DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-025-09041-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40399669
تاريخ النشر: 2025-05-21
المؤلف: Michael Scherer وآخرون
الموضوع الرئيسي: علم النسخ الجيني أحادي الخلية والمكاني
نظرة عامة
في هذا القسم، يتناول المؤلفون قيود الطرق الحالية لتتبع مستنسخات الخلايا الجذعية أثناء التمايز، والتي غالبًا ما تتطلب تعديلات جينية أو تعتمد على متغيرات الحمض النووي الجسدية النادرة. يقدمون نهجًا جديدًا يستفيد من أنماط ميثلة الحمض النووي في مواقع CpG محددة، حيث تعكس مجموعة واحدة التمايز الخلوي وتخضع أخرى لتغيرات عشوائية في الميثيل، مما يعمل كرموز رقمية لهوية المستنسخات. يقدم المؤلفون EPI-Clone، وهي طريقة لتتبع السلالة بدون نقل الجينات تسمح بالتوصيف المستهدف للخلايا الفردية لميثلة الحمض النووي بدقة CpG واحدة.
يتم تطبيق EPI-Clone لدراسة تكوين الدم في نماذج الفئران والبشر، حيث يتم التقاط مسارات التمايز المستنسخة الواسعة عبر مجموعة بيانات كبيرة تضم 230,358 خلية فردية. تكشف النتائج أنه في شيخوخة الفئران، يتم حصر التحيز النخاعي وانخفاض الناتج من خلايا الدم الجذعية الناضجة في عدد محدود من المستنسخات المتوسعة، بينما تستمر العديد من المستنسخات التي تظهر خصائص وظيفية شابة. في شيخوخة البشر، تحدد الدراسة طيفًا من التوسعات المستنسخة المرتبطة بالعمر، بما في ذلك المستنسخات التي تحتوي على طفرات معروفة وأخرى بدونها، والتي تظهر تحيزات سلالة مشابهة. بشكل عام، يمثل EPI-Clone تقدمًا كبيرًا في تتبع سلالة الخلايا الفردية، مما يسهل فهمًا أعمق لديناميات حالة خلايا الدم عبر أعمار مختلفة.
طرق
في هذه الدراسة، تم إجراء سلسلة من التجارب للتحقيق في الديناميات الخلوية باستخدام نظام ترميز الفيروسات القهقرية LARRY وتسلسل ميثلة الحمض النووي المستهدف للخلايا الفردية (scTAM-seq). تضمنت تجارب الفئران بناء متجهات ترميز LARRY، وإنتاج الفيروسات القهقرية، ثم نقل الخلايا الجذعية المجمعة من الفئران. تم زرع هذه الخلايا، وتم توصيف مختلف المكونات الخلوية بعد 5-10 أشهر باستخدام scTAM-seq، الذي يستخدم إنزيم تقييد حساس للميثيل، HhaI، لتضخيم ثنائيات النوكليوتيد الميثيلة بشكل انتقائي. سمح البروتوكول أيضًا بالتحليل المتزامن للمعلومات الجينية وتعبير المستضد السطحي من خلال الأجسام المضادة المشفرة بواسطة أوليغونوكليوتيد.
بالنسبة للدراسة البشرية، تم تحليل عينات نخاع العظام الأولية باستخدام نفس منهجية scTAM-seq. شمل تحليل البيانات تعريف حالات الخلايا وتحديد المستنسخات من خلال خوارزمية EPI-Clone، التي تركز على CpGs الثابتة دون ارتباط بمستضد سطحي. التزمت الدراسة باللوائح الأخلاقية والإرشادات لاستخدام الحيوانات، حيث تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ولجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية. تم الحفاظ على الفئران المستخدمة في التجارب تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وتم تنفيذ القتل الرحيم وفقًا للممارسات الإنسانية. تتوفر بروتوكولات مفصلة لـ scTAM-seq والتحليلات المعلوماتية لمزيد من المرجع.
مناقشة
في هذا القسم، يقدم المؤلفون تحليلًا شاملاً لأنماط ميثلة الحمض النووي في تكوين الدم باستخدام تحليل مستهدف للخلايا الفردية للميثيلوم (scTAM-seq) عبر إعدادات تجريبية مختلفة في كل من الفئران والبشر. قاموا بإنشاء خريطة ميثلة الحمض النووي مفصلة تدمج هوية المستنسخات وحالات التمايز لخلايا الدم الجذعية والخلايا السلفية (HSPCs) من خلال توصيف 453 CpG ميثلة بشكل مختلف وتعبير 20 بروتين سطحي. كشفت دمج البيانات من تجارب متعددة عن أربع مسارات تمايز رئيسية، مما يبرز الطبيعة الديناميكية لميثلة الحمض النووي فيما يتعلق بعوامل النسخ الخاصة بالسلالة. تقدم الدراسة أيضًا خوارزمية EPI-Clone، التي تستخدم CpGs الثابتة لتحديد المستنسخات المتوسعة، مما يوضح فعاليتها في تمييز هوية المستنسخات وحالات التمايز في كل من أنظمة تكوين الدم للفئران والبشر.
تشير النتائج إلى أن ميثلة الحمض النووي ترمز لكل من هوية المستنسخات وحالة التمايز، مع مجموعات متميزة من CpGs المرتبطة بكل منها. نجح EPI-Clone في تحديد المستنسخات المتوسعة في الفئران المسنّة، كاشفًا عن فقدان التعقيد المستنسخ وزيادة في المستنسخات المتوسعة من خلايا الدم الجذعية ذات القدرة المنخفضة على الزرع. يعكس هذا النمط الملاحظات في شيخوخة البشر، حيث وُجد أن التوسعات المستنسخة، وخاصة تلك المرتبطة بتكوين الدم المستنسخ (CH)، تتراكم مع تقدم العمر. يخلص المؤلفون إلى أن EPI-Clone هو أداة قوية لتتبع الديناميات المستنسخة في تكوين الدم، مما يوفر رؤى حول العلاقة بين التوسعات المستنسخة والشيخوخة في كل من الفئران والبشر.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-025-09041-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40399669
Publication Date: 2025-05-21
Author(s): Michael Scherer et al.
Primary Topic: Single-cell and spatial transcriptomics
Overview
In this section, the authors address the limitations of current methods for tracking stem cell clones during differentiation, which often require genetic modifications or depend on sparse somatic DNA variants. They present a novel approach that leverages DNA methylation patterns at specific CpG sites, where one subset reflects cellular differentiation and another undergoes stochastic epimutations, serving as digital barcodes for clonal identity. The authors introduce EPI-Clone, a method for transgene-free lineage tracing that allows for targeted single-cell profiling of DNA methylation at single-CpG resolution.
EPI-Clone is applied to study haematopoiesis in both mouse and human models, capturing extensive clonal differentiation trajectories across a large dataset of 230,358 single cells. The findings reveal that in mouse ageing, myeloid bias and reduced output from aged haematopoietic stem cells are confined to a limited number of expanded clones, while many clones exhibiting functionally young characteristics persist. In human ageing, the study identifies a spectrum of age-related clonal expansions, including clones with and without known driver mutations of clonal haematopoiesis, which exhibit similar lineage biases. Overall, EPI-Clone represents a significant advancement in single-cell lineage tracing, facilitating a deeper understanding of hematopoietic cell state dynamics across different ages.
Methods
In this study, a series of experiments were conducted to investigate cellular dynamics using the LARRY lentiviral barcoding system and single-cell targeted DNA methylation sequencing (scTAM-seq). The mouse experiments involved the construction of LARRY barcoding vectors, production of lentiviruses, and subsequent transduction of stem cells collected from mice. These cells were transplanted, and various cellular compartments were profiled 5-10 months later using scTAM-seq, which employs a methylation-sensitive restriction enzyme, HhaI, to selectively amplify methylated CpG dinucleotides. The protocol also allowed for the simultaneous analysis of genetic information and surface-antigen expression through oligonucleotide-barcoded antibodies.
For the human study, primary bone marrow samples were analyzed using the same scTAM-seq methodology. Data analysis involved defining cell states and identifying clones through the EPI-Clone algorithm, which focuses on static CpGs without surface-antigen association. The study adhered to ethical regulations and guidelines for animal use, with all procedures approved by the Institutional Review Board and the Institutional Animal Care and Use Committee. Mice used in the experiments were maintained under specific-pathogen-free conditions, and euthanasia was performed following humane practices. Detailed protocols for scTAM-seq and bioinformatic analyses are available for further reference.
Discussion
In this section, the authors present a comprehensive analysis of DNA methylation patterns in hematopoiesis using single-cell targeted analysis of the methylome (scTAM-seq) across various experimental settings in both mice and humans. They established a detailed DNA methylation map that integrates clonal identity and differentiation states of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) by profiling 453 differentially methylated CpGs and the expression of 20 surface proteins. The integration of data from multiple experiments revealed four main differentiation trajectories, highlighting the dynamic nature of DNA methylation in relation to lineage-specific transcription factors. The study also introduces the EPI-Clone algorithm, which utilizes static CpGs to identify expanded clones, demonstrating its effectiveness in distinguishing clonal identity and differentiation states in both mouse and human hematopoietic systems.
The findings indicate that DNA methylation encodes both clonal identity and differentiation state, with distinct sets of CpGs associated with each. EPI-Clone successfully identified expanded clones in aged mice, revealing a loss of clonal complexity and an increase in HSC-expanded clones with low engraftment capacity. This pattern mirrors observations in human aging, where clonal expansions, particularly those associated with clonal hematopoiesis (CH), were found to accumulate with age. The authors conclude that EPI-Clone is a powerful tool for tracing clonal dynamics in hematopoiesis, providing insights into the relationship between clonal expansions and aging in both mice and humans.