DOI: https://doi.org/10.3389/fncel.2026.1796397
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42058701
تاريخ النشر: 2026-04-14
المؤلف: Valentina Mazziotti وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في التأثيرات المختلفة للليبوبوليسكاريد (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والالتهاب العصبي اللاحق، متحدية الافتراض السائد بأن جميع أنواع LPS لها تأثيرات التهابية موحدة. تقارن الدراسة بين LPS الكلاسيكي من *Escherichia coli* و LPS من البكتيريا المتعايشة *Phocaeicola vulgatus* في خلايا الدبقية الصغيرة الفأرية (BV2) والبشرية (HMC3). باستخدام ELISA لقياس الوسائط الالتهابية و western blotting لتقييم إشارات TLR4، تكشف النتائج أن LPS من *P. vulgatus* لا يحفز إنتاج أكسيد النيتريك، أو تعبير iNOS، أو إفراز السيتوكينات الالتهابية في أي نوع من خلايا الدبقية الصغيرة، ولا ينشط مسار TLR4.
علاوة على ذلك، أثرت الوسائط المشروطة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بـ *E. coli* سلبًا على تعبير MAP2 في خلايا الأعصاب PC12، مما يشير إلى آثار سامة عصبية، بينما لم تظهر الوسائط من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بـ *P. vulgatus* مثل هذه الآثار. تشير هذه النتائج إلى أن الالتهاب العصبي الناتج عن LPS ليس استجابة عالمية، بل هو ظاهرة تتأثر بالخصائص الهيكلية المحددة لـ LPS. تؤكد الدراسة على أهمية مراعاة تنوع هيكل LPS في نماذج الالتهاب العصبي، خاصة فيما يتعلق بتفاعلات الأمعاء والدماغ.
مقدمة
تسلط مقدمة هذه الورقة البحثية الضوء على الدور الحاسم للخلايا الدبقية الصغيرة كحراس مناعيين في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، خاصة استجابةً للإشارات الالتهابية. تستخدم الخلايا الدبقية الصغيرة مستقبلات التعرف على الأنماط، مثل مستقبلات Toll-like 4 (TLR4)، لترجمة إشارات الخطر الخارجية إلى استجابات التهابية تؤثر على وظيفة الأعصاب وبقائها. لقد تم استخدام الليبوبوليسكاريد (LPS) من البكتيريا سالبة الجرام، وخاصة تلك المستمدة من *Escherichia coli* و *Salmonella*، بشكل واسع لنمذجة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والالتهاب العصبي. ومع ذلك، يتحدى المؤلفون الفكرة السائدة بأن جميع LPS هي مواد التهابية موحدة، مشيرين إلى أن LPS تظهر تنوعًا هيكليًا كبيرًا يؤثر على نشاطها المناعي.
تشير النتائج الحديثة إلى أن LPS من البكتيريا المتعايشة المقيمة في الأمعاء، مثل *Phocaeicola vulgatus*، قد لا تحفز نفس الاستجابات الالتهابية كما تفعل LPS الكلاسيكية من البكتيريا المعوية. يقدم المؤلفون أدلة على أن LPS من *P. vulgatus*، الذي يتميز بنقص الأسيل والفوسفات الأحادي، يؤدي إلى إنتاج ضئيل من السيتوكينات الالتهابية بينما يعزز إفراز IL-10 المضاد للالتهابات. تهدف هذه الدراسة إلى التحقيق في التأثيرات المختلفة لـ LPS المستمدة من البكتيريا المعوية مقابل تلك المستمدة من البكتيريا المتعايشة على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وصحة الأعصاب، كاشفة أن استجابات الخلايا الدبقية الصغيرة تعتمد على التركيب الكيميائي لـ LPS بدلاً من أن تكون خاصية متأصلة في هذه الجزيئات. تؤكد النتائج على الحاجة إلى إعادة النظر في استخدام LPS في نماذج الالتهاب العصبي، حيث يمكن أن تعدل كيمياء LPS الاستجابات المناعية في الجهاز العصبي المركزي بشكل كبير.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخراج الليبوبوليسكاريد (LPS) من *Prevotella vulgatus* باستخدام طريقة الفينول-الماء الساخن، تليها هضم إنزيمي باستخدام DNase و RNase وبروتينات لإزالة الملوثات. شمل عملية التنقية كروماتوغرافيا الفصل حسب الحجم والطرد المركزي الفائق، مع خطوات إضافية لإزالة الفوسفوليبيدات والملوثات البروتينية التي يمكن أن تنشط مستقبلات مثل TLR2، كما تم توضيحه سابقًا من قبل Di Lorenzo et al. (2020) و Pither et al. (2023).
استخدمت الدراسة عدة خطوط خلوية: خط خلايا الدبقية الصغيرة الفأرية BV2، وخط خلايا الدبقية الصغيرة البشرية HMC3، وخط خلايا الكروموسيتوما الفأرية (PC12). تم زراعة BV2 و HMC3 في وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM) معزز بمصل العجل الجنيني، و L-glutamine، و البنسلين/ستربتوميسين، بينما تم الحفاظ على خلايا PC12 في وسط RPMI-1640 مع مصل الخيل ومصل العجل الجنيني. من أجل التمايز العصبي، تم معالجة خلايا PC12 بعامل نمو الأعصاب (NGF) في وسط RPMI المعدل. تم الحفاظ على جميع خطوط الخلايا في بيئة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ لضمان ظروف نمو مثالية.
النتائج
تشير النتائج إلى أن الليبوبوليسكاريدات (LPS) المستمدة من *P. vulgatus* لا تستحث الاستجابات الالتهابية الكلاسيكية لأكسيد النيتريك (NO) و إنزيم أكسيد النيتريك المحفز (iNOS) في خلايا BV2 الدبقية الصغيرة، مما يتناقض بشكل حاد مع تأثيرات LPS من *E. coli*. في سلسلة من التجارب، تعرضت خلايا BV2 لتركيزات متفاوتة (0.1، 1، 10، أو 100 نانوغرام/مل) من كلا نوعي LPS. بينما تسبب LPS من *E. coli* عند 100 نانوغرام/مل في انخفاض معنوي في حيوية الخلايا (p < 0.05)، لم يؤثر LPS من *P. vulgatus* على حيوية الخلايا عبر جميع التركيزات. أظهرت تحليل المناعة الفلورية عدم وجود تغييرات شكلية كبيرة أو انخفاض في عدد الخلايا لأي من المعالجات، على الرغم من أنه تم ملاحظة انخفاض طفيف في عدد خلايا BV2 مع LPS من *E. coli*. كشفت التقييمات الإضافية أن LPS من *E. coli* زاد بشكل كبير من تراكم النيتريت، مما يشير إلى إنتاج قوي لأكسيد النيتريك، ورفع بشكل ملحوظ من تعبير iNOS. على النقيض من ذلك، لم يحفز LPS من *P. vulgatus* أي زيادة قابلة للاكتشاف في مستويات النيتريت أو تعبير iNOS، مما يشير إلى أنه لا ينشط مسار NO-iNOS. تشير هذه النتائج إلى أن LPS من *P. vulgatus* قد يعزز حالة غير التهابية تشبه التسامح في خلايا BV2 الدبقية الصغيرة، بدلاً من التنشيط الكلاسيكي المرتبط بـ LPS من البكتيريا المعوية، كما تدعمه الدراسات السابقة (Qin et al., 2016; Chavero Vargas et al., 2025).
المناقشة
تسلط قسم المناقشة في الدراسة الضوء على الاستجابات المختلفة للخلايا الدبقية الصغيرة تجاه الليبوبوليسكاريدات (LPS) المستمدة من *Escherichia coli* و *Prevotella vulgatus*. تظهر الأبحاث أنه بينما ينشط LPS من *E. coli* بشكل قوي المسارات الالتهابية وإنتاج السيتوكينات في كل من نماذج الخلايا الدبقية الصغيرة الفأرية BV2 والبشرية HMC3، فإن LPS من *P. vulgatus* يفشل في استحثاث استجابة مماثلة. على وجه التحديد، أدى LPS من *E. coli* إلى زيادات كبيرة في السيتوكينات الالتهابية (IL-1β، IL-6، TNF-α) ونشط المسارات الإشارية الرئيسية مثل STAT3 و NF-κB و ERK1/2، بينما أدى LPS من *P. vulgatus* إلى إفراز ضئيل من السيتوكينات وانخفاض في فسفرة هذه الوسائط الإشارية. يشير هذا إلى أن الخصائص الهيكلية لـ LPS من *P. vulgatus*، بما في ذلك نقص الأسيل والفوسفات الأحادي في الدهون A، قد تحد من قدرتها على تنشيط المسارات الإشارية المعتمدة على TLR4.
علاوة على ذلك، تشير الدراسة إلى أن الوسائط المشروطة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بـ LPS من *E. coli* قد أضرت بشكل كبير بسلامة الأعصاب في خلايا PC12 المتمايزة، كما يتضح من انخفاض تعبير MAP2. على النقيض من ذلك، لم تؤثر الوسائط المشروطة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة بـ LPS من *P. vulgatus* سلبًا على صحة الأعصاب، مما يعزز الفكرة القائلة بأن ليس كل جزيئات LPS تعمل كمنبهات التهابية. تشير النتائج إلى أن LPS من *P. vulgatus* يتم التعرف عليه من قبل الجهاز المناعي في سياق غير التهابي، كما يتضح من وجود الأجسام المضادة IgG المضادة لـ LPS في الأفراد الأصحاء. تؤكد هذه الأبحاث على أهمية مراعاة التنوع الهيكلي للإشارات الميكروبية في فهم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وآثاره على الالتهاب العصبي وصحة الأعصاب.
DOI: https://doi.org/10.3389/fncel.2026.1796397
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42058701
Publication Date: 2026-04-14
Author(s): Valentina Mazziotti et al.
Primary Topic: Neuroinflammation and Neurodegeneration Mechanisms
Overview
This research investigates the differential effects of lipopolysaccharides (LPSs) from Gram-negative bacteria on microglial activation and subsequent neuroinflammation, challenging the prevailing assumption that all LPS chemotypes are uniformly pro-inflammatory. The study compares the canonical LPS from *Escherichia coli* with that from the commensal bacterium *Phocaeicola vulgatus* in murine (BV2) and human (HMC3) microglial cells. Using ELISA to quantify pro-inflammatory mediators and western blotting to assess TLR4 signaling, the findings reveal that *P. vulgatus* LPS does not induce nitric oxide production, iNOS expression, or pro-inflammatory cytokine release in either microglial cell type, nor does it activate the TLR4 pathway.
Moreover, conditioned media from *E. coli*-treated microglia negatively impacted MAP2 expression in PC12 neuronal cells, indicating neurotoxic effects, while media from *P. vulgatus*-treated microglia did not exhibit such effects. These results suggest that LPS-induced neuroinflammation is not a universal response but rather a phenomenon influenced by the specific structural characteristics of LPS. The study underscores the importance of considering LPS structural diversity in models of neuroinflammation, particularly regarding gut-brain interactions.
Introduction
The introduction of this research paper highlights the critical role of microglia as immune sentinels in the central nervous system (CNS), particularly in response to inflammatory signals. Microglia utilize pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptor 4 (TLR4), to translate extracellular danger signals into inflammatory responses that affect neuronal function and survival. Lipopolysaccharides (LPSs) from Gram-negative bacteria, especially those derived from Escherichia coli and Salmonella, have been extensively used to model microglial activation and neuroinflammation. However, the authors challenge the prevailing notion that all LPSs are uniformly pro-inflammatory, noting that LPSs exhibit significant structural diversity that influences their immunological activity.
Recent findings suggest that LPSs from gut-resident commensal bacteria, such as Phocaeicola vulgatus, may not induce the same pro-inflammatory responses as classical enterobacterial LPSs. The authors present evidence that P. vulgatus LPS, characterized by hypoacylation and monophosphorylation, leads to minimal pro-inflammatory cytokine production while promoting anti-inflammatory IL-10 release. This study aims to investigate the differential effects of enterobacterial versus commensal-derived LPS on microglial activation and neuronal health, revealing that microglial responses are contingent upon the chemical structure of LPSs rather than being an inherent property of these molecules. The findings underscore the need to reconsider the use of LPS in neuroinflammation models, as the chemistry of LPS can significantly modulate immune responses in the CNS.
Methods
In this study, lipopolysaccharide (LPS) from *Prevotella vulgatus* was extracted using the hot phenol-water method, followed by enzymatic digestion with DNase, RNase, and proteases to eliminate contaminants. The purification process included size-exclusion chromatography and ultracentrifugation, with additional steps to remove phospholipids and lipoprotein contaminants that could activate receptors such as TLR2, as previously detailed by Di Lorenzo et al. (2020) and Pither et al. (2023).
The research utilized several cell lines: the murine BV2 microglial cell line, the human microglial clone-3 (HMC3), and the rat pheochromocytoma cell line (PC12). BV2 and HMC3 were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with fetal bovine serum, L-glutamine, and penicillin/streptomycin, while PC12 cells were maintained in RPMI-1640 medium with horse serum and fetal bovine serum. For neuronal differentiation, PC12 cells were treated with nerve growth factor (NGF) in a modified RPMI medium. All cell lines were kept in a humidified environment at 37°C with 5% CO₂ to ensure optimal growth conditions.
Results
The results indicate that lipopolysaccharides (LPS) derived from *P. vulgatus* do not elicit the classical nitric oxide (NO) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) inflammatory responses in BV2 microglia, contrasting sharply with the effects of *E. coli* LPS. In a series of experiments, BV2 cells were exposed to varying concentrations (0.1, 1, 10, or 100 ng/mL) of both LPS types. While *E. coli* LPS at 100 ng/mL caused a statistically significant reduction in cell viability (p < 0.05), *P. vulgatus* LPS did not affect cell viability across all concentrations. Immunofluorescence analysis showed no significant morphological changes or reductions in cell number for either treatment, although a slight decrease in BV2 cell number was noted with *E. coli* LPS. Further assessments revealed that *E. coli* LPS significantly increased nitrite accumulation, indicating robust NO production, and markedly elevated iNOS expression. In stark contrast, *P. vulgatus* LPS did not induce any detectable increase in nitrite levels or iNOS expression, suggesting that it does not activate the NO-iNOS pathway. These findings imply that *P. vulgatus* LPS may promote a non-inflammatory, tolerance-like state in BV2 microglia, rather than the classical activation associated with enterobacterial LPS, as supported by previous studies (Qin et al., 2016; Chavero Vargas et al., 2025).
Discussion
The discussion section of the study highlights the differential responses of microglia to lipopolysaccharides (LPS) derived from *Escherichia coli* and *Prevotella vulgatus*. The research demonstrates that while *E. coli* LPS robustly activates inflammatory pathways and cytokine production in both murine BV2 and human HMC3 microglial models, *P. vulgatus* LPS fails to elicit a similar response. Specifically, *E. coli* LPS induced significant increases in pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) and activated key signaling pathways such as STAT3, NF-κB, and ERK1/2, whereas *P. vulgatus* LPS resulted in minimal cytokine release and reduced phosphorylation of these signaling mediators. This suggests that the structural characteristics of *P. vulgatus* LPS, including its hypoacylated and monophosphorylated lipid A, may limit its capacity to activate TLR4-dependent signaling pathways.
Furthermore, the study indicates that conditioned media from *E. coli* LPS-treated microglia significantly impaired neuronal integrity in differentiated PC12 cells, as evidenced by decreased MAP2 expression. In contrast, conditioned media from *P. vulgatus* LPS-treated microglia did not adversely affect neuronal health, reinforcing the notion that not all LPS molecules act as pro-inflammatory stimuli. The findings suggest that *P. vulgatus* LPS is recognized by the immune system in a non-inflammatory context, as indicated by the presence of circulating anti-LPS IgG antibodies in healthy individuals. This research underscores the importance of considering the structural diversity of microbial signals in understanding microglial activation and its implications for neuroinflammation and neuronal health.