontol. 2000. 2021;86:157-187. https://doi.org/ 10.1111/prd. 12368
  6. Feng Z, Weinberg A. Role of bacteria in health and disease of periodontal tissues. Periodontol. 2000. 2006:40:50-76. https://doi.org/10.1111/j.1600-0757 .2005.00148.x
  7. Yin Y, Yang S, Ai D, Qin H, Sun Y, Xia X, Xu X, Ji W, Song J. Rational design of bioactive hydrogels toward periodontal delivery: from pathophysiology to therapeutic applications. Adv Funct Mater. 2023;33:2301062. https://doi.org/1 0.1002/adfm.202301062.
  8. Zhao X, Yang Y, Yu J, Ding R, Pei D, Zhang Y, He G, Cheng Y, Li A. Injectable hydrogels with high drug loading through B-N coordination and ROS-triggered drug release for efficient treatment of chronic periodontitis in diabetic rats. Biomaterials. 2022;282:121387. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials. 202 2.121387.
  9. Pan S, Zhong W, Lan Y, Yu S, Yang L, Yang F, Li J, Gao X, Song J. Pathol-ogy-Guided cell Membrane-Coated polydopamine nanoparticles for efficient multisynergistic treatment of periodontitis. Adv Funct Mater. 2024;34:202312253. https://doi.org/10.1002/adfm. 202312253.
  10. Yang S, Zhu Y, Ji C, Zhu H, Lao A, Zhao R, Hu Y, Zhou Y, Zhou J, Lin K, Xu Y. A five-in-one novel MOF-modified injectable hydrogel with thermo-sensitive and adhesive properties for promoting alveolar bone repair in periodontitis: antibacterial, hemostasis, immune reprogramming, pro-osteo-/angiogenesis and recruitment. Bioact Mater. 2024;41:239-56. https://doi.org/10.1016/j.bioa ctmat.2024.07.016.
  11. Dong Z, Lin Y, Xu S, Chang L, Zhao X, Mei X, Gao X. NIR-triggered tea polyphenol-modified gold nanoparticles-loaded hydrogel treats periodontitis by inhibiting bacteria and inducing bone regeneration. Mater Design. 2023;225:111487. https://doi.org/10.1016/j.matdes.2022.111487.
  12. Wang P, Wang L, Zhan Y, Liu Y, Chen Z, Xu J, Guo J, Luo J, Wei J, Tong F, Li Z. Versatile hybrid nanoplatforms for treating periodontitis with chemical/ photothermal therapy and reactive oxygen species scavenging. Chem Eng J. 2023;463:142293. https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.142293.
  13. Wang L, Li Y, Ren M, Wang X, Li L, Liu F, Lan Y, Yang S, Song J. pH and lipase-responsive nanocarrier-mediated dual drug delivery system to treat periodontitis in diabetic rats. Bioactive Mater. 2022;18:254-66. https://doi.org /10.1016/j.bioactmat.2022.02.008.
  14. Lou J, Mooney DJ. Chemical strategies to engineer hydrogels for cell culture. Nat Reviews Chem. 2022;6:726-44. https://doi.org/10.1038/s41570-022-0042 0-7.
  15. Ye B, Xiang R, Luo F. Hydrogel-Based drug delivery systems for diabetes bone defects. Chem Eng J. 2024;497:154436. https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154 436.
  16. Huang M, Huang Y, Liu H, Tang Z, Chen Y, Huang Z, Xu S, Du J, Jia B. Hydrogels for the treatment of oral and maxillofacial diseases: current research, challenges, and future directions. Biomater Sci. 2022;10:6413-46. https://doi.org/ 10.1039/d2bm01036d.
  17. Gan Z, Xiao Z, Zhang Z, Li Y, Liu C, Chen X, Liu Y, Wu D, Liu C, Shuai X, Cao Y. Stiffness-tuned and ROS-sensitive hydrogel incorporating complement C5a receptor antagonist modulates antibacterial activity of macrophages for periodontitis treatment. Bioact Mater. 2023;25:347-59. https://doi.org/10.101 6/j.bioactmat.2023.01.011.
  18. Wu Y, Wang Y, Long L, Hu C, Kong Q, Wang Y. A Spatiotemporal release platform based on ROS stimuli-responsive hydrogel in wound repairing. J Control Release. 2022;341:147-65. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2021.11.0 27.
  19. Zhang L, Bei Z, Li T, Qian Z. An injectable conductive hydrogel with dual responsive release of Rosmarinic acid improves cardiac function and promotes repair after myocardial infarction. Bioact Mater. 2023;29:132-50. https:/ /doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.07.007.
  20. Ming P, Liu Y, Yu P, Jiang X, Yuan L, Cai S, Rao P, Cai R, Lan X, Tao G, Xiao J. A biomimetic Se-nHA/PC composite microsphere with synergistic Immunomodulatory and osteogenic ability to activate bone regeneration in periodontitis. Small. 2024;20:e2305490. https://doi.org/10.1002/smll. 2023054 90.
  21. Bai X, Peng W, Tang Y, Wang Z, Guo J, Song F, Yang H, Huang C. An NIRpropelled janus nanomotor with enhanced ROS-scavenging, Immunomodulating and biofilm-eradicating capacity for periodontitis treatment. Bioact Mater. 2024;41:271-92. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.07.014.
  22. Peng S, Fu H, Li R, Li H, Wang S, Li B, Sun J. A new direction in periodontitis treatment: biomaterial-mediated macrophage immunotherapy. J Nanobiotechnol. 2024;22:359. https://doi.org/10.1186/s12951-024-02592-4.
  23. Liu X, Wan X, Sui B, Hu Q, Liu Z, Ding T, Zhao J, Chen Y, Wang ZL, Li L. Piezoelectric hydrogel for treatment of periodontitis through bioenergetic activation. Bioact Mater. 2024;35:346-61. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat. 2024.02.011.
  24. He Z, Liu Y, Zheng ZL, Lv JC, Liu SB, Zhang J, Liu HH, Xu JZ, Li ZM, Luo E. Periodic Lamellae-Based nanofibers for precise Immunomodulation to treat inflammatory bone loss in periodontitis. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303549. https://doi.org/10.1002/adhm.202303549.
  25. Cai G, Ren L, Yu J, Jiang S, Liu G, Wu S, Cheng B, Li W, Xia J. A Microenviron-ment-Responsive, controlled release hydrogel delivering Embelin to promote bone repair of periodontitis via Anti-Infection and Osteo-Immune modulation. Adv Sci. 2024;11:e202403786. https://doi.org/10.1002/advs.202403786.
  26. Yang S, Yin Y, Sun Y, Ai D, Xia X, Xu X, Song J. AZGP1 aggravates macrophage M1 polarization and pyroptosis in periodontitis. J Dent Res. 2024;103:631-41. https://doi.org/10.1177/00220345241235616.
  27. Li J, Wang Y, Tang M, Zhang C, Fei Y, Li M, Li M, Gui S, Guo J. New insights into nanotherapeutics for periodontitis: a triple concerto of antimicrobial activity, Immunomodulation and periodontium regeneration. J Nanobiotechnol. 2024;22:19. https://doi.org/10.1186/s12951-023-02261-y.
  28. Lei M, Wan H, Song J, Lu Y, Chang R, Wang H, Zhou H, Zhang X, Liu C, Qu X. Programmable Electro-Assembly of collagen: constructing porous Janus films with customized dual signals for Immunomodulation and tissue regeneration in periodontitis treatment. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2305756. https://d oi.org/10.1002/advs.202305756.
  29. Xie Y, Xiao S, Huang L, Guo J, Bai M, Gao Y, Zhou H, Qiu L, Cheng C, Han X. Cascade and ultrafast artificial antioxidases alleviate inflammation and bone resorption in periodontitis. ACS Nano. 2023;17:15097-112. https://doi.org/10. 1021/acsnano.3c04328.
  30. Xin X, Liu J, Liu X, Xin Y, Hou Y, Xiang X, Deng Y, Yang B, Yu W. MelatoninDerived carbon Dots with free radical scavenging property for effective periodontitis treatment via the Nrf2/HO-1 pathway. ACS Nano. 2024;18:8307-24. https://doi.org/10.1021/acsnano.3c12580.
  31. Yang GG, Zhou DJ, Pan ZY, Yang J, Zhang DY, Cao Q, Ji LN, Mao ZW. Multifunctional low-temperature photothermal nanodrug with in vivo clearance, ROSScavenging and anti-inflammatory abilities. Biomaterials. 2019;216:119280. ht tps://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119280.
  32. Yang SY, Hu Y, Zhao R, Zhou YN, Zhuang Y, Zhu Y, Ge XL, Lu TW, Lin KL, Xu YJ. Quercetin-loaded mesoporous nano-delivery system remodels osteoimmune microenvironment to regenerate alveolar bone in periodontitis via the miR-21a-5p/PDCD4/NF-kappaB pathway. J Nanobiotechnol. 2024;22:94. https ://doi.org/10.1186/s12951-024-02352-4.
  33. Wang Y, Li C, Wan Y, Qi M, Chen Q, Sun Y, Sun X, Fang J, Fu L, Xu L, et al. Quercetin-Loaded ceria nanocomposite potentiate Dual-Directional
    immunoregulation via macrophage polarization against periodontal inflammation. Small. 2021;17:e2101505. https://doi.org/10.1002/smll. 202101505.
  34. Zhu H, Cai C, Yu Y, Zhou Y, Yang S, Hu Y, Zhu Y, Zhou J, Zhao J, Ma H, et al. Quercetin-Loaded bioglass injectable hydrogel promotes m6A alteration of Per1 to alleviate oxidative stress for periodontal bone defects. Adv Sci (Weinh). 2024;11:e2403412. https://doi.org/10.1002/advs. 202403412.
  35. Li Y, Li J, Chang Y, Zhang J, Wang Z, Wang F, Lin Y, Sui L. Mitochondria-targeted drug delivery system based on tetrahedral framework nucleic acids for bone regeneration under oxidative stress. Chem Eng J. 2024;496:153723. https://do i.org/10.1016/j.cej.2024.153723.
  36. Gui S, Tang W, Huang Z, Wang X, Gui S, Gao X, Xiao D, Tao L, Jiang Z, Wang X. Ultrasmall coordination polymer nanodots Fe-Quer nanozymes for preventing and delaying the development and progression of diabetic retinopathy. Adv Funct Mater. 2023;33:2300261. https://doi.org/10.1002/adfm.202300261.
  37. Han Z, Gao X, Wang Y, Cheng S, Zhong X, Xu Y, Zhou X, Zhang Z, Liu Z, Cheng L. Ultrasmall iron-quercetin metal natural product nanocomplex with antioxidant and macrophage regulation in rheumatoid arthritis. Acta Pharm Sin B. 2023;13:1726-39. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.11.020.
  38. Xu Y, Luo Y, Weng Z, Xu H, Zhang W, Li Q, Liu H, Liu L, Wang Y, Liu X, et al. Microenvironment-Responsive Metal-Phenolic nanozyme release platform with antibacterial, ROS scavenging, and osteogenesis for periodontitis. ACS Nano. 2023;17:18732-46. https://doi.org/10.1021/acsnano.3c01940.
  39. Zhu S, Zhao B, Li M, Wang H, Zhu J, Li Q, Gao H, Feng Q, Cao X. Microenvironment responsive nanocomposite hydrogel with NIR photothermal therapy, vascularization and anti-inflammation for diabetic infected wound healing. Bioact Mater. 2023;26:306-20. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.00 5.
  40. Tian Y, Li Y, Liu J, Lin Y, Jiao J, Chen B, Wang W, Wu S, Li C. Photothermal therapy with regulated Nrf2/NF-kappaB signaling pathway for treating bacteria-induced periodontitis. Bioact Mater. 2022;9:428-45. https://doi.org/1 0.1016/j.bioactmat.2021.07.033.
  41. Boda SK, Fischer NG, Ye Z, Aparicio C. Dual oral tissue adhesive nanofiber membranes for pH -Responsive delivery of antimicrobial peptides. Biomacromolecules. 2020;21:4945-61. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01163.
  42. Qiao B, Wang J, Qiao L, Maleki A, Liang Y, Guo B. ROS-responsive hydrogels with Spatiotemporally sequential delivery of antibacterial and anti-inflammatory drugs for the repair of MRSA-infected wounds. Regenerative Biomaterials. 2023;11:rbad110. https://doi.org/10.1093/rb/rbad110.
  43. Luo Q, Yang Y, Ho C, Li Z, Chiu W, Li A, Dai Y, Li W, Zhang X. Dynamic hydrogel-metal-organic framework system promotes bone regeneration in periodontitis through controlled drug delivery. J Nanobiotechnol. 2024;22:287. https://d oi.org/10.1186/s12951-024-02555-9.
  44. Wu Y, Wang Y, Long L, Hu C, Kong Q, Wang Y. A Spatiotemporal release platform based on pH/ROS stimuli-responsive hydrogel in wound repairing. J Controlled Release. 2022;341:147-65. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2021.1 1.027.
  45. Qiao B, Wang J, Qiao L, Maleki A, Liang Y, Guo B. ROS-responsive hydrogels with Spatiotemporally sequential delivery of antibacterial and anti-inflammatory drugs for the repair of MRSA-infected wounds. Regenerative Biomaterials. 2024;11. https://doi.org/10.1093/rb/rbad110.
  46. Dong Z, Sun Y, Chen Y, Liu Y, Tang C, Qu X. Injectable adhesive hydrogel through a microcapsule Cross-Link for periodontitis treatment. ACS Appl Bio Mater. 2019;2:5985-94. https://doi.org/10.1021/acsabm.9b00912.
  47. Guo H, Huang S, Yang X, Wu J, Kirk TB, Xu J, Xu A, Xue W. Injectable and Self-Healing hydrogels with Double-Dynamic bond tunable mechanical, Gel-Sol transition and drug delivery properties for promoting periodontium regeneration in periodontitis. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13:61638-52. h ttps://doi.org/10.1021/acsami.1c18701.
  48. Zhang C, Yan R, Bai M, Sun Y, Han X, Cheng C, Ye L. Pt-Clusters-Equipped Antioxidase-Like biocatalysts as efficient ROS scavengers for treating periodontitis. Small. 2024;20:e2306966. https://doi.org/10.1002/smll. 202306966.
  49. Wang Y, Yuan Y, Wang R, Wang T, Guo F, Bian Y, Wang T, Ma Q, Yuan H, Du Y, et al. Injectable thermosensitive gel CH-BPNs-NBP for effective periodontitis treatment through ROS-Scavenging and jaw vascular unit protection. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2400533. https://doi.org/10.1002/adhm.202400533.
  50. Liu Y, Yan J, Chen L, Liao Y, Huang L, Tan J. Multifunctionalized and DualCrosslinked hydrogel promotes inflammation resolution and bone regeneration via NLRP3 Inhibition in periodontitis. Small Struct. 2024;5. https://doi.org /10.1002/sstr.202300281.
  51. Gong J, Wang S, Liu J, Zhang Y, Li J, Yang H, Liang K, Deng Y. In situ oxygengenerating bio-heterojunctions for enhanced anti-bacterial treatment of
    anaerobe-induced periodontitis. Chem Eng J. 2024;498. https://doi.org/10.10 16/j.cej.2024.155083.
  52. Xia P, Yu M, Yu M, Chen D, Yin J. Bacteria-responsive, Cell-recruitable, and osteoinductive nanocomposite microcarriers for intelligent bacteriostasis and accelerated tissue regeneration. Chem Eng J. 2023;465:142972. https://d oi.org/10.1016/j.cej.2023.142972.
  53. Thananukul K, Kaewsaneha C, Opaprakasit P, Lebaz N, Errachid A, Elaissari A. Smart gating porous particles as new carriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 2021;174:425-46. https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.04.023.
  54. Zhu B, Wu J, Li T, Liu S, Guo J, Yu Y, Qiu X, Zhao Y, Peng H, Zhang J, et al. A glutathione Peroxidase-Mimicking nanozyme precisely alleviates reactive oxygen species and promotes periodontal bone regeneration. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2302485. https://doi.org/10.1002/adhm. 202302485.
  55. Guo J, Xing Z, Liu L, Sun Y, Zhou H, Bai M, Liu X, Adeli M, Cheng C, Han X. Antioxidase-Like nanobiocatalysts with ultrafast and reversible RedoxCenters to secure stem cells and periodontal tissues. Adv Funct Mater. 2023;33:202211778. https://doi.org/10.1002/adfm. 202211778.
  56. Xu Z, Zhu Y, Xie M, Liu K, Cai L, Wang H, Li D, Chen H, Gao L. Mackinawite nanozymes as reactive oxygen species scavengers for acute kidney injury alleviation. J Nanobiotechnol. 2023;21:281. https://doi.org/10.1186/s12951-02 3-02034-7.
  57. Zhang Y, Zhang H, Zhao F, Jiang Z, Cui Y, Ou M, Mei L, Wang Q. Mitochondrialtargeted and ROS-responsive nanocarrier via nose-to-brain pathway for ischemic stroke treatment. Acta Pharm Sin B. 2023;13:5107-20. https://doi.or g/10.1016/j.apsb.2023.06.011.
  58. Hu S, Wang L, Li J, Li D, Zeng H, Chen T, Li L, Xiang X. Catechol-Modified and -Nanozyme-Reinforced hydrogel with improved antioxidant and antibacterial capacity for periodontitis treatment. ACS Biomater Sci Eng. 2023;9:5332-46. https://doi.org/10.1021/acsbiomaterials.3c00454.
  59. Tian M, Chen G, Xu J, Lin Y, Yi Z, Chen X, Li X, Chen S. Epigallocatechin gallatebased nanoparticles with reactive oxygen species scavenging property for effective chronic periodontitis treatment. Chem Eng J. 2022;433:132197. http s://doi.org/10.1016/j.cej.2021.132197.
  60. Liu X, Hou Y, Yang M, Xin X, Deng Y, Fu R, Xiang X, Cao N, Liu X, Yu W, et al. N-Acetyl-I-cysteine-Derived carbonized polymer Dots with ROS scavenging
    via Keap1-Nrf2 pathway regulate alveolar bone homeostasis in periodontitis. Adv Healthc Mater. 2023;12:e2300890. https://doi.org/10.1002/adhm. 202300 890.
  61. Yang G, Fan M, Zhu J, Ling C, Wu L, Zhang X, Zhang M, Li J, Yao Q, Gu Z, Cai . A multifunctional anti-inflammatory drug that can specifically target activated macrophages, massively deplete intracellular , and produce large amounts CO for a highly efficient treatment of osteoarthritis. Biomaterials. 2020;255:120155. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120155.
  62. Liu S, Wang W, Wu P, Chen Z, Pu W, Li L, Li G, Zhang J, Song J. PathogenesisGuided engineering of Multi-Bioactive hydrogel Co-Delivering InflammationResolving nanotherapy and Pro-Osteogenic protein for bone regeneration. Adv Funct Mater. 2023;33:2301523. https://doi.org/10.1002/adfm.202301523.
  63. Sun H, Xu J, Wang Y, Shen S, Xu X, Zhang L, Jiang Q. Bone microenvironment regulative hydrogels with ROS scavenging and prolonged oxygen-generating for enhancing bone repair. Bioact Mater. 2023;24:477-96. https://doi.org/ 10.1016/j.bioactmat.2022.12.021.
  64. Wang H, Zhang Y, Zhang Y, Li C, Zhang M, Wang J, Zhang Y, Du Y, Cui W, Chen W. Activating macrophage continual efferocytosis via microenvironment biomimetic short fibers for reversing inflammation in bone repair. Adv Mater. 2024;36:e2402968. https://doi.org/10.1002/adma.202402968.
  65. Bai L, Feng M, Li Q, Zhao Y, Zhang G, Cai Z, Xiao J, Lin Y. Curcumin delivery using tetrahedral framework nucleic acids enhances bone regeneration in osteoporotic rats. Chem Eng J. 2023;472:144978. https://doi.org/10.1016/j.cej. 2023.144978.
  66. Dos Santos DM, Moon JI, Kim DS, Bassous NJ, Marangon CA, CampanaFilho SP, Correa DS, Kang MH, Kim WJ, Shin SR. Hierarchical Chitin Nano-crystal-Based 3D printed dual-Layer membranes hydrogels: A dual drug delivery Nano-Platform for periodontal tissue regeneration. ACS Nano. 2024;18:24182-203. https://doi.org/10.1021/acsnano.4c05558.

Publisher’s note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
  1. *Correspondence:
    Rui Cai
    cairui@swmu.edu.cn
    Chunhui Li
    Ich10221022@163.com
    Gang Tao
    taogang@swmu.edu.cn
    Full list of author information is available at the end of the article