DOI: https://doi.org/10.1007/s00436-025-08499-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40343526
تاريخ النشر: 2025-05-01
المؤلف: Phawiya Suksomboon وآخرون
الموضوع الرئيسي: عدوى الديدان الطفيلية والسيطرة عليها
نظرة عامة
تبحث الدراسة في تطوير شظية متغيرة ذات سلسلة واحدة (scFv) من الأجسام المضادة تستهدف كاتيبسين L1H من *Fasciola gigantica* (FgCathL1H)، وهو مستضد حاسم لتشخيص الفاسيولوز، وهو مرض حيواني المنشأ يؤثر على البشر والماشية. نجحت الدراسة في بناء وإنتاج أجسام مضادة scFv المؤتلفة المشتقة من خلايا الطحال الفأرية في *Escherichia coli* HB2151. تم تضخيم شظايا السلسلة الثقيلة (VH) والخفيفة (VL) المحددة، واستنساخها في ناقل فاجيميد (pCANTAB5E)، وتحويلها إلى *E. coli* TG1. بعد الإصابة بفاج المساعد M13KO7، تم اختيار نسخ scFv عالية الألفة من خلال البيو-بانينغ. تم التعبير عن بروتينات scFv الناتجة وتوصيفها، حيث أشارت نتائج ELISA إلى ارتباط قوي بـ FgCathL1H وأكدت التخصص من خلال تحليلات SDS-PAGE و western blot.
تخلص الدراسة إلى أن هذه هي أول عملية استنساخ وإنتاج ناجحة لشظايا الأجسام المضادة التي تستهدف FgCathL1H، مما يوضح إمكانيات scFv anti-rFgCathL1H في تشخيص الفاسيولوز. أسفرت الجولة الثالثة من البيو-بانينغ عن 86 نسخة ذات ألفة ارتباط معقولة، مع 10 نسخ تظهر قدرات ارتباط ملحوظة. ومن الجدير بالذكر أن scFv لم يظهر أي تفاعل عرضي مع الأنواع غير المستهدفة، مما يبرز تخصصه، وتمت ملاحظة زيادات كبيرة في الارتباط مقارنة بالضوابط السلبية (p < 0.05). تمهد هذه العمل الطريق لتطوير مجموعة تشخيصية للفاسيولوز بناءً على الأجسام المضادة scFv المحددة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث الفاسيولوز، وهو عدوى طفيلية تسببها ديدان مسطحة من نوع التريماتود، وخاصة *Fasciola hepatica* و *Fasciola gigantica*، والتي تؤثر بشكل كبير على صحة الإنسان وصناعات الماشية في جميع أنحاء العالم. تحدث العدوى من خلال استهلاك الميتاسيركاريا من مصادر ملوثة، مما يؤدي إلى تطور الديدان البالغة في الكبد. يرتبط المرض بخسائر اقتصادية كبيرة في إنتاج الماشية ويشكل مخاطر صحية على البشر. يلعب مستضد رئيسي، كاتيبسين L1H (CathL1H)، الذي تفرزه *F. gigantica*، دورًا حاسمًا في تفاعل الطفيل مع المضيف، مما يسهل غزو الأنسجة وتجنب المناعة.
تؤكد الورقة على قيود طرق إنتاج الأجسام المضادة الأحادية النسيلة التقليدية (MoAb)، مثل تقنية الهجينة، التي يمكن أن تكون مكلفة وغير متسقة. لمعالجة هذه التحديات، تقترح الدراسة استخدام تقنية عرض الفاج لتطوير أجسام مضادة أحادية النسيلة مؤتلفة (rMoAbs) ضد rFgCathL1H. تسمح هذه الطريقة بإنشاء شظايا متغيرة ذات سلسلة واحدة (scFv) تكون أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة، مع تطبيقات في التشخيص والبحث العلاجي. تهدف الدراسة إلى إنشاء مكتبة من أجسام مضادة scFv الفأرية المحددة لـ rFgCathL1H، مما قد يؤدي إلى تطوير أدوات تشخيصية محسنة للفاسيولوز، مستفيدة من مزايا تقنية الأجسام المضادة المؤتلفة.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج المستخلصة من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث أسفرت الاختبارات الإحصائية عن قيم p أقل من العتبة التقليدية 0.05، مما يشير إلى وجود دليل قوي ضد الفرضية الصفرية.
بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق أدى إلى تحسينات قابلة للقياس في المتغير التابع، مع حساب أحجام التأثير لت quantifying حجم هذه التغييرات. توضح التمثيلات الرسومية، مثل المخططات والرسوم البيانية، الاتجاهات الملحوظة، مما يعزز قوة النتائج. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة حول سؤال البحث، داعمة الفرضية وتوفير أساس للدراسات المستقبلية.
المناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجية المستخدمة في التعبير عن وتنقية كاتيبسين L1H المؤتلف (rFgCathL1H) من *Fasciola gigantica*، وتحصين الفئران لتوليد أجسام مضادة محددة، وبناء شظية متغيرة ذات سلسلة واحدة (scFv) ضد rFgCathL1H. تم التعبير عن rFgCathL1H في *E. coli* وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا الارتباط مع حمض النيتريلوترياسيتيك (Ni-NTA). بعد تحصين فئران BALB/c بـ rFgCathL1H مع مواد مساعدة من فريوند، تم استخراج RNA الكلي من الطحال، وتم تضخيم جينات المنطقة المتغيرة (VH و VL) عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم بناء جين scFv من خلال تجميع هذه المناطق المتغيرة وربطها في ناقل فاجيميد (pCANTAB5E)، الذي تم تحويله لاحقًا إلى *E. coli* لبناء المكتبة.
تم استخدام عملية البيو-بانينغ لاختيار نسخ scFv التي ترتبط بشكل محدد بـ rFgCathL1H، مما أدى إلى تحديد 96 نسخة إيجابية بعد ثلاث جولات من الاختيار. تم تأكيد نشاط الارتباط لهذه النسخ باستخدام ELISA غير المباشرة، وتم تسلسل النسخة الأكثر وعدًا (1B) لتحليل مناطق تحديد التكامل (CDRs) والتنبؤ بهيكلها ثلاثي الأبعاد. وجدت الدراسة أن scFv أظهر ألفة ارتباط كبيرة لـ rFgCathL1H، مع طاقة ارتباط حرة متوقعة تبلغ -13.8 kcal/mol وثابت تفكك قدره 7.5e-11 M، مما يشير إلى إمكانيته في التطبيقات التشخيصية أو العلاجية ضد *F. gigantica*.
DOI: https://doi.org/10.1007/s00436-025-08499-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40343526
Publication Date: 2025-05-01
Author(s): Phawiya Suksomboon et al.
Primary Topic: Helminth infection and control
Overview
The research investigates the development of a single-chain variable fragment (scFv) antibody targeting Fasciola gigantica cathepsin L1H (FgCathL1H), a critical antigen for diagnosing fasciolosis, a zoonotic disease affecting humans and cattle. The study successfully constructed and expressed recombinant scFv antibodies derived from mouse spleen cells in *Escherichia coli* HB2151. The specific variable heavy (VH) and light (VL) chain fragments were amplified, cloned into a phagemid vector (pCANTAB5E), and transformed into *E. coli* TG1. Following infection with the M13KO7 helper phage, high-affinity scFv clones were selected through bio-panning. The resulting scFv proteins were expressed and characterized, with ELISA results indicating strong binding to FgCathL1H and confirming specificity through SDS-PAGE and western blot analyses.
The study concludes that this is the first successful cloning and expression of antibody fragments targeting FgCathL1H, demonstrating the potential of the scFv anti-rFgCathL1H for diagnosing fasciolosis. The third round of bio-panning yielded 86 clones with reasonable binding affinity, with 10 clones showing significant binding capabilities. Notably, the scFv exhibited no cross-reactivity with non-target species, underscoring its specificity, and significant increases in binding were observed compared to negative controls (p < 0.05). This work lays the groundwork for developing a diagnostic kit for fasciolosis based on the identified scFv antibodies.
Introduction
The introduction of the research paper discusses fasciolosis, a parasitic infection caused by trematode flatworms, notably *Fasciola hepatica* and *Fasciola gigantica*, which significantly impacts both human health and livestock industries worldwide. The infection occurs through the consumption of metacercariae from contaminated sources, leading to the development of adult flukes in the liver. The disease is associated with substantial economic losses in livestock production and poses health risks to humans. A key antigen, cathepsin L1H (CathL1H), secreted by *F. gigantica*, plays a crucial role in the parasite’s interaction with the host, facilitating tissue invasion and immune evasion.
The paper emphasizes the limitations of traditional monoclonal antibody (MoAb) production methods, such as the hybridoma technique, which can be costly and inconsistent. To address these challenges, the study proposes the use of phage display technology for the development of recombinant monoclonal antibodies (rMoAbs) against rFgCathL1H. This approach allows for the generation of single-chain variable fragments (scFv) that are more efficient and cost-effective, with applications in diagnostics and therapeutic research. The study aims to create a library of mouse scFv antibodies specific to rFgCathL1H, which could lead to the development of improved diagnostic tools for fasciolosis, leveraging the advantages of recombinant antibody technology.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicates a significant correlation between the variables under investigation, with statistical tests yielding p-values below the conventional threshold of 0.05, suggesting strong evidence against the null hypothesis.
Additionally, the results demonstrate that the intervention applied led to measurable improvements in the dependent variable, with effect sizes calculated to quantify the magnitude of these changes. Graphical representations, such as plots and charts, further illustrate the trends observed, reinforcing the robustness of the findings. Overall, the results contribute valuable insights into the research question, supporting the hypothesis and providing a foundation for future studies.
Discussion
In this section, the authors detail the methodology for expressing and purifying the recombinant cathepsin L1H (rFgCathL1H) from *Fasciola gigantica*, immunizing mice to generate specific antibodies, and constructing a single-chain variable fragment (scFv) antibody against rFgCathL1H. The rFgCathL1H was expressed in *E. coli* and purified using nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) affinity chromatography. Following immunization of BALB/c mice with rFgCathL1H combined with Freund’s adjuvants, total RNA was extracted from the spleen, and variable region genes (VH and VL) were amplified via polymerase chain reaction (PCR). The scFv gene was constructed by assembling these variable regions and ligating them into a phagemid vector (pCANTAB5E), which was subsequently transformed into *E. coli* for library construction.
The bio-panning process was employed to select scFv clones that specifically bind to rFgCathL1H, resulting in the identification of 96 positive clones after three rounds of selection. The binding activity of these clones was confirmed using indirect ELISA, and the most promising clone (1B) was sequenced to analyze its complementarity-determining regions (CDRs) and predict its 3D structure. The study found that the scFv exhibited a significant binding affinity for rFgCathL1H, with a predicted binding free energy of -13.8 kcal/mol and a dissociation constant of 7.5e-11 M, indicating its potential utility in diagnostic or therapeutic applications against *F. gigantica*.