تتجمع الخلايا الدبقية الصغيرة عند حدود القشرة الجنينية حيث تحافظ على سلامة الأنسجة في سياق القيود الشكلية. تمنع هذه الخلايا المناعية تكوين الآفات التجويفية وتساهم في إصلاحها السريع، مما يبرز الوظائف الوقائية خلال مراحل تطوير الدماغ المبكرة.
تحتفظ الخلايا الدبقية الصغيرة بالسلامة الهيكلية خلال تشكل دماغ الجنين
أكيندي رينيه لورانس،أليس كانزي،سيسيل بريدلانسنيكولا أوليفييه،كلير لانسونوركلاريسا كاتاللارا بيزاميليوبنوئيت كلوكينرأيمريك سيلفين،ديفيد أ. د. مونرو،أوريليان فورتولدافيد بويدو،فريال زهانييوغ كارتونيتسارة فيجييه،جيوم أولير،باولا سكوارزوني،أدريان كانداتجولي هيلفتسيسيل أليهفرانسواز واترانجان-برنار مانانبيير باولتيدينيس ثيفري لورا كانتيني، كلير بريدانزجوزيف بريllerأنتوانيت جيلوت، باولو جاكوبيني، لويزا تشوبانوفلوران جينهouxمorgane سونيا تيون،لودميلا لوكمان وسونيا جاريل معهد البيولوجيا في المدرسة العليا (IBENS)، المدرسة العليا، CNRS، INSERM، جامعة PSL، فريق تطوير الدماغ والمرونة، 75005 باريس، فرنسامركز البحث بين التخصصات في البيولوجيا (CIRB)، كلية فرنسا، CNRS، INSERM، جامعة PSL، باريس، فرنساجامعة السوربون، الكلية الدكتوراه، 75005 باريس، فرنسامعهد البيولوجيا في المدرسة العليا (IBENS)، المدرسة العليا، CNRS، INSERM، جامعة PSL، فريق البيولوجيا النظامية الحاسوبية، 75005 باريس، فرنسامعهد البيولوجيا في المدرسة العليا (IBENS)، المدرسة العليا، CNRS، INSERM، جامعة PSL، فريق مستقبلات الغلوتامات والاشتباكات المثيرة، 75005 باريس، فرنساحرم غاستاف روسي للسرطان، INSERM، فريق تطوير الخلايا النخاعية، 94800 فيليجويف، فرنسامعهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة بجامعة إدنبرة، مركز علوم الدماغ السريرية، جامعة إدنبرة، إدنبرة، المملكة المتحدةإنميد، إنسيرم، جامعة إكس-مارسيليا، مركز تورينغ للأنظمة الحية، مارسيليا، فرنسانيووروسبين، مركز الأبحاث الفرنسي، جامعة باريس-ساكلاي، غيف-sur-يفيت، ساكلاي، فرنسامعهد البيولوجيا في المدرسة العليا (IBENS)، المدرسة العليا، CNRS، INSERM، جامعة PSL، منشأة المجهر الإلكتروني، 75005 باريس، فرنسامعهد كوشين، INSERM، CNRS، جامعة باريس سيتé، فريق البلعميات وعلم المناعة الورمي، 75014 باريس، فرنساUMR-S 1172، JPArc – مركز أبحاث الأعصاب والسرطان، جامعة ليل، ليل، فرنساجامعة إدنبرة مركز أبحاث الالتهابات، إدنبرة EH16 4TJ، المملكة المتحدةمبادرة سيمونز للدماغ النامي، جامعة إدنبرة، إدنبرة، المملكة المتحدةقسم الطب النفسي والعلاج النفسي، كلية الطب، الجامعة التقنية في ميونيخ، 81675 ميونيخ، ألمانياالطب النفسي العصبي ومختبر الطب النفسي الجزيئي، شاريتي – جامعة الطب وDZNE برلين، 10117 برلين، ألمانياقسم التشريح المرضي، مستشفى تروسو APHP، 75571 باريس سيدكس 12، فرنساجامعة ليل، مركز المستشفى الجامعي ليل، إنسرم، مختبر التطور والمرونة للدماغ العصبي الصماء، علوم الأعصاب والإدراك في ليل، UMR-S 1172، 59000 ليل، فرنساشبكة المناعة في سنغافورة (SIgN)، وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحث، سنغافورة 138648، سنغافورةكلية فرنسا، جامعة PSL، 75005 باريس، فرنساالعنوان الحالي: معهد باستور، جامعة باريس سيتé، CNRS UMR 3738، فريق التعلم الآلي لعلم الجينوم التكاملي، 75015 باريس، فرنساساهم هؤلاء المؤلفون بالتساويساهم هؤلاء المؤلفون بالتساويجهة الاتصال الرئيسية*المراسلة: sonia.garel@bio.ens.psl.euhttps://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.012
الملخص
الملخص تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة (MG)، وهي البلعميات المقيمة في الدماغ، أدوارًا رئيسية في الصحة والمرض من خلال تنوع حالات الخلايا. بينما تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية تنوعًا كبيرًا في توزيع الخلايا وحالات النسخ الجيني، تظل وظائفها غير موصوفة بشكل جيد. هنا، اكتشفنا دورًا للخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على السلامة الهيكلية عند حدين قشريين جنينيين. عند هذه الحدود بين الهياكل التي تنمو في اتجاهات متميزة، تتجمع الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية، وتظهر حالة تشبه الخلايا الدبقية المرتبطة بالألياف العصبية بعد الولادة (ATM) وتمنع تقدم الميكروكافيتات إلى آفات تجويفية كبيرة، جزئيًا من خلال آلية تتضمن عامل ATM Spp1. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة وSpp1 أيضًا في الإصلاح السريع للآفات، مما يبرز بشكل جماعي الوظائف الوقائية التي تحافظ على الدماغ الجنيني من الضغط المورفوجيني الفسيولوجي والإصابة. وبالتالي، تبرز دراستنا الأدوار الرئيسية للخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية وSpp1 في الحفاظ على السلامة الهيكلية خلال المورفوجينيسيس، مع تداعيات كبيرة لفهمنا لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة وتطور الدماغ.
الميكروغليا (MG)، وهي البلعميات المقيمة في الدماغ، تلعب أدوارًا رئيسية في تطوير وصيانة الدوائر الدماغية طوال الحياة.تشارك هذه الحراس المناعية في خطوات رئيسية من تجميع الشبكات العصبية، على سبيل المثال، من خلال تنظيم أعداد الخلايا العصبية، وتطوير المشابك وتحسينها، ونضوج المايلين، وانتقال الإشارات المشبكية أو قابلية إثارة الخلايا العصبية.تتفق الأدوار المتنوعة لـ MG مع ارتباط خللها تقريبًا بجميع أمراض الدماغ، بدءًا من الاضطرابات النمائية إلى الأمراض التنكسية العصبية.أظهرت الدراسات التشريحية والدراسات الحديثة للتعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة (sc) أن خلايا الميكروغليا (MG) توجد في حالات خلوية وتعبيرية جينية متميزة، لا سيما خلال التطور، والشيخوخة، والتنكس العصبي.هذا التنوع في النسخ الجيني، كما هو موضح في المادة البيضاء والقشرة الدماغيةوفي الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة،يمكن أن تتأثر بالبيئة المحلية، مما يكشف عن علاقة تكافلية بين MG وموائلها الدماغية المحلية.ومع ذلك، فإن كيفية ارتباط هذه التباينات بمواقع ووظائف محددة لهذه الخلايا متعددة الأوجه، خاصة خلال الفترة الديناميكية من التطور قبل الولادة، لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.
تنشأ الخلايا الميكروفاجية من الماكروفاجات المشتقة من كيس الصفار التي تهاجر وتزرع في أوليات الدماغ خلال مرحلة تكوين الجنين المبكرة.تبدأ هذه العملية من اليوم الجنيني التاسع (E9) في الفئران، ومن الأسبوع الرابع من الحمل (GW4) في البشر.بعد ذلك، تقوم MG باستعمار النسيج الخلوي خلال المراحل الديناميكية من تطور الدماغ، والتي تتميز بمرحلة مطولة من توليد الخلايا العصبية، والهجرة، والتوصيل، بينما ينمو الدماغ، ويتجعد، ويتغير شكله.في كل من البشر والفئران، تستعمر MG الدماغ بطريقة تقدمية وشديدة النمطية.تتميز بتوزيع غير متساوٍ: تتجمع الخلايا الجذعية العصبية في النقاط الساخنة، وتتجنب المناطق الانتقائية مثل الصفيحة القشرية النامية،وتظهر مجموعة متنوعة من الأشكال، والسلوكيات الخلوية، والحالات النسخية.على الرغم من أن تباين الخلايا الدبقية الصغيرة يتناقص تدريجياً مع تقدم التطور، إلا أنه يمكن أن يظهر مرة أخرى في سياق الشيخوخة والمرض.في الظروف الفسيولوجية، تمتد تنوع الخلايا الدبقية الصغيرة عبر الفترات قبل الولادة وبعدها.على وجه الخصوص، توجد مجموعات محددة من الخلايا الأميبية MG في المادة البيضاء القشرية بعد الولادة، بما في ذلك الجسم الثفني (CC)،تظهر حالة ترنسكريبتومية محددة وقد تم تسميتها بشكل مختلف ميكروغليا مرتبطة بالأكسون (ATM)،الميكروغليا المرتبطة بالمنطقة التكاثرية (PAM)الميكروغليا المرتبطة بالشباب (YAM)أو MG إيجابية CD11c (+). بعد الولادة ATM/PAM/YAM/ CD11c أو ATM، تتميز بتعبير Spp1 (الذي يشفر الأوستيوپونتين أو OPN)، Lgals3، Gpnmb، Clec7a، Itgax (الذي يشفر CD11c)، Csf1، وIgf1، حيث تشترك في ميزات النسخ الجيني مع الميكروغليا المرتبطة بالمرض (DAM)، التي تم التعرف عليها في نماذج الفئران لمرض الزهايمر وتم ملاحظتها في سياقات عصبية تنكسية مختلفة.وظيفياً، تشارك خلايا ATM بعد الولادة في ابتلاع خلايا الدبق الناشئة، وتنظيم عملية الميالين، وتعزيز بقاء الخلايا العصبية، جزئياً من خلال تعبير Igf1.بينما تبرز هذه الدراسات رابطًا بين النقاط الساخنة للميكروغليا بعد الولادة، والحالات والتعبيرات الجينية المحددة والوظائف، لا تزال أدوار التراكمات قبل الولادة وتنوعها الخلوي المحتمل بحاجة إلى فك الشفرة إلى حد كبير.
هنا، من خلال دمج التحليلات النسخية، والتصوير، ونماذج الفئران المعدلة وراثيًا، نكشف أن الخلايا الدبقية الصغيرة تحافظ على السلامة الهيكلية عند حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزة (CSA) وحدود القشرة-الحاجز (CSB)، حيث تتجمع الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية وتظهر حالة محددة تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الولادة.تستند هذه الحدود، التي تكون عرضة للتوترات التنموية المرتبطة بنمو الدماغ وتشكيل الأشكال، إلى الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) لمنع تكوين آفات تجويفية كبيرة، جزئيًا من خلال آلية تتضمن عامل ATM متعدد الوظائف Spp1/OPN. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة وSpp1 أيضًا في الإصلاح السريع للآفات الكبيرة، مما يبرز وظائفها الوقائية في الحفاظ على دماغ الجنين من التوترات والتلفات المورفوجينية الفسيولوجية. تكشف دراستنا إذن أن الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية وعامل ATM Spp1 تلعب أدوارًا حاسمة في الحفاظ على السلامة الهيكلية للدماغ النامي خلال التشكيل الطبيعي، مع تداعيات كبيرة لفهمنا لوظائف الخلايا الدبقية الصغيرة وتطور الدماغ.
النتائج
تتجمع MG الشبيهة بالصرافات الآلية عند حدين قشريين جنينيين
بينما تم إثبات التباين التنموي لمرض الوهن العضلي الوبيل من خلال التشريحودراسات النسخ الجيني أحادي الخلية،ما إذا كانت التراكمات العابرة للخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ الجنيني تتكون من خلايا في حالات محددة لا يزال يتعين تحديده.
كخطوة أولى نحو استكشاف تباين MG خلال تطور الجنين، استفدنا من مجموعة بيانات النسخ الجيني للدماغ على مدى زمني التي أنشأها لا مانو وآخرون بين E 9 ومن خلال استخراج وتحليل MG من هذه المجموعة البيانية، حددنا 3 مجموعات متميزة: MG الدائرية، MG غير الدائرية وMG الجنينية التي تشبه ATM/PAM/YAM/CD11c بعد الولادة. (الشكل 1A). تتواجد خلايا شبيهة بـ ATM الجنينية بشكل خاص من اليوم الرابع عشر من الحمل فصاعدًا (الأشكال 1A-1C و S1A؛ الجدول S1) وتشارك في توقيع جيني أساسي مع خلايا ATM في المادة البيضاء بعد الولادة التي تم وصفها سابقًا (الأشكال 1B و 1D) أو PAM (الأشكال S1B-S1D) : يعبرون بشكل ملحوظ عن Spp1، الذي يشفر OPN، Csf1، Igf1، Lgals3، الذي يشفر Galectin3/ Mac2 و Gpnmb (الشكل S1A؛ الجدول S1).بشكل متسق، شبيه ATM جنيني و PAM توقيعات الجينات موجودة بشكل رئيسي في مجموعة ATM التي وصفها هاموند وزملاؤه (الأشكال S1D-S1F)، مما يبرز أوجه التشابه بين هذه التوقيعات النسخية قبل وبعد الولادة.
لتقييم ما إذا كانت خلايا شبيهة بـ ATM الجنينية قد تتواجد في مناطق محددة، ركزنا أولاً على منتصف تكوين الأعصاب (E14.5)، عندما يبدأ توزيع الخلايا الدبقية الصغيرة في أن يكون غير متساوٍ بشكل ملحوظ عبر الدماغ الأمامي النامي.استخدامخط الفأر، الذي يحدد جميع البلعميات، لاحظنا تراكمًا كبيرًا لـ GFPMG عند الحدود بين القشرة الدماغية، والسترياتوم، واللوزة.التي أطلقنا عليها اسم CSA (الأشكال 1E و S1G-S1I). الهوية الحقيقية للخلايا الدبقية الصغيرة GFPتم تأكيد الخلايا من خلال موقعها في النسيج (الشكل 1E) وتعبيرها عن علامة الميكروغليا مستقبل P 2 Y 12 ولكن ليس علامة البلعميات المحيطية LYVE1 (الشكل 1E).كانت هذه الخلايا الأكثر وفرة في E15 وكانت تعبر عن علامات محددة لـ ATM في هذه النقطة الزمنية (الأشكال 1E و S1G-S1I). باستخدام فئران CD11ceYFP والتلوين المناعي، وجدنا أن حوالي
60% من بروتينات CSA MG المترافقة التي ترمز لها جينات توقيع ATM “الأساسية”: CD11c، Mac2، Clec7A، Spp1، وGPNMB (الأشكال 1E وS1G-S1I). وهذا يتناقض مع المناطق المجاورة، حيث كانت هناك فقط بعض الخلايا المتناثرة التي تعبر عن هذه العلامات (الأشكال 1E وS1G وS1I)، مما يبرز تراكمًا محليًا وكثيفًا يشبه ATM في CSA بين E14.5 وE16.5، مع تقييد الخلايا في CSA البطني الذيل عند E18.5 (الشكل S1G). بالإضافة إلى توقيعها النسخي المميز، أظهرت خلايا تشبه ATM شكلًا أميبيًا، ونشاطًا بلعوميًا كما تم تقييمه في شرائح خارج الجسم، ومستويات تعبير أعلى من علامة الليزوزوم CD68 مقارنةً بـ MG المجاورة (الأشكال S1J وS1K). وبالتالي، مثل ATM بعد الولادة، يبدو أن الخلايا الدبقية الشبيهة بخلايا ATM الجنينية تتمتع بقدرة عالية على البلعمة، مما يعزز أوجه التشابه بين حالات ATM قبل وبعد الولادة بخلاف توقيعها النسخي المحفوظ. للتحقق مما إذا كان يحدث تراكم مشابه في البشر، قمنا بتوسيم أدمغة الأجنة من الأسبوع التاسع إلى الأسبوع الرابع عشر من الحمل واكتشفنا نمطًا محفوظًا من الخلايا الدبقية التي تعبر عن عوامل أساسية شبيهة بـ ATM في منطقة CSA طوال هذه المراحل (الشكل S1L). تظهر هذه البيانات أنه، في كل من الفئران والبشر، تتراكم الخلايا الدبقية التي تعبر عن توقيع شبيه بـ ATM في منطقة CSA الجنينية.
نظرًا لأن بصمة النسخ الجيني الشبيهة بـ ATM تم اكتشافها طوال الحياة الجنينية، قمنا بإجراء دراسة طولية على الدماغ الأمامي الجنيني بعد E14.5 للتحقق مما إذا كانت هناك تراكمات أخرى موجودة في مراحل ما قبل الولادة اللاحقة. بالإضافة إلى CSA، وجدنا فقط تراكمًا كبيرًا وكثيفًا واحدًا من خلايا شبيهة بـ ATM في الخط الأوسط بين E16.5 و E18.5، في CSB (الأشكال 1F و S1G). كان هذا النقطة الساخنة تقع أسفل CC، بما يتماشى مع المكان الذي تقيم فيه ATM بعد الولادة لاحقًا في الحياة.ويدل على استمرارية تراكمات ATM التي تمتد عبر الفترات قبل وبعد الولادة. باستخدام مجموعة محفوظة من علامات ATM الأساسية (Spp1، Clec7A، GPNMB، وMac2)، وجدنا أن حواليمن تراكم MG عند علامات ATM المعبر عنها بشكل مشترك في CSB عند E18.5 (الشكل 1F).
تظهر هذه البيانات أن الخلايا الجذعية التي تعبر عن توقيع ATM تتجمع في CSA وCSB الجنينية، وهما حدان بين القشرة الجديدة والهياكل الدماغية المجاورة.
تحافظ MG على السلامة الهيكلية عند الحدود القشرية الكثيفة لأجهزة الصراف الآلي
تراكم MG الشبيه بـ ATM في CSA و CSB يحدث في وقت أبكر بكثير من التوليد الواسع للخلايا الدبقية الأخرى أو تطوير المايلين، وكلاهما مرتبط بوظائف ATM بعد الولادة. للتحقيق في الدور المحتمل لـ MG في تطوير CSA و CSB، قمنا بفحص نماذج مختلفة من استنفاد البلعميات و MG، من خلال استهداف مسار إشارة مستقبل عامل تحفيز المستعمرات 1 (CSF1R) بشكل رئيسي، والذي يتطلب لبقاء الخلايا الدبقية الصغيرة.قمنا أولاً بإعطاء جسم مضاد مثبط لـ CSF1R (AFS98) للأمهات في اليوم السادس والنصف واليوم السابع والنصف من الحمل، مما تسبب في نقص مؤقت في سلالات الخلايا الدبقية الصغيرة ونقص شديد في الخلايا الدبقية الصغيرة حتى اليوم الثامن عشر والنصف. (الشكل S2A)، تليه إعادة توطين ميكروغليا تدريجية خلال الأسبوع الأول بعد الولادة.لقد حققنا أيضًا استنفادًا/إعادة توطين مماثلة من خلال تغذية الأمهات الحوامل بـ PLX3397،مثبط دوائي لـ CSF1R، بين E6.5 و E15 (الشكل S2B) وتمت مقارنته مع أجنة طافرة Pu. 1 التي تفتقر إلى جميع الخلايا النخاعية، بغض النظر عن إشارة CSF1R.نظرًا لأن هذه النماذج تستهدف كل من الخلايا البالغة الأخرى والسكان الماكروفاج على مدى فترة جنينية واسعة، قمنا أيضًا بإجراء تخفيضات أكثر عابرة من خلال معالجة الأمهات الحوامل بـ PLX3397 لمدة 3 أيام فقط، بين E12.5 و E15، مما يتداخل مع توقيت تراكم الخلايا الدقيقة في CSA (الشكل S2C). أخيرًا، ومن المهم، قمنا بفحص Csf1rالفئران التي تفتقر إلى MG لكنها تحتفظ بمعظم الماكروفاجات الدماغية الأخرىوتمكين استجواب الأدوار المحددة لـ MG في دوائر الدماغ.في جميع الطفرات أو الأجنة المستنفدة، بما في ذلك علاج PLX3397 لمدة 3 أيام وCsf1rفي الأجنة، وجدنا أن نقص MG أدى إلى ظهور “آفة تجويفية” كبيرة في CSA بدءًا من E14.5 (الشكل 2A) واستمرت حتى E18.5 (الشكل 2A). هذه التجاويف، التي تشكلت حيث تتجمع MG الشبيهة بـ ATM عادةً (الشكل 1E)، كانت تفتقر إلى أجسام الخلايا ولم تظهر أي اتصال مع البطينات، مما دفعنا لفحصها باستخدام المجهر الإلكتروني (EM) (الشكل S2D). كما لوحظ في الأجنة المعالجة بـ PLX3397، لم تحتوي الآفات التجويفية على خلايا أو عرضت غشاء قاعدي (الشكل S2D)، بل كانت تتكون من حطام غشائي غير منتظم نادر، يشبه الكيسات، أو الكيسات الزائفة التي تم الإبلاغ عنها في عدة أمراض بشرية، بما في ذلك اعتلالات الدماغ البيضاء.على النقيض من ذلك، لم نلاحظ مثل هذه الآفات التجويفية في النماذج التي تؤثر على الوظائف التطورية المعروفة بالفعل لـ MG، مثل طفرات Cx3cr1 وDap12/TyroBP وموصل المكمل 3 (CR3)، أو في الأجنة المعرضة لالتهاب قبل الولادة خفيف (تنشيط المناعة الأمومية [MIA]) (الشكل S2E). لتقييم المزيد من
الشكل 1. تتجمع الخلايا الدبقية الشبيهة بـ ATM في CSA و CSB الجنينية (أ) رسم تخطيطي لتقريب وإسقاط الفضاء الموحد للتعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة (UMAP) لخلايا الميكروغليا الجنينيةمستخرج من مجموعة بيانات لا مانويظهر MG الدائري (باللون البرتقالي)، وMG غير الدائري (باللون الأرجواني)، وMG الشبيه بـ ATM الجنيني (باللون الأخضر). (ب) إسقاط توقيع ATM بعد الولادة (الجينات المعبر عنها بشكل مختلف الأكثر غنىً [DEGs]) من مجموعة بيانات هاموندإلى (A). (ج) نسبة الدراجات (برتقالي)، غير الدراجات (بنفسجي)، و ATM-like MG الجنيني (أخضر) في مراحل جنينية مختلفة. (د) مخطط فين يوضح التداخل بين جينات التعبير المميزة لـ ATM في المرحلة الجنينية وما بعد الولادة، كما تم تحديدها من قبل لا مانّووهاموندمجموعات البيانات (تغيير الطي)معدل بونفيروني ). (E) وسم المناعة لمقاطع الدماغ من E14.5 أو E15 Cx3cr1أو أجنة CD11c-EYFP التي تظهر التعبير المشترك لعلامات الميكروغليا وATM عند CSA. يتم تحديد تفاصيل CSA بخطوط منقطة. الميكروغليا الإيجابية لـGFP في Cx3cr1تم تحديد مواقع الأدمغة بالكامل مع علامة الميكروغليا مستقبل P2Y12، وتم استخدام IBA1 لتوسيم الميكروغليا في أدمغة CD11c-EYFP (تمت التجربة على مقاطع دماغية من ثلاثة فئران على الأقل من ولادتين مختلفتين). (F) وسم المناعة لشرائح الدماغ التاجية من E18.5 Cx3cr1 أو الأجنة CD11c-EYFP التي تظهر التعبير المشترك لعلامات الميكروغليا وعلامات ATM عند الحدود القشرية الحاجزية (CSB)، أسفل الجسم الثفني (CC). تم تحديد المقاطع القريبة من CSB بخطوط منقطة. الميكروغليا الإيجابية لـ GFP في Cx3cr1تم تحديد جميع الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام علامة IBA1، والتي تم استخدامها لتحديد جميع الخلايا الدبقية الصغيرة في أدمغة CD11c-EYFP (تمت الدراسة على مقاطع دماغية من ثلاثة فئران على الأقل من ولادتين مختلفتين). تظهر الرسوم البيانية المتوسطاتSEM. قضبان القياس:في (E، أعلى اليسار)؛في (E، أدنى)؛ في (E، أعلى اليمين) و(F)؛ و (E إدراجات). ATM، ميكروغليا المرتبطة بالألياف العصبية؛ ATM-like، ميكروغليا المرتبطة بالألياف العصبية على نحو مشابه؛ CC، الجسم الثفني؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزة؛ CSB، حدود القشرة-الحاجز؛ DEGs، الجينات المعبر عنها بشكل مختلف؛ MG، ميكروغليا؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Se، الحاجز؛ Str، المخطط. انظر أيضًا الشكل S1 والجدول S1.
ج
D
E
ف
تأثير استنفاد الخلايا الدبقية الصغيرة على الحدود القشرية الأخرى حيث تتجمع خلايا شبيهة بـ ATM، قمنا بفحص CSB في جميع نماذج استنفاد MG (الأشكال 2A و S2A-S2C). مشابهًا لما لاحظناه في CSA، أدى غياب MG في CSB إلى حدوث آفات تجويفية في الخط الأوسط، حيث تتجمع عادةً خلايا MG الشبيهة بـ ATM.
لاستبعاد احتمال أن تكون تجاويف CSA أو CSB ناتجة عن تلف الأنسجة أثناء القطع، قمنا بتحليل أدمغة كاملة باستخدام تقنية iDISCO للتوضيح والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI).أظهر مسح iDISCO والتنفيذ الثلاثي الأبعاد لإعادة بناء نصف الدماغ في كلا نموذجَي نقص CSF1R آفات CSA تقع في الثلث الذيل من الحويصلات التيلينسيفالية، عند الحدود بين قشرة العزلة الذيلية، والكلوسترم، والسترياتوم، واللوزة (الشكل 2C؛ مقاطع الفيديو S1 و S2). وبالمثل، أظهرت مسحات الرنين المغناطيسي للدماغ بالكامل للعينات الثابتة المعالجة بـ PLX3397 و Csf1rأظهرت الأجنة والجراء حديثة الولادة تباينات ساطعة ثنائية الجانب بعد تعزيز التباين، مما يؤكد بشكل قاطع وجود آفات كيسية تجويفية من نوع CSA في غياب MG (الأشكال 2D و2E). وبالمثل، تم ملاحظة آفات تجويفية في CSB على الخط الوسطي باستخدام تقنية iDISCO للشفافية (الفيديوهات S3 وS4)، وفي صور الرنين المغناطيسي عندما سمح التباين في الخط الوسطي بالرؤية (الشكل 2F).
بشكل عام، يؤدي الغياب الجنيني لـ MG إلى فقدان متسلسل للسلامة الهيكلية في كل من CSA و CSB، وهما موقعان يتجمع فيهما MG الشبيه بـ ATM عادة، مما يكشف عن وظيفة فسيولوجية مهمة لـ MG خلال التطور قبل الولادة.
MG تحد من تشكيل الآفات التجويفية بسبب الضغط المورفوجيني
أثارت مشاركة MG في الحفاظ على تماسك الأنسجة عند الحدود القشرية سؤالاً حول خصوصيات هذه الحدود. يقع CSB عند الحدود بين القشرة الدماغية والحاجز، ويتعرض لقيود مورفوجينية تزداد مع نمو القشرة الدماغية، ويظهر تجويفاً يحدث عادةً يسمى تجويف الحاجز الذي يتم امتصاصه مع التطور.تشبه CSA، مثل CSB، تقع عند الحدود بين القشرة الدماغية والهياكل التي تنمو بمعدلات مختلفة وفي اتجاهات متميزة، مما يجعلها منطقة من التوترات المورفوجينية وإعادة تنظيم الأنسجة.
لذلك ركزنا على CSA للتحقق مما إذا كانت هذه الحدود تظهر ميزات محددة ويمكن أن تتأثر بالقيود المورفوجينية.
قمنا أولاً بتوصيف الفضاء المحلي لـ CSA في ATM خلال التطور الفسيولوجي الطبيعي عند E14.5. ومن المثير للاهتمام أن CSA كان يتميز بوجود تجاويف دقيقة كانت مأهولة بشكل نادر بالخلايا وكانت محاطة بخلايا MG التي تعبر عن علامات ATM مثل Mac2 و Spp1 (الشكل 3A). أكدت المجهر الإلكتروني وجود تجاويف دقيقة محاطة بخلايا MG في CSA (الشكل 3B). كانت هذه التجاويف الدقيقة تفتقر إلى الغشاء القاعدي، وتحتوي على قطع من أغشية الخلايا، وكانت محاطة بشكل منهجي بخلايا MG تظهر شكلًا أميبيًا، وهو سمة من سمات MG في CSA (الشكل 3B). أثارت ملاحظاتنا احتمال أن هذه التجاويف الدقيقة الفسيولوجية قد تساهم في تجنيد الميكروغليا المحلي و/أو تحفيز حالة مشابهة لـ ATM. علاوة على ذلك، اقترحت أن غياب MG قد يؤدي إلى تقدم التجاويف الدقيقة إلى آفات أكبر بسبب القيود المورفوجينية المحلية، مع تأثيرات ملحوظة على سلامة دماغ الجنين.
لاختبار فرضية أن آفات التجاويف في CSA تتشكل بسبب الضغط غير المقيد المرتبط بالتشكل، قمنا بفحص أدمغة الأجنة في الفئران التي تؤدي الطفرات الجينية فيها إلى زيادة أو تقليل القيود التنموية (الأشكال 3C-3G). أولاً، استخدمنا نموذجًا جينيًا مشروطًا لـتعطيل )، حيث تتشكل تكتلات غير طبيعية كبيرة حول البطين (PVNH) من E15.5 (الأشكال 3C و3D)، مما يزيد من القيود على القشرة النامية ويؤثر على سمكها وتنظيمها. في E18.5 وما بعده، عندما تكون الهتروتوبيا كبيرة وتأثرت مورفوجينيسيس القشرة، لاحظنا آفات مرئية في CSA في 50% من الأجنة الطافرة، تتقدم إلى آفات كبيرة لوحظت في جميع الحالات عند P8 (الأشكال 3C و3D). بينما لم يتغير توزيع MG بشكل كبير في المراحل المبكرة، كان نمو الهتروتوبيا مرتبطًا بتجنيد MG في CSA عند E18.5، حتى في الأجنة التي لم تظهر بعد آفات ملحوظة في هذه النقطة الزمنية (الشكل S3). تكشف نتائجنا إذن أن زيادة التوترات المورفوجينية بشكل كبير يمكن أن تؤدي، حتى في وجود MG، في النهاية إلى آفات في CSA، مما يكشف أن هذه المنطقة هي موقع للضعف المورفوجيني.
الشكل 3. تحدد الخلايا الدبقية الصغيرة تقدم التجاويف الدقيقة في CSA إلى آفات كبيرة استجابةً للقيود الشكلية (أ) تشير نتائج تلوين الأجسام المضادة IBA1 وSpp1 وMac2 إلى أن التجاويف الدقيقة في خط ATM (رؤوس الأسهم الصلبة) مرئية بواسطة تلوين هوشت عند E14.5 (، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة).
(ب) تكشف المجهرية الإلكترونية المنقولة (EM) أيضًا عن وجود تجاويف دقيقة (رؤوس الأسهم الصلبة)، مغطاة بخلايا الدبقية الأميبية (اللون الأخضر الزائف)، وتحتوي على قطع غشاء (رؤوس الأسهم المفتوحة) (، من على الأقل اثنين من النسل المتميزين).
(ج و د) مقاطع نصفية إكليلية (ج) من الفئران الضابطة و; الفئران، حيث تظهر الأخيرة وجود تكتل غير طبيعي حول البطين (PVNH) مرئي من E18.5 فصاعدًا (خطوط منقطة). يظهر التلوين المضاد لهوشت غياب آفات CSA في الضوابط والطفرات عند E15.5 (رؤوس الأسهم المفتوحة)، وآفة CSA ملحوظة (رؤوس الأسهم الصلبة) في من الطفرات عند E 18.5 وفي من الطفرات عند P8 (، ). تستخدم الكمية في (د) قيمًا تمثل تقييم شدة الآفة، تم تقييمها من 0 إلى 2، كما هو مفصل في الجدول S2.
(هـ) مقاطع نصفية إكليلية من أدمغة E15.5 من Brn4 ; Wnt3a تظهر إزالة المهاد (النجمة البيضاء) وتغيير عالمي في شكل الدماغ ولكن لا تأثير ملحوظ على CSA ().
(و و ز) مقاطع نصفية إكليلية (و) من أدمغة E15.5 من الفئران الضابطة و Brn4 ; Wnt3a المعرضة لـ PLX3397 بين E12.5 و E15.5. بينما أظهرت الضوابط المعرضة لـ PLX3397 باستمرار آفات (رؤوس الأسهم المفتوحة)، أظهرت الطفرات المعالجة بـ PLX3397 آفات أصغر أو عدم وجود آفات (رؤوس الأسهم الصلبة) على الرغم من الاستنفاد المحلي الفعال كما تم تقييمه بواسطة تلوين IBA1 (، من على الأقل اثنين من النسل المتميزين). تستخدم الكمية في (ز) قيمًا تمثل تقييم شدة الآفة، تم تقييمها من 0 إلى 2، كما هو مفصل في الجدول S2.
تظهر الرسوم البيانية المتوسطات SEM. تم إجراء اختبارات مان-ويتني للمقارنة الإحصائية، ; *** ; ns، غير مهم (). أشرطة القياس: (أ، اليسار)؛ (أ و و، تكبيرات عالية)؛ ; و، و، تكبير منخفض).
Am، اللوزة؛ CSA، حدود القشرة-المخطط-اللوزة؛ PVNH، تكتل غير طبيعي حول البطين؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط؛ Th، المهاد.
انظر أيضًا الشكل S3.
على الرغم من أن MG لم تكن قادرة على تعويض مثل هذه التغيرات التطورية الجذرية، إلا أنها يمكن أن تحد من تقدم الآفات التجاويف في CSA في سياق ضغط مورفوجيني أخف، كما يحدث في الظروف الفسيولوجية. للتحقيق مباشرة في هذه الإمكانية، اختبرنا ما إذا كان تخفيف القيود المورفوجينية سيحد من تشكيل الآفات في سياق غياب الخلايا الدبقية. استفدنا من Brn4 ; Wnt3A الأجنة، التي تفتقر إلى هيكل دماغي كبير، المهاد (Th)، وبالتالي تعاني من ضغط مورفوجيني مخفض في الدماغ الأمامي النامي (الأشكال 3E-3G). كما هو متوقع، تم الحفاظ على CSA في الطفرات عند E15.5 (الشكل 3E). من المRemarkably، أظهر علاج الأمهات Brn4 ; Wnt3A بـ PLX3397 خلال نافذة زمنية قصيرة بين E12.5 و E15.5 أن الأجنة الطافرة مع ضغط مورفوجيني مخفض أظهرت عددًا أقل من الآفات وأصغر عند استنفاد MG (الأشكال 3F و 3G). تظهر هذه الملاحظات بالتالي أن مدى آفات CSA مدفوع بالقيود المورفوجينية.
تشير نتائجنا مجتمعة إلى أن CSA هو موقع ضعف تطوري، حيث تتراكم MG استجابةً للقيود المورفوجينية. في الظروف الفسيولوجية، تمنع MG تقدم الآفات التجاويف بسبب الضغط المورفوجيني، مما يحافظ على السلامة الهيكلية لهذه الحدود القشرية الجنينية.
MG شبيهة بـ ATM تتأثر بالضغط المورفوجيني وآفات الأنسجة
تشير نتائجنا إلى أن زيادة أو تخفيف التوترات الشكلية alters alters recruitment of MG and tissue integrity at the CSA. Since ATM-like MG are normally detected at this boundary, we wondered whether changes associated with morphogenetic stress could contribute to the induction of the ATM-like state.
للإجابة على هذا السؤال، قمنا أولاً بفحص ما إذا كانت علامات ATM الأساسية معبرة في CSA لكل من Emx1 ; RhoA و Brn4 ; Wnt3A الأجنة (الأشكال 4A-4D). وجدنا أن الاستقطاب المحلي المحدد لـ MG في CSA من Emx ; RhoA الأجنة (الشكل S3) كان يتميز بزيادة ملحوظة في نسبة الخلايا الأميبية التي تعبر عن علامة ATM Spp1 عند E18.5 (الأشكال 4A و 4B). على العكس، لاحظنا استقطابًا محفوظًا لـ MG في CSA في Brn4 ; Wnt3A الأجنة، على الرغم من وجود نسبة مخفضة من الخلايا التي تعبر عن عامل ATM Spp1 (الأشكال 4C و 4D). وبالتالي، فإن التغيرات الجذرية في القيود المورفوجينية تتوافق مع استقطاب MG في CSA والتحريض المحلي والمحدد لميزات شبيهة بـ ATM.
نظرًا لأن التعديلات في الضغط المورفوجيني مرتبطة بأضرار الأنسجة (الشكل 3)، اختبرنا أيضًا ما إذا كان إنشاء آفات خارجية كافياً لاستقطاب MG الجنينية و/أو تحريض ميزات شبيهة بـ ATM. لهذا الغرض، قمنا بتحفيز آفات داخل الرحم (IULs) في القشرة الجديدة من الأجنة E14.5 Cx3cr1 عن طريق إجراء جرح طعني باستخدام أنبوب زجاجي (الشكل 4E). قمنا بفحص الأدمغة بعد 2.5 ساعة من الإصابة لتقييم الاستجابة الأولية (الأشكال 4E و 4F). بعد 2.5 ساعة، لاحظنا بالفعل تراكمًا ملحوظًا لخلايا Cx 3 cr1 -الإيجابية في موقع الآفة، مع حوالي من هذه الخلايا تعبر أيضًا عن علامات ATM Spp1 أو Mac2، و 10% تعبر عن GPNMB (الشكل 4F). وبالتالي، أدت الآفات الطعنية الميكانيكية داخل الرحم إلى استقطاب سريع للخلايا -الإيجابية التي تعبر عن بعض علامات ATM الأساسية في موقع الآفة (الشكل 4F).
بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن الضغط المورفوجيني والأضرار الناتجة عن الأنسجة يمكن أن تدفع الاستقطاب المحلي لـ MG مع ميزات شبيهة بـ ATM، والتي بدورها، يمكن أن تساهم في الحد من تقدم الآفات التجاويف الكبيرة في CSA.
يساهم عامل ATM Spp1 في السلامة الهيكلية عند الحدود القشرية
يثير دور MG في تماسك الأنسجة عند النقاط الساخنة الشبيهة بـ ATM السؤال حول الآليات الجزيئية الأساسية. كما ذكرنا، لم نلاحظ آفات تجويفية في CSA في النماذج الجينية التي تعطل الوظائف التطورية المعروفة لـ MG، مثل Cx3cr1 و Dap12/TyroBP و CR3 الطفرات (الشكل S2E)، مما يشير إلى تورط مسارات بديلة. ركزنا على جزيئات محددة لـ ATM معروفة بتعديل الوظائف المناعية والمساهمة في الالتصاق وإعادة تشكيل الأنسجة، مثل Spp1 و GPNMB.على وجه الخصوص، تم ربط Spp1، الذي يشفر OPN، بإعادة تشكيل الأنسجة، وعمليات الشفاء والإصلاح، وقد أظهرت شكله المفرز مؤخرًا أنه يعزز البلعمة الدبقية في سياق الأضرار العصبية وفي المراحل المبكرة من مرض الزهايمر.استفدنا من الطفرات العالمية المتاحة، حيث يتم التعبير عن هذه العوامل بشكل عالٍ ومحدد بواسطة MG في الدماغ قبل الولادة في هذه النقاط الزمنية التطورية (الشكل S4A). بينما أظهرت الفئران التي تفتقر إلى Gpnmb بنية دماغية طبيعية (الأشكال S4B و S4C)، أظهر حوالي 50% من تلك التي تفتقر إلى Spp1 آفات تجويفية في CSA عند E14.5 (الشكل 5A)، و 70% كانت لديها آفات في CSB عند E18.5 (الشكل 5B). تم امتصاص التجاويف بسرعة مع مرور الوقت، خلال 24 ساعة، مما يشير إلى أنه بينما يساهم Spp1/OPN في الحفاظ على السلامة الهيكلية في الدماغ النامي (الشكل S4D)، يبدو أن عوامل إضافية أو خصائص دبقية متورطة. من المهم أن عوامل ATM، بما في ذلك Mac2 و GPNMB، لا تزال معبرة في الطفرات Spp1 في كل من CSA و CSB (الأشكال 5C و 5D)، مما يشير إلى أن Spp1 ليس مطلوبًا لتحريض هذه العوامل الأساسية لـ ATM ولكن يساهم بدلاً من ذلك في وظيفة الخلايا الدبقية في سلامة الدماغ عند الحدود القشرية.
للتحقيق في كيفية تأثير تعطيل Spp1 على وظائف الميكروغليا الجنينية، قمنا بإجراء تحليلات النسخ الجزيئي الفردي على البلعميات من كل من النوع البري (WT) وطفرات Spp1 في E14.5 وE18.5 (الأشكال 5E-5H وS4E-S4G). باستخدام فرز MACS للخلايا الإيجابية لـ CD45 من المخ الأمامي في هذين الوقتين، حيث يؤثر تعطيل Spp1 على سلامة CSA وCSB، حددنا مجموعات فردية تت correspond إلى أنواع وخلايا مختلفة (الشكل S4E؛ الجدول S3)، التي كانت موجودة جميعها في ظروف التحكم والطفرات (الشكل S4F). بعد ذلك، ركزنا على البلعميات (الأشكال 5E-5H؛ الجدول S4) ولاحظنا تعبيرًا عاليًا لـ Spp1 بشكل انتقائي في مجموعة ATM من الضوابط (الشكل 5F)، مما يؤكد تحليلاتنا النسخ الجزيئي (الشكل S4A) وتحليلات الصبغ المناعي (الأشكال 5C و5D). قمنا أيضًا بتقييم الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين خلايا شبيهة بـ ATM في الضوابط والأجنة الطافرة (الجدول S5) ووجدنا أن التوقيع النسخي لخلايا شبيهة بـ ATM يتغير في الأجنة الطافرة (الأشكال 5G و5H). أشار كل من المقارنة المباشرة (الشكل 5G) وتحليلات المسارات باستخدام Metascape (الشكل 5H؛ الجدول S6) إلى أن تعطيل Spp1 يؤثر على مسارات وظيفية محددة في خلايا شبيهة بـ ATM: تم تقليل تعبير عدة علامات أساسية لـ ATM (مثل Lgals3 وApoE وFtl1) ومن بين عدة مسارات متغيرة، تم تقليل مسارات مرتبطة بالبلعمة، بما يتماشى مع التأثيرات الموصوفة سابقًا لـ
الشكل 4. يتم تحفيز الميكروغليا الشبيهة بـ ATM بواسطة القيود الشكلية وإصابات الأنسجة الميكانيكية (A و B) مقاطع نصفية من دماغ E18.5 تم صبغها مناعياً باستخدام IBA1 و Spp1 تُظهر تجنيداً ملحوظاً لميكروغليا تعبر عن Spp1 في CSA لـ Emx1; رهوA الفئران، بحواليمن الميكروغليا CSA الإيجابية لـ Spp1 في الطفرات، لكن من خلايا CSA التي تم اكتشافها في الضوابط في هذه المرحلة ( على الأقل لكل حالة، من حد أدنى من اثنين من القمامات المتميزة). (C و D) مقاطع نصفية من دماغ E15.5 تم تلطيخها مناعياً لـ IBA1 و Spp1 تظهر نسبة ملحوظة من انخفاض نسبة خلايا الميكروغليا CSA التي تعبر عن Spp1 في E15.5 Brn4; ونت3افئران متحورة مقارنةً بالتحكم، على الرغم من عدد الخلايا المتراكمة المحفوظ.على الأقل لكل حالة، من حد أدنى من اثنين من القمامات المتميزة). تمثيل تخطيطي لإجراء إصابة داخل الرحم (IUL) الناتج عن الوخز الميكانيكي للقشرة الجديدة باستخدام شعيرة زجاجية. (F) مقاطع كورونالية من القشرة الجديدة في الأجنة الضابطة و IUL في عمر 14.5 يومًا تم جمعها بعد 2.5 ساعة من تحفيز الإصابة، تظهر خلايا Cx3cr1 الأميبية-الخلايا الإيجابية تتجمع في موقع الآفة والتعبير المشترك عن Spp1 و Mac2 (رؤوس الأسهم الصلبة) في الأجنة IUL ولكن Cx3cr1 متشتت-الخلايا الإيجابية وعدم تعبير علامات ATM في الضوابط، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). قياس نسبة -الخلايا الإيجابية في موقع الآفة التي تعبر عن علامات ATMمن على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). تظهر الرسوم البيانية المتوسطاتSEM. مان-ويتنيتم إجراء اختبارات للمقارنة الإحصائية،شريط القياس: في (أ) و في (C) و(F). أم، اللوزة؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزية؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط.
الشكل 5. عامل ATM-core Spp1 يساهم في سلامة الأنسجة في CSA و CSB (أ) مقاطع نصفية تاجية من أدمغة E14.5 ملونة بهوشت تكشف عن اضطراب CSA في 50% من الطفرات Spp1-/- (رؤوس الأسهم الصلبة) مقارنة بالتحكمات (رؤوس الأسهم المفتوحة) و فيالأجنة المعالجة بـ PLX3397 (رؤوس الأسهم الصلبة)قياس آفات CSA عبر النماذج. (ب) تتيح تلوين المناعية L1 تصور المحاور العصبية (رؤوس الأسهم المفتوحة) والإصابات في الخط الأوسط (رؤوس الأسهم الصلبة) في حواليمن الطفرات Spp1-/- مقارنة بـفي الأجنة المعرضة لـ PLX3397قياس آفات CSB عبر النماذج.
تم إفراز Spp1 على MG خلال تلف الدماغ ومرض الزهايمر.
لتأكيد ما إذا كانت إبطال Spp1 يغير الخصائص البلعومية في الجسم الحي، بحثنا أولاً عن الركائز التي قد تبتلعها MG الشبيهة بـ ATM، مع التركيز على CSA (الأشكال 5 I و 5 J). في سياق سلامة الأنسجة، قمنا بفحص مكونات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) ولاحظنا تلونًا مكثفًا ومتنقطًا للفبرونيكتين 1 (FN1) في MG CSA باستخدام الوسم المناعي وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (الأشكال 5I و 5J). نظرًا لأن Fn1 لا يتم التعبير عنه بشكل ملحوظ بواسطة MG (الشكل 5J)، وكان التلوين المتنقط لـ FN1 موجودًا في مجالات داخل الخلوية تشبه الحويصلات (الأشكال 5I و 5J)، تدعم ملاحظاتنا أن MG CSA تبتلع FN1 في الظروف الفسيولوجية. إن ترسيب FN1 وإعادة تشكيله هو عامل رئيسي في الإصلاح وشفاء الجروح.مقترحًا أن ابتلاعها بواسطة MG قد يعدل خصائص الأنسجة. لاختبار ما إذا كان تعطيل Spp1 يغير هذه العملية، قمنا بقياس الحجم النسبي لـ FN1 داخل CSA MG في كل من الشهادات و Spp1-/- ووجدنا انخفاضًا كبيرًا في الأجنة الطافرة (الشكل 5 K).
تظهر بياناتنا إذن أن Spp1، الذي ينظم خصائص الميكروغليا الشبيهة بـ ATM مثل البلعمة، هو أحد العوامل التي تساهم في الحفاظ على سلامة الأنسجة عند الحدود القشرية.
تساهم MG و Spp1 في الإصلاح السريع للآفات التجويفية
تشير نتائجنا إلى أن MG تمنع تكوين الآفات في مواقع التوترات المورفوجينية جزئيًا من خلال Spp1. نظرًا لأن MG معروفة بمساعدتها في إصلاح الأضرار الخارجية في دماغ البالغين والحبل الشوكي حديثي الولادة،قمنا بمزيد من التحقيق لمعرفة ما إذا كان MG و Spp1 يمكن أن يعملان من خلال تعزيز إصلاح الأنسجة.
لمعالجة هذه المسألة، قمنا بدراسة ما إذا كانت خلايا MG تساهم في امتصاص الآفات الكبيرة في CSA و CSB. أولاً، حددنا فترة الوقت التي تكون فيها غياب خلايا MG بشكل دائم في Csf1rنارأدت فئران /FIRE إلى آفات تجويفية عند الحدود القشرية. يتماشى ذلك مع حقيقة أن Csf1rلم تُظهر الفئران تغييرات شكلية واضحة- الأمم في البالغين،وجدنا أنه بينما كانت الآفات لا تزال ملحوظة في جميع Csf1rكان هناك جراء في P7، وتم امتصاصها تدريجياً خلال الأسبوعين الثاني والثالث بعد الولادة، دون الكشف عن أي آفات بحلول P28/P30 (الأشكال 6A، S5A، وS6A). بينما تكشف هذه النتائج عن وجود آليات تعويضية محتملة لإغلاق الآفات في وقت لاحق من الحياة بعد الولادة، فإنها تبرز أن MG مطلوبة ليس فقط للحفاظ على السلامة الهيكلية قبل الولادة ولكن أيضًا خلال الأسبوع الأول بعد الولادة.
لتقييم ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم في إصلاح آفات CSA وCSB خلال الأسبوع الأول بعد الولادة، استغللنا حقيقة أن الخلايا الدبقية الصغيرة تبدأ في إعادة توطين الدماغ حول وقت الولادة بعد العلاج قبل الولادة بـ PLX3397. وجدنا أن في الجراء المعرضة مسبقًا لـ PLX3397، تم امتصاص آفات CSA بسرعة خلال الأيام الأولى بعد الولادة، بالتزامن مع إعادة توطين الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل تدريجي (الأشكال 6B و6C): بينما كانت جميع الفئران تحمل تجاويف في P0،كانت قد أغلقت بالكامل بحلول P3 (الشكل 6B). ومن المRemarkable، كانت إغلاق الآفة مرتبطًا باستمرار بتجمع كثيف من الخلايا الدبقية الصغيرة عند الندبة في P3، على الرغم من انخفاض كثافة الخلايا الدبقية الصغيرة في المنطقة المحيطة (الأشكال 6C و6D)، مما يدعم دورًا محليًا للخلايا الدبقية الصغيرة في CSA خلال عملية الامتصاص. في P7، كان أكثر من 70% من الفئران قد أغلقت آفات CSA الخاصة بها وتم امتصاص جميع تجاويف CSA بشكل منهجي بحلول P20 (الشكل 6B). لاحظنا جدولًا زمنيًا مشابهًا لعملية الامتصاص في CSB (الشكل S5B)، مما يظهر أن الخلايا الدبقية الصغيرة حفزت إصلاحًا سريعًا للآفات عند كلا الحدين.
على الرغم من إصلاح الآفات، استمرت العيوب الشكلية طويلة الأمد في CSA (الأشكال S6A-S6C)، مما يبرز أهمية الحفاظ على السلامة الهيكلية خلال التكوين الشكلي. في الواقع، حتى في الفئران اليافعة المعرضة مسبقًا لـ PLX3397 والتي تظهر آفات أكثر عابرة، لاحظنا عدم تنظيم حزمة محورية ملاصقة لـ CSA، وهي كبسولة تنقل المدخلات إلى Am، وهي بنية دماغية أساسية يرتبط اختلال تنظيمها بالاضطرابات النمائية العصبية.كلا المسارات المحورية والخلايا العصبية المثبطة الإيجابية لـ Foxp2، المهمة للتحكم في المدخلات إلى Am،كانت غير منظمة (الأشكال S6A و
الشكل 6. إعادة توطين الميكروغليا المحلية في CSA يدفع الإصلاح السريع للآفات الكهفية (أ) مقاطع كورونالية تظهر منطقة CSA في الضوابط و Csf1rالجروات، مشيرًا إلى أن الآفات التجويفية تُلاحظ بشكل منهجي في P7 Csf1rالجروات (رؤوس السهام الصلبة)، ولكنها غائبة في مجموعة التحكم P7 أو في P30 في كلا الحالتين (رؤوس السهام المفتوحة) (, , من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة لكل مرحلة وظروف). تظهر الرسوم البيانية النسب المئوية للدماغ مع الآفات، لكن النقاط الفردية تمثل أدمغة بها آفة (100) أو بدون آفة (0) لتوضيح التباين.
(ب وج) مقاطع كورونالية من أدمغة تعرضت قبل الولادة لـ PLX 3397 تظهر منطقة CSA (رؤوس الأسهم الصلبة) عند , و P 20. تم إعادة امتصاص الآفات التجويفية تدريجياً، مع نسبة كبيرة تم إعادة امتصاصها عند P 3، وتم تحقيق ذلك تقريباً بالكامل بحلول P 7، بالتزامن مع إعادة توطين الخلايا الإيجابية ، التي تراكمت في موقع إغلاق الآفة (رأس السهم الصلب) (; , من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة لكل مرحلة وظروف). يتم تقديم الرسم البياني في (ب) كما هو في (أ)، بينما يعرض الرسم البياني في (ج) المتوسطات SEM.
(د) أعداد الميكروغليا المتجددة قابلة للمقارنة في CSA من الضوابط والأجنة المعرضة لـ PLX3397 عند P3، حتى لو ظلت أعداد الميكروغليا أقل في المنطقة المحيطة بالأدمغة التي يتم إعادة امتصاصها (, من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). يظهر الرسم البياني في (د) المتوسطات SEM.
تم إجراء اختبار فيشر الدقيق و واختبار مان-ويتني U ( و ) للمقارنة الإحصائية، ; ** ; *** ; ns، غير مهم (). قضبان القياس: في (ب) و (ج) و في (أ) و (د).
أم، اللوزة؛ CSA، حدود القشرة-المخطط-اللوزة؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط.
انظر أيضًا الأشكال S5 و S6.
S6B). كشفت تسجيلات الشريحة الكهربية في الفئران البالغة أن العيوب الشكلية تتوافق مع عدم توازن ثابت في استجابات التثبيط/التحفيز (I/E) من خلايا الهرمونات اللوزية بعد تحفيز الكبسولة (الشكل S6C). وبالتالي، حتى بعد الإصلاح السريع لآفات CSA، استمرت هذه المنطقة المهمة فسيولوجيًا في إظهار عيوب في التوصيل التشريحي والوظيفي حتى سن البلوغ.
للاستكشاف بشكل أكبر لعملية الإصلاح واعتمادها المحتمل على Spp1، ركزنا على CSA وفحصنا خصائص الميكروغليا خلال الأسبوع الأول بعد الولادة (الأشكال 7 و S7). وجدنا أن MG المتراكمة بكثافة في الندبة تعبر عن علامات ATM Spp1 و GPNMB و Mac2 عند P3 (الشكل 7A). أظهرت هذه الخلايا أيضًا شكلًا أميبيًا وابتلاعًا ملحوظًا لـ FN1، الذي يتراكم في الندبة (الشكل S7). في
الشكل 7. عامل ATM Spp1 يساهم في إصلاح الآفات
(أ) خلايا Cx3cr1 -الإيجابية المتراكمة في موقع إغلاق الآفة تعبر عن علامات ATM Spp1 و Mac2 و GPNMB، كما هو موضح ومقاس عند P3 ( لكل علامة، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة).
(ب) إشارة Spp1 خارج الخلية، المحددة بواسطة التلوين المناعي ووضع علامة هوشت، تتراكم في CSA المعاد امتصاصها عند P3. تظهر الرسوم البيانية زيادة شدة الإشارة في CSA (الخطوط المنقطة) مقارنة بمتوسط شدة الإشارة المقاسة في القشرة الجديدة المحيطة (الخطوط المنقطة) واللوزة (الخطوط المنقطة) في الجراء المعرضة لـ PLX3397 مقابل الضوابط (; , من اثنين من القمامات المتميزة).
(ج) على عكس الضوابط، أظهرت الطفرات Spp1-/- المعرضة لـ PLX3397، والضوابط المعرضة لـ PLX3397، أن الطفرات Spp1-/- المعرضة لـ PLX3397 عرضت بشكل متكرر آفات مرئية بواسطة تلوين هوشت (رؤوس الأسهم الصلبة مقابل المفتوحة) (). تمثل القيم تقييم شدة الآفة، تم تقييمها من 0 إلى 2، كما هو مفصل في الجدول S2.
(د) بينما تعبر خلايا IBA1 الإيجابية في CSA عن Mac2 في الضوابط المعالجة بـ PLX3397 عند P7، تراكمت أيضًا حول الآفات في الطفرات Spp1 المعالجة بـ PLX3397، مما يشير إلى أن تعطيل Spp1 لم يمنع التعبير عن علامات ATM المختارة ().
تظهر الرسوم البيانية المتوسطات SEM. تم إجراء اختبار مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية، ; ns، غير مهم (). قضبان القياس: في (أ)؛ في (ج) و (د)؛ و في (ب).
أم، اللوزة؛ CSA، حدود القشرة-المخطط-اللوزة؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط.
انظر أيضًا الشكل S7.
بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن تلوين Spp1 لم يتم اكتشافه فقط في وحول خلايا الميكروغليا ولكن أيضًا يتراكم في الفضاء خارج الخلية بمستويات أعلى من تلك الموجودة في القشرة الجديدة أو اللوزة المجاورة (الشكل 7B). تظهر هذه النتائج أن عملية الإصلاح تتوافق مع تحفيز محلي لـ MG الشبيهة بـ ATM، كما يتضح من التعبير عن العلامات الأساسية وابتلاع FN1، بالإضافة إلى تراكم Spp1 خارج الخلية. كما هو الحال في منع تشكيل الآفات التجويفية، وجدنا أن عملية الإصلاح السريعة تعتمد على Spp1 (الأشكال 7C و 7D). في الواقع، من خلال المقارنة عند P7 بين الجراء WT و Spp1-/- المعرضة لـ PLX3397 قبل الولادة، لاحظنا تجنيد ميكروغليا قابل للمقارنة وتحفيز Mac2 (الشكل 7D)، ولكن تم تثبيط كبير لإغلاق الآفة في الفئران التي تفتقر إلى Spp1 (الشكل 7C).
بشكل عام، تظهر هذه البيانات أن MG و Spp1 تلعبان أدوارًا حاسمة في منع تقدم الميكروكافتي إلى آفات كبيرة وفي تعزيز إغلاقها السريع، وهو أمر ضروري للحفاظ على سلامة الدماغ أثناء التطور. تكشف دراستنا عن وظائف رئيسية لـ MG و Spp1 في الحفاظ على السلامة الهيكلية استجابةً للإجهاد المورفوجيني والآفات، مما يبرز أهمية هذه الخلايا المناعية في تطوير الدماغ المبكر.
النقاش
ارتبطت MG بالعديد من الوظائف، بما في ذلك تقدم المحاور، توصيل الخلايا العصبية القشرية، تطوير المشابك وتحسينها، من خلال مجموعة متنوعة من المستقبلات ومسارات الإشارة بما في ذلك Cx3cr1/Cx3cl1، Trem2/Dap12، المكمل، ومستقبلات البورين P2Y12. تكشف دراستنا عن أدوار أساسية إضافية لـ MG في الحفاظ على سلامة الأنسجة خلال تطوير القشرة الدماغية، قبل ظهور خلايا الدبقية المحتملة الزائدة أو التكميلية، مثل الخلايا النجمية. في الواقع، لأن MG تستعمر الدماغ من مراحل الجنين المبكرة وتنتج الخلايا النجمية أو الدبقية بشكل أساسي لاحقًا، تشكل MG مجموعة فريدة وكبيرة من خلايا الدبقية الجنينية.
في غياب MG، تتشكل الآفات عند حدود قشرية محددة تشكل مواقع هشة وتستضيف عادة تراكمات من MG في حالة تشبه ATM بعد الولادة. تستخدم دراستنا مجموعة من نماذج استنفاد الميكروغليا العالمية، المؤقتة والانتقائية، لتأسيس دور واضح لهذه الخلايا المناعية في منع تقدم الميكروكافتي إلى آفات تجويفية كبيرة عند الحدود القشرية (الأشكال , و ). من خلال مقارنة الاستنفادات الدائمة والمؤقتة، أظهرنا أن (1) غياب MG يؤدي إلى آفات تجويفية خلال تطور الجنين وحتى P7 على الأقل؛ (2) في غياب MG المستمر في الفئران Csf1r ، يتم إصلاح الآفات في النهاية بعد P7؛ (3) إن إعادة توطين MG المبكرة بعد الولادة كافية لدفع الإصلاح السريع للآفات (الأشكال 2 و 6 و S2 و S5). يبرز الإغلاق المتأخر للآفات في الفئران Csf1r آليات تعويضية قد تشمل ملء الآفات بسبب نمو الدماغ أو وظائف زائدة للخلايا التي تتطور لاحقًا، ويتماشى ذلك مع عدم وجود عيوب تشريحية كبيرة في الفئران البالغة Csf1r . ومع ذلك، كان للاستنفادات المؤقتة والآفات تأثير دائم على الدوائر، كما تم تقييمه في CSA (الشكل S6)، مما يدعم أن الحفاظ على السلامة الهيكلية خلال المورفوجينيسيس أمر ضروري لتطوير الدماغ بشكل صحيح. وبالتالي، تؤسس دراستنا أن MG تحافظ على
سلامة CSA و CSB وتعزز الإصلاح السريع للآفات، مما يكشف عن وظائف فسيولوجية مهمة لـ MG في خطوات حاسمة من المورفوجينيسيس المبكر للدماغ.
كل من CSA و CSB تتميز بتراكمات كثيفة من MG الشبيهة بـ ATM الجنينية، التي تعرض العديد من الميزات المشتركة مع ATM بعد الولادة التي تم تحديدها سابقًا. على وجه الخصوص، تشترك خلايا ATM الشبيهة بالجنين و ATM/PAM بعد الولادة ليس فقط في توقيعات ترنسكريبتوم متداخلة للغاية (الأشكال 1 و S 1)، ولكن أيضًا في شكل أميبي وميزات بلعومية عالية (الشكل S1). نظرًا لأننا لم نتمكن من استنفاد MG محليًا بشكل فعال أو التلاعب بالحالات الخلوية المؤقتة، فمن الممكن أن يكون التراكم المحلي للخلايا الشبيهة بـ ATM في هذه المواقع قد لا يكون العامل الوحيد المسؤول عن الظواهر المرصودة. ومع ذلك، اكتشفنا أن النقاط الساخنة المؤقتة للميكروغليا في CSA و CSB تحتوي على تراكمات كثيفة من الخلايا الشبيهة بـ ATM التي كانت مشابهة بشكل ملحوظ لنظيراتها بعد الولادة، مما يؤكد أن حالة ATM تمتد عبر الفترات قبل وبعد الولادة.
من المثير للاهتمام أنه بينما تم نسب وظائف ATM بعد الولادة إلى Igf1 إلى حد كبير، تكشف دراستنا أن Spp1/OPN، وهو عامل غير نمطي يتفاعل مع ECM وقد ارتبط سابقًا بتطور العظام، وشفاء الجروح، والالتهاب، وابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة، يساهم في سلامة الأنسجة والإصلاح السريع للآفات الكبيرة في الدماغ النامي (الأشكال 5، 7، S5، وS7). بينما لم يكن تعطيل Spp1 وحده يحاكي تمامًا تأثير نقص الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يشير إلى أن عوامل أخرى من المحتمل أن تكون متورطة، تدعم نتائجنا مساهمة عامل Spp1 الأساسي في وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في كل من سلامة الأنسجة والإصلاح. على المستوى الآلي، يتراكم Spp1 خارج الخلية في موقع الإصلاح (الشكل 7) ويؤدي تعطيل Spp1 إلى إضعاف المسارات البلعومية وقدرة CSA MG على ابتلاع FN1 بكفاءة (الشكل 5). FN1 هو مكون من ECM يتراكم بعد تلف الأنسجة أو الآفات الصغيرة، وإعادة تشكيله أمر أساسي للإصلاح السليم. وبالتالي، تثير نتائجنا إمكانية أن يعمل Spp1 من خلال تنظيم عمليات متعددة، بما في ذلك إفرازه خارج الخلية وتعزيز البلعمة، كما يتضح من ابتلاع FN1. بينما من المحتمل أن تبتلع ATM الجنينية مجموعة متنوعة من الركائز الخلوية الأخرى التي لا تزال بحاجة إلى التعرف عليها، تشير دراستنا إلى أن Spp1 يمكن أن يعمل، على الأقل جزئيًا، من خلال تنظيم إعادة تشكيل ECM، وهي ميزة خلايا دبقية صغيرة كانت متورطة سابقًا في إصلاح الحبل الشوكي وتنظيم المشابك. من المهم أيضًا أن نظهر أن Spp1 وعوامل ATM الأخرى يتم تحفيزها بسرعة كبيرة في MG المجندين إلى الآفات قبل الولادة (الشكل 4)، مما يكشف عن قدرة ملحوظة لهذه الخلايا على تغيير الحالات وإظهار اللدونة استجابةً للإصابة التي تم تحفيزها تجريبيًا.
تشارك عوامل ATM الأساسية، بما في ذلك Spp1/OPN، في استجابات خلايا المناعة، وتنظيم ECM، وشفاء الجروح، وتنظيم الالتهاب وقد تم اكتشافها في مجموعة واسعة من البلعميات، خلال آفات الجلد، وإصلاح القلب بعد احتشاء عضلة القلب أو تليف الكبد. تشير هذه الملاحظة إلى أن بعض جوانب “برنامج ATM” المتعلق بسلامة الدماغ والإصلاح ليست فريدة من نوعها بالنسبة لـ MG ولكن تمثل بدلاً من ذلك ميزة أساسية مشتركة عبر البلعميات، وهو أمر مهم للصيانة العامة لتوازن الأنسجة، خاصة استجابةً للتلف الخارجي أو الآفات. في MG، يتم أيضًا التعبير عن Spp1 وعوامل ATM بواسطة MG المستحثة بالتلف خلال السكتة الدماغية أو إصلاح الحبل الشوكي حديثي الولادة، وكذلك في DAM وTAM، المرتبطة على التوالي
بالخرف والأورام. وبالتالي، قد يتداخل برنامج ATM مع برنامج إصلاح أساسي في البلعميات يتم تحفيزه بواسطة تدمير الأنسجة في سياقات مختلفة من الصحة والمرض. سواء كان Spp1 متورطًا باستمرار وكيف يعمل، وما هي العوامل الأخرى التي تساهم في وظائف ATM في تماسك الأنسجة والإصلاح، وما إذا كانت أنواع خلايا أخرى يمكن أن تمارس وظائف مماثلة في الدماغ بعد الولادة والبالغين تشكل أسئلة رئيسية يجب معالجتها في الدراسات المستقبلية.
لم يتم الإبلاغ عن الدور الحقيقي للخلايا الدبقية الصغيرة النامية كما هو موصوف في هذه الدراسة في أنواع أخرى، مثل سمك الزرد، الذي يوفر نماذج جينية متنوعة لفحص تطور الدماغ في غياب MG. بينما حددنا نقاط ساخنة كثيفة من ATM في كل من الفئران والبشر، لم يتم الإبلاغ عنها حتى الآن في سمك الزرد. تثير هذه الملاحظات إمكانية مثيرة للاهتمام أن الحالة الشبيهة بـ ATM الجنينية، وخصائص الإصلاح المرتبطة بها، قد تم استغلالها خلال التطور لضمان التشكيل الصحيح لقشرة الدماغ المتنامية، وهو سمة مميزة للثدييات. وبما يتماشى مع ذلك، وجدنا أن زيادة القيود التشكيلية في نموذج PVNH القشري يمكن أن تؤدي إلى كسر انتقائي عند حدود CSA، مما يعزز فرضية أن CSA يمثل موقعًا للهشاشة التشكيلية في الثدييات (الأشكال 3 وS3). على النقيض من ذلك، عندما تم تخفيف القيود التشكيلية في نموذج جيني لإزالة Th، وُجد أن MG وATM الجنينية كانت أقل أهمية في منع الآفات (الشكل 3). ومع ذلك، في كلا النموذجين، لاحظنا أن تجنيد خلايا شبيهة بـ ATM تأثر بالقيود التشكيلية ووجود الآفات (الشكل 4)، مما يبرز التفاعل بين خلايا المناعة في الدماغ وموائلها المحلية، كما هو الحال في المادة البيضاء المتقدمة في العمر وقشرة الدماغ بعد الولادة. وبالتالي، هناك توازن دقيق بين هشاشة الأنسجة، وتوطين ATM الجنينية ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة، مما يستدعي مزيدًا من التحقيق في المسارات المعنية في تحفيز ATM ودورها في الفئران وعبر الأنواع. بشكل عام، تظهر نتائجنا أن التطور السليم لقشرة الدماغ يعتمد على تخفيف تلف الأنسجة بواسطة البلعميات المقيمة في الدماغ، مما يسمح بتشكل هياكل معقدة، وهو سمة مميزة لتطور الدماغ.
في سياق توصيل الدماغ البشري المرضي، ترتبط الآفات عادةً بالتلف الناتج عن MG “المفعلة” بشكل غير طبيعي استجابةً لمجموعة متنوعة من المحفزات، مثل نقص الأكسجة، والالتهاب، والولادة المبكرة، أو العدوى الفيروسية الخلقية. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن كيسين ثنائيين في الفصوص الصدغية، حيث يقع CSA، أو تجاويف منتصف الخط مثل تجويف الحاجز الشفاف والآفات الكيسية، في عدة اضطرابات تنموية عصبية. توضح دراستنا الأدوار الرئيسية لـ MG وSpp1 في الحفاظ على سلامة الأنسجة، مما يشير إلى أن مثل هذه الآفات قد تكون أيضًا نتيجة لفقدان الوظائف الفسيولوجية لـ MG خلال مراحل حاسمة من التشكيل.
هذه النتائج لها آثار كبيرة ليس فقط على فهمنا للآليات الأساسية التي تحكم تشكيل الدماغ ووظائف MG المحددة بالحالة ولكن أيضًا تفتح آفاقًا لاستكشاف مساهمات الخلايا الدبقية الصغيرة في علم الأمراض الدماغية.
قيود الدراسة
بينما حددت دراستنا دورًا رئيسيًا لـ MG وخصائص الإصلاح المعتمدة على Spp1 عند الحدود القشرية، من المهم أن
نعترف بعدة قيود في بحثنا. أولاً، تم تقييم الضغط التشكلي بشكل غير مباشر من خلال التلاعبات الجينية التي تشوه تشكيل الدماغ. ومع ذلك، نعتقد أن هذه الملاحظة تعوض من خلال الاستفادة من نموذجين يزيدان ويقللان بشكل انتقائي من القيود التشكيلية. ثانيًا، لم يكن من الممكن إجراء تلاعبات محلية أو محددة للحالة لـ CSA وCSB MG. على الرغم من عدة محاولات للتلاعب بشكل انتقائي في هذه الحالة، لم نتمكن من القضاء بكفاءة وانتقائية على هذه المجموعة الخلوية العابرة، كما تم الإبلاغ عنه بالنسبة لـ ATM بعد الولادة، ووفقًا لنتائجنا التي تشير إلى أن هذه الحالة يتم تحفيزها بسرعة استجابةً للموائل المحلية. ومع ذلك، توفر نتائجنا رؤى حول مساهمة MG وتنوعها في تطور الدماغ، والتطور، وعلم الأمراض، مما يبرز دورها الحقيقي في تشكيل القشرة الدماغية الجنينية.
طرق STAR*
تم توفير طرق مفصلة في النسخة الإلكترونية من هذه الورقة وتشمل ما يلي:
نشكر M. Keita على المساعدة الفنية الممتازة وE. Touzalin وA. Delecourt وC. Le Moal على المساعدة في مستعمرات الفئران. نحن ممتنون لـ Denis Jabaudon وأعضاء مختبر Garel على المناقشات المفيدة والمراجعة النقدية للمخطوطة، وAna-Maria Lennon-Duménil وSilvia Cappello، و
نشكر كورد براكيبوش على الهدايا الكريمة من المواد الكيميائية ونماذج الفئران، وكريستين زينغيلر وجون لوكنز على المناقشات خلال مسار هذا العمل. نشكر لوسي روبنسون وإيليا ديمشينكو من إنسايت إيديتنج لندن على التحرير العلمي للمخطوطة. نشكر مرفق التصوير في IBENS (فرنسا بيولماغينج، المدعوم من ANR-10-INBS-04، ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE، وANR-11-IDEX-000-02 PSL* جامعة الأبحاث، “الاستثمارات من أجل المستقبل”) والقابلات في قسم النساء والتوليد، مستشفى جان دي فلاندر في ليل (مركز الأورثوجيني)، على مساعدتهم ودعمهم الكريم. يعترف المؤلفون بدعم برنامج إنسرم العلمي المتقاطع (HuDeCA إلى P.G.). تم دعم هذا العمل من خلال منح لس.ج. من إنسرم، CNRS، ERC Consolidator NImO 616080، MicroSENSO ANR-19-CE16-0018، FSER، مؤسسة كلية فرنسا (صندوق سانت ميشيل)، ومؤسسة البحث الطبي (FRM) (EQU202003010195). حصل أ.ر.ل. على منحة دراسية من شبكة مدرسة الأعصاب في باريس إيل دو فرانس ومنصب ATER من كلية فرنسا؛ س.ب. مدعوم بمنحة دكتوراه AMX؛ ن.أ. من قبل FRM (FRM، EQU202003010195)؛ حصل س.ل. على منحة دكتوراه من FRM (FRM، ECO202006011600).
مساهمات المؤلفين
تصور، أ.ر.ل، ج.ب، م.س.ت، ل.ل، و س.ج؛ التحليل الرسمي، أ.ر.ل، أ. كانزي، ج.ب، ن.أ، ج.ل، ج.س، ل.ب، ب.ك، أ.س، د.ب، ل.ج، أ. كاندات، أ.ج، د.ت، ل.ج، م.س.ت، و ل.ل؛ التحقيق، أ.ر.ل، أ. كانزي، ج.ب، ن.أ، ج.ل، ج.س، ل.ب، ب.ك، أ.س، ف.ز، هـ.ج، س.ف، ج.أ، ب.س، ل. كانتيني، ل. تشوبانو، م.س.ت، و ل.ل؛ الموارد، د.م، أ.ف، ج.أ، ف.و، ج.-ب.م، ب.ب، ج.ب، ج.ب، ب.ج، و ف.ج؛ كتابة المسودة الأصلية، أ.ر.ل، م.س.ت، ل.ل، و س.ج؛ جميع المؤلفين ساهموا في تحرير المخطوطة؛ التصور، أ.ر.ل، أ. كانزي، ج.ب، ن.أ، ج.ل، ج.س، ل.ب، ب.ك، م.س.ت، و ل.ل؛ إدارة المشروع، م.س.ت، ل.ل، و س.ج؛ الإشراف، م.س.ت، ل.ل، و س.ج؛ الحصول على التمويل، س.ج.
إعلان المصالح
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
تاريخ الاستلام: 13 مارس 2023 تمت المراجعة: 30 سبتمبر 2023 تم القبول: 10 يناير 2024 نُشر: 2 فبراير 2024
REFERENCES
Colonna, M., and Butovsky, O. (2017). Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu. Rev. Immunol. 35, 441-468.
Li, Q., and Barres, B.A. (2018). Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nat. Rev. Immunol. 18, 225-242.
Hammond, T.R., Robinton, D., and Stevens, B. (2018). Microglia and the Brain: Complementary Partners in Development and Disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 34, 523-544.
Thion, M.S., Ginhoux, F., and Garel, S. (2018). Microglia and early brain development: An intimate journey. Science 362, 185-189.
Sierra, A., Paolicelli, R.C., and Kettenmann, H. (2019). Cien Anos de Microglia: Milestones in a Century of Microglial Research. Trends Neurosci. 42, 778-792.
Prinz, M., Jung, S., and Priller, J. (2019). Microglia Biology: One Century of Evolving Concepts. Cell 179, 292-311.
Prinz, M., Masuda, T., Wheeler, M.A., and Quintana, F.J. (2021). Microglia and Central Nervous System-Associated Macrophages-From Origin to Disease Modulation. Annu. Rev. Immunol. 39, 251-277.
Cserép, C., Pósfai, B., and Dénes, Á. (2021). Shaping Neuronal Fate: Functional Heterogeneity of Direct Microglia-Neuron Interactions. Neuron 109, 222-240.
Badimon, A., Strasburger, H.J., Ayata, P., Chen, X., Nair, A., Ikegami, A., Hwang, P., Chan, A.T., Graves, S.M., Uweru, J.O., et al. (2020). Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature 586, 417-423.
McNamara, N.B., Munro, D.A.D., Bestard-Cuche, N., Uyeda, A., Bogie, J.F.J., Hoffmann, A., Holloway, R.K., Molina-Gonzalez, I., Askew, K.E., Mitchell, S., et al. (2023). Microglia regulate central nervous system myelin growth and integrity. Nature 613, 120-129.
Thion, M.S., Mosser, C.A., Férézou, I., Grisel, P., Baptista, S., Low, D., Ginhoux, F., Garel, S., and Audinat, E. (2019). Biphasic Impact of Prenatal Inflammation and Macrophage Depletion on the Wiring of Neocortical Inhibitory Circuits. Cell Rep. 28, 1119-1126.e4.
Scott-Hewitt, N., Perrucci, F., Morini, R., Erreni, M., Mahoney, M., Witkowska, A., Carey, A., Faggiani, E., Schuetz, L.T., Mason, S., et al. (2020). Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. EMBO J. 39, e105380.
Favuzzi, E., Huang, S., Saldi, G.A., Binan, L., Ibrahim, L.A., FernándezOtero, M., Cao, Y., Zeine, A., Sefah, A., Zheng, K., et al. (2021). GABAreceptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell 184, 5686.
Cserép, C., Schwarcz, A.D., Pósfai, B., László, Z.I., Kellermayer, A., Környei, Z., Kisfali, M., Nyerges, M., Lele, Z., Katona, I., and Adam, D. (2022). Microglial control of neuronal development via somatic purinergic junctions. Cell Rep. 40, 111369.
Gallo, N.B., Berisha, A., and Van Aelst, L. (2022). Microglia regulate chandelier cell axo-axonic synaptogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2114476119.
Bisht, K., Sharma, K.P., Lecours, C., Sánchez, M.G., El Hajj, H., Milior, G., Olmos-Alonso, A., Gómez-Nicola, D., Luheshi, G., Vallières, L., et al. (2016). Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states. Glia 64, 826-839.
Krasemann, S., Madore, C., Cialic, R., Baufeld, C., Calcagno, N., El Fatimy, R., Beckers, L., O’Loughlin, E., Xu, Y., Fanek, Z., et al. (2017). The TREM2-APOE Pathway Drives the Transcriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases. Immunity 47, 566-581.e9.
Keren-Shaul, H., Spinrad, A., Weiner, A., Matcovitch-Natan, O., DvirSzternfeld, R., Ulland, T.K., David, E., Baruch, K., Lara-Astaiso, D., Toth, B., et al. (2017). A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell 169, 1276-1290.e17.
Deczkowska, A., Keren-Shaul, H., Weiner, A., Colonna, M., Schwartz, M., and Amit, I. (2018). Disease-Associated Microglia: A Universal Immune Sensor of Neurodegeneration. Cell 173, 1073-1081.
Stratoulias, V., Venero, J.L., Tremblay, M.E., and Joseph, B. (2019). Microglial subtypes: diversity within the microglial community. EMBO J. 38, e101997.
Li, Q., Cheng, Z., Zhou, L., Darmanis, S., Neff, N.F., Okamoto, J., Gulati, G., Bennett, M.L., Sun, L.O., Clarke, L.E., et al. (2019). Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron 101, 207-223.e10.
Hammond, T.R., Dufort, C., Dissing-Olesen, L., Giera, S., Young, A., Wysoker, A., Walker, A.J., Gergits, F., Segel, M., Nemesh, J., et al. (2019). Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity 50, 253-271.e6.
Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Böttcher, C., Amann, L., Sagar, S., Scheiwe, C., Nessler, S., Kunz, P., van Loo, G., et al. (2019). Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at sin-gle-cell resolution. Nature 566, 388-392.
Sala Frigerio, C., Wolfs, L., Fattorelli, N., Thrupp, N., Voytyuk, I., Schmidt, I., Mancuso, R., Chen, W.T., Woodbury, M.E., Srivastava, G., et al. (2019). The Major Risk Factors for Alzheimer’s Disease: Age, Sex, and Genes Modulate the Microglia Response to Abeta Plaques. Cell Rep. 27, 1293-1306.e6.
Kracht, L., Borggrewe, M., Eskandar, S., Brouwer, N., Chuva de Sousa Lopes, S.M., Laman, J.D., Scherjon, S.A., Prins, J.R., Kooistra, S.M., and Eggen, B.J.L. (2020). Human fetal microglia acquire homeostatic im-mune-sensing properties early in development. Science 369, 530-537.
Bian, Z., Gong, Y., Huang, T., Lee, C.Z.W., Bian, L., Bai, Z., Shi, H., Zeng, Y., Liu, C., He, J., et al. (2020). Deciphering human macrophage development at single-cell resolution. Nature 582, 571-576.
Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., and Prinz, M. (2020). Microglia Heterogeneity in the Single-Cell Era. Cell Rep. 30, 1271-1281.
Marschallinger, J., Iram, T., Zardeneta, M., Lee, S.E., Lehallier, B., Haney, M.S., Pluvinage, J.V., Mathur, V., Hahn, O., Morgens, D.W., et al. (2020). Lipid-droplet-accumulating microglia represent a dysfunctional and proinflammatory state in the aging brain. Nat. Neurosci. 23, 194-208.
Safaiyan, S., Besson-Girard, S., Kaya, T., Cantuti-Castelvetri, L., Liu, L., Ji, H., Schifferer, M., Gouna, G., Usifo, F., Kannaiyan, N., et al. (2021). White matter aging drives microglial diversity. Neuron 109, 11001117.e10.
La Manno, G., Siletti, K., Furlan, A., Gyllborg, D., Vinsland, E., Mossi Albiach, A., Mattsson Langseth, C., Khven, I., Lederer, A.R., Dratva, L.M., et al. (2021). Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature 596, 92-96.
Silvin, A., Uderhardt, S., Piot, C., Da Mesquita, S., Yang, K., Geirsdottir, L., Mulder, K., Eyal, D., Liu, Z., Bridlance, C., et al. (2022). Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity 55, 1448-1465.e6.
Stogsdill, J.A., Kim, K., Binan, L., Farhi, S.L., Levin, J.Z., and Arlotta, P. (2022). Pyramidal neuron subtype diversity governs microglia states in the neocortex. Nature 608, 750-756.
Paolicelli, R.C., Sierra, A., Stevens, B., Tremblay, M.E., Aguzzi, A., Ajami, B., Amit, I., Audinat, E., Bechmann, I., Bennett, M., et al. (2022). Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron 110, 3458-3483.
Stratoulias, V., Ruiz, R., Kanatani, S., Osman, A.M., Keane, L., Armengol, J.A., Rodríguez-Moreno, A., Murgoci, A.N., García-Domínguez, I., Alonso-Bellido, I., et al. (2023). ARG1-expressing microglia show a distinct molecular signature and modulate post-natal development and function of the mouse brain. Nat. Neurosci. 26, 1008-1020.
Dolan, M.J., Therrien, M., Jereb, S., Kamath, T., Gazestani, V., Atkeson, T., Marsh, S.E., Goeva, A., Lojek, N.M., Murphy, S., et al. (2023). Exposure of iPSC-derived human microglia to brain substrates enables the generation and manipulation of diverse transcriptional states in vitro. Nat. Immunol. 24, 1382-1390.
Park, M.D., Silvin, A., Ginhoux, F., and Merad, M. (2022). Macrophages in health and disease. Cell 185, 4259-4279.
Thion, M.S., and Garel, S. (2020). Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions. Curr. Opin. Genet. Dev. 65, 186-194.
Menassa, D.A., Muntslag, T.A.O., Martin-Estebané, M., Barry-Carroll, L., Chapman, M.A., Adorjan, I., Tyler, T., Turnbull, B., Rose-Zerilli, M.J.J., Nicoll, J.A.R., et al. (2022). The spatiotemporal dynamics of microglia across the human lifespan. Dev. Cell 57, 2127-2139.e6.
Cossart, R., and Garel, S. (2022). Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat. Rev. Neurosci. 23, 395-410.
Squarzoni, P., Oller, G., Hoeffel, G., Pont-Lezica, L., Rostaing, P., Low, D., Bessis, A., Ginhoux, F., and Garel, S. (2014). Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Rep. 8, 1271-1279.
Thion, M.S., and Garel, S. (2017). On place and time: microglia in embryonic and perinatal brain development. Curr. Opin. Neurobiol. 47, 121-130.
Wlodarczyk, A., Holtman, I.R., Krueger, M., Yogev, N., Bruttger, J., Khorooshi, R., Benmamar-Badel, A., de Boer-Bergsma, J.J., Martin, N.A., Karram, K., et al. (2017). A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. EMBO J. 36, 3292-3308.
Hagemeyer, N., Hanft, K.M., Akriditou, M.A., Unger, N., Park, E.S., Stanley, E.R., Staszewski, O., Dimou, L., and Prinz, M. (2017). Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathol. 134, 441-458.
Ueno, M., Fujita, Y., Tanaka, T., Nakamura, Y., Kikuta, J., Ishii, M., and Yamashita, T. (2013). Layer V cortical neurons require microglial support for survival during post-natal development. Nat. Neurosci. 16, 543-551.
Hankin, M.H., Schneider, B.F., and Silver, J. (1988). Death of the subcallosal glial sling is correlated with formation of the cavum septi pellucidi. J. Comp. Neurol. 272, 191-202.
Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A.M., Dobrenis, K., and Pollard, J.W. (2011). Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One 6, e26317.
Pridans, C., Raper, A., Davis, G.M., Alves, J., Sauter, K.A., Lefevre, L., Regan, T., Meek, S., Sutherland, L., Thomson, A.J., et al. (2018). Pleiotropic Impacts of Macrophage and Microglial Deficiency on Development in Rats with Targeted Mutation of the Csf1r Locus. J. Immunol. 201, 2683-2699.
Hoeffel, G., Wang, Y., Greter, M., See, P., Teo, P., Malleret, B., Leboeuf, M., Low, D., Oller, G., Almeida, F., et al. (2012). Adult Langerhans cells derive predominantly from embryonic fetal liver monocytes with a minor contribution of yolk sac-derived macrophages. J. Exp. Med. 209, 1167-1181.
Elmore, M.P., Najafi, A.R., Koike, M.A., Dagher, N.N., Spangenberg, E.E., Rice, R.A., Kitazawa, M., Matusow, B., Nguyen, H., West, B.L., and Green, K.N. (2014). Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron 82, 380-397.
Green, K.N., Crapser, J.D., and Hohsfield, L.A. (2020). To Kill a Microglia: A Case for CSF1R Inhibitors. Trends Immunol. 41, 771-784.
Back, J., Dierich, A., Bronn, C., Kastner, P., and Chan, S. (2004). PU. 1 determines the self-renewal capacity of erythroid progenitor cells. Blood 103, 3615-3623.
Rojo, R., Raper, A., Ozdemir, D.D., Lefevre, L., Grabert, K., WollscheidLengeling, E., Bradford, B., Caruso, M., Gazova, I., Sánchez, A., et al. (2019). Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat. Commun. 10, 3215.
Munro, D.A.D., Bradford, B.M., Mariani, S.A., Hampton, D.W., Vink, C.S., Chandran, S., Hume, D.A., Pridans, C., and Priller, J. (2020). CNS macrophages differentially rely on an intronic Csf1r enhancer for their development. Development 147, dev194449.
Kiani Shabestari, S., Morabito, S., Danhash, E.P., McQuade, A., Sanchez, J.R., Miyoshi, E., Chadarevian, J.P., Claes, C., Coburn, M.A., Hasselmann, J., et al. (2022). Absence of microglia promotes diverse pathologies and early lethality in Alzheimer’s disease mice. Cell Rep. 39, 110961.
Esteban, H., Blondiaux, E., Audureau, E., Sileo, C., Moutard, M.L., Gelot, A., Jouannic, J.M., Ducou le Pointe, H., and Garel, C. (2015). Prenatal features of isolated subependymal pseudocysts associated with adverse pregnancy outcome. Ultrasound in Obstet. Gyne. 46, 678-687.
Belle, M., Godefroy, D., Dominici, C., Heitz-Marchaland, C., Zelina, P., Hellal, F., Bradke, F., and Chédotal, A. (2014). A simple method for 3D analysis of immunolabeled axonal tracts in a transparent nervous system. Cell Rep. 9, 1191-1201.
Renier, N., Wu, Z., Simon, D.J., Yang, J., Ariel, P., and Tessier-Lavigne, M. (2014). iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell 159, 896-910.
Kaur, C., and Ling, E.A. (2017). Transitory cystic cavities in the developing mammalian brain – normal or anomalous? J. Anat. 230, 197-202.
Saito, K., Okamoto, M., Watanabe, Y., Noguchi, N., Nagasaka, A., Nishina, Y., Shinoda, T., Sakakibara, A., and Miyata, T. (2019). Dorsal-toVentral Cortical Expansion Is Physically Primed by Ventral Streaming of Early Embryonic Preplate Neurons. Cell Rep. 29, 1555-1567.e5.
Van Essen, D.C. (2020). A 2020 view of tension-based cortical morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117, 32868-32879.
Das, J.M., and Dossani, R.H. (2022). Cavum Septum Pellucidum. In StatPearls (StatPearls Publishing).
Cappello, S., Böhringer, C.J., Bergami, M., Conzelmann, K.K., Ghanem, A., Tomassy, G.S., Arlotta, P., Mainardi, M., Allegra, M., Caleo, M., et al. (2012). A radial glia-specific role of RhoA in double cortex formation. Neuron 73, 911-924.
Deck, M., Lokmane, L., Chauvet, S., Mailhes, C., Keita, M., Niquille, M., Yoshida, M., Yoshida, Y., Lebrand, C., Mann, F., et al. (2013). Pathfinding of corticothalamic axons relies on a rendezvous with thalamic projections. Neuron 77, 472-484.
Liaw, L., Birk, D.E., Ballas, C.B., Whitsitt, J.S., Davidson, J.M., and Hogan, B.L. (1998). Altered wound healing in mice lacking a functional osteopontin gene (spp1). J. Clin. Invest. 101, 1468-1478.
Rosmus, D.D., Lange, C., Ludwig, F., Ajami, B., and Wieghofer, P. (2022). The Role of Osteopontin in Microglia Biology: Current Concepts and Future Perspectives. Biomedicines 10, 840.
Shen, X., Qiu, Y., Wight, A.E., Kim, H.J., and Cantor, H. (2022). Definition of a mouse microglial subset that regulates neuronal development and proinflammatory responses in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2116241119.
De Schepper, S., Ge, J.Z., Crowley, G., Ferreira, L.S.S., Garceau, D., Toomey, C.E., Sokolova, D., Rueda-Carrasco, J., Shin, S.H., Kim, J.S., et al. (2023). Perivascular cells induce microglial phagocytic states and synaptic engulfment via SPP1 in mouse models of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 26, 406-415.
Bonnans, C., Chou, J., and Werb, Z. (2014). Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 786-801.
Patten, J., and Wang, K. (2021). Fibronectin in development and wound healing. Adv. Drug Deliv. Rev. 170, 353-368.
Moretti, L., Stalfort, J., Barker, T.H., and Abebayehu, D. (2022). The interplay of fibroblasts, the extracellular matrix, and inflammation in scar formation. J. Biol. Chem. 298, 101530.
Li, Y., He, X., Kawaguchi, R., Zhang, Y., Wang, Q., Monavarfeshani, A., Yang, Z., Chen, B., Shi, Z., Meng, H., et al. (2020). Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature 587, 613-618.
Meisner, O.C., Nair, A., and Chang, S.W.C. (2022). Amygdala connectivity and implications for social cognition and disorders. Handb. Clin. Neurol. 187, 381-403.
Varghese, M., Keshav, N., Jacot-Descombes, S., Warda, T., Wicinski, B., Dickstein, D.L., Harony-Nicolas, H., De Rubeis, S., Drapeau, E., Buxbaum, J.D., et al. (2017). Autism spectrum disorder: neuropathology and animal models. Acta Neuropathol. 134, 537-566.
Amaral, D.G., Schumann, C.M., and Nordahl, C.W. (2008). Neuroanatomy of autism. Trends Neurosci. 31, 137-145.
Paré, D., Quirk, G.J., and Ledoux, J.E. (2004). New vistas on amygdala networks in conditioned fear. J. Neurophysiol. 92, 1-9.
Tovote, P., Fadok, J.P., and Lüthi, A. (2015). Neuronal circuits for fear and anxiety. Nat. Rev. Neurosci. 16, 317-331.
Asede, D., Doddapaneni, D., and Bolton, M.M. (2022). Amygdala Intercalated Cells: Gate Keepers and Conveyors of Internal State to the Circuits of Emotion. J. Neurosci. 42, 9098-9109.
Paolicelli, R.C., Bolasco, G., Pagani, F., Maggi, L., Scianni, M., Panzanelli, P., Giustetto, M., Ferreira, T.A., Guiducci, E., Dumas, L., et al.
(2011). Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science 333, 1456-1458.
Schafer, D.P., Lehrman, E.K., Kautzman, A.G., Koyama, R., Mardinly, A.R., Yamasaki, R., Ransohoff, R.M., Greenberg, M.E., Barres, B.A., and Stevens, B. (2012). Microglia sculpt post-natal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron 74, 691-705.
Miyamoto, A., Wake, H., Ishikawa, A.W., Eto, K., Shibata, K., Murakoshi, H., Koizumi, S., Moorhouse, A.J., Yoshimura, Y., and Nabekura, J. (2016). Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nat. Commun. 7, 12540.
Weinhard, L., di Bartolomei, G., Bolasco, G., Machado, P., Schieber, N.L., Neniskyte, U., Exiga, M., Vadisiute, A., Raggioli, A., Schertel, A., et al. (2018). Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction. Nat. Commun. 9, 1228.
Allen, N.J., and Lyons, D.A. (2018). Glia as architects of central nervous system formation and function. Science 362, 181-185.
Frangogiannis, N.G. (2014). The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nat. Rev. Cardiol. 11, 255-265.
Pellicoro, A., Ramachandran, P., Iredale, J.P., and Fallowfield, J.A. (2014). Liver fibrosis and repair: immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat. Rev. Immunol. 14, 181-194.
Vannella, K.M., and Wynn, T.A. (2017). Mechanisms of Organ Injury and Repair by Macrophages. Annu. Rev. Physiol. 79, 593-617.
Shin, Y.J., Kim, H.L., Choi, J.S., Choi, J.Y., Cha, J.H., and Lee, M.Y. (2011). Osteopontin: correlation with phagocytosis by brain macrophages in a rat model of stroke. Glia 59, 413-423.
Rentsendorj, A., Sheyn, J., Fuchs, D.T., Daley, D., Salumbides, B.C., Schubloom, H.E., Hart, N.J., Li, S., Hayden, E.Y., Teplow, D.B., et al. (2018). A novel role for osteopontin in macrophage-mediated amyloidbeta clearance in Alzheimer’s models. Brain Behav. Immun. 67, 163-180.
Lyons, D.A., and Talbot, W.S. (2014). Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a020586.
Sharma, K., Bisht, K., and Eyo, U.B. (2021). A Comparative Biology of Microglia Across Species. Front. Cell Dev. Biol. 9, 652748.
Teissier, N., Fallet-Bianco, C., Delezoide, A.L., Laquerrière, A., Marcorelles, P., Khung-Savatovsky, S., Nardelli, J., Cipriani, S., Csaba, Z., Picone, O., et al. (2014). Cytomegalovirus-induced brain malformations in fetuses. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 73, 143-158.
Nunes, R.H., Pacheco, F.T., and da Rocha, A.J. (2014). Magnetic resonance imaging of anterior temporal lobe cysts in children: discriminating special imaging features in a particular group of diseases. Neuroradiology 56, 569-577.
Tomasello, E., Desmoulins, P.O., Chemin, K., Guia, S., Cremer, H., Ortaldo, J., Love, P., Kaiserlian, D., and Vivier, E. (2000). Combined natural killer cell and dendritic cell functional deficiency in KARAP/DAP12 loss-of-function mutant mice. Immunity 13, 355-364.
Jackson, B., Peyrollier, K., Pedersen, E., Basse, A., Karlsson, R., Wang, Z., Lefever, T., Ochsenbein, A.M., Schmidt, G., Aktories, K., et al. (2011). RhoA is dispensable for skin development, but crucial for contraction and directed migration of keratinocytes. Mol. Biol. Cell 22, 593-605.
Jung, S., Aliberti, J., Graemmel, P., Sunshine, M.J., Kreutzberg, G.W., Sher, A., and Littman, D.R. (2000). Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114.
Lindquist, R.L., Shakhar, G., Dudziak, D., Wardemann, H., Eisenreich, T., Dustin, M.L., and Nussenzweig, M.C. (2004). Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250.
van Spriel, A.B., Leusen, J.H.W., van Egmond, M., Dijkman, H.B.P.M., Assmann, K.J.M., Mayadas, T.N., and van de Winkel, J.G.J. (2001).
Mac-1 (CD11b/CD18) is essential for Fc receptor-mediated neutrophil cytotoxicity and immunologic synapse formation. Blood 97, 2478-2486.
99. Hao, Y., Hao, S., Andersen-Nissen, E., Mauck, W.M., 3rd, Zheng, S., Butler, A., Lee, M.J., Wilk, A.J., Darby, C., Zager, M., et al. (2021). Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell 184, 3573-3587.e29.
100. Hafemeister, C., and Satija, R. (2019). Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 20, 296.
101. Langmead, B., and Salzberg, S.L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods 9, 357-359.
102. Ahlmann-Eltze, C., and Huber, W. (2021). glmGamPoi: fitting GammaPoisson generalized linear models on single cell count data. Bioinformatics 36, 5701-5702.
103. Zappia, L., and Oshlack, A. (2018). Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience 7, giy083.
104. Genescu, I., Aníbal-Martínez, M., Kouskoff, V., Chenouard, N., MailhesHamon, C., Cartonnet, H., Lokmane, L., Rijli, F.M., López-Bendito, G., Gambino, F., and Garel, S. (2022). Dynamic interplay between thalamic activity and Cajal-Retzius cells regulates the wiring of cortical layer 1. Cell Rep. 39, 110667.
105. de Frutos, C.A., Bouvier, G., Arai, Y., Thion, M.S., Lokmane, L., Keita, M., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P., Hirata, T., Riethmacher, D., et al. (2016). Reallocation of Olfactory Cajal-Retzius Cells Shapes Neocortex Architecture. Neuron 92, 435-448.
106. Schafer, D.P., Lehrman, E.K., Heller, C.T., and Stevens, B. (2014). An engulfment assay: a protocol to assess interactions between CNS phagocytes and neurons. JoVE. 51482.
طرق النجوم
جدول الموارد الرئيسية
كاشف أو مورد
المصدر
معرف
الأجسام المضادة
مضاد CD68 من الجرذان
بايو راد
القطعة# MCA1957; RRID:AB_322219
أرنب مضاد-FN1
ميلليبور
القطعة# AB2033؛ RRID:AB_2105702
جلوبيولين مضاد لـ FOXP2 من الماعز
سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية
القطعة# sc-21069; RRID:AB_2107124
دجاج مضاد لـ GFP
أفيز لابز
القطعة# GFP-1020؛ RRID:AB_10000240
أرنب مضاد-IBA1
فوجي فيلم واكو شباياجي
القطعة# 019-19741; RRID:AB_839504
أرنب مضاد-IBA1 (بشري)
أبكام
القطعة# ab178846; RRID:AB_2636859
دجاج مضاد-IBA1
الأنظمة المشبكية
رقم المنتج: 234009؛ RRID:AB_2891282
مضاد ل-Lgals3 من الجرذان (MAC2)
سيدارلين
رقم المنتج: CL8942AP؛ RRID:AB_10060357
مضاد L1 من الجرذان
ميلبورو
القطعة# MAB5272; RRID:AB_2133200
الجرذان المضادة لـ LYVE1 الموصلة بالبيوتين
ثيرمو فيشر ساينتيفيك
قط# 13-0443-82; RRID:AB_1724157
مضاد بروتين المايلين الأساسي (MBP) من الجرذان
ميلبورو
القط# MAB386; RRID:AB_94975
مضاد الفأر لـ mDectin-1 (CLEC7A)
إنفيفوجين
قط# mabg-mdect; RRID:AB_2753143
علامة الفيلامين العصبي المضاد للفأر SMI-312
بايو ليجند
الرقم التعريفي# 837904؛ RRID:AB_2566782
الأجسام المضادة الماعز ضد أوستيوأكتيفين الفأر (GPNMB)
أنظمة البحث والتطوير
القطعة# AF2330؛ RRID:AB_2112934
أرنب مضاد لمستقبل P2Y12
أنا سبيك؛ مجموعة EGT
رقم الكات: 55043A؛ RRID:AB_2298886
جلوبيولين مضاد لـ SPP1 من الماعز
أنظمة البحث والتطوير
القط# AF808; RRID:AB_2194992
الأجسام المضادة للدجاج من نوع دونكي Alexa 10 Fluor® 488 المرتبطة
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 703-545-155؛ RRID:AB_2340375
الألكسا 10 فلور® 488 المرتبطة بمضاد الحمار ضد الماعز
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة # 705-545-147؛ RRID:AB_2336933
مضاد حيواني ضد الجرذان أليكس 10 فلور® 488-مقترن
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة # 712-545-150؛ RRID:AB_2340683
الأرنب المضاد للحمير أليكس 10 فلور® 488-المترافق
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 711-545-152; RRID:AB_2313584
الأجسام المضادة للأغنام المربوطة بـ Cy3
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 705-165-147؛ RRID:AB_2307351
الأجسام المضادة للأرانب المربوطة بـ Cy3 من نوع الحمار
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 711-165-152; RRID:AB_2307443
مضاد حيواني من نوع حمار وحشي مترافق مع Cy3
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة رقم 712-165-150؛ RRID:AB_2340666
الألكسا 10 فلور® 647 المرتبط بمضاد الحمار ضد الماعز
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 705-605-147؛ RRID:AB_2340437
مضاد حيواني للماعز مترافق مع Cy5
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة# 705-175-147; RRID:AB_2340415
مضاد حيوي من نوع دونكي مدمج مع Cy5 للفئران
مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش
القطعة # 712-175-150؛ RRID:AB_2340671
عينات بيولوجية
نسيج دماغ الجنين البشري
قسم النساء والتوليد، مستشفى جان دو فلاندر، ليل، فرنسا
غير متوفر
المواد الكيميائية، الببتيدات، والبروتينات المؤتلفة
ليبوبوليسكاريد
إنفيفوجين
القط# tlrl-pelps; CAS: 93572-42-0
بيكسيدارتينيب (PLX3397)
بليكسكون
CAS: 1029044-16-3
الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ CSF1RCSF1R، النسخة AFS98)
مختبر فلوران جينهoux
غير متوفر
ترايتون 100X
يوروبيو
قطعة# GAUTTR00-07
هوخست
سيغما ألدريتش
القط# 33342
بارافورمالدهيد
سيغما ألدريتش
القط# P6148
جيلاتين
كيماويات VWR
القط# 24350.262
ديبنزيل إيثر
سيغما ألدريتش
القط# 33630
ثنائي كلورو ميثان
سيغما ألدريتش
القط# 270997
ميثانول
سيغما ألدريتش
القط# 34860
اختبارات تجارية حاسمة
بي ديمجموعة مضاعفة عينات الخلايا المفردة السيدة
بي دي بيوساينس
القط# 633793
(يتبع في الصفحة التالية)
مستمر
كاشف أو مورد
المصدر
معرف
بي دي رابسوديالمصفوفة الجينية الكاملة
مجموعة تضخيم تحليل (WTA)
بي دي بيوساينس
القط# 633801
بي دي رابسوديالمصفوفة الجينية الكاملة
مجموعة كواشف التحليل (WTA)
بي دي بيوساينس
القط# 665915
pHrodoالجزيئات الحيويةتصريفات لـ
البلعمة ومجموعة البلعمة
ثيرمو فيشر ساينتيفيك
قط# P35361
البيانات المودعة
تسلسل RNA أحادي الخلية لميكروغليا الجنين (C57BL/6)
لا مانو وآخرون
http://mousebrain.org/ التطوير (“dev_all.loom”)
تسلسل RNA أحادي الخلية لميكروغليا ما بعد الولادة (C57BL/6)
هاموند وآخرون
جي إس إي: 121654
تسلسل RNA أحادي الخلية لميكروغليا ما بعد الولادة (C57BL/6)
ميكروسكوب أولتراميكروسكوب II بميكروسكوب شريحة ضوئية
ميلتيني بيوتيك
https://www.miltenyibiotec.com
ميكروسكوب الفلورسنت لايكا DMi8
لايكا
https://www.leica-microsystems.com/
ميكروسكوب الإلكترون الناقل فيليبس تيكني 12
فيليبس/في إي آي
https://nano.tau.ac.il
كريوستات لايكا CM 3050S
لايكا
https://www.leica-microsystems.com/
ميكروسكوب أوليمبوس BX51WIF
أوليمبوس
https://www.olympus-lifescience.com
طعام الفئران القياسي ssniff
شركة ssniff للأنظمة الغذائية الخاصة
https://www.ssniff.com
توافر الموارد
جهة الاتصال الرئيسية
يجب توجيه الطلبات والمعلومات الإضافية المتعلقة بهذه الدراسة إلى جهة الاتصال الرئيسية، سونيا غاريل (sonia.garel@bio.ens).psl.eu).
توفر المواد
لم تنتج هذه الدراسة مواد كيميائية فريدة جديدة.
توفر البيانات والشيفرة
تم إيداع مجموعة بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية في ArrayExpress برقم الوصول E-MTAB-13581 وهي متاحة للجمهور اعتبارًا من تاريخ النشر. البيانات المولدة في الجداول S1 و S3 و S4 متاحة للتنقيب. سيتم مشاركة بيانات المجهر الواردة في هذه الورقة من قبل جهة الاتصال الرئيسية عند الطلب.
هذه الورقة لا تقدم كودًا أصليًا.
أي معلومات إضافية مطلوبة لإعادة تحليل البيانات المبلغ عنها في هذه الورقة العمل متاحة من جهة الاتصال الرئيسية عند الطلب.
تفاصيل النموذج التجريبي وشارك الدراسة
خطوط الفأر
Cx3cr1 (RRID:IMSR_JAX:005582)، Pu.1 Cd11c-eYFP (RRID:IMSR_JAX:007567)، Csf1r Spp1 (RRID: IMSR_JAX:004936)، CR3 (Cd11b (RRID:IMSR_JAX:003991)، داب12/تايروبP (RRID:MGI:3818477)، رهوA ، إم إكس; WntA3 وبرن4 فئرانتم الحفاظ عليها على خلفية C57BL/6J، باستثناء Csf1rالفئران التي تم الاحتفاظ بها على خلفية مختلطة من C57BL/6J CBA. تم استخدام فئران C57BL/6J من النوع البري أو الأشقاء المتغايرين كضوابط للفئران الطافرة، حيث لم تظهر أي نمط ظاهري، باستثناء تحليلات الإصلاح (الشكل 7)، حيث قمنا بمقارنة Spp1.و Spp1-، في تحليلات التكتلات غير الطبيعية المحيطية البطينية (الأشكال 3 و 4)، حيث قمنا بمقارنةمع الأشقاء من نفس القمامة، ودراسات على Csf1rفئران حيث قمنا بمقارنة الطفرات مع Csf1rالأشقاء (الأشكال 2، 6، S5، وS6). تحققنا من النمط الظاهري قبل الولادة لـ Csf1r كانت الفئران مشابهة على خلفية مختلطة من C57BL/6J CBA وعلى خلفية C57BL/6J بالنسبة لـ E14.5 و E18.5، من ولادتين متميزتين)، بينما لم يكن من الممكن تقييم النمط الظاهري بعد الولادة على خلفية C57BL/6J لأن الفئران الطافرة تطورت لديها استسقاء الرأس. تم اعتبار يوم تشكيل السدادة المهبلية E0.5. تم جمع معظم الأجنة في الصباح، باستثناء E15.0 التي تم جمعها في فترة بعد الظهر منيوم الحمل. في جميع التجارب، كانت الفئران متطابقة في العمر والجنس، وتم الاحتفاظ بالحيوانات في منشأة الحيوانات التابعة لـ IBENS، وتم التعامل معها وفقًا للوائح الاتحاد الأوروبي ولجنة الأخلاقيات المحلية.
الأجنة البشرية
تم توفير الأنسجة الجنينية وفقًا للقوانين الفرنسية (الممارسات الجيدة المتعلقة بالحفظ والتحويل والنقل للأنسجة البشرية التي ستستخدم لأغراض علاجية، المنشورة في 29 ديسمبر 1998). تمت الموافقة على الدراسات المتعلقة بأنسجة الأجنة البشرية من قبل الوكالة الفرنسية للبحوث الطبية الحيوية (وكالة البيوميديسين، سانت دينيس لا بلاين، فرنسا، البروتوكول : PFS16-002). تم الحصول على ثلاثة أجنة بشرية بدون أمراض معروفة في أسابيع الحمل (GW) 9 و GW11 و GW14 من حالات الحمل التي تم إنهاؤها طوعًا بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الوالدين (قسم النساء والتوليد، مستشفى جان دي فلاندر، ليل، فرنسا). البيانات الشخصية (مثل العرق، والعرق، والوراثة، وتاريخ الميلاد وغيرها من البيانات المماثلة) غير متاحة وفقًا للوائح الخصوصية في فرنسا. تم تثبيت الأجنة عن طريق الغمر في بارافورمالدهيد (PFA) عندلـ 3 (جنين GW9) أو 5 أيام (أجنة GW11 و GW14). تم حماية الأنسجة بالتبريد فيسكروز/ PBS عندبين عشية وضحاها، تم تضمينه في مركب Tissue-Tek OCT (ساكورا فينيتيك، الولايات المتحدة الأمريكية)، مجمد على الثلج الجاف ومخزن فيحتى التقطيع. تم قطع العينات المجمدة بشكل متسلسل عندباستخدام جهاز التجميد ليكا CM 3050S (ليكا بيوسيستمز نوسلوخ GmbH، ألمانيا). تم الاحتفاظ بالشرائح في.
تفاصيل الطريقة
إعادة تحليل النسخ الجيني
إعادة تحليل بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية
بيانات scRNA-seq الدقيقة من هاموند وآخرون.ولا مانو وآخرونتم تنزيلها من سلسلة GSE121654 وملف loomhttp://mousebrain.org/development (“dev_all.loom”)، على التوالي. مصفوفة العد الخام والبيانات الوصفية للخلايا المعلّمة بالميكروغليا في لا مانو وآخرون.تم استخراجها من ملف النول باستخدامv4.1.2. تتضمن البيانات ما مجموعه 1,711 خلية (510 خلية جوية، 415 خلية ميكروغليا دائرية، 786 خلية ميكروغليا غير دائرية). تم تصفية الجينات كما وصفها المؤلفون (المعبر عنها في 10 خلايا على الأقل لـ La Manno وآخرون).وعلى الأقل 20 خلية لـ هاموند وآخرون. ). لمجموعة البيانات من هاموند وآخرون، تم توفير بيانات وصفية إضافية مثل إحداثيات التوزيع الاحتمالي المجاور الموزع (tSNE) المعلنة والمجموعات المبلغ عنها من قبل المؤلفين لاختيار 76,149 خلية، بما في ذلك 2,517 خلية atm.
سورات v4.1.1تم استخدام خط أنابيب تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-seq) لإنتاج تقريب متعدد الأبعاد الموحد ورسم إسقاط (UMAP) ومخططات tSNE لبيانات الميكروغليا.تم استخدام المعلمات الافتراضية، ما لم يُذكر خلاف ذلك. لـتم تطبيع البيانات وتعديل مقاييسها باستخدام SCTransform.تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) وحساب إحداثيات UMAP باستخدام 5 مكونات رئيسية. تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام Seurat v4.1.1 و ggplot2 v3.3.6 و scCustomize v1.1.1 ولوحة الألوان viridis v0.6.2.
تحليل التعبير التفاضلي
الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) من خلايا موصوفة بواسطة ATM من لا مانو وآخرون.تم تحديدها باستخدام دالة “FindAllMarkers” في Seurat (اختبار ويلكوكسون ذو الرتبة الموقعة، التحليل“RNA”، النسبة المئوية الدنيا، فقط. تم تصفية الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (تغير الطيمعدل بونفيرونيقيمةلإنشاء مخططات فين، تم تطبيق نفس العتبة على الجينات المعبر عنها بشكل مختلف المنشورة لـ ATM. و PAM.
تحليل إثراء مجموعة الجينات
لتحديد إثراء مجموعة الجينات في مجموعة بيانات scRNA-seq، تم استخدام دالة “AddModuleScore” من Seurat (ctrl.size = طول قائمة الجينات، nbin=24). تم اختبار عدة توقيعات جينية للإثراء في بيانات scRNA-seq للميكروغليا من La Manno وآخرون. : (i) أعلى DEGs الغنية في ATM من هاموند وآخرون، المطابقة لـ 9 علامات تم الإبلاغ عنها (أي، Spp1، Gpnmb، Igf1، Lgals3، Fapb5، Lpl، Lgals1، Ctsl، Anxa5)، و (ii) أعلى DEG PAM الغنية من Li وآخرون. (أي، Spp1، Clec7a، Gpnmb، Igf1، Lpl، Pld3، Ctsl، Ctsb، Slc23a2، Gpx3) (الجدول S1).
تحليل النسخ الجيني في الشهادات والطفرات Spp1 تسلسل RNA أحادي الخلية كامل النسخ باستخدام Rhapsody
بالنسبة لتجربة Rhapsody، تم تنفيذ العملية بالكامل من خلال اتباع بروتوكول الشركة المصنعة (BD Biosciences). تم إثراء خلايا CD45+ السابقة باستخدام كريات ميكروبيولوجية CD45 من Miltenyi وجهاز Automacs باستخدام وظيفة possel. تم التقاط 115,256 خلية في جولة مزدوجة، 6 عينات مشفرة لكل جولة، وتم تجميعها باستخدام BD. مجموعة أدوات تعدد العينات لخلايا مفردة (رقم الكاتالوج: 633793). تم معالجة العينة وفقًا لـ BD Rhapsodyمجموعة تضخيم تحليل النسخ الكامل (WTA) (رقم الكاتالوج: 633801) وBD Rhapsodyمجموعة أدوات تحليل النسخ الكامل (WTA) (رقم الكاتالوج: 665915). ثم تم إخضاع المكتبتين لتشغيل تسلسل مزدوج النهاية مع فهرسة.تمت الدورة على نظام Illumina HiSeq 4000 (Illumina، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) مع إضافة 20% من PhiX. تم تسلسل ما مجموعه 5,830 مليون قراءة لـ 115,256 خلية.
محاذاة ومعالجة مسبقة لبيانات تسلسل RNA أحادي الخلية
تمت معالجة ملفات Fastq الخاصة بالترانسكريبتوميات عبر خط تحليل Rhapsody القياسي (BD Biosciences) وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. أولاً، يتم تصفية قراءات R1 و R2 للحصول على قراءات عالية الجودة، مع إسقاط القراءات القصيرة جدًا (أقل من 66 قاعدة لـ R1 وأقل من 64 قاعدة لـ R2) أو التي تحتوي على درجة جودة قاعدة أقل من 20. يتم توضيح قراءات R1 لتحديد تسلسلات علامات الخلايا والمعرفات الجزيئية الفريدة (UMIs)، ويتم تعيين قراءات R2 إلى التسلسلات المرجعية المناسبة باستخدام Bowtie2.أخيرًا، يتم دمج جميع قراءات R1 و R2 الناجحة وتوضيحها للجزيئات المعنية. من أجل مراقبة جودة القراءات، تم تطبيق تصحيح الأخطاء القائم على الاستبدال التكراري (RSEC) وتصحيح الأخطاء القائم على التوزيع (DBEC)، وهما خوارزميات تم تطويرها من قبل الشركة المصنعة لتصحيح أخطاء PCR والتسلسل. لتحديد الخلايا المحتملة (التي ستحتوي على العديد من القراءات أكثر من تسميات خلايا الضوضاء)، تأخذ خوارزمية التصفية في الاعتبار عدد القراءات المصححة بواسطة DBEC، حيث تحسب المشتق الثاني الأدنى مع القراءات التراكمية كنقطة قطع. أخيرًا، تم الحصول على مصفوفة التعبير من عدد الجزيئات المعدلة بواسطة DBEC بتنسيق CSV. تم تحديد الخلية كخلية مفردة إذا كانت الحد الأدنى لعدد القراءات لعلامة عينة واحدة فوق العتبة.تم تصنيف الخلية كمتعددة إذا تجاوزت الخلية العتبة لأكثر من علامة عينة واحدة. تم تصنيف الخلية التي لا تلبي العتبة على أنها غير محددة. تم استبعاد كل من الخلايا المتعددة والخلايا غير المحددة من التحليل كما هو موضح أدناه.
معالجة وتحليل بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية
تم تحميل وتحليل مصفوفات عدد الجزيئات المعدلة بواسطة RSEC من خط أنابيب محاذاة Seven Bridges BD Rhapsody باستخدام Seurat v4.3.0.1. تم فصل العينات باستخدام مصفوفة استدعاء علامة العينة من خط أنابيب محاذاة Seven Bridges BD Rhapsody وتم تعيين البيانات الوصفية يدويًا لكل علامة. تم تصفية واختيار الخلايا عالية الجودة بناءً علىمن الحمض النووي الريبي من الجينات الميتوكوندرية، أكثر من 200 من الجينات الفريدة المعبر عنها وأكثر من 100 من عدد وحدات التسلسل الفريدة. تم تطبيع مصفوفة العد وتوسيعها باستخدام نموذج خطي عام غاما بواسون استنادًا إلى 8000 من الجينات الأكثر تباينًا باستخدام SCTransform v0.3.5. و glmGamPoi v1.10.2 تم تنفيذ حزم PCA وتقليل الأبعاد UMAP وتحديد الجيران الأقرب وتجميع لوفيان باستخدام وظائف Seurat القياسية مع المعلمات القياسية. تم اختيار أكثر دقة مستقرة للتجميع (SCT_snn_res.0.3) وفقًا لإرشادات حزمة clustree v0.5.0.تم إجراء التعبير الجيني التفاضلي باستخدام دالة “FindAllMarkers” في Seurat مع اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة، وقيمة p المعدلة باستخدام FDR والمعايير القياسية.
تم إجراء الجولة الأولى من التوصيف الواسع يدويًا استنادًا إلى الجينات الأكثر تعبيرًا بشكل مختلف عبر المجموعات (المعدلة-قيمة) وتم تمثيل أعلى 5 جينات معبرة باستخدام دالة “DotPlot” في Seurat. لتدقيق التحليل على مجموعات الاهتمام والحصول على توصيف أكثر تفصيلاً، تم اختيار البلعميات يدويًا وأعيدت العملية بالكامل باستخدام نفس المعايير. تم إنشاء مخطط الكمان لتعبير الجينات باستخدام دالة “VInPlot”. تم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي ضمن مجموعة ATM بين الظروف البرية و Spp1-/- باستخدام دالة “FindMarkers” في Seurat باستخدام اختبار ويلكوكسون لمجموع الرتب، وقيمة p المعدلة وفقًا لمعدل الاكتشاف الخاطئ والمعايير القياسية. تم تمثيل الجينات المعبرة بشكل تفاضلي في مخطط البركان باستخدام EnhancedVolcano v1.16.0 وتم تصفيتها بناءً على المعدل المعدل.-قيمةثم تم إدخال البيانات في بوابة Metascape (الإصدار 3.5.20230501) المستندة إلى الويب للحصول على مصطلحات إثراء الوظائف لمجموعة الجينات باستخدام عدة قواعد بيانات. تم إنشاء مخططات الأعمدة باستخدام حزمة ggplot2 الإصدار 3.4.3 من ملفات الإخراج المضغوطة لـ Metascape. تم إجراء جميع التحليلات على R الإصدار 4.2.2.
نقص الخلايا الدبقية الصغيرة
تم إعطاء إناث C57BL/6J الحوامل جسم مضاد أحادي النسيلة ضد CSF1Rتم حقن CSF1R، النسخة AFS98) أو التحكم في نوع IgG2a من الجرذ (النسخة R35-95؛ BD Biosciences) عن طريق الحقن داخل الصفاق في E 6.5 و E 7.5، كما تم وصفه سابقًا.بدلاً من ذلك، تم إعطاء الفئران الحوامل مثبط CSF1R PLX3397 (Plexxikon) مخلوطًا في العلف القياسي (Ssniff) من E6.5 أو E12.5 حتى E15.5. كانت جرعة PLX3397 هيوتلقت المجموعات الضابطة الطعام القياسي. تم التحقق من كفاءة إجراءات الاستنفاد بواسطة الكيمياء المناعية في المراحل الجنينية وفي حديثي الولادة P0 لكل مجموعة من المواليد بعد الولادة.
تنشيط المناعة الأمومية
ليبوبوليسكاريد في محلول فوسفات البفر المعقمتم حقن الفئران الحامل في اليوم الثالث عشر والنصف من الحمل (E13.5) بمادة (InvivoGen وSigma) عن طريق الحقن داخل البطن. وتم حقن محلول PBS المعقم في الإناث الحوامل الضابطة بنفس الطريقة وفي نفس الوقت، دون تأثيرات ملحوظة على النمط الظاهري الجنيني.
التلوين المناعي النسيجي على الشرائح
للتلوين المناعي النسيجي، تم تثبيت أدمغة الأجنة الفأرية فييرجى العثور على المرفق فيلمدة ساعتين إلى overnight، اعتمادًا على المرحلة التطورية. لتحليل أدمغة ما بعد الولادة، تم ضخ الحيوانات بـيرجى الملاحظة، تم تشريح الأدمغة، ثم تم تثبيتها بعد ذلك طوال الليل فيقبل تقطيعها إلى أقسام في PBS. تم وصف إعداد نسيج دماغ الجنين البشري أعلاه.
تم إجراء الكيمياء المناعية على عينات عائمة حرة-شرائح دماغ الفأر المقطوعة باستخدام جهاز الاهتزاز بسماكة--قطع أنسجة بشرية مقطعة باستخدام جهاز التبريد السميك. تم تحضين الشرائح أولاً لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT) فيترايتون X-100جيلاتين في PBS (محلول الحجب)، ثم تم الحضانة عند“بينما كانت في نفس محلول الحجب طوال الليل مع الأجسام المضادة الأولية التالية: فأر مضاد-CD68 (1/500؛ Bio-Rad Cat# MCA1957، RRID:AB_322219)، أرنب مضاد-FN1 (1/200؛ Millipore Cat# AB2033، RRID:AB_ 2105702)، ماعز مضاد-FOXP2 (1/500؛ Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-21069، RRID:AB_2107124)، دجاج مضاد-GFP (1/1000؛ Aves Labs Cat# GFP-1020، RRID:AB_10000240)، أرنب مضاد-IBA1 (1/500؛ FUJIFILM Wako Shibayagi Cat# 019-19741، RRID:AB_ 839504)، أرنب مضاد-IBA1 (بشري) (1/500؛ Abcam Cat# ab178846، RRID:AB_2636859)، دجاج مضاد-IBA1 (1/500؛ Synaptic Systems Cat# 234009، RRID:AB_2891282)، فأر مضاد-Lgals3 (MAC2) (1/1000؛ CEDARLANE Cat# CL8942AP، RRID:AB_10060357)، فأر مضاد-L1 (1/100؛ Millipore Cat# MAB5272، RRID:AB_2133200)، مضاد-LYVE1 المسمى بالبيوتين (1/200؛ Thermo Fisher Scientific Cat# 13-044382، RRID:AB_1724157)، فأر مضاد-بروتين المايلين الأساسي (MBP) (1/300؛ Millipore Cat# MAB386، RRID:AB_94975)، فأر مضاد-mDectin-1 (CLEC7A) (1/30؛ InvivoGen Cat# mabg-mdect، RRID:AB_2753143)، فأر مضاد-علامة الألياف العصبية SMI-312 (1/300؛ BioLegend Cat# 837904، RRID:AB_2566782)، ماعز مضاد-أوستيوأكتيفين (GPNMB) (1/200؛ R and Dترايتون إكس-100 وتم حضنه عندمن ساعتين إلى overnight مع الأجسام المضادة الثانوية التالية (“في PBS، مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش): أليكسا 10 فلور® 488-المترافق مع الأتان المضاد للدجاج (رقم الكاتالوج# 703-545-155، RRID:AB_2340375)، أليكسا 10 فلور® 488-المترافق مع الأتان المضاد للماعز (رقم الكاتالوج# 705-545-147، RRID:AB_2336933)، أليكسا 10 فلور® 488-المترافق مع الأتان المضاد للفأر (رقم الكاتالوج# 712-545-150، RRID:AB_2340683)، أليكسا 10 فلور® 488-المترافق مع الأتان المضاد للأرنب (رقم الكاتالوج# 711-545-152، RRID:AB_2313584)، Cy3-المترافق مع الأتان المضاد للماعز (رقم الكاتالوج# 705-165-147، RRID:AB_2307351)، Cy3-المترافق مع الأتان المضاد للأرنب (رقم الكاتالوج# 711-165-152، RRID:AB_2307443)، Cy3-المترافق مع الأتان المضاد للفأر (رقم الكاتالوج# 712-165-150، RRID:AB_2340666)، أليكسا 10 فلور® 647-المترافق مع الأتان المضاد للماعز (رقم الكاتالوج# 705-605-147، RRID:AB_2340437)، Cy5-المترافق مع الأتان المضاد للماعز (رقم الكاتالوج# 705-175-147، RRID:AB_2340415)، Cy5-المترافق مع الأتان المضاد للماعز (مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش رقم الكاتالوج# 705-175-147، RRID:AB_2340415) و Cy5-المترافق مع الأتان المضاد للفأر (رقم الكاتالوج# 712-175-150، RRID:AB_2340671). تم استخدام هوشت (1/1000؛ سيغ
تنظيف الأنسجة
استخدمنا نسخة معدلة من بروتوكول التصفية iDISCO+ المنشور سابقًا.تمت جميع خطوات الحضانة في درجة حرارة الغرفة في خزانة غازات، على جهاز تدوير الأنابيب (SB3، ستيوارت) بسرعة 0.045 جرام، باستخدام أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل (فالكون) مغطى بورق الألمنيوم لحجب الضوء. تم تجفيف عينات دماغ E16.5 أولاً من خلال حضانة متتالية لمدة 90 دقيقة في سلسلة متدرجة.، و ) من الميثانول ( MeOH ، سيغما-ألدريتش) المخفف في تبع ذلك إزالة الدهون في ثنائي كلورو ميثان (DCM؛ سيغما ألدريتش) لمدة 30 دقيقة. أخيرًا، تم تنظيف العينات طوال الليل في ديبنزيل إيثر (DBE؛ سيغما ألدريتش) ثم تم تخزينها في قوارير زجاجية بنية مملوءة بـ DBE في الظلام عند درجة حرارة الغرفة.
تحضير الأنسجة لميكروسكوب الإلكترون الناقل (TEM)
تمت معالجة أجنة الفئران E14.5 بمحلول 4% PFA و2.5% جلاutaraldehyde (درجة EM) في PBS. تم الاحتفاظ بالأجنة المثبتة، المغلفة بورق الألمنيوم، على الثلج لمدة 30 دقيقة للسماح بتشبع الجلاutaraldehyde. ثم تم تشريح الأدمغة من الأجنة وحضنت.بين عشية وضحاها في منطقة عازلة من PFA في PBS.تم جمع مقاطع الفيبرايتوم، وغسلها 3 مرات في PBS وثبتت فيأكسيد الأوزميوم الرباعي في PBS لمدة ساعتين. تم تلوين العينات بشكل جماعي بـأسيتات اليورانيوم المائي عندلمدة 1.5 ساعة. ثم تم تجفيف العينات عن طريق الحضانة المتتالية لمدة 10 دقائق في تركيزات متدرجة من الإيثانول.وثلاث مرات ) وتم شطفها عن طريق الحضانة في الأسيتون اللامائي 3 مرات لمدة 10 دقائق. تم تسرب العينات بتركيزات متدرجة من راتنج أرالدايت 502 ( ساعة لكل خطوة) وتم حضنها لمدة ساعتين في راتنج نقي تم تحضيره حديثًا. ثم تم تثبيت العينات في كمية قليلة من الراتنج بين فيلمين من ACLAR 33C، مع إجراء البلمرة عند لمدة 48 ساعة. قبل القطع، تم لصق كتل العينات بشكل متوازي مع السطح المسطح لكتلة أسطوانية من الراتنج المستخدمة كدعم. تم الحصول على مقاطع رقيقة جداً بسمك 70 نانومتر من العينات باستخدام ميكروطوم فائق (UC6، لايكا). تم جمع المقاطع الرقيقة جداً على شريحة مغطاة بالفورمفار.تم إجراء صبغ إيجابي للشبكات عن طريق الحضانة لمدة دقيقتين في محلول مائي UranyLess (دلتا ميكروسكوبي) تلاها صبغ بالسترات الرصاصية لمدة دقيقة واحدة.
فحوصات الرنين المغناطيسي
بعد التثبيت، تم تخزين الأجنة في خليط 1:250 من 0.5 مليمول من حمض غادوتيريك (دوتاريم ®، غيربي) في PBS لمدة لا تقل عن 72 ساعة. للتصوير، تم تضمين الأجنة فيهلام الأجار ذو نقطة الانصهار المنخفضة (سيغما-ألدريتش) وتم وضعه في حاويات بلاستيكية صغيرة. تم إجراء عمليات الاستحواذ على تردد لامور 17.2 تسلا (1H).ماسح Bruker Biospec ما قبل السريرية مزود بملف طاقة قفص طيور رباعي بقطر داخلي 25 مم (Rapid Biomedical). تم الحصول على صور ثلاثية الأبعاد مع وزن T1 باستخدام تسلسل Fast-Low Angle Shot (FLASH) بدقة متساوية تبلغ 40 ميكرومتر.
تحفيز آفات قشرية داخل الرحم
تم تخدير إناث الفئران الحوامل في اليوم الرابع عشر ونصف من الحمل باستخدام الإيزوفلورانللتعريف،أثناء الجراحة) وتم إعطاؤهمن البوبرينورفين المحقون تحت الجلد لتخفيف الألم. تم كشف قرون الرحم بعد عملية فتح البطن. تم تحفيز آفات قشرية داخل الرحم بشكل أحادي باستخدامقطر شعيرة زجاجية، من خلال ثقب في الصفيحة القشرية حتى البطين الجانبي، كما هو معتاد في عملية التحفيز الكهربائي داخل الرحم أو العدوى الفيروسية.تم ترك الأجنة المصابة للتعافي في رحم الأم لمدة 2.5 ساعة بعد الجراحة، وبعد ذلك تم جمع أدمغتها وتثبيتها فييرجى العثور علىبين عشية وضحاها.
اختبار البلعمة خارج الجسم
تم إعداد الشرائح كما هو موصوف سابقًامع التعديلات التالية. تم إعداد وسط التشريح من الوسط الأساسي الأدنى (MEM) (جيبكو) مع 20 مللي مول من مسحوق TRIS pH7-9 (سيغما) و 45 مللي مول من D-glucose (سيغما). بعد قطع أدمغة التيلينسيفال إلىتم تخزين شرائح الاهتمام من الأقسام التاجية لجهاز الفيبرايتوم في هذا الوسط على الثلج حتى الاستخدام. بالنسبة لابتلاع الخلايا خارج الجسم، تم إعادة تعليق pH-rodo (تقنيات الحياة) عندفي وسط التشريح الذي يحتوي على 2.5 مللي مول ومع HEPES (Gibco) لكل 50 مل. بعد الإزالة الدقيقة لـ MEM،تم إضافة محلول pHrodo إلى قمة كل شريحة وتم حضنه لمدة ساعة واحدة عندفيتم إيقاف التفاعل بإضافة وسط تعليق pH-rodo بارد. بعد ثلاث غسلات، تم تثبيت الشرائح فيقم بتثبيت العينة في PBS لمدة 45 دقيقة، تليها تقنية المناعية النسيجية كما هو موضح أعلاه.
بالغتم تخدير الفئران (P60) بعمق باستخدام الإيزوفلوران وتم قطع رؤوسها. تم إزالة الدماغ بسرعة ووضعه في محلول ACSF المبرد على الثلج والذي يحتوي على (بالمليمول):الجلوكوز و75 سكر مستمر في الفقاعات مع الكاربوغين O2/ شرائح تاجية حادة (CO2).-سميك) تحتوي على اللوزة تم إعدادها باستخدام جهاز 7000 SMZ-2 فيبراتوم (كامدن إنسترومنتس المحدودة، المملكة المتحدة) في محلول سكر بارد. تم نقل الشرائح لمدة 30 دقيقة في حرارة دافئة ( ) ACSF الذي يحتوي على (بالمليمول): و 25 جلوكوز، مشبع بـ 95% O2-5% CO2، ثم وُضِع في غرفة تسجيل وتم ضخّه باستمرار بمحلول ACSF مُنفَخ بـ O2/5% CO2 ( ). تم تصور الخلايا العصبية المسجلة باستخدام ميكروسكوب أوليمبوس BX51WIF (أوليمبوس، فرنسا) مزود بكاميرا Qimaging RETIGA 2000R (Teledyne Photometrics، الولايات المتحدة الأمريكية) تعمل بواسطة Micro-Manager (مختبر فالي، USCF، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تسجيل الإشارات الكهربية باستخدام مضخم Multiclamp 700B (رأس CV-7B)، ولوحة اكتساب Digidata 1440A وبرنامج pClamp 10.3 (أجهزة جزيئية، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تصفية الإشارات الكهربية عند 2 كيلو هرتز وتم أخذ عينات عند 10 كيلو هرتز. تم تحليل البيانات بشكل غير متصل (برنامج pClamp-10، أدوات أكسون). تم تعويض مقاومات السلسلة حتى الحد الأقصى. تم إجراء تسجيلات توصيل الخلايا الكاملة في الخلايا الهرمية من اللوزة القاعدية الجانبية (BLA) باستخدام أنابيب زجاجية بوروسيليكات.المقاومة) تحتوي على (بالمليمول): – فوسفات الكرياتين؛ 15 BAPTA؛ 4 Na2-ATP؛ 0.4 Na2-GTP؛ 1 QX314. لم يتم تصحيح القيم لجهد الوصل السائل. تم قياس التيارات الغلوتاماترية (EPSCs) عند جهد الانعكاس للأحداث التي تتوسطها مستقبلات GABA-A ( -70 مللي فولت ) وتم قياس التيارات التي تتوسطها مستقبلات GABA-A (IPSCs) عند جهد الانعكاس للأحداث الغلوتاماترية ( +5 مللي فولت ) في المحلول الخارجي (ACSF) الذي يحتوي على مضاد مستقبلات NMDA (تم الحصول على التحفيز المشبكي خارج الخلوي من خلال تطبيق نبضات جهد خارج الخلوي (0.1 هرتز، أنظمة A-M، الولايات المتحدة الأمريكية) تم توصيلها باستخدام أنبوب ثانٍ مليء بمحلول مخفف بالهيبز، موضوع بالقرب من كبسولة اللوزة (الشكل S6C). تم تعديل شدة التحفيز لكل خلية من أجل استثارة EPSC قابل للمقارنة. ثم تم حساب نسبة I/E من خلال قسمة سعات IPSC وEPSC المقاسة في نفس الخلية مع الحفاظ على نفس موضع وشدة التحفيز.
اكتساب الصورة وتحليلها تصوير الشرائح
تم الحصول على صور الكيمياء المناعية على الشرائح باستخدام مجهر ثنائي العينين بالفلوروسينس (Leica MZ16 F) أو مجهر فلوروسينس (Leica DMi8) أو مجهر كونفوكال (Leica TCS SP5 و TSP8). تم إجراء تحليلات الصور باستخدام FIJI (ImageJ؛ RRID: SCR_003070) وImaris (Bitplane؛ RRID:SCR_007370) وبرنامج Adobe Photoshop CS6 (Adobe Systems؛ RRID:SCR_014199).
تصوير ومعالجة iDISCO ثلاثي الأبعاد
تم إجراء التصوير ثلاثي الأبعاد باستخدام مجهر فائق II (LaVision BioTec) باستخدام برنامج ImspectorPro (LaVision BioTec). تم توليد شريحة الضوء بواسطة ليزر (طول موجي 488 ليزر ياقوتي متماسك، LaVision BioTec) وعدستين أسطوانيتين. تم وضع العينات في خزان تصوير مصنوع من الكوارتز 100% (LaVision BioTec) مملوء بالإيثيل سينامات وتم إضاءته من الجانب بواسطة ضوء الليزر. تم التقاط الصور باستخدام كاميرا PCO Edge SCMOS CCD.-حجم البكسل، LaVision BioTec). كانت المسافة بين كل صورة ثابتة عند. تم تسجيل الفلورية الخلفية لجميع العينات الناتجة عن التعرض لطول موجة 488 نانومتر من أجل إعادة بناء شكل الدماغ والآفات. تم إنشاء الصور والحجم ثلاثي الأبعاد والأفلام باستخدام برنامج Imaris x64 (الإصدار 10.0، Bitplane؛ RRID:SCR_007370). تم تحويل صور المكدس أولاً إلى ملف imaris (.ims) باستخدام ImarisFileConverter. تم تقليل حجم الملف بعد ذلك إلى 8 بت. تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعينة باستخدام “عرض الحجم” (Imaris). يمكن تقطيع العينة بصريًا عند أي زاوية باستخدام أدوات “المقطع العمودي” أو “المقطع المائل” للتحقق من التغيرات الظاهرية. تم تسليط الضوء على الآفات الناتجة عن نقص الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال إنشاء قناع حول الحجم باستخدام أداة “السطح”. لهذا الغرض، تم اختيار بكسلات منخفضة الكثافة الناتجة عن الفلورية الخلفية المنخفضة (أي غياب الخلايا في الآفات) في حالة التعرض 488 نانومتر من أجل إنشاء حجم “السطح”. تم الحصول على قيم الحجم للأسطح التي تم إنشاؤها تلقائيًا من برنامج Imaris وتمت مقارنتها بين ظروف مختلفة (الشكل 2C). تم إنشاء صور ثلاثية الأبعاد وأفلام باستخدام أدوات “لقطة” و”تحريك”. تم إنشاء أساطير الأفلام باستخدام برنامج FIJI ImageJ.
تصوير ثلاثي الأبعاد ومعالجة صبغة الخلايا الدبقية الصغيرة وصبغة الفيبروكتين 1
تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا الدبقية الصغيرة وصبغة الفيبروكتين 1 (FN1) (الأشكال 5J و5K وS7B) باستخدام Imaris 10.0.0 (Bitplane؛ زيورخ، سويسرا). لكل حيوان، تم الحصول على من خليتين إلى خمس خلايا دبقية صغيرة CSA كأكوام z على مجهر ضوئي متماسك (Leica TCS SP8) مع هدف و عامل تكبير، باستخدام – حجم خطوة وإعدادات متطابقة. تم استخدام خلايا الدبقية الصغيرة فقط ضمن مستوى التركيز لصبغة FN1 للتحليلات. ثم تم تنعيم عمليات الاستحواذ وتم طرح الخلفية في برنامج FIJI ImageJ (NIH) وفقًا لـ تم تحويل الصور الناتجة إلى ملف Imaris (.ims) باستخدام ImarisFileConverter، ثم تمت معالجتها وتحليلها في Imaris 10.0.0 (Bitplane؛ زيورخ، سويسرا) كما تم وصفه سابقًا. باختصار، تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للعينة باستخدام خيار عرض السطح في عرض Surpass، مع طريقة تحديد العتبة بناءً على الكثافة المطلقة للإشارة. بالنسبة لعرض الحجم ثلاثي الأبعاد للخلايا الدبقية الصغيرة، تم ضبط عتبة IBA1 (لنقطة الزمن E14.5/E15) أو إشارة Cx3cr1-GFP (لنقطة الزمن P3) يدويًا لتظهر الخلية بشكل مناسب. بالنسبة لعرض إشارة FN1 ثلاثية الأبعاد، تم تعيين العتبة لإعادة البناء عند 2 ضعف العتبة المكتشفة تلقائيًا، لتظهر التراكمات عالية الكثافة. من أجل قياس إشارة FN1 داخل الخلايا الدبقية الصغيرة، تم إنشاء قناة باستخدام وظيفة القناع، مما يحجب إشارة FN1 داخل سطح الخلايا الدبقية الصغيرة. تم إجراء عرض ثلاثي الأبعاد لإشارة FN1 المحجوبة بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نفس قيمة العتبة التي تم تعيينها لعرض إشارة FN1 الكلية. تم تسجيل حجم كل سطح معبرًا عنه في من علامة التبويب Graph. ثم تم التعبير عن حجم FN1 المحجوبة كنسبة من حجم الخلايا الدبقية الصغيرة (باستخدام حجم IBA1/Cx3cr1-GFP) للتطبيع. تم إجراء قياس غير متحيز لجميع الصور بشكل أعمى لعلاج الحيوانات. تم إنشاء صور ثلاثية الأبعاد باستخدام أداة “لقطة” في Imaris.
تصوير المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)
تم إجراء TEM باستخدام مجهر إلكتروني ناقل Philips Tecnai 12 (Philips/FEI، أيندهوفن، هولندا) في قسم التصوير الإلكتروني من منصة Imachem للتصوير (France Biolmaging) في معهد البيولوجيا في المدرسة العليا للنورمال، باريس. تم استخدام برنامج Gatan DigitalMicrograph للحصول على صور TEM بتكبيرات مختلفة باستخدام كاميرا CCD Orius 1000 بدقة 4K (Gatan).
القياس والتحليل الإحصائي
تم إجراء التسمية المشتركة لـ IBA1 أو الخلايا البلعمية مع علامة الخلايا الدبقية الصغيرة P2Y12 وعلامات ATM على أكوام متماسكة 25x، تكبير 1x (Leica DM6 FS) مع سمك و حجم خطوة z وتم قياسها بشكل محدد في الخلايا المتراكمة على طول CSA، والخلايا الدبقية الصغيرة المتفرعة المجاورة في القشرة، بالإضافة إلى الخلايا المتراكمة في CSB وحول الآفات الناتجة عن التحفيز داخل الرحم في القشرة باستخدام أداة عد الخلايا في برنامج FIJI ImageJ (الأشكال 1 و4F وS1). تم إجراء التسمية المشتركة لـ Cx3cr1-GFP الخلايا البلعمية مع علامات ATM على أكوام متماسكة 10x، تكبير 1x (Leica DM6 FS) مع سمك و– حجم خطوة وتم قياسها بشكل محدد في الخلايا المتراكمة على طول CSA في الجراء المعالجة بالتحكم وPLX3397 عند P3 باستخدام أداة عد الخلايا في برنامج FIJI ImageJ (الشكل 7A).
تم إجراء تحليل تغطية CD68 في ATMs عند E14.5 على أكوام متماسكة 40x، تكبير 1x (Leica TCS SP8) مع سمك و حجم خطوة z (الشكل S1K). تم تحليل ما لا يقل عن 5 خلايا دبقية صغيرة شبيهة بالأميبا في CSA (Spp1+) وما لا يقل عن 5 خلايا دبقية صغيرة متفرعة مجاورة (Spp1-) لكل حيوان لمجموع أجنة E14.5. لكل خلية، تم إنشاء أقنعة لـ GFP (مخطط الخلية) وCD68 (إشارة الليزوزوم داخل الخلية) وتم قياس مساحة كل قناع في برنامج FIJI ImageJ. تم حساب تغطية CD68 كنسبة من إشارة CD68 (قناع CD68) التي تغطي مساحة الخلايا الدبقية الصغيرة (مساحة قناع GFP).
تم قياس توزيع الخلايا الدبقية الصغيرة في منطقة CSA في الفئران الضابطة وEmx1 ; المتحورة عند E18.5 باستخدام أداة عد الخلايا في FIJI ImageJ على أكوام متماسكة 10x، تكبير 1x مع سمك و عمليات الاستحواذ المتماسكة z (Leica DM6 FS). تم إجراء القياس في 3 مناطق متميزة تم تعريفها كما يلي: (1) CSA، مركزة على الحدود وبعرض , (2) المنطقة المحيطة بـ CSA بعرض و(3) المنطقة البعيدة، التي تحيط بالمنطقة المحيطة (2) بعرض (الشكل S3). تم قياس توزيع الخلايا الدبقية الصغيرة في منطقة CSA في الفئران الضابطة وPLX3397 عند P3 باستخدام أداة عد الخلايا في FIJI ImageJ على أكوام متماسكة 10x، تكبير 1x مع سمك و عمليات الاستحواذ المتماسكة z (Leica DM6 FS) (الشكل 6D). تم إجراء القياس في منطقتين متميزتين تم تعريفهما كما يلي: (1) CSA، مركزة على الحدود وبعرض , (2) المنطقة المحيطة بـ CSA بعرض .
لتقييم شدة الآفات بعد النقص في ; RhoA الفئران، Brn4 ; Wnt3A الفئران (الأشكال 3C-3G)، أو الأجنة والجراء المعرضة لـ PLX3397 (الشكل 7) أنشأنا نظام تسجيل يعتمد على مساحة الآفة المقاسة عبر برنامج FIJI ImageJ، حيث قد تظهر الضوابط بعض التجاويف الصغيرة (الأشكال 3A و3B). لكل دماغ، تم اختيار مساحة أكبر آفة تم ملاحظتها على الشريحة، وتم تعيين الدرجات بناءً على غياب الآفة (الدرجة 0)، آفة خفيفة (الدرجة 1) أو آفات شديدة (الدرجة 2). يعرض الجدول S2 تسجيل الآفات بالتفصيل. ثم تمت مقارنة متوسط الدرجات لشدة الآفات عبر ظروف تجريبية مختلفة إحصائيًا.
تم قياس صبغة Spp1 وFN1 خارج الخلايا في CSA في الفئران الضابطة وPLX3397 عند P3 على أكوام متماسكة 20x، تكبير 1x (Leica TCS SP8) مع سمك و حجم خطوة z (الأشكال 7 وS7). تم قياس متوسط شدة الإشارة في برنامج FIJI ImageJ في 3 مناطق من الاهتمام ( مربعات) التي استبعدت أجسام الخلايا الدبقية الصغيرة (GFP+) لكل دماغ: عند مستوى CSA، وكذلك القشرة المجاورة وBLA. بالنسبة لكل من Spp1 وFN1، تم حساب نسبة كمتوسط شدة الإشارة عند CSA مقسومًا على متوسط شدة الإشارة في القشرة المجاورة وBLA.
مقالة الخلايا
تم تقديم البيانات كمتوسط الخطأ القياسي للمتوسط (SEM)، باستثناء عندما يتم الإشارة إليها صراحة في أسطورة الشكل. تم استخدام اختبارات مان-ويتني U الثنائية غير المعلمية لمقارنة توزيعين في التسمية المشتركة، تغطية CD68، شدة الآفة وتجارب شدة الإشارة. تم استخدام اختبار فيشر الدقيق لمقارنة وجود أو غياب آفات CSA/CSB في الضوابط، Spp1-/-, والفئران المعالجة بـ PLX3397. تم إنشاء جميع الرسوم البيانية والتحليلات الإحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software؛ RRID:SCR_002798). ; ns، غير مهم ( ).
لتحليلات النسخ الجيني للخلايا الفردية على الأنواع البرية والمتحورات Spp1-/-، تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام (الإصدار 4.2.2).
خلية
مقالة
الرسوم التوضيحية التكميلية
خلية مقالة
مقالة خلوية
الشكل S3. يتم تعديل تجنيد الخلايا الدبقية الصغيرة بواسطة التغيرات العالمية في تشكيل الدماغ، المتعلقة بالشكل 3 تظهر علامات IBA1 المناعية في المقاطع التاجية توزيع الخلايا الدبقية الصغيرة في المجموعة الضابطة و; أدمغة الطفرات في E18.5. تظهر الفئران الطافرة تراكمات من الخلايا الدبقية الصغيرة في منطقة CSA المتضررة وأعدادًا أقل في المناطق المحيطة، على الرغم من عدم وجود فرق عام في أعداد الخلايا الدبقية الصغيرة في منطقة CSA الذيلية أو القشرة الجديدة الأمامية.على الأقل من 2 سلالات متميزة لكل من الشهادات والمتحولات). (ب) قياسات خلايا IBA1+ في جميع منطقة CSA، القشرة الجديدة الأمامية وداخل المناطق الفرعية لـ CSA (1-3). تظهر الرسوم البيانية المتوسطات تم إجراء اختبارات مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية، *p < 0.05. شريط القياس، . أم، اللوزة الدماغية؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزية؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط.
مقالة خلوية
الشكل S4. يؤدي تعطيل Spp1 إلى تغيير مؤقت في سلامة CSA و CSB، مرتبط بالشكل 5 (أ) رسم نقطي يوضح مستوى التعبير المتوسط لـ Spp1 و Gpnmb في أنواع خلايا مختلفة من La Manno وآخرون.بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية عبر نقاط زمنية جنينية مختلفة (229,948 خلية). اللون يمثل مستوى التعبير المتوسط عبر جميع الخلايا داخل مجموعة، بينما يشير حجم النقطة إلى نسبة الخلايا المعبر عنها في تلك المجموعة. (ب) E14.5 نصف مقطع كورونالي ملون بصبغة هوشت، يظهر سلامة CSA في الفئران الضابطة و Gpnmbالمتحولات (رؤوس السهام المفتوحة) (، ، من ما لا يقل عن 2 من سلالات متميزة). (C) تمييز المناعية L1 يظهر سلامة CSB في الفئران الضابطة و Gpnmbالمتحولات (رؤوس السهام المفتوحة) (، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). (د) آفات CSA و CSB في الطفرات Spp1-/- مؤقتة وقد تم امتصاصها، على التوالي، بحلول E18.5“، من ما لا يقل عن 2 من سلالات متميزة) و P3 (، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). تظهر الرسوم البيانية النسب المئوية للدماغ مع الآفات، لكن النقاط الفردية تمثل أدمغة بها آفة (100) أو بدون آفة (0)، لتوضيح أعداد العينات. تصوير UMAP لجميع الخلايا المرتبة (من الأجنة البرية [WT] و Spp1-/- في عمر 14.5 و 18.5 يومًا) ملونة حسب المجموعات المعلنة (نوع الخلية العريض). (F) خريطة UMAP لجميع الخلايا المرتبة مقسمة وملونة حسب ظروف WT (رمادي فاتح) و Spp1-/- (رمادي داكن). (G) رسم نقطي للتعبير المتوسط المقاس ونسبة أعلى 5 جينات معبرة بشكل مختلف (DEGs) حسب مجموعات البلعميات المعلنة (RefinedCellType). شريط القياس،. ATM، الميكروغليا المرتبطة بالألياف المحورية؛ BAM، البلعميات المرتبطة بالحدود؛ CC، الجسم الجاسئ؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططة-اللوزية؛ CSB، حدود القشرة-الحاجز؛ Fx، الحُصين؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ MG، الميكروغليا؛ PVM، البلعميات المحيطية للأوعية؛ Se، الحاجز؛ Str، المخطط؛ WT، النوع البري.
الشكل S5. جدول زمني لإغلاق آفة CSB مشابه لذلك في CSA، مرتبط بالشكل 6 (أ) مقاطع كورونالية ملونة بعكس باستخدام هوشت تظهر منطقة CSB في Csf1rالفئران. تم ملاحظة آفات تجويفية (رؤوس الأسهم الصلبة) بشكل منهجي في الطفرات حتى P7، بينما كانت غائبة في الشهادات أو تم امتصاصها في الطفرات عند P30 (رؤوس الأسهم المفتوحة)، بشكل مشابه لما تم ملاحظته في CSA. ). (ب) مقاطع كورونالية تظهر منطقة CSB (رؤوس الأسهم المفتوحة) في الجراء المعرضة مسبقًا لـ PLX3397 في P0 وP3 وP7 وP20. تم امتصاص الآفات التجويفية (رؤوس الأسهم الصلبة) بشكل تدريجي خلال الأسبوع الأول بعد الولادة، مع جدول زمني مشابه لـ CSA.; ). تظهر الرسوم البيانية النسب المئوية للدماغ مع الآفات، لكن النقاط الفردية تمثل أدمغة بها آفة (100) أو بدون آفة (0) لتوضيح التباين. تم إجراء اختبار فيشر الدقيق للمقارنة الإحصائية.“; غير دالة ( ). قضبان القياس، . CC، الجسم الثفني؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Se، الحاجز.
الشكل S6. التأثير طويل الأمد على منطقة CSA بعد إغلاق الآفة، مرتبط بالشكل 6 (أ) مقاطع نصفية تاجية من 28 دماغًا ملونة بمؤشر الألياف العصبية الشامل SMI-312 وبروتين المايلين الأساسي (MBP) وHoechst تكشف عن تغييرات في منطقة CSA في Csf1rالفئران. المسارات المحورية لكبسولة اللوزة، الواقعة بين القشرة الجديدة والنواة الجانبية القاعدية للوزة (BLA)، تكون غير منظمة في الطفرات (رؤوس الأسهم الصلبة) مقارنةً بالتحكمات (رؤوس الأسهم المفتوحة)، مما يبرز العواقب الشكلية طويلة الأمد لغياب الخلايا الدبقية الصغيرة وإصابات CSA في مرحلة الطفولة المبكرة، حتى بعد إغلاق الإصابة.، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). (ب) تظهر مقاطع نصفية من أدمغة الفئران تم تلطيخها مناعياً باستخدام علامة الألياف العصبية المحورية SMI-312 وبروتين المايلين الأساسي (MBP) (يسار) أو باستخدام MBP و FOXP2 (يمين) تغييرات في منطقة CSA للفئران المعرضة قبل الولادة لـ PLX3397 (رؤوس الأسهم الصلبة) مقارنةً بالمجموعة الضابطة (رؤوس الأسهم المفتوحة). إن المسارات المحورية للكبسولة اللوزية والخلية العصبية المثبطة الإيجابية لـ FOXP2 غير منظمة، مما يبرز العواقب الشكلية طويلة الأمد لغياب الميكروغليا المبكر وآفات CSA المؤقتة.; من ما لا يقل عن اثنين من القمامات المتميزة لكل حالة). (C) تمثيل تخطيطي للنهج التجريبي (يسار) المستخدم لتسجيل كل من التيارات ما بعد المشبكية المثيرة (EPSCs) والتيارات ما بعد المشبكية المثبطة (IPSCs) من خلايا هرمية في اللوزة الدماغية استجابةً لتحفيز الكبسولة اللوزية. من المهم أن تحفيز الكبسولة اللوزية تم تصميمه لتحفيز EPSCs بجهد يتراوح بين -150 و -350 pA في كل من الطفرات الجينية والفئران المعرضة لـ PLX3397 قبل الولادة، وتم قياس IPSCs لاحقًا عن طريق تغيير الجهد الثابت لتقييم نسبة التثبيط/الإثارة (I/E). تظهر سعة EPSCs وIPSCs ونسبة I/E (يمين) توازنًا متغيرًا في الأجنة المعرضة لـ PLX3397، مقارنةً بالضوابط عند P60.خلايا من 5 حيوانات وعلى الأقل من 2 نسل مختلفين،خلايا، من 5 حيوانات ومن على الأقل 2 من سلالات مختلفة). مقاييس الرسم، (أ و ب، تكبير منخفض) و (ب، تكبير عالي). الرسوم البيانية تظهر المتوسطاتتم إجراء اختبارات مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية، ****p < 0.0001. أم، اللوزة الدماغية؛ أمبل، السعة؛ BLA، النواة القاعدية الجانبية من اللوزة الدماغية؛ CSA، حدود القشرة-المخيخ-اللوزة؛ EPSCs، تيارات ما بعد المشبك المثيرة؛ I/E، نسبة التثبيط/الإثارة؛ IPSCs، تيارات ما بعد المشبك المثبطة؛ Ncx، القشرة الجديدة.
خلية مقالة
الشكل S7. تبتلع الخلايا الدبقية الليفية الفيبروكتين 1 أثناء إصلاح آفة CSA، مرتبط بالشكل 7 (أ) إشارة الفيبروكتين 1 (FN1) بعد صبغة المناعة تتجمع عند CSA P 3 القابض في Cx3cr1تم التعرض للجراء في مرحلة ما قبل الولادة لـ PLX3397 في كل من الميكروغليا المتجددة والأنسجة المحيطة بها، في حين تم الكشف عن إشارة FN1 القليلة فقط خارج الأوعية الدموية في الضوابط. تمثل المربعات المنقطة المناطق التي تم قياس شدة إشارة FN1 في الفضاء خارج الخلوي في CSA، والقشرة الجديدة (Ncx) واللوزة (Am). تُظهر الكمية (على اليمين) شدة إشارة FN1 في CSA، المعدلة بالنسبة لمتوسط إشارات القشرة الجديدة واللوزة في كل من الضوابط والجراء المعرضة لـ PLX3397 في مرحلة ما قبل الولادة. ٤؛ ، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). (ب) تكبير عالي وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد لميكروغليا CSA المحددة كـ Cx3cr1تظهر الخلايا الإيجابية زيادة طفيفة في حجم FN1 داخل الخلايا الدبقية الصغيرةفئران؛الفئران؛ من على الأقل سلالتين متميزتين وعلى الأقل خليتين تم قياسهما ومتوسطهما لكل حيوان) وزيادة ملحوظة في عدد الخلايا الدبقية الصغيرة مع شموليات FN1 في أدمغة P3 التي تعاني من الامتصاص مقارنةً بالتحكمات (; ; الفئران من على الأقل ولادتين متميزتين). تظهر الرسوم البيانية المتوسطاتتم إجراء اختبار مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية،“; غير دالة ( ). قضبان القياس: في ( أ )؛ في (B، الوسوم المناعية)؛ وفي (إعادة البناء ثلاثي الأبعاد). أم، اللوزة الدماغية؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزية؛ Ncx، القشرة الجديدة.
الشكل 2. الخلايا الدبقية الصغيرة ضرورية لسلامة الأنسجة في CSA و CSB الجنيني (أ) صبغة هوكست لشرائح الدماغ نصفية التاج من الأجنة في عمر E14.5 أو E15.5، تظهر سلامة CSA في الشهادات (سهم مفتوح) وآفات تجويفية في غياب الخلايا الدبقية الصغيرة (أسهم صلبة) ); ومن الأجنة E18.5، تظهر توطين آفات التجاويف CSA، المحاذية للقشرة الجديدة (Ncx)، والسترياتوم (Str)، واللوزة (Am) ( ١١، ). (ب) تلوين L1 المناعي يلون الجسم الثفني (CC) والقرن (Fx)، مما يبرز سلامة CSB في الضوابط (رؤوس الأسهم المفتوحة) والآفات التجويفية (رؤوس الأسهم الصلبة) في نماذج مختلفة تعطل استعمار الخلايا الدبقية. ). (C) إعادة بناء التجويف (باللون الأصفر) بعد تنظيف نصف الدماغ بالكامل باستخدام iDISCO، مما يبرز غياب التجاويف في العينات الضابطة والتجاويف الموجودة بشكل نمطي في نموذجين من النقص.وتمكين القياس الثلاثي الأبعاد لحجوم الآفات (برنامج إيماريس). (د) صور الرنين المغناطيسي للدماغ بالكامل لفئران E15.5 أو P0، تظهر إشارات منخفضة الكثافة تؤكد تشكيل آفات في منطقة CSA للأجنة المعالجة بـ PLX3397 (رؤوس الأسهم الصفراء المملوءة) بالمقارنة مع الشهادات (رؤوس الأسهم الصفراء المفتوحة) ( ). (E) صور الرنين المغناطيسي للدماغ بالكامل لفئران E15.5 أو E18.5، تظهر إشارات منخفضة الكثافة تؤكد تشكيل آفات في منطقة CSA من Csf1rالأجنة (رؤوس الأسهم الصلبة الصفراء) بالمقارنة مع الضوابط (رؤوس الأسهم المفتوحة الصفراء؛ ). (F) صور الرنين المغناطيسي للدماغ بالكامل لفئران E18.5، تظهر إشارات منخفضة الكثافة تؤكد تشكيل آفات في CSB لـ Csf1rالأجنة (رؤوس الأسهم الصلبة الصفراء) بالمقارنة مع الشواهد (رؤوس الأسهم المفتوحة الصفراء) ). تظهر الرسوم البيانية المتوسطاتSEM. مان-ويتنيتم إجراء اختبارات للمقارنة الإحصائية، **ص < 0.01. شريط القياس: في (أ) و (ب)؛ في (C)؛ و . أم، اللوزة؛ CC، الجسم الثفني؛ CSA، حدود القشرة-المخاطية-اللوزية؛ CSB، حدود القشرة-الحاجز؛ Fx، الحُصين؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ OB، البصلة الشمية؛ Se، الحاجز؛ Str، العقدة. انظر أيضًا الشكل S2 ومقاطع الفيديو S1-S4.
(C و D) E14.5 (C) و E18.5 (D) مقاطع نصفية إكليلية تظهر عدم وجود اختلافات في الميكروغليا التي تعبر عن Mac2 و GPNMB في CSA و CSB من الضوابط (سهام مفتوحة) والأجنة Spp1-/- (، في كل مرحلة من مرحلتين على الأقل من سلالتين متميزتين). تصوير UMAP لبيانات تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-seq) التي تمثل مجموعات الماكروفاج المستخرجة من الأجنة البرية (WT) و Spp1-/- في مراحل E14.5 و E18.5 ملونة حسب المجموعات المعلنة (RefinedCellType). رسم بياني على شكل كمان يعرض تعبير Spp1 المعاير والمقاس عبر المجموعات المعلنة بين الفئران من النوع البري (WT) (رمادي فاتح) وSpp1-/- (KO) (رمادي داكن) مما يظهر أن تعبير Spp1 مقصور إلى حد كبير على ATM من النوع البري (المجموعة 5). مخطط البركان للجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) بين ظروف WT و Spp1-/- في خلايا ATM (معدل الاكتشاف الخاطئ [FDR] المعدلوالمتوسط_تظهر الجينات التي تم تقليل تعبيرها في الأجنة Spp1-/- باللون البرتقالي، بينما تظهر الجينات التي تم زيادة تعبيرها باللون الأخضر، وتمت إضافة بعض الجينات يدويًا. (H) مخططات الأعمدة لتغنيت مجموعة الجينات في Metascape للـ DEGs (G) في كل من ظروف WT أو Spp1-/-, مع تسليط الضوء على المسارات المرتفعة (باللون الأخضر) والمخفضة (باللون البرتقالي) في الأجنة Spp1-/- مقابل الضوابط، مع تسليط الضوء على المسارات المتعلقة بالبلعمة بواسطة رأس سهم أحمر. (I) مقاطع دماغية من E15 Cx3cr1فئران تظهر وسمًا محددًا للفبرونيكتين 1 (FN1) داخل الميكروغليا ATM الإيجابية لـ GFP و Mac2 في CSA (تمت على مقاطع دماغية من ثلاثة فئران على الأقل من ولادتين مختلفتين). (ج) الحصول على صور مجهرية عالية التكبير وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد للخلايا (برنامج إيماريس) من مقاطع معلمة مناعياً من أدمغة الأجنة في عمر 14.5 يومًا تظهر Cx3cr1-الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية لـ CSA مع إشارة FN1 داخل أجسام الخلايا (تمت على مقاطع دماغية من ثلاثة فئران على الأقل من ولادتين مختلفتين). (ك) مقارنة نسبة حجم FN1 المقاس (برنامج إيماريس) داخل الميكروغليا الفردية تظهر انخفاضًا في طفرات Spp1 مقارنةً بالتحكمات، من على الأقل اثنين من القمامات المتميزة). تظهر الرسوم البيانية النسب في و ويعنيتم إجراء اختبار فيشر الدقيق لمقارنة توزيعات الحالات التي تحتوي على آفات في الضوابط، والأجنة المعرضة لـ Spp1-/- و PLX3397 (A و B)، وتم إجراء اختبارات مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية في جميع الرسوم البيانية الأخرى.; غير ذي دلالة ). قضبان القياس: (A، B تكبير منخفض، و D)؛ (C و F) ; (ج، يسار)؛ و (خلايا معاد بناؤها ثلاثية الأبعاد في F و G). ATM، الميكروغليا المرتبطة بالألياف المحورية؛ BAM، البلعميات المرتبطة بالحدود؛ CC، الجسم الجاسئ؛ CSA، حدود القشرة المخية-المخططية-اللوزة؛ CSB، حدود القشرة-الحاجز؛ DEGs، الجينات المعبر عنها بشكل مختلف؛ Fx، الحُصين؛ Intravasc mac، البلعميات الوعائية؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ PVM، البلعميات المحيطية للأوعية؛ Se، الحاجز؛ Str، المخطط؛ WT، النوع البري. انظر أيضًا الشكل S4 والجداول S3-S6.
الشكل S1. تشبه خلايا ATM الشبيهة بالجنين خلايا ATM بعد الولادة، المتعلقة بالشكل 1 (أ) رسم نقطي يوضح مستويات التعبير النسبية لجينات ATM الأساسية في الخلايا الدبقية الشبيهة بـ ATM في الأجنة مقارنة بالخلايا الدبقية غير المتكررة أو المتكررة في مجموعة بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية La Manno.يمثل اللون مستوى التعبير الطبيعي عبر جميع الخلايا داخل مجموعة، بينما تشير حجم النقطة إلى نسبة الخلايا التي تعبر عن كل جين في تلك المجموعة. (ب) إسقاط توقيع PAM بعد الولادة من مجموعة بيانات Liعلى مخطط UMAP من الشكل 1A الذي يظهر خلايا شبيهة بـ ATM جنينية. (C) مخطط فين يبرز التداخل بين الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) في دماغ الجنين ATM التي تم تحديدها في مجموعة بيانات لا مانو،الصندوق الآلي بعد الولادة في مجموعة بيانات هاموند،وما بعد الولادة PAM في مجموعة بيانات Li. (د) رسم بياني tSNE المعاد إنتاجه لـ 76,149 خلية تم تمييزها بواسطة scRNA-seq في مجموعة بيانات لا مانو. (E و F) إسقاطات توقيع ATM الجنيني المحدد في مجموعة بيانات لا مانووتوقيع PAM المحدد في مجموعة بيانات Li، مما يظهر التداخل مع مجموعة أجهزة الصراف الآلي هاموند 4. (G) تكبير منخفض لشرائح الدماغ من الفئران الجنينية في E15.0 و E18.5 يظهر تراكمات من الميكروغليا التي تعبر عن SPP1، والتي تم تحديدها على أنها Cx3cr1الخلايا البرانشيمية الإيجابية لـ IBA1 أو الإيجابية، مقصورة على CSA و CSB. (H) وسم المناعة لشريحة دماغ الجنين E15.0 CD11c-EYFP تظهر الميكروغليا الإيجابية لـ IBA1 التي تعبر عن YFP ) وعلامة الصراف الآلي CLEC7A ( ) في CSA. (I) مقارنة تعبير علامة ATM بين الخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة في القشرة الجديدة و CSA في E15.0 CD11c-EYFP و Cx3cr1-أدمغة إيجابية، تظهر أمثلة على CSA والمناطق القشرية الجديدة المستخدمة للتquantification؛ تم إجراء وسم المناعية على مقاطع الدماغ من 3 فئران على الأقل من 2 من سلالات مختلفة. (J) تم إجراء اختبار pHrodo على شرائح الدماغ خارج الجسم (على الأقلمن 2 فضلات متميزة) تظهر تلوينًا مكثفًا في الخلايا الدبقية الصغيرة في CSA عند E14.5. (ك) وسم المناعة لـ CD68 يظهر تصبغًا كثيفًا داخل الخلايا الدبقية الصغيرة CSA في E14.5 في ظروف فسيولوجية ومقارنة بين متوسط تغطية CD68 للخلايا الدبقية المتفرعة السلبية لـ SPP1 والخلايا الدبقية الصغيرة CSA الإيجابية لـ SPP1.خلايا في 4 فئران من 2 من سلالات مختلفة). (L) وسم المناعة لشرائح الدماغ العرضية البشرية GW9 و GW14 تظهر التعبير المشترك لعلامات ATM مع IBA1 في CSA.
الرسوم البيانية (تعبير علامات ATM وتغطية CD68) تظهر المتوسطاتتم إجراء اختبار مان-ويتني U للمقارنة الإحصائية،; شريط المقياس: في (G يسار) و (L يمين)؛ في (G، اليمين)؛ في (I)-(K)؛ في (H); في (L، أعلى اليسار)؛ و في (L، أسفل اليسار). ATM، الميكروغليا المرتبطة بالألياف المحورية؛ CC، الجسم الثفني؛ CSA، حدود القشرة القشرية-المخططية-اللوزة؛ DEGs، الجينات المعبر عنها بشكل مختلف؛ GW، أسبوع الحمل؛ MG، الميكروغليا؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ PAM، الميكروغليا المرتبطة بالمنطقة التكاثرية؛ Se، الحاجز؛ Str، المخطط.
الشكل S2. نماذج استنفاد البلعميات والتغير الوظيفي، المتعلقة بالشكل 2 (A-C) تأكيد استنفاد الميكروغليا في أدمغة Cx3cr1 الجنينيةالفئران في E14.5 و E18.5، حيث تم تعريض الأمهات الحوامل لـ (A) حقن داخل البطن لجسم مضاد مثبط لـ CSF1R (AFS) في E6.5 و E7.5 (E14.5، ); (B) التغذية بـ PLX3397، وهو مثبط دوائي لمسار CSF1R، من E6.5 إلى E15.0 (E14.5، ; E18.5، ); و (C) التغذية بـ PLX3397 من E12.5 إلى E15.0 (E15.5، تشير رؤوس الأسهم المفتوحة والصلبة إلى تراكم خلايا إيجابية GFP في CSA وآفة الأنسجة المحلية في CSA في غياب خلايا إيجابية GFP، على التوالي. (د) صورة مجهر إلكتروني ناقل لآفة CSA في دماغ الأجنة في عمر E14.5 من الأمهات المعالجات بـ PLX3397، تظهر وجود حطام خلوي (رؤوس الأسهم الصلبة) ولكن غياب الغشاء القاعدي. ).
(هـ) مقاطع كورونالية عبر نصف دماغ الأجنة E14.5 من الفئران البرية؛ تلك المعرضة لتنشيط المناعة الأمومية الخفيف (MIA)؛ وCx3cr1-/-, Dap12/ Tyro , والأجنة الطافرة التي تظهر غياب آفات CSA (رؤوس الأسهم المفتوحة) (على الأقل لكل حالة).
أشرطة القياس: في (A)-(C)، و(E)؛ في (D، تكبير منخفض)؛ و في (D، تكبير عالي).
CSA، حدود القشرة القشرية-المخططية-اللوزة؛ Ncx، القشرة الجديدة؛ Str، المخطط.
Microglia accumulate at fetal cortical boundaries where they preserve tissue integrity in the context of morphogenetic constraints. These immune cells prevent the formation of cavitary lesions and contribute to their rapid repair, highlighting protective functions during early brain development.
Microglia maintain structural integrity during fetal brain morphogenesis
Akindé René Lawrence, Alice Canzi, Cécile Bridlance, Nicolas Olivié, Claire Lansonneur, Clarissa Catale, Lara Pizzamiglio, Benoit Kloeckner, Aymeric Silvin, David A.D. Munro, Aurélien Fortoul, Davide Boido, Feriel Zehani, Hugues Cartonnet, Sarah Viguier, Guillaume Oller, Paola Squarzoni, Adrien Candat, Julie Helft, Cécile Allet, Francoise Watrin, Jean-Bernard Manent, Pierre Paoletti, Denis Thieffry, Laura Cantini, Clare Pridans, Josef Priller, Antoinette Gélot, Paolo Giacobini, Luisa Ciobanu, Florent Ginhoux, Morgane Sonia Thion, Ludmilla Lokmane, and Sonia Garel Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS), École Normale Supérieure, CNRS, INSERM, Université PSL, Team Brain Development and Plasticity, 75005 Paris, France Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, Paris, France Sorbonne Université, Collège Doctoral, 75005 Paris, France Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS), École Normale Supérieure, CNRS, INSERM, Université PSL, Team Computational Systems Biology, 75005 Paris, France Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS), École Normale Supérieure, CNRS, INSERM, Université PSL, Team Glutamate Receptors and Excitatory Synapses, 75005 Paris, France Gustave Roussy Cancer Campus, INSERM, Team Myeloid Cell Development, 94800 Villejuif, France UK Dementia Research Institute at the University of Edinburgh, Centre for Clinical Brain Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh, UK INMED, INSERM, Aix-Marseille University, Turing Centre for Living Systems, Marseille, France NeuroSpin, CEA, Paris-Saclay University, Gif-sur-Yvette, Saclay, France Institut de Biologie de l’École Normale Supérieure (IBENS), École Normale Supérieure, CNRS, INSERM, Université PSL, Electron Microscopy Facility, 75005 Paris, France Institut Cochin, INSERM, CNRS, Université Paris Cité, Team Phagocytes and Tumor Immunology, 75014 Paris, France UMR-S 1172, JPArc – Centre de Recherche Neurosciences et Cancer, University of Lille, Lille, France University of Edinburgh Centre for Inflammation Research, Edinburgh EH16 4TJ, UK Simons Initiative for the Developing Brain, University of Edinburgh, Edinburgh, UK Department of Psychiatry and Psychotherapy, School of Medicine, Technical University Munich, 81675 Munich, Germany Neuropsychiatry and Laboratory of Molecular Psychiatry, Charité – Universitätsmedizin and DZNE Berlin, 10117 Berlin, Germany Service d’anatomie Pathologique, Hôpital Trousseau APHP, 75571 Paris Cedex 12, France University of Lille, CHU Lille, Inserm, Laboratory of Development and Plasticity of the Neuroendocrine Brain, Lille Neuroscience and Cognition, UMR-S 1172, 59000 Lille, France Singapore Immunology Network (SIgN), Agency for Science, Technology and Research, Singapore 138648, Singapore Collège de France, Université PSL, 75005 Paris, France Present address: Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR 3738, Team Machine Learning for Integrative Genomics, 75015 Paris, France These authors contributed equally These authors contributed equally Lead contact*Correspondence: sonia.garel@bio.ens.psl.euhttps://doi.org/10.1016/j.cell.2024.01.012
Abstract
SUMMARY Microglia (MG), the brain-resident macrophages, play major roles in health and disease via a diversity of cellular states. While embryonic MG display a large heterogeneity of cellular distribution and transcriptomic states, their functions remain poorly characterized. Here, we uncovered a role for MG in the maintenance of structural integrity at two fetal cortical boundaries. At these boundaries between structures that grow in distinct directions, embryonic MG accumulate, display a state resembling post-natal axon-tract-associated microglia (ATM) and prevent the progression of microcavities into large cavitary lesions, in part via a mechanism involving the ATM-factor Spp1. MG and Spp1 furthermore contribute to the rapid repair of lesions, collectively highlighting protective functions that preserve the fetal brain from physiological morphogenetic stress and injury. Our study thus highlights key major roles for embryonic MG and Spp1 in maintaining structural integrity during morphogenesis, with major implications for our understanding of MG functions and brain development.
Microglia (MG), the brain-resident macrophages, play key roles in the development and maintenance of brain circuits throughout life. These immune sentinels are involved in key steps of neural network assembly, for instance, by regulating neuronal numbers, synaptic development and refinement, maturation of myelin, synaptic transmission or neuronal excitability. In agreement with the diverse roles of MG, their dysfunction has been linked to almost all brain pathologies, ranging from developmental disorders to neurodegenerative diseases. Anatomical and recent single-cell (sc) transcriptomic studies have shown that MG exist in distinct cellular and transcriptomic states, particularly during development, aging, and neurodegeneration. This transcriptomic diversity, as shown in the white matter and cerebral cortex and in induced pluripotent cells, can be driven by the local environment, revealing a symbiotic relationship between MG and their local cerebral niches. Yet, how such heterogeneity relates to specific locations and functions of these multifaceted cells, especially during the dynamic period of prenatal development, remains poorly understood.
MG originate from yolk sac-derived macrophages that migrate and seed the brain primordium during early embryogenesis. This process starts from embryonic day 9 (E9) in mice, and gestational week 4 (GW4) in humans. MG subsequently colonize the parenchyma during the dynamic phases of cerebral development, characterized by a prolonged phase of neuronal generation, migration and wiring, as the brain grows, folds and changes of shape. In both human and mice, MG colonize the brain in a progressive, highly stereotyped manner characterized by an uneven distribution: MG accumulate at hotspots, avoid selective regions such as the developing cortical plate, and exhibit a diverse range of morphologies, cellular behaviors, and transcriptomic states. Although microglial heterogeneity is progressively lost as development proceeds, it can reemerge in the context of aging and disease. In physiological conditions, microglial heterogeneity spans both the prenatal and post-natal periods. In particular, specific populations of amoeboid MG present in the post-natal cortical white matter, including the corpus callosum(CC), display a specific transcriptomic state and have been variously termed axon-tract-associated microglia (ATM), proliferative-region associated microglia (PAM), youth-associated microglia (YAM), or CD11c-positive (+) MG. Post-natal ATM/PAM/YAM/ CD11c , or ATM, are characterized by the expression of Spp1 (encoding osteopontin or OPN), Lgals3, Gpnmb, Clec7a, Itgax (encoding CD11c), Csf1, and Igf1, sharing transcriptomic features with disease-associated microglia (DAM), initially identified in mouse models of Alzheimer’s disease and observed in various neurodegenerative contexts. Functionally, post-natal ATM are involved in the engulfment of nascent glial cells, regulation of myelination, and promotion of neuronal survival, in part through Igf1 expression. While these studies highlight a link between post-natal microglial hotspots, specific transcriptomic states and functions, the roles of prenatal accumulations and their potential cellular heterogeneity remain largely to be deciphered.
Here, by combining transcriptomic analyses, imaging and genetically modified mouse models, we reveal that MG maintain the structural integrity at the fetal cortico-striato-amygdalar boundary (CSA) and cortico-septal boundary (CSB), where embryonic MG accumulate and display a specific state resembling post-natal ATM. These boundaries, which are vulnerable to developmental tensions linked to brain growth and morphogenesis, rely on MG to prevent the formation of large cavitary lesions, in part via a mechanism involving the pleiotropic ATM-factor Spp1/OPN. MG and Spp1 furthermore contribute to the rapid repair of large lesions, which highlights their protective functions in preserving the fetal brain from physiological morphogenetic tensions and injuries. Our study thus reveals that embryonic MG and the ATM-factor Spp1 play critical roles in maintaining the structural integrity of the developing brain during normal morphogenesis, with major implications for our understanding of MG functions and cerebral development.
RESULTS
ATM-like MG accumulate at two embryonic cortical boundaries
While the developmental heterogeneity of MG has been established by anatomical and sc transcriptomic studies, whether microglial transient accumulations in the embryonic brain are composed of cells in specific states is yet to be determined.
As a first step toward exploring the heterogeneity of MG during embryogenesis, we took advantage of a longitudinal brain sc transcriptomic dataset generated by La Manno et al. between E 9 and By extracting and analyzing MG from this dataset, we identified 3 distinct clusters: cycling MG, non-cycling MG and embryonic MG that resemble post-natal ATM/PAM/YAM/ CD11c (Figure 1A). Embryonic ATM-like cells are particularly present from E14 onward (Figures 1A-1C and S1A; Table S1) and share a core genetic signature with previously described post-natal white-matter ATM (Figures 1B and 1D) or PAM (Figures S1B-S1D) : they notably express Spp1, which codes for OPN, Csf1, Igf1, Lgals3, which codes for Galectin3/ Mac2 and Gpnmb (Figure S1A; Table S1). Consistently, embryonic ATM-like and PAM gene signatures are present mainly in the ATM cluster described by Hammond and colleagues (Figures S1D-S1F), highlighting similarities between these prenatal and post-natal transcriptomic signatures.
To assess whether embryonic ATM-like cells may locate in specific regions, we first focused on mid-neurogenesis (E14.5), when microglial distribution starts to be noticeably uneven across the developing forebrain. Using the mouse line, which labels all macrophages, we observed a significant accumulation of GFP MG at the boundary between the cerebral cortex, striatum , and amygdala, which we called the CSA (Figures 1E and S1G-S1I). The bona fide microglial identity of GFP cells was confirmed by their location in the parenchyma (Figure 1E) and expression of the microglial marker P 2 Y 12 receptor but not the perivascular macrophage marker LYVE1 (Figure 1E). These cells were most abundant at E15 and co-expressed ATM-specific markers at this time point (Figures1E and S1G-S1I). Using CD11ceYFP mice and immunostainings we found that approximately
60% of CSA MG co-expressed proteins encoded by ATM “core” signature genes: CD11c, Mac2, Clec7A, Spp1, and GPNMB (Figures 1E and S1G-S1I). This contrasted with adjacent regions, where only few sparse cells expressed these markers (Figures 1E, S1G, and S1I), highlighting a local and dense CSA ATM-like accumulation between E14.5 and E16.5, with cells restricted to the ventrocaudal CSA at E18.5 (Figure S1G). In addition to their distinct transcriptomic signature, ATM-like cells exhibited an amoeboid morphology, phagocytic activity as assessed in ex vivo slices, and higher expression levels of the lysosomal marker CD68 than the neighboring MG (Figures S1J and S1K). Thus, like post-natal ATM, embryonic ATM-like MG seem highly phagocytic, reinforcing similarities between pre- and post-natal ATM states beyond their conserved transcriptomic signature. To investigate whether a similar accumulation occurs in humans, we labeled fetal brains from GW9 to GW14 and detected a conserved pattern of MG expressing ATM-core factors at the CSA throughout these stages (Figure S1L). These data show that, in both mice and humans, MG expressing an ATMlike signature accumulate at the embryonic CSA.
Since the ATM-like transcriptomic signature is detected throughout fetal life, we conducted a longitudinal study of the embryonic forebrain after E14.5 to investigate whether other accumulations were present at later prenatal stages. In addition to the CSA, we found only one large and dense accumulation of ATM-like cells at the midline between E16.5 and E18.5, at the CSB (Figures 1F and S1G). This hotspot was located below the CC, consistent with where post-natal ATM reside later in life and indicating a continuum of ATM accumulations that spans the pre- and post-natal periods. Using a conserved combination of core ATM markers (Spp1, Clec7A, GPNMB, and Mac2), we found that approximately of MG accumulating at the CSB co-expressed ATM markers at E18.5 (Figure 1F).
These data show that MG expressing an ATM signature accumulate at the embryonic CSA and CSB, two boundaries between the neocortex and adjacent brain structures.
MG maintain structural integrity at ATM-dense cortical boundaries
Accumulation of ATM-like MG at the CSA and CSB occurs much earlier than the extensive generation of other glial cells or the
development of myelin, both of which have been associated with post-natal ATM functions. To investigate the potential role of MG in the development of the CSA and CSB, we examined various established and novel models of macrophage and MG depletions by mainly targeting the colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) signaling pathway, which is required for microglial survival. We first administered a CSF1R-blocking antibody (AFS98) to dams at E6.5 and E7.5, causing a transient depletion of microglial progenitors and a severe depletion of MG until E18.5 (Figure S2A), followed by a progressive microglial repopulation during the first post-natal week. We also achieved similar depletion/repopulation by feeding pregnant dams with PLX3397, a pharmacological inhibitor of CSF1R, between E6.5 and E15 (Figure S2B) and compared with Pu. 1 mutant embryos that lack all myeloid cells, independently of the CSF1R signaling. As these models target both MG and other macrophage populations over a broad embryonic period, we also performed more transient depletions by treating pregnant dams with PLX3397 for only 3 days, between E12.5 and E15, overlapping the timing of microglial accumulation at the CSA (Figure S2C). Finally, and importantly, we examined Csf1r mice that lack MG yet retain most other brain macrophages and enable to interrogate MG-specific roles in brain circuits. In all the mutants or depleted embryos, including the 3 days PLX3397 treatment and Csf1r embryos, we found that the lack of MG induced a large “cavitary lesion” at the CSA starting at E14.5 (Figure 2A) and persisting until E18.5 (Figure 2A). These cavities, which formed where ATMlike MG normally accumulate (Figure 1E), lacked cell bodies and showed no contact with the ventricles, prompting us to examine them using electron microscopy (EM) (Figure S2D). As observed in PLX3397-treated embryos, the cavitary lesions did not contain cells or displayed a basal lamina (Figure S2D), but rather comprised sparse irregular membrane debris, resembling cysts, or pseudocysts that are reported in several human pathologies, including leukoencephalopathies. In contrast, we did not observe such cavitary lesions in models perturbing already known developmental functions of MG, such as Cx3cr1, Dap12/TyroBP, and complement receptor 3 (CR3) mutants, or in embryos exposed to a mild prenatal inflammation (maternal immune activation [MIA]) (Figure S2E). To further assess the
Figure 1. ATM-like microglia accumulate at the embryonic CSA and CSB
(A) Single-cell transcriptomic uniform manifold approximation and projection (UMAP) plot of embryonic microglial cells extracted from the La Manno dataset, showing cycling MG (orange), non-cycling MG (purple), and embryonic ATM-like MG (green).
(B) Projection of the post-natal ATM signature (top-enriched differentially expressed genes [DEGs]) from the Hammond dataset onto (A).
(C) Proportion of cycling (orange), non-cycling (purple), and embryonic ATM-like MG (green) at different embryonic stages.
(D) Venn diagram showing the overlap between embryonic and post-natal ATM DEGs, respectively, identified from La Manno and Hammond datasets (fold change , Bonferroni-adjusted ).
(E) Immunolabeling of brain sections from E14.5 or E15 Cx3cr1 or CD11c-EYFP embryos showing co-expression of microglia and ATM markers at the CSA. CSA close ups are delineated by dotted lines. GFP-positive microglia in Cx3cr1 brains fully colocalized with the microglial marker P2Y12 receptor, and IBA1 was used to label microglia in CD11c-EYFP brains (performed on brain sections of at least three mice from two different litters).
(F) Immunolabeling of coronal brain sections from E18.5 Cx3cr1 or CD11c-EYFP embryos showing co-expression of microglia and ATM markers at the cortico-septal boundary (CSB), below the corpus callosum (CC). CSB close ups are delineated by dotted lines. GFP-positive microglia in Cx3cr1 brains fully colocalized with the IBA1 marker, which was used to label all microglia in CD11c-EYFP brains (performed on brain sections of at least three mice from two different litters).
Graphs show means SEM. Scale bars: in (E, upper left); in (E, lower); in (E, upper right) and (F); and (E insets).
ATM, axon-tract-associated microglia; ATM-like, axon-tract-associated-like microglia; CC, corpus callosum; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; CSB, cortico-septal boundary; DEGs, differentially expressed genes; MG, microglia; Ncx, neocortex; Se, Septum; Str, striatum.
See also Figure S1 and Table S1.
C
D
E
F
impact of microglial depletion on the other cortical boundary where ATM-like cells accumulate, we examined the CSB in all the models of MG depletion (Figures 2A and S2A-S2C). Similar to what we observed at the CSA, the absence of MG at the CSB induced midline cavitary lesions, where embryonic ATMlike MG normally accumulate (Figure 2B).
To rule out the possibility that either CSA or CSB cavities were caused by tissue damage during sectioning, we analyzed whole brains using iDISCO clearing and magnetic resonance imaging (MRI). iDISCO clearing and 3D hemibrain reconstruction performed in both CSF1R depletion models revealed CSA lesions located in the caudal third of the telencephalic vesicles, at the border between the caudal insular cortex, claustrum, striatum, and amygdala (Figure 2C; Videos S1 and S2). Similarly, wholehead MRI scans of fixed PLX3397-treated and Csf1r embryos, and newborns pups showed bright bilateral hyperintensities after contrast enhancement, unequivocally confirming the presence of CSA cavitary cystic lesions in the absence of MG (Figures 2D and 2E). Likewise, midline CSB cavitary lesions was observed with iDISCO transparization (Videos S3 and S4), and in MRI scans when the contrast at the midline enabled visualization (Figure 2F).
Overall, the embryonic absence of MG leads to a sequential loss of structural integrity at both the CSA and CSB, two sites where ATM-like MG normally accumulate, revealing an important physiological function of MG during prenatal development.
MG limit the formation of cavitary lesions due to morphogenetic stress
The involvement of MG in maintaining tissue cohesion at cortical boundaries raised the question of the specificities of these boundaries. The CSB, located at the border between the cerebral cortex and the septum, is subjected to morphogenetic constraints that increase as the cerebral cortex grows, and displays a normally occurring cavity called the cavum septum that resorbs over development. The CSA, similarly to the CSB, is located at the border between the cerebral cortex and structures growing at different rates and in distinct directions, making it a region of morphogenetic tensions and tissue reorganization.
We therefore focused on the CSA to investigate whether such boundaries exhibit specific features and could be affected by morphogenetic constraints.
We first characterized the local CSA niche of ATM during normal physiological development at E14.5. Interestingly, the CSA was characterized by microcavities that were only sparsely populated by cells and that were bordered by MG expressing the ATM markers Mac2 and Spp1 (Figure 3A). EM confirmed the presence of microcavities surrounded by MG at the CSA (Figure 3B). These microcavities lacked a basal lamina, contained cell membrane fragments, and were systematically abutted by MG displaying an amoeboid morphology, which is a characteristic of CSA MG (Figure 3B). Our observations raised the possibility that such physiological microcavities might contribute to the local microglial recruitment and/or the induction of an ATM-like state. Furthermore, they suggested that in the absence of MG, microcavities might progress into larger lesions due to local morphogenetic constraints, with notable effects on fetal brain integrity.
To experimentally test the hypothesis that CSA cavitary lesions form due to unrestrained stress linked to morphogenesis, we examined the embryonic brains of mice in which genetic mutations generate increased or decreased developmental constraints (Figures 3C-3G). First, we used a genetic model of conditional inactivation ( ), in which a large periventricular nodular heterotopia (PVNH) forms from E15.5 (Figures 3C and 3D), increasing constraints on the developing cortex and affecting its thickness and organization. At E18.5 and onward, when the heterotopia is large and cortical morphogenesis affected, we observed visible lesions at the CSA in 50% of mutant embryos, progressing into large lesions observed in all cases at P8 (Figures 3C and 3D). While the distribution of MG was not drastically altered at early stages, the growth of the heterotopia correlated with the recruitment of MG at the CSA at E18.5, even in embryos that did not show yet marked lesions at this time point (Figure S3). Our findings hence reveal that drastically increasing morphogenetic tensions can, even in the presence of MG, ultimately lead to CSA lesions, thereby revealing that this region is a site of morphogenetic vulnerability.
Figure 3. Microglia limit the progression of CSA microcavities into large lesions in response to morphogenetic constraints
(A) IBA1, Spp1, and Mac2 immunostaining findings indicate that ATM line microcavities (solid arrowheads), visible by Hoechst counterstaining at E14.5 ( , from at least two distinct litters).
(B) Transmitted electron microscopy (EM) also reveals the presence of microcavities (solid arrowheads), lined with amoeboid microglia (green pseudo-color), and containing membrane fragments (open arrowheads) ( , from at least two distinct litters).
(C and D) Coronal hemisections (C) from control and ; mice, the latter displaying a periventricular nodular heterotopia (PVNH) visible from E18.5 onward (dotted lines). Hoechst counterstaining shows the absence of CSA lesions in controls and mutants at E15.5 (open arrowheads), a striking CSA lesion (solid arrowheads) in of the E 18.5 mutants and in of the mutants at P8 ( , ). Quantification in (D) uses values that represent the scoring of lesion severity, scored from 0 to 2, as detailed in Table S2.
(E) Coronal hemisections of E15.5 brains from Brn4 ; Wnt3a embryos show an ablation of the thalamus (white asterisk) and a global change in brain shape but no marked impact on the CSA ( ).
(F and G) Coronal hemisections (F) of E15. 5 brains from control and Brn4 ; Wnt3a mice exposed to PLX3397 between E12.5 and E15.5. While PLX3397exposed controls consistently displayed lesions (open arrowheads), PLX3397-treated mutants exhibited smaller lesions or no lesions (solid arrowheads) despite effective local depletion as assessed by IBA1 staining ( , from at least two distinct litters). Quantification in (G) uses values that represent the scoring of lesion severity, scored from 0 to 2, as detailed in Table S2.
Graphs show means SEM. Mann-Whitney tests were performed for statistical comparison, ; *** ; ns, non significant ( ). Scale bars: (A, left); (A and F, high magnifications); ; and , and , low magnification).
Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; PVNH, periventricular nodular heterotopia; Ncx, neocortex; Str, striatum; Th, thalamus.
See also Figure S3.
Although MG were not able to compensate for such drastic developmental changes, they could nonetheless limit the progression of cavitary lesions at the CSA in the context of milder morphogenetic stress, as occurring in physiological conditions. To directly investigate this possibility, we tested whether alleviating morphogenetic constraints would limit lesion formation in the context of microglial absence. We took advantage of Brn4 ; Wnt3A embryos, which lack a large brain structure, the thalamus (Th), and therefore experience reduced morphogenetic stress in the developing forebrain (Figures 3E-3G). As expected, the CSA was preserved in E15.5 mutants (Figure 3E). Remarkably, the treatment of Brn4 ; Wnt3A dams with PLX3397 during a short time window between E12.5 and E15.5 revealed that mutant embryos with reduced morphogenetic stress showed fewer and smaller lesions when MG are depleted (Figures 3F and 3G). These observations thus show that the extent of CSA lesions is driven by morphogenetic constraints.
Taken together, our results indicate that the CSA is a site of developmental vulnerability, where MG accumulate in response to morphogenetic constraints. In physiological conditions, MG prevent the progression of cavitary lesions due to morphogenetic stress, thereby preserving the structural integrity of this fetal cortical boundary.
ATM-like MG are induced by morphogenetic stress and tissue lesions
Our results indicate that increasing or alleviating morphological tensions alters the recruitment of MG and tissue integrity at the CSA. Since ATM-like MG are normally detected at this boundary, we wondered whether changes associated with morphogenetic stress could contribute to the induction of the ATM-like state.
To address this question, we first examined whether core ATM markers were expressed at the CSA of both Emx1 ; RhoA and Brn4 ; Wnt3A embryos (Figures 4A-4D). We found that the very local and specific recruitment of MG at the CSA of Emx ; RhoA embryos (Figure S3) was characterized by a marked increase in proportion of amoeboid cells expressing the ATM marker Spp1 at E18.5 (Figures 4A and 4B). Conversely, we observed a conserved recruitment of MG at the CSA in Brn4 ; Wnt3A embryos, although with a reduced proportion of cells co-expressing the ATM-factor Spp1 (Figures 4C and 4D). Thus, drastic changes in morphogenetic constraints correlated with the recruitment of MG at the CSA and the local and specific induction of ATM-like features.
Since modifications in morphogenetic stress are linked to tissue damage (Figure 3), we further tested whether creating exogenous lesions was sufficient to recruit embryonic MG and/or induce ATM-like features. To this aim, we induced in utero lesions (IULs) in the neocortex of E14.5 Cx3cr1 embryos by performing a stab-wound using a glass pipette (Figure 4E). We examined the brains 2.5 h after the injury to assess the initial response (Figures 4E and 4F). After 2.5 h , we already observed a marked accumulation of Cx 3 cr1 -positive cells at the lesion site, with approximately of these cells also expressing the ATM markers Spp1 or Mac2, and 10% expressing GPNMB (Figure 4F). Thus, in utero mechanical stab-lesions led to rapid recruitment of -positive cells that expressed some ATM-core markers at the site of lesion (Figure 4F).
Overall, these results indicate that morphogenetic stress and induced tissue damage can drive the local recruitment of MG with ATM-like features, which in turn, could contribute to limit the progression of large cavitary lesions at the CSA.
ATM-factor Spp1 contributes to structural integrity at cortical boundaries
The role of MG in tissue cohesion at ATM-like hotspots raises the question of the underlying molecular mechanisms. As mentioned, we did not observe CSA cavitary lesions in genetic models perturbing known developmental functions of MG, such as Cx3cr1, Dap12/TyroBP, and CR3 mutants (Figure S2E), suggesting the involvement of alternative pathways. We focused on ATM-specific molecules known to modulate immune functions and contribute to adhesion and tissue remodeling, such as Spp1 and GPNMB. In particular, Spp1, which encodes OPN, has been linked to tissue remodeling, wound healing and repair processes, and its secreted form has recently been shown to promote microglial phagocytosis in the context of neuronal damage and in early stages of Alzheimer’s disease. We took advantage of available global knockouts, as these factors are highly and specifically expressed by MG in the prenatal brain at these developmental time points (Figure S4A). While mice lacking Gpnmb displayed normal brain structure (Figures S4B and S4C), approximately 50% of those lacking Spp1 showed cavitary lesions at the CSA at E14.5 (Figure 5A), and 70% had lesions at the CSB at E18.5 (Figure 5B). The cavities rapidly resorbed overtime, within 24 h , suggesting that while Spp1/OPN contributes to maintaining structural integrity in the developing brain (Figure S4D), additional factors or microglial properties appear to be implicated. Importantly, ATM factors, including Mac2 and GPNMB, were still expressed in Spp1 mutants at both the CSA and CSB (Figures 5C and 5D), indicating that Spp1 is not required for the induction of these ATM-core factors but rather contributes to microglial function in brain integrity at cortical boundaries.
To investigate how Spp1 inactivation may affect embryonic microglial functions, we performed sc transcriptomic analyses on macrophages from both wild-type (WT) and Spp1 mutants at E14.5 and E18.5 (Figures 5E-5H and S4E-S4G). Using MACSsorting of CD45-positive cells from forebrains at these two time points, in which Spp1 inactivation impairs CSA and CSB integrity, we identified individual clusters corresponding to different cell types and states (Figure S4E; Table S3), that were all present in control and mutant conditions (Figure S4F). We next focused on macrophages (Figures 5E-5H; Table S4) and observed high Spp1 expression selectively in the ATM cluster of controls (Figure 5F), confirming our transcriptomic (Figure S4A) and immunostaining analyses (Figures 5C and 5D). We further assessed differentially expressed genes (DEGs) between ATM-like cells in controls and mutant embryos (Table S5) and found that the transcriptomic signature of ATM-like cells is altered in mutant embryos (Figures 5G and 5H). Both direct comparison (Figure 5G) and pathway analyses using Metascape (Figure 5H; Table S6) indicated that Spp1 inactivation impacts specific functional pathways in ATM-like cells: the expression of several ATM-core markers (such as Lgals3, ApoE, and Ftl1) was decreased and, among several altered pathways, phagocytosis-related pathways were downregulated, consistent with previously described effects of
Figure 4. ATM-like microglia are induced by morphogenetic constraints and tissue mechanical lesions
(A and B) Coronal E18.5 brain hemisections immunostained with IBA1 and Spp1 showing a marked recruitment of Spp1-expressing microglia at the CSA of Emx1 ; RhoA mice, with approximately of Spp1-positive CSA microglia in mutants, but of CSA cells detected in controls at this stage ( at least for each condition, from a minimum of two distinct litters).
(C and D) Coronal E15.5 brain hemisections immunostained for IBA1 and Spp1 showing a significantly diminished percentage of CSA microglia expressing Spp1 in E15.5 Brn4 ; Wnt3a mutant mice compared to controls, despite a conserved number of accumulating cells ( at least for each condition, from a minimum of two distinct litters).
(E) Schematic representation of in utero lesion (IUL) procedure induced by mechanical poking of the neocortex using a glass capillary.
(F) Coronal sections through the E14.5 neocortex of control and IUL embryos collected 2.5 h after lesion induction, showing amoeboid Cx3cr1 -positive cells accumulating at the lesion site and the co-expression of Spp1 and Mac2 (solid arrowheads) in IUL embryos but dispersed Cx3cr1 -positive cells and no expression of ATM markers in controls ( , from at least two distinct litters). Quantification of the percentage of -positive cells at the lesion site co-expressing ATM markers ( from at least two distinct litters).
Graphs show means SEM. Mann-Whitney tests were performed for statistical comparison, . Scale bars: in (A) and in (C) and (F). Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex; Str, striatum.
Figure 5. ATM-core factor Spp1 contributes to tissue integrity at the CSA and CSB
(A) Coronal hemisections of E14.5 brains stained with Hoechst reveal CSA disruption in 50% of Spp1-/- mutants (solid arrowheads) compared to controls (open arrowheads) and in of PLX3397-treated embryos (solid arrowheads) ( ). Quantification of CSA lesions across models.
(B) L1 immunolabeling enables axon visualization (open arrowheads) and midline lesions (solid arrowheads) in approximately of Spp1-/- mutants compared with in PLX3397-exposed embryos ( ). Quantification of CSB lesions across models.
secreted Spp1 on MG during brain damage and Alzheimer’s disease.
To further confirm whether Spp1 inactivation alters phagocytic properties in vivo, we first searched for substrates that ATM-like MG may engulf, focusing on the CSA (Figures 5 I and 5 J ). In the context of tissue integrity, we examined components of the extracellular matrix (ECM) and observed an intense and punctuated staining of fibronectin 1 (FN1) in CSA MG using immunolabeling and 3D reconstructions (Figures 5I and 5J). Since Fn1 is not notably expressed by MG (Figure 5J), and FN1 punctuated staining was located in intracellular domains resembling vesicles (Figures 5I and 5 J ), our observations support that CSA MG engulf FN1 in physiological conditions. FN1 deposition and remodeling is a key factor in repair and wound healing, suggesting that its engulfment by MG might modify tissue properties. To test whether Spp1 inactivation alters this process, we measured the relative volume of FN1 within CSA MG in both controls and Spp1-/- and detected a significant reduction in mutant embryos (Figure 5 K ).
Our data thus show that Spp1, which regulates ATM-like microglial properties such as phagocytosis, is one of the factors contributing to maintain tissue integrity at cortical boundaries.
MG and Spp1 contribute to the rapid repair of cavitary lesions
Our results indicate that MG prevent lesion formation at sites of morphogenetic tensions in part through Spp1. Since MG are known to help repair exogenous damage in the adult brain and neonatal spinal cord, we further investigated whether MG and Spp1 could act by promoting tissue repair.
To address this issue, we examined whether MG contribute to the resorption of large lesions at the CSA and CSB. We first delineated the time window during which the permanent absence of MG in Csf1r FIRE /FIRE mice led to cavitary lesions at cortical boundaries. Consistently with the fact that Csf1r mice did not show gross morphological alter-
ations in adults, we found that while lesions were still observed in all Csf1r pups at P7, they progressively resorbed during the second and third post-natal week, with no lesions detected by P28/P30 (Figures 6A, S5A, and S6A). While these results reveal the existence of potential compensatory mechanisms for lesion closure later in post-natal life, they highlight that MG are required to not only maintain structural integrity prenatally but also during the first post-natal week.
To assess whether MG contribute to the repair of CSA and CSB lesions during the first post-natal week, we took advantage of the fact that MG start to repopulate the brain around birth after PLX3397-prenatal treatment. We found that in pups prenatally exposed to PLX3397, CSA lesions rapidly resorbed within the first post-natal days, concomitantly to the progressive microglial repopulation (Figures 6B and 6C): while all mice bore cavities at P0, had already fully closed by P3 (Figure 6B). Remarkably, lesion closure was consistently associated with a dense microglial accumulation at the scar at P3, in spite of a reduced MG density in the surrounding region (Figures 6C and 6D), supporting a local role of MG at the CSA during resorption. At P7, over 70% of the mice had their CSA lesions closed and all CSA cavities were systematically resorbed by P20 (Figure 6B). We observed a similar timeline of resorption at the CSB (Figure S5B), showing that MG induced a rapid repair of lesions at both boundaries.
Despite lesion repair, long-lasting morphological defects persisted at the CSA (Figures S6A-S6C), underscoring the importance of preserving structural integrity during morphogenesis. Indeed, even in juvenile mice prenatally exposed to PLX3397 which display more transient lesions, we observed a disorganization of an axonal tract abutting the CSA, a capsule that conveys inputs to the Am, an essential brain structure which dysregulation is linked to neurodevelopmental disorders. Both axonal tracts and Foxp2-positive inhibitory interneurons, important to gate inputs to the Am, were disorganized (Figures S6A and
Figure 6. Local microglia repopulation at the CSA drives the rapid repair of cavitary lesions
(A) Coronal sections showing the CSA region in controls and Csf1r pups, highlighting that cavitary lesions are systematically observed in P7 Csf1r pups (solid arrowheads), but absent in P7 controls or at P30 in both conditions (open arrowheads) ( , , from at least two distinct litters for each stage and condition). Graphs show percentages of brain with lesions, but individual dots represent brains with lesion (100) or no lesion (0) to illustrate variability.
( B and C ) Coronal sections of brains prenatally exposed to PLX 3397 showing the CSA region (solid arrowheads) at , and P 20 . Cavitary lesions progressively resorbed, with a significant proportion being resorbed at P 3 , and almost all achieved by P 7 , concurrently with the overall repopulation of positive cells, which accumulated at the site of lesion closure (solid arrowhead) ( ; , from at least two distinct litters for each stage and condition). Graph in (B) is presented as in (A), while graph in (C) displays means SEM.
(D) Repopulating microglia numbers are comparable at the CSA of controls and PLX3397-exposed embryos at P3, even if microglia numbers remain lower in the surrounding area of resorbing brains ( , from at least two distinct litters). Graph in (D) show means SEM.
Fisher’s exact test and and Mann-Whitney U test ( and ) were performed for statistical comparison, ; ** ; *** ; ns, non significant ( ). Scale bars: in (B) and (C) and in (A) and (D).
Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex; Str, striatum.
See also Figures S5 and S6.
S6B). Electrophysiological slice recordings in adult mice revealed that morphological deficits correlated with a consistent imbalance of inhibition/excitation (I/E) responses of Am pyramidal neurons following capsule stimulation (Figure S6C). Thus, even after the rapid repair of CSA lesions, this physiologically important region persistently displayed anatomical and functional wiring deficits up to adulthood.
To further explore the repair process and its potential dependence on Spp1, we focused on the CSA and examined microglial properties during the first post-natal week (Figures 7 and S7). We found that densely accumulating MG at the scar co-expressed ATM markers Spp1, GPNMB, and Mac2 at P3 (Figure 7A). These cells furthermore showed an amoeboid morphology and marked engulfment of FN1, which accumulates at the scar (Figure S7). In
Figure 7. ATM-factor Spp1 contributes to lesion repair
(A) Cx3cr1 -positive cells accumulating at the site of lesion closure co-express ATM markers Spp1, Mac2, and GPNMB, as shown and quantified at P3 ( for each marker, from at least two distinct litters).
(B) Extracellular Spp1 signal, delineated by immunostaining and Hoechst labeling, accumulates at the resorbing CSA at P3. Graphs show the increased signal intensity at the CSA (dotted lines) compared with a mean between signal intensity measured in the surrounding neocortex (dotted lines) and amygdala (dotted lines) in PLX3397-exposed pups versus controls ( ; , from two distinct litters).
(C) In contrast to controls, Spp1-/- mutants, and PLX3397-exposed controls, PLX3397-exposed Spp1-/- mutants reproducibly displayed lesions visible by Hoechst staining (solid versus open arrowheads) ( ). Values represent the scoring of lesion severity, scored from 0 to 2, as detailed in Table S2.
(D) While CSA IBA1-positive cells co-expressed Mac2 in resorbed PLX3397-treated controls at P7, they also accumulated around the lesions in PLX3397-treated Spp1 mutants, indicating that Spp1 inactivation did not prevent the expression of selected ATM markers ( ).
Graphs show means SEM. Mann-Whitney U test was performed for statistical comparison, ; ns, non significant ( ). Scale bars: in (A); in (C) and (D); and in (B).
Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex; Str, striatum.
See also Figure S7.
addition, we observed that Spp1 labeling was not only detected in and around microglial cells but also accumulating in the extracellular space at higher levels than in the adjacent neocortex or amygdala (Figure 7B). These results show that the repair process correlates with a local induction of ATM-like MG, as illustrated by the expression of core markers and FN1 engulfment, as well as the extracellular accumulation of Spp1. Like for the prevention of cavitary lesion formation, we found that the rapid repair process relied on Spp1 (Figures 7C and 7D). Indeed, by comparing at P7 WT and Spp1-/- pups exposed to PLX3397 prenatally, we observed a comparable microglial recruitment and Mac2 induction (Figure 7D), but a significant inhibition of lesion closure in mice lacking Spp1 (Figure 7C).
Taken together, these data show that MG and Spp1 play crucial roles in preventing the progression of CSA microcavities into large lesions and in promoting their prompt closure, which is essential for preserving brain integrity during development. Our study reveals key functions of MG and Spp1 in maintaining structural integrity in response to morphogenetic stress and lesions, underscoring the importance of these immune cells in early brain development.
DISCUSSION
MG have been associated with multiple functions, including axonal progression, cortical interneuron wiring, synaptic development and refinement, through a variety of receptors and signaling pathways including Cx3cr1/Cx3cl1, Trem2/Dap12, Complement, and purinergic P2Y12 receptors. Our study reveals additional essential roles of MG in preserving tissue integrity during the development of the cerebral cortex, before the emergence of potentially redundant or complementary glial cells, such as astrocytes. Indeed, because MG colonize the brain from early embryonic stages and astrocytes or oligodendrocytes are mostly produced later, MG constitute a unique and a large contingent of embryonic glial cells.
In the absence of MG, lesions form at specific cortical boundaries that constitute sites of fragility and normally host accumulations of MG in a state resembling post-natal ATM. Our study uses a combination of global, transient and selective models of microglial depletion, to unambiguously establish a role for these immune cells in preventing the progression of microcavities into large cavitary lesions at cortical boundaries (Figures , and ). By comparing permanent and transient depletions we showed that (1) the absence of MG leads to cavitary lesions during embryogenesis and up to P7 at least; (2) in the lasting absence of MG in Csf1r mice, lesions eventually repair after P7; (3) early post-natal repopulation of MG is sufficient to drive the rapid repair of lesions (Figures 2, 6, S2, and S5). The later closure of lesions in Csf1r mice highlights compensatory mechanisms potentially including fill-in of lesions due to brain growth or redundant functions of later developing cells, and is consistent with a lack of gross anatomical defects in adult Csf1r mice. Nonetheless, transient depletions and lesions had lasting impact on circuits, as assessed at the CSA (Figure S6), supporting that maintenance of structural integrity during morphogenesis is essential for proper brain development. Our study thus establishes that MG maintain
CSA and CSB integrity and promote the rapid repair of lesions, revealing important physiological functions of MG at critical steps of early brain morphogenesis.
Both the CSA and CSB are characterized by dense accumulations of embryonic ATM-like MG, that display several common features with previously identified post-natal ATM. In particular, embryonic ATM-like cells and post-natal ATM/ PAM share not only highly overlapping transcriptomic signatures (Figures 1 and S 1 ), but also an amoeboid morphology and highly phagocytic features (Figure S1). As we were unable to efficiently locally deplete MG or manipulate transient cellular states, it is possible that the local accumulation of ATM-like cells at these sites might not be the only factor responsible for the observed phenotypes. Nonetheless, we discovered that transient microglial hotspots at the CSA and CSB contained dense accumulations of ATM-like cells that were remarkably similar to their post-natal counterparts, confirming that the ATM state spans the prenatal and post-natal periods.
Interestingly, while the functions of post-natal ATM have largely been attributed to Igf1, our study reveals that Spp1/OPN, an atypical ECM-interacting factor previously linked to bone development, wound healing, inflammation, and microglial phagocytosis, contributes to tissue integrity and the rapid repair of large lesions in the developing brain (Figures 5, 7, S5, and S7). While inactivating Spp1 alone did not fully mimic the impact of microglial depletion, suggesting that other factors are likely involved, our findings support a contribution of the Spp1 core ATM factor to microglial functions in both tissue integrity and repair. At the mechanistic level, extracellular Spp1 accumulates at the repair site (Figure 7) and Spp1 inactivation impairs phagocytic pathways and the capacity of CSA MG to efficiently engulf FN1 (Figure 5). FN1 is an ECM component that accumulates after tissue damage or microlesions, and which remodeling is key for proper repair. Our results thus raise the possibility that Spp1 acts by regulating multiple processes, including its extracellular secretion and the promotion of phagocytosis, as shown by FN1 engulfment. While embryonic ATM likely engulf a variety of other cellular substrates that remain to be identified, our study suggests that Spp1 could, at least in part, act by regulating ECM remodeling, a microglial feature that has been previously involved in spinal cord repair and synapse regulation. Importantly, we also show that Spp1 and other ATM factors are very quickly induced in MG recruited to prenatal lesions (Figure 4), revealing a remarkable ability of these cells to switch states and exhibit plasticity in response to experimentally induced injury.
Core ATM factors, including Spp1/OPN, are involved in immune cell responses, ECM organization, wound healing, and regulation of inflammation and have been detected in a wide range of macrophages, during skin lesion, heart-repair after myocardial infarction or liver fibrosis. This observation indicates that at least some aspects of the “ATM program” involved in brain integrity and repair are likely not unique to MG but rather represent a basic feature shared across macrophages, which is important for the general maintenance of tissue homeostasis, particularly in response to exogenous damage or lesions. In MG, Spp1 and ATM factors are also expressed by damage-induced MG during stroke or neonatal spinal cord repair, as well as in DAM and TAM, which are respectively
associated with neurodegeneration and tumors. Thus, the ATM program may overlap with a basic repair program in macrophages that is triggered by tissue disruption in different contexts of health and disease. Whether Spp1 is consistently involved and how it acts, which other factors contribute to ATM functions in tissue cohesion and repair, and whether other cell types could exert similar functions in the post-natal and adult brain constitute key questions to address in future studies.
The genuinely glial role of developing MG described in this study has not been reported in other species, such as zebrafish, which provides various genetic models to examine brain development in the absence of MG. While we identified dense ATM hotspots in both mouse and human, they have so far not been reported in zebrafish. These observations raise the intriguing possibility that the embryonic ATM-like state, and associated repair properties, might have been co-opted during evolution to ensure the proper morphogenesis of a growing cerebral cortex, which is a hallmark of mammals. In agreement, we found that increasing morphogenetic constraints in a model of cortical PVNH can lead to a selective breaking at the CSA boundary, strengthening the hypothesis that the CSA represents a site of morphogenetic fragility in mammals (Figures 3 and S3). In contrast, when morphogenetic constraints were alleviated in a genetic model of Th ablation, MG, and embryonic ATM were found to be less crucial in preventing lesions (Figure 3). However, in both models, we observed that the recruitment of ATM-like cells was influenced by morphogenetic constraints and the presence of lesions (Figure 4), underscoring the interaction between immune brain cells and their local niches, as seen in the aging white matter and post-natal cerebral cortex. There is thus a delicate balance between tissue fragility, embryonic ATM localization and microglial functions, which warrants further investigation into the pathways involved in ATM induction and their role in mice and across species. Overall, our findings demonstrate that the proper development of the cerebral cortex depends on the mitigation of tissue damage by brain-resident macrophages, allowing for the morphogenesis of complex structures, which is a hallmark of brain evolution.
In the context of human pathological brain wiring, lesions are typically associated with damage induced by abnormally “activated” MG in response to various triggers, such as hypoxia, inflammation, preterm birth, or congenital viral infections. For example, bilateral cysts in the temporal lobes, where the CSA is located, or midline cavities such as cavum septum pellucidum and cystic lesions, have been reported in several neurodevelopmental disorders. Our study demonstrates key roles of MG and Spp1 in maintaining tissue integrity, suggesting that such lesions may also result from a loss of physiological functions of MG during crucial stages of morphogenesis.
These findings have not only significant implications for our understanding of the fundamental mechanisms that govern brain morphogenesis and the state-specific functions of MG but also open avenues for exploring microglial contributions to brain pathology.
Limitations of the study
While our study identified a key role for MG and Spp1-dependent repair properties at cortical boundaries, it is important to
acknowledge several limitations of our research. First, morphogenetic stress was indirectly assessed through genetic manipulations that distort brain morphogenesis. However, we believe that this caveat is compensated by leveraging two models that selectively increase and reduce morphogenetic constraints. Second, it was not possible to conduct local or state-specific manipulations of CSA and CSB MG. Despite several attempts to selectively manipulate this state, we were unable to efficiently and selectively eliminate this transient cell population, as reported for post-natal ATM, and consistent with our findings that this state is quickly induced in response to the local niche. Nonetheless, our results provide insights into the contribution of MG and their diversity to brain development, evolution, and pathology, highlighting their bona fide role in fetal cortical morphogenesis.
STAR*METHODS
Detailed methods are provided in the online version of this paper and include the following:
KEY RESOURCES TABLE
RESOURCE AVAILABILITY
Lead contact
Materials availability
Data and code availability
EXPERIMENTAL MODEL AND STUDY PARTICIPANT DETAILS
Mouse Lines
Human fetuses
METHOD DETAILS
Transcriptomic reanalysis
Transcriptomic analysis in controls and Spp1 mutants
Microglial Depletion
Maternal Immune activation
Immunohistochemistry on sections
Tissue Clearing
Tissue preparation for transmission electron microscopy (TEM)
MRI scans
Induction of in utero cortical lesions
Ex vivo phagocytic assay
Preparation of brain slices and electrophysiological recordings
We thank M. Keita for excellent technical assistance and E. Touzalin, A. Delecourt, and C. Le Moal for assistance with mouse colonies. We are grateful to Denis Jabaudon and Garel lab members for helpful discussions and critical review of the manuscript, to Ana-Maria Lennon-Duménil, Silvia Cappello, and
Cord Brackebusch for the kind gifts of reagents and mouse models, and to Kristine Zengeler and John Lukens for discussions during the course of this work. We thank Lucy Robinson and Ilya Demchenko of Insight Editing London for scientific editing of the manuscript. We thank the IBENS Imaging Facility (France Biolmaging, supported by ANR-10-INBS-04, ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE, and ANR-11-IDEX-000-02 PSL* Research University, “Investments for the future”) and the midwives of the Gynecology Department, Jeanne de Flandre Hospital of Lille (Centre d’Orthogenie), for their kind assistance and support. The authors acknowledge the support of the Inserm CrossCutting Scientific Program (HuDeCA to P.G.). This work was supported by grants to S.G. from INSERM, CNRS, the ERC Consolidator NImO 616080, MicroSENSO ANR-19-CE16-0018, FSER, Fondation du Collège de France (Fonds St Michel), and Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (EQU202003010195). A.R.L. obtained a fellowship from Ecole des Neurosciences de Paris lle-de-France network and an ATER position from the College de France; C.B. is supported by an AMX PhD fellowship; N.O. by the FRM (FRM, EQU202003010195); C.L. obtained a FRM PhD fellowship (FRM, ECO202006011600).
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Conceptualization, A.R.L., C.B., M.S.T., L.L., and S.G.; formal analysis, A.R.L., A. Canzi, C.B., N.O., C.L., C.C., L.P., B.K., A.S., D.B., L.C, A. Candat, A.G., D.T., L.C., M.S.T., and L.L.; investigation, A.R.L., A. Canzi, C.B., N.O., C.L., C.C., L.P., B.K., A.S., F.Z., H.C., S.V., G.O., P.S., L. Cantini, L. Ciobanu, M.S.T., and L.L.; resources, D.M., A.F., C.A., F.W., J.-B.M., P.P., C.P., J.P., P.G., and F.G.; writing- original draft, A.R.L., M.S.T., L.L., and S.G.; all authors contributed to manuscript editing; visualization, A.R.L., A. Canzi, C.B., N.O., C.L., C.C., L.P., B.K., M.S.T., and L.L.; project administration, M.S.T., L.L., and S.G.; supervision, M.S.T., L.L., and S.G.; funding acquisition, S.G.
DECLARATION OF INTERESTS
The authors declare no competing interests.
Received: March 13, 2023
Revised: September 30, 2023
Accepted: January 10, 2024
Published: February 2, 2024
REFERENCES
Colonna, M., and Butovsky, O. (2017). Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu. Rev. Immunol. 35, 441-468.
Li, Q., and Barres, B.A. (2018). Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nat. Rev. Immunol. 18, 225-242.
Hammond, T.R., Robinton, D., and Stevens, B. (2018). Microglia and the Brain: Complementary Partners in Development and Disease. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 34, 523-544.
Thion, M.S., Ginhoux, F., and Garel, S. (2018). Microglia and early brain development: An intimate journey. Science 362, 185-189.
Sierra, A., Paolicelli, R.C., and Kettenmann, H. (2019). Cien Anos de Microglia: Milestones in a Century of Microglial Research. Trends Neurosci. 42, 778-792.
Prinz, M., Jung, S., and Priller, J. (2019). Microglia Biology: One Century of Evolving Concepts. Cell 179, 292-311.
Prinz, M., Masuda, T., Wheeler, M.A., and Quintana, F.J. (2021). Microglia and Central Nervous System-Associated Macrophages-From Origin to Disease Modulation. Annu. Rev. Immunol. 39, 251-277.
Cserép, C., Pósfai, B., and Dénes, Á. (2021). Shaping Neuronal Fate: Functional Heterogeneity of Direct Microglia-Neuron Interactions. Neuron 109, 222-240.
Badimon, A., Strasburger, H.J., Ayata, P., Chen, X., Nair, A., Ikegami, A., Hwang, P., Chan, A.T., Graves, S.M., Uweru, J.O., et al. (2020). Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature 586, 417-423.
McNamara, N.B., Munro, D.A.D., Bestard-Cuche, N., Uyeda, A., Bogie, J.F.J., Hoffmann, A., Holloway, R.K., Molina-Gonzalez, I., Askew, K.E., Mitchell, S., et al. (2023). Microglia regulate central nervous system myelin growth and integrity. Nature 613, 120-129.
Thion, M.S., Mosser, C.A., Férézou, I., Grisel, P., Baptista, S., Low, D., Ginhoux, F., Garel, S., and Audinat, E. (2019). Biphasic Impact of Prenatal Inflammation and Macrophage Depletion on the Wiring of Neocortical Inhibitory Circuits. Cell Rep. 28, 1119-1126.e4.
Scott-Hewitt, N., Perrucci, F., Morini, R., Erreni, M., Mahoney, M., Witkowska, A., Carey, A., Faggiani, E., Schuetz, L.T., Mason, S., et al. (2020). Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. EMBO J. 39, e105380.
Favuzzi, E., Huang, S., Saldi, G.A., Binan, L., Ibrahim, L.A., FernándezOtero, M., Cao, Y., Zeine, A., Sefah, A., Zheng, K., et al. (2021). GABAreceptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits. Cell 184, 5686.
Cserép, C., Schwarcz, A.D., Pósfai, B., László, Z.I., Kellermayer, A., Környei, Z., Kisfali, M., Nyerges, M., Lele, Z., Katona, I., and Adam, D. (2022). Microglial control of neuronal development via somatic purinergic junctions. Cell Rep. 40, 111369.
Gallo, N.B., Berisha, A., and Van Aelst, L. (2022). Microglia regulate chandelier cell axo-axonic synaptogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2114476119.
Bisht, K., Sharma, K.P., Lecours, C., Sánchez, M.G., El Hajj, H., Milior, G., Olmos-Alonso, A., Gómez-Nicola, D., Luheshi, G., Vallières, L., et al. (2016). Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states. Glia 64, 826-839.
Krasemann, S., Madore, C., Cialic, R., Baufeld, C., Calcagno, N., El Fatimy, R., Beckers, L., O’Loughlin, E., Xu, Y., Fanek, Z., et al. (2017). The TREM2-APOE Pathway Drives the Transcriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases. Immunity 47, 566-581.e9.
Keren-Shaul, H., Spinrad, A., Weiner, A., Matcovitch-Natan, O., DvirSzternfeld, R., Ulland, T.K., David, E., Baruch, K., Lara-Astaiso, D., Toth, B., et al. (2017). A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer’s Disease. Cell 169, 1276-1290.e17.
Deczkowska, A., Keren-Shaul, H., Weiner, A., Colonna, M., Schwartz, M., and Amit, I. (2018). Disease-Associated Microglia: A Universal Immune Sensor of Neurodegeneration. Cell 173, 1073-1081.
Stratoulias, V., Venero, J.L., Tremblay, M.E., and Joseph, B. (2019). Microglial subtypes: diversity within the microglial community. EMBO J. 38, e101997.
Li, Q., Cheng, Z., Zhou, L., Darmanis, S., Neff, N.F., Okamoto, J., Gulati, G., Bennett, M.L., Sun, L.O., Clarke, L.E., et al. (2019). Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron 101, 207-223.e10.
Hammond, T.R., Dufort, C., Dissing-Olesen, L., Giera, S., Young, A., Wysoker, A., Walker, A.J., Gergits, F., Segel, M., Nemesh, J., et al. (2019). Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity 50, 253-271.e6.
Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Böttcher, C., Amann, L., Sagar, S., Scheiwe, C., Nessler, S., Kunz, P., van Loo, G., et al. (2019). Spatial and temporal heterogeneity of mouse and human microglia at sin-gle-cell resolution. Nature 566, 388-392.
Sala Frigerio, C., Wolfs, L., Fattorelli, N., Thrupp, N., Voytyuk, I., Schmidt, I., Mancuso, R., Chen, W.T., Woodbury, M.E., Srivastava, G., et al. (2019). The Major Risk Factors for Alzheimer’s Disease: Age, Sex, and Genes Modulate the Microglia Response to Abeta Plaques. Cell Rep. 27, 1293-1306.e6.
Kracht, L., Borggrewe, M., Eskandar, S., Brouwer, N., Chuva de Sousa Lopes, S.M., Laman, J.D., Scherjon, S.A., Prins, J.R., Kooistra, S.M., and Eggen, B.J.L. (2020). Human fetal microglia acquire homeostatic im-mune-sensing properties early in development. Science 369, 530-537.
Bian, Z., Gong, Y., Huang, T., Lee, C.Z.W., Bian, L., Bai, Z., Shi, H., Zeng, Y., Liu, C., He, J., et al. (2020). Deciphering human macrophage development at single-cell resolution. Nature 582, 571-576.
Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., and Prinz, M. (2020). Microglia Heterogeneity in the Single-Cell Era. Cell Rep. 30, 1271-1281.
Marschallinger, J., Iram, T., Zardeneta, M., Lee, S.E., Lehallier, B., Haney, M.S., Pluvinage, J.V., Mathur, V., Hahn, O., Morgens, D.W., et al. (2020). Lipid-droplet-accumulating microglia represent a dysfunctional and proinflammatory state in the aging brain. Nat. Neurosci. 23, 194-208.
Safaiyan, S., Besson-Girard, S., Kaya, T., Cantuti-Castelvetri, L., Liu, L., Ji, H., Schifferer, M., Gouna, G., Usifo, F., Kannaiyan, N., et al. (2021). White matter aging drives microglial diversity. Neuron 109, 11001117.e10.
La Manno, G., Siletti, K., Furlan, A., Gyllborg, D., Vinsland, E., Mossi Albiach, A., Mattsson Langseth, C., Khven, I., Lederer, A.R., Dratva, L.M., et al. (2021). Molecular architecture of the developing mouse brain. Nature 596, 92-96.
Silvin, A., Uderhardt, S., Piot, C., Da Mesquita, S., Yang, K., Geirsdottir, L., Mulder, K., Eyal, D., Liu, Z., Bridlance, C., et al. (2022). Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity 55, 1448-1465.e6.
Stogsdill, J.A., Kim, K., Binan, L., Farhi, S.L., Levin, J.Z., and Arlotta, P. (2022). Pyramidal neuron subtype diversity governs microglia states in the neocortex. Nature 608, 750-756.
Paolicelli, R.C., Sierra, A., Stevens, B., Tremblay, M.E., Aguzzi, A., Ajami, B., Amit, I., Audinat, E., Bechmann, I., Bennett, M., et al. (2022). Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron 110, 3458-3483.
Stratoulias, V., Ruiz, R., Kanatani, S., Osman, A.M., Keane, L., Armengol, J.A., Rodríguez-Moreno, A., Murgoci, A.N., García-Domínguez, I., Alonso-Bellido, I., et al. (2023). ARG1-expressing microglia show a distinct molecular signature and modulate post-natal development and function of the mouse brain. Nat. Neurosci. 26, 1008-1020.
Dolan, M.J., Therrien, M., Jereb, S., Kamath, T., Gazestani, V., Atkeson, T., Marsh, S.E., Goeva, A., Lojek, N.M., Murphy, S., et al. (2023). Exposure of iPSC-derived human microglia to brain substrates enables the generation and manipulation of diverse transcriptional states in vitro. Nat. Immunol. 24, 1382-1390.
Park, M.D., Silvin, A., Ginhoux, F., and Merad, M. (2022). Macrophages in health and disease. Cell 185, 4259-4279.
Thion, M.S., and Garel, S. (2020). Microglial ontogeny, diversity and neurodevelopmental functions. Curr. Opin. Genet. Dev. 65, 186-194.
Menassa, D.A., Muntslag, T.A.O., Martin-Estebané, M., Barry-Carroll, L., Chapman, M.A., Adorjan, I., Tyler, T., Turnbull, B., Rose-Zerilli, M.J.J., Nicoll, J.A.R., et al. (2022). The spatiotemporal dynamics of microglia across the human lifespan. Dev. Cell 57, 2127-2139.e6.
Cossart, R., and Garel, S. (2022). Step by step: cells with multiple functions in cortical circuit assembly. Nat. Rev. Neurosci. 23, 395-410.
Squarzoni, P., Oller, G., Hoeffel, G., Pont-Lezica, L., Rostaing, P., Low, D., Bessis, A., Ginhoux, F., and Garel, S. (2014). Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Rep. 8, 1271-1279.
Thion, M.S., and Garel, S. (2017). On place and time: microglia in embryonic and perinatal brain development. Curr. Opin. Neurobiol. 47, 121-130.
Wlodarczyk, A., Holtman, I.R., Krueger, M., Yogev, N., Bruttger, J., Khorooshi, R., Benmamar-Badel, A., de Boer-Bergsma, J.J., Martin, N.A., Karram, K., et al. (2017). A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. EMBO J. 36, 3292-3308.
Hagemeyer, N., Hanft, K.M., Akriditou, M.A., Unger, N., Park, E.S., Stanley, E.R., Staszewski, O., Dimou, L., and Prinz, M. (2017). Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathol. 134, 441-458.
Ueno, M., Fujita, Y., Tanaka, T., Nakamura, Y., Kikuta, J., Ishii, M., and Yamashita, T. (2013). Layer V cortical neurons require microglial support for survival during post-natal development. Nat. Neurosci. 16, 543-551.
Hankin, M.H., Schneider, B.F., and Silver, J. (1988). Death of the subcallosal glial sling is correlated with formation of the cavum septi pellucidi. J. Comp. Neurol. 272, 191-202.
Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A.M., Dobrenis, K., and Pollard, J.W. (2011). Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One 6, e26317.
Pridans, C., Raper, A., Davis, G.M., Alves, J., Sauter, K.A., Lefevre, L., Regan, T., Meek, S., Sutherland, L., Thomson, A.J., et al. (2018). Pleiotropic Impacts of Macrophage and Microglial Deficiency on Development in Rats with Targeted Mutation of the Csf1r Locus. J. Immunol. 201, 2683-2699.
Hoeffel, G., Wang, Y., Greter, M., See, P., Teo, P., Malleret, B., Leboeuf, M., Low, D., Oller, G., Almeida, F., et al. (2012). Adult Langerhans cells derive predominantly from embryonic fetal liver monocytes with a minor contribution of yolk sac-derived macrophages. J. Exp. Med. 209, 1167-1181.
Elmore, M.P., Najafi, A.R., Koike, M.A., Dagher, N.N., Spangenberg, E.E., Rice, R.A., Kitazawa, M., Matusow, B., Nguyen, H., West, B.L., and Green, K.N. (2014). Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron 82, 380-397.
Green, K.N., Crapser, J.D., and Hohsfield, L.A. (2020). To Kill a Microglia: A Case for CSF1R Inhibitors. Trends Immunol. 41, 771-784.
Back, J., Dierich, A., Bronn, C., Kastner, P., and Chan, S. (2004). PU. 1 determines the self-renewal capacity of erythroid progenitor cells. Blood 103, 3615-3623.
Rojo, R., Raper, A., Ozdemir, D.D., Lefevre, L., Grabert, K., WollscheidLengeling, E., Bradford, B., Caruso, M., Gazova, I., Sánchez, A., et al. (2019). Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat. Commun. 10, 3215.
Munro, D.A.D., Bradford, B.M., Mariani, S.A., Hampton, D.W., Vink, C.S., Chandran, S., Hume, D.A., Pridans, C., and Priller, J. (2020). CNS macrophages differentially rely on an intronic Csf1r enhancer for their development. Development 147, dev194449.
Kiani Shabestari, S., Morabito, S., Danhash, E.P., McQuade, A., Sanchez, J.R., Miyoshi, E., Chadarevian, J.P., Claes, C., Coburn, M.A., Hasselmann, J., et al. (2022). Absence of microglia promotes diverse pathologies and early lethality in Alzheimer’s disease mice. Cell Rep. 39, 110961.
Esteban, H., Blondiaux, E., Audureau, E., Sileo, C., Moutard, M.L., Gelot, A., Jouannic, J.M., Ducou le Pointe, H., and Garel, C. (2015). Prenatal features of isolated subependymal pseudocysts associated with adverse pregnancy outcome. Ultrasound in Obstet. Gyne. 46, 678-687.
Belle, M., Godefroy, D., Dominici, C., Heitz-Marchaland, C., Zelina, P., Hellal, F., Bradke, F., and Chédotal, A. (2014). A simple method for 3D analysis of immunolabeled axonal tracts in a transparent nervous system. Cell Rep. 9, 1191-1201.
Renier, N., Wu, Z., Simon, D.J., Yang, J., Ariel, P., and Tessier-Lavigne, M. (2014). iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell 159, 896-910.
Kaur, C., and Ling, E.A. (2017). Transitory cystic cavities in the developing mammalian brain – normal or anomalous? J. Anat. 230, 197-202.
Saito, K., Okamoto, M., Watanabe, Y., Noguchi, N., Nagasaka, A., Nishina, Y., Shinoda, T., Sakakibara, A., and Miyata, T. (2019). Dorsal-toVentral Cortical Expansion Is Physically Primed by Ventral Streaming of Early Embryonic Preplate Neurons. Cell Rep. 29, 1555-1567.e5.
Van Essen, D.C. (2020). A 2020 view of tension-based cortical morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117, 32868-32879.
Das, J.M., and Dossani, R.H. (2022). Cavum Septum Pellucidum. In StatPearls (StatPearls Publishing).
Cappello, S., Böhringer, C.J., Bergami, M., Conzelmann, K.K., Ghanem, A., Tomassy, G.S., Arlotta, P., Mainardi, M., Allegra, M., Caleo, M., et al. (2012). A radial glia-specific role of RhoA in double cortex formation. Neuron 73, 911-924.
Deck, M., Lokmane, L., Chauvet, S., Mailhes, C., Keita, M., Niquille, M., Yoshida, M., Yoshida, Y., Lebrand, C., Mann, F., et al. (2013). Pathfinding of corticothalamic axons relies on a rendezvous with thalamic projections. Neuron 77, 472-484.
Liaw, L., Birk, D.E., Ballas, C.B., Whitsitt, J.S., Davidson, J.M., and Hogan, B.L. (1998). Altered wound healing in mice lacking a functional osteopontin gene (spp1). J. Clin. Invest. 101, 1468-1478.
Rosmus, D.D., Lange, C., Ludwig, F., Ajami, B., and Wieghofer, P. (2022). The Role of Osteopontin in Microglia Biology: Current Concepts and Future Perspectives. Biomedicines 10, 840.
Shen, X., Qiu, Y., Wight, A.E., Kim, H.J., and Cantor, H. (2022). Definition of a mouse microglial subset that regulates neuronal development and proinflammatory responses in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2116241119.
De Schepper, S., Ge, J.Z., Crowley, G., Ferreira, L.S.S., Garceau, D., Toomey, C.E., Sokolova, D., Rueda-Carrasco, J., Shin, S.H., Kim, J.S., et al. (2023). Perivascular cells induce microglial phagocytic states and synaptic engulfment via SPP1 in mouse models of Alzheimer’s disease. Nat. Neurosci. 26, 406-415.
Bonnans, C., Chou, J., and Werb, Z. (2014). Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 786-801.
Patten, J., and Wang, K. (2021). Fibronectin in development and wound healing. Adv. Drug Deliv. Rev. 170, 353-368.
Moretti, L., Stalfort, J., Barker, T.H., and Abebayehu, D. (2022). The interplay of fibroblasts, the extracellular matrix, and inflammation in scar formation. J. Biol. Chem. 298, 101530.
Li, Y., He, X., Kawaguchi, R., Zhang, Y., Wang, Q., Monavarfeshani, A., Yang, Z., Chen, B., Shi, Z., Meng, H., et al. (2020). Microglia-organized scar-free spinal cord repair in neonatal mice. Nature 587, 613-618.
Meisner, O.C., Nair, A., and Chang, S.W.C. (2022). Amygdala connectivity and implications for social cognition and disorders. Handb. Clin. Neurol. 187, 381-403.
Varghese, M., Keshav, N., Jacot-Descombes, S., Warda, T., Wicinski, B., Dickstein, D.L., Harony-Nicolas, H., De Rubeis, S., Drapeau, E., Buxbaum, J.D., et al. (2017). Autism spectrum disorder: neuropathology and animal models. Acta Neuropathol. 134, 537-566.
Amaral, D.G., Schumann, C.M., and Nordahl, C.W. (2008). Neuroanatomy of autism. Trends Neurosci. 31, 137-145.
Paré, D., Quirk, G.J., and Ledoux, J.E. (2004). New vistas on amygdala networks in conditioned fear. J. Neurophysiol. 92, 1-9.
Tovote, P., Fadok, J.P., and Lüthi, A. (2015). Neuronal circuits for fear and anxiety. Nat. Rev. Neurosci. 16, 317-331.
Asede, D., Doddapaneni, D., and Bolton, M.M. (2022). Amygdala Intercalated Cells: Gate Keepers and Conveyors of Internal State to the Circuits of Emotion. J. Neurosci. 42, 9098-9109.
Paolicelli, R.C., Bolasco, G., Pagani, F., Maggi, L., Scianni, M., Panzanelli, P., Giustetto, M., Ferreira, T.A., Guiducci, E., Dumas, L., et al.
(2011). Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science 333, 1456-1458.
Schafer, D.P., Lehrman, E.K., Kautzman, A.G., Koyama, R., Mardinly, A.R., Yamasaki, R., Ransohoff, R.M., Greenberg, M.E., Barres, B.A., and Stevens, B. (2012). Microglia sculpt post-natal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron 74, 691-705.
Miyamoto, A., Wake, H., Ishikawa, A.W., Eto, K., Shibata, K., Murakoshi, H., Koizumi, S., Moorhouse, A.J., Yoshimura, Y., and Nabekura, J. (2016). Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nat. Commun. 7, 12540.
Weinhard, L., di Bartolomei, G., Bolasco, G., Machado, P., Schieber, N.L., Neniskyte, U., Exiga, M., Vadisiute, A., Raggioli, A., Schertel, A., et al. (2018). Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction. Nat. Commun. 9, 1228.
Allen, N.J., and Lyons, D.A. (2018). Glia as architects of central nervous system formation and function. Science 362, 181-185.
Frangogiannis, N.G. (2014). The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nat. Rev. Cardiol. 11, 255-265.
Pellicoro, A., Ramachandran, P., Iredale, J.P., and Fallowfield, J.A. (2014). Liver fibrosis and repair: immune regulation of wound healing in a solid organ. Nat. Rev. Immunol. 14, 181-194.
Vannella, K.M., and Wynn, T.A. (2017). Mechanisms of Organ Injury and Repair by Macrophages. Annu. Rev. Physiol. 79, 593-617.
Shin, Y.J., Kim, H.L., Choi, J.S., Choi, J.Y., Cha, J.H., and Lee, M.Y. (2011). Osteopontin: correlation with phagocytosis by brain macrophages in a rat model of stroke. Glia 59, 413-423.
Rentsendorj, A., Sheyn, J., Fuchs, D.T., Daley, D., Salumbides, B.C., Schubloom, H.E., Hart, N.J., Li, S., Hayden, E.Y., Teplow, D.B., et al. (2018). A novel role for osteopontin in macrophage-mediated amyloidbeta clearance in Alzheimer’s models. Brain Behav. Immun. 67, 163-180.
Lyons, D.A., and Talbot, W.S. (2014). Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 7, a020586.
Sharma, K., Bisht, K., and Eyo, U.B. (2021). A Comparative Biology of Microglia Across Species. Front. Cell Dev. Biol. 9, 652748.
Teissier, N., Fallet-Bianco, C., Delezoide, A.L., Laquerrière, A., Marcorelles, P., Khung-Savatovsky, S., Nardelli, J., Cipriani, S., Csaba, Z., Picone, O., et al. (2014). Cytomegalovirus-induced brain malformations in fetuses. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 73, 143-158.
Nunes, R.H., Pacheco, F.T., and da Rocha, A.J. (2014). Magnetic resonance imaging of anterior temporal lobe cysts in children: discriminating special imaging features in a particular group of diseases. Neuroradiology 56, 569-577.
Tomasello, E., Desmoulins, P.O., Chemin, K., Guia, S., Cremer, H., Ortaldo, J., Love, P., Kaiserlian, D., and Vivier, E. (2000). Combined natural killer cell and dendritic cell functional deficiency in KARAP/DAP12 loss-of-function mutant mice. Immunity 13, 355-364.
Jackson, B., Peyrollier, K., Pedersen, E., Basse, A., Karlsson, R., Wang, Z., Lefever, T., Ochsenbein, A.M., Schmidt, G., Aktories, K., et al. (2011). RhoA is dispensable for skin development, but crucial for contraction and directed migration of keratinocytes. Mol. Biol. Cell 22, 593-605.
Jung, S., Aliberti, J., Graemmel, P., Sunshine, M.J., Kreutzberg, G.W., Sher, A., and Littman, D.R. (2000). Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114.
Lindquist, R.L., Shakhar, G., Dudziak, D., Wardemann, H., Eisenreich, T., Dustin, M.L., and Nussenzweig, M.C. (2004). Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250.
van Spriel, A.B., Leusen, J.H.W., van Egmond, M., Dijkman, H.B.P.M., Assmann, K.J.M., Mayadas, T.N., and van de Winkel, J.G.J. (2001).
Mac-1 (CD11b/CD18) is essential for Fc receptor-mediated neutrophil cytotoxicity and immunologic synapse formation. Blood 97, 2478-2486.
99. Hao, Y., Hao, S., Andersen-Nissen, E., Mauck, W.M., 3rd, Zheng, S., Butler, A., Lee, M.J., Wilk, A.J., Darby, C., Zager, M., et al. (2021). Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell 184, 3573-3587.e29.
100. Hafemeister, C., and Satija, R. (2019). Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 20, 296.
101. Langmead, B., and Salzberg, S.L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods 9, 357-359.
102. Ahlmann-Eltze, C., and Huber, W. (2021). glmGamPoi: fitting GammaPoisson generalized linear models on single cell count data. Bioinformatics 36, 5701-5702.
103. Zappia, L., and Oshlack, A. (2018). Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience 7, giy083.
104. Genescu, I., Aníbal-Martínez, M., Kouskoff, V., Chenouard, N., MailhesHamon, C., Cartonnet, H., Lokmane, L., Rijli, F.M., López-Bendito, G., Gambino, F., and Garel, S. (2022). Dynamic interplay between thalamic activity and Cajal-Retzius cells regulates the wiring of cortical layer 1. Cell Rep. 39, 110667.
105. de Frutos, C.A., Bouvier, G., Arai, Y., Thion, M.S., Lokmane, L., Keita, M., Garcia-Dominguez, M., Charnay, P., Hirata, T., Riethmacher, D., et al. (2016). Reallocation of Olfactory Cajal-Retzius Cells Shapes Neocortex Architecture. Neuron 92, 435-448.
106. Schafer, D.P., Lehrman, E.K., Heller, C.T., and Stevens, B. (2014). An engulfment assay: a protocol to assess interactions between CNS phagocytes and neurons. JoVE. 51482.
Philips Tecnai 12 Transmission Electron Microscope
Philips/FEI
https://nano.tau.ac.il
Leica CM 3050S cryostat
Leica
https://www.leica-microsystems.com/
Olympus BX51WIF microscope
Olympus
https://www.olympus-lifescience.com
ssniff standard mouse chow
ssniff Spezialdiäten GmbH
https://www.ssniff.com
RESOURCE AVAILABILITY
Lead contact
Further requests and information concerning this study should be addressed to the lead contact, Sonia Garel (sonia.garel@bio.ens. psl.eu).
Materials availability
This study did not generate new unique reagents.
Data and code availability
Single-cell RNA-seq dataset have been deposited into ArrayExpress with accession number E-MTAB-13581 and are publicly available as of the date of publication. Data generated in Tables S1, S3, and S4 is available for mining. Microscopy data reported in this paper will be shared by the lead contact upon request.
This paper does not report original code.
Any additional information required to reanalyze the data reported in this work paper is available from the lead contact upon request.
EXPERIMENTAL MODEL AND STUDY PARTICIPANT DETAILS
Mouse Lines
Cx3cr1 (RRID:IMSR_JAX:005582), Pu.1 Cd11c-eYFP (RRID:IMSR_JAX:007567), Csf1r Spp1 (RRID: IMSR_JAX:004936), CR3 (Cd11b (RRID:IMSR_JAX:003991), Dap12/TyroBP (RRID:MGI:3818477), RhoA , Emx ; WntA3 and Brn4 mice were maintained on a C57BL/6J background, except for Csf1r mice that were kept on a mixed C57BL/6J CBA background. C57BL/6J wild-type mice or heterozygote littermates were used as controls for mutant mice, as they did not exhibit any phenotype, with the exception of repair analyses (Figure 7), in which we compared Spp1 and Spp1- , in periventricular nodular heterotopia analyses (Figures 3 and 4), in which we compared with cre- littermates, and studies of the Csf1r mice in which we compared mutants with Csf1r littermates (Figures 2, 6 , S5, and S6). We checked that the prenatal phenotype of Csf1r mice was similar on mixed C57BL/6J CBA and on C57BL/6J background ( for E14.5 and E18.5, from two distinct litters), whereas the postnatal phenotype could not be assessed on C57BL/6J background because mutant mice developed hydrocephalus. The day of vaginal plug formation was considered E0.5. Most embryos were harvested in the morning, except E15.0 that were harvested on the afternoon of the day of gestation. For all experiments, mice were age and sex matched and animals were housed in the animal facility of the IBENS, and handled in accordance with the regulations of the European Union and the local ethics committee.
Human fetuses
Fetal tissues were made available in accordance with French bylaws (Good Practice Concerning the Conservation, Transformation, and Transportation of Human Tissue to Be Used Therapeutically, published on December 29, 1998). The studies on human fetal tissue were approved by the French agency for biomedical research (Agence de la Biomédecine, Saint-Denis la Plaine, France, protocol : PFS16-002). Three human fetuses without known pathologies were obtained at gestational weeks (GW) 9, GW11 and GW14 from voluntarily terminated pregnancies upon obtaining written informed consent from the parents (Gynaecology Department, Jeanne de Flandre Hospital, Lille, France). Personal data (i.e. ethnicity, race, genetics, date of birth and other similar data) is not available in compliance with privacy regulations in France. Fetuses were fixed by immersion in paraformaldehyde (PFA) at for 3 (GW9 fetus) or 5 days (GW11 and GW14 fetuses). The tissues were cryoprotected in sucrose/PBS at overnight, embedded in Tissue-Tek OCT compound (Sakura Finetek, USA), frozen on dry ice and stored at until sectioning. Frozen samples were cut serially at using a Leica CM 3050S cryostat (Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany). Sections were kept at .
METHOD DETAILS
Transcriptomic reanalysis
Single-cell RNA-seq data reanalysis
10X scRNA-seq microglia data from Hammond et al. and La Manno et al. were downloaded from the GSE121654 series and loom file http://mousebrain.org/development (“dev_all.loom”), respectively. The raw count matrix and metadata for microglia-annotated cells in La Manno et al. were extracted from the loom file using v4.1.2. The data include a total of 1,711 cells ( 510 atm, 415 cycling microglia, 786 non-cycling microglia cells). Genes were filtered as described by the authors (expressed in at least 10 cells for La Manno et al. and at least 20 cells for Hammond et al. ). For the data set from Hammond et al., additional metadata such as published t-distributed stochastic neighbor embedding (tSNE) coordinates and reported clusters were provided by the authors to select the 76,149 cells, including 2,517 atm cells.
The Seurat v4.1.1 scRNA-seq pipeline was used to produce uniform manifold approximation and projection (UMAP) and tSNE plots of the microglia data. Default parameters were used, unless stated otherwise. For, data were first normalized and scaled using SCTransform. PCA was performed and UMAP coordinates were computed using 5 principal components. Plots were created using Seurat v4.1.1, ggplot2 v3.3.6, scCustomize v1.1.1, and the viridis v0.6.2 palette.
Differential expression analysis
Differentially expressed genes (DEGs) of ATM-annotated cells from La Manno et al. were identified using the “FindAllMarkers” Seurat function (Wilcoxon signed-rank test, assay “RNA”, min.pct , only.pos=TRUE). DEGs were further filtered (Fold Change , Bonferroni adjusted value ). To construct Venn diagrams, the same threshold was applied to published DEGs of ATM and PAM.
Gene set enrichment analysis
To determine gene set enrichment in the scRNA-seq dataset, the “AddModuleScore” Seurat function (ctrl.size = length of gene list, nbin=24) was used. Several gene signatures were tested for enrichment in the microglia scRNA-seq data from La Manno et al. : (i) top enriched ATM DEGs from Hammond et al., corresponding to the 9 reported markers (i.e., Spp1, Gpnmb, Igf1, Lgals3, Fapb5, Lpl, Lgals1, Ctsl, Anxa5), and (ii) top enriched PAM DEGs from Li et al. (i.e., Spp1, Clec7a, Gpnmb, Igf1, Lpl, Pld3, Ctsl, Ctsb, Slc23a2, Gpx3) (Table S1).
Transcriptomic analysis in controls and Spp1 mutants scRNA-sequencing Whole Transcriptome using Rhapsody
For the Rhapsody experiment, the whole process was done by following manufacturer’s (BD Biosciences) protocol. Prior CD45+ cells were enriched using CD45 microbeads from Miltenyi and the Automacs using possel function. 115,256 cells were captured in a double run, 6 barcoded samples for each run, pooled using BD Ms Single Cell Sample Multiplexing Kit (Cat No: 633793). The sample was processed according to the BD Rhapsody Whole Transcriptome Analysis (WTA) Amplification Kit (Cat No: 633801) and the BD Rhapsody Whole Transcriptome Analysis (WTA) Reagent Kit (Cat No: 665915). The 2 librairies were then subjected to an indexed paired-end sequencing run of cycles on an Illumina HiSeq 4000 system (Illumina, San Diego, CA, USA) with 20% PhiX spike in. A total of 5,830 million reads were sequenced for 115,256 cells.
Alignment and pre-processing of single-cell RNA sequencing data
Transcriptomics Fastq files were processed via the standard Rhapsody analysis pipeline (BD Biosciences) per the manufacturer’s recommendations. First, R1 and R2 reads are filtered for high-quality reads, dropping reads too short (less than 66 bases for R1 and 64 bases for R2) or have a base quality score of less than 20 . R1 reads are annotated to identify cell label sequences and unique molecular identifiers (UMIs), and R2 reads are mapped to the respective reference sequences using Bowtie2. Finally, all passing R1 and R2 reads are combined and annotated to the respective molecules. For quality control of the reads, recursive substation error correction (RSEC) and distribution-based error correction (DBEC) were applied, which are manufacturer-developed algorithms correcting for PCR and sequencing errors. For determining putative cells (which will contain many more reads than noise cell labels), a filtering algorithm takes the number of DBEC-corrected reads into account, calculating the minimum second derivative along with the cumulative reads as the cut-off point. Finally, the expression matrix was obtained from the DBEC-adjusted molecule counts in a CSV format. A cell was determined as a singlet if the minimum read count of a single sample tag is above the threshold of . A cell was classified as a multiplet if the cell exceeds the threshold for more than one sample tag. A cell that does not meet the threshold was labelled as undetermined. Both multiplets and undetermined cells were excluded from the analysis as described below.
Processing and analysis of single-cell RNA sequencing data
RSEC-adjusted molecule counts matrices from Seven Bridges BD Rhapsody alignment pipeline were loaded and analyzed using Seurat v4.3.0.1. Samples were demultiplexed using Sample Tag Call matrix from Seven Bridges BD Rhapsody alignment pipeline and metadata was manually assigned to each Tag. High quality cells were filtered and selected based on of RNA from mitochondrial genes, >200 of expressed unique genes and >100 of UMI counts. Count matrix was normalized and scaled using gammapoisson generalized linear model based on the 8,000 most variable genes using SCTransform v0.3.5 and glmGamPoi v1.10.2 packages. PCA, UMAP dimension reduction, nearest neighbors’ determination and Louvain clustering were performed using standard Seurat’s functions using standard parameters. The most stable resolution of clustering (SCT_snn_res.0.3) was chosen according to clustree v0.5.0 package guidelines Differential gene expression was performed with the “FindAllMarkers” Seurat function using Wilcoxon signed-rank test, FDR-adjusted p-value and standard parameters.
The first round of broad annotation was manually conducted based on the most differentially expressed genes across clusters (adjusted -value ) and the top 5 DEGs were represented using “DotPlot” Seurat function. To refine the analysis on subsets of interest and get a more granular annotation, macrophages were manually selected and the whole process was performed again using the same parameters. The violin plot of gene expression was generated using “VInPlot” function. Differential gene expression within ATM subset between wild-type and Spp1-/- conditions was conducted using “FindMarkers” Seurat function using Wilcoxon rank-sum test, FDR-adjusted p-value and standard parameters. DEGs were represented in a Volcano plot using EnhancedVolcano v1.16.0 filtered based on adjusted -value and then input in Metascape (v3.5.20230501) web-based portal to get gene set functional enrichment terms using several databases. Bar plots were generated using ggplot2 v3.4.3 package from Metascape output zip files. All analyses were conducted on R v4.2.2.
Microglial Depletion
Pregnant C57BL/6J females were given anti-CSF1R mAb ( CSF1R, clone AFS98) or the rat IgG2a isotype control (clone R35-95; BD Biosciences) by intraperitoneal injection at E 6.5 and E 7.5 , as described previously. Alternatively, pregnant mice were given the CSF1R inhibitor PLX3397 (Plexxikon) mixed into standard chow (Ssniff) from E6.5 or E12.5 until E15.5. The dose of PLX3397 was and respective controls received standard chow. The efficiency of depletion procedures was verified by immunohistochemistry at embryonic stages and in one newborn P0 per litter for postnatal litters.
Maternal Immune activation
Lipopolysaccharide in sterile PBS ( mouse; InvivoGen and Sigma) was injected intraperitoneally into pregnant mice at E13.5. Sterile PBS was injected into control pregnant females by the same route and at the same timepoint, without detectable effects on embryonic phenotype.
Immunohistochemistry on sections
For immunohistochemistry, mouse embryonic brains were fixed in PFA at for 2 h to overnight, depending on the developmental stage. For the analysis of postnatal brains, animals were perfused with PFA, brains were dissected out, then post-fixed overnight at before cutting into sections in PBS. The preparation of human fetal brain tissue is described above.
Immunohistochemistry was performed on free-floating -thick vibratome-cut mouse brain sections or -thick cryo-stat-cut human tissue sections. Slices were first incubated for 1 h at room temperature (RT) in Triton X-100, Gelatin in PBS (blocking solution), and then incubated at overnight in the same blocking solution with the following primary antibodies: rat anti-CD68 (1/500; Bio-Rad Cat# MCA1957, RRID:AB_322219), rabbit anti-FN1 (1/200; Millipore Cat# AB2033, RRID:AB_ 2105702), goat anti-FOXP2 (1/500; Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-21069, RRID:AB_2107124), chicken anti-GFP (1/1000; Aves Labs Cat# GFP-1020, RRID:AB_10000240), rabbit anti-IBA1 (1/500; FUJIFILM Wako Shibayagi Cat# 019-19741, RRID:AB_ 839504), rabbit anti-IBA1 (human) (1/500; Abcam Cat# ab178846, RRID:AB_2636859), chicken anti-IBA1 (1/500; Synaptic Systems Cat# 234009, RRID:AB_2891282), rat anti-Lgals3 (MAC2) (1/1000; CEDARLANE Cat# CL8942AP, RRID:AB_10060357), rat anti-L1 (1/100; Millipore Cat# MAB5272, RRID:AB_2133200), biotinylated rat anti-LYVE1 (1/200; Thermo Fisher Scientific Cat# 13-044382, RRID:AB_1724157), rat anti-Myelin Basic Protein (MBP) (1/300; Millipore Cat# MAB386, RRID:AB_94975), rat anti-mDectin-1 (CLEC7A) (1/30; InvivoGen Cat# mabg-mdect, RRID:AB_2753143), mouse anti-neurofilament marker SMI-312 (1/300; BioLegend Cat# 837904, RRID:AB_2566782), goat anti-mouse Osteoactivin (GPNMB) (1/200; R and D Systems Cat# AF2330, RRID:AB_ 2112934), rabbit anti-P2Y12 receptor (1/500; AnaSpec; EGT Group Cat# 55043A, RRID:AB_2298886) and goat anti-SPP1 (1/400; R and D Systems Cat# AF808, RRID:AB_2194992). Sections were rinsed in PBS- TritonX-100 and incubated at from 2 h to overnight with the following secondary antibodies ( in PBS, Jackson ImmunoResearch Labs): Alexa 10 Fluor® 488-conjugated donkey anti-chicken (Cat# 703-545-155, RRID:AB_2340375), Alexa 10 Fluor® 488-conjugated donkey anti-goat (Cat# 705-545-147, RRID:AB_2336933), Alexa 10 Fluor® 488-conjugated donkey anti-rat (Cat# 712-545-150, RRID:AB_2340683), Alexa 10 Fluor® 488-conjugated donkey rabbit (Cat# 711-545-152, RRID:AB_2313584), Cy3-conjugated donkey anti-goat (Cat# 705-165-147, RRID:AB_2307351), Cy3-conjugated donkey anti-rabbit (Cat# 711-165-152, RRID:AB_2307443), Cy3-conjugated donkey anti-rat (Cat# 712-165-150, RRID:AB_2340666), Alexa 10 Fluor® 647-conjugated donkey anti-goat (Cat# 705-605-147, RRID:AB_2340437), Cy5-conjugated donkey anti-goat (Cat# 705-175-147, RRID:AB_2340415), Cy5-conjugated donkey anti-goat (Jackson ImmunoResearch Labs Cat# 705-175-147, RRID:AB_2340415) and Cy5-conjugated donkey anti-rat (Cat# 712-175-150, RRID:AB_2340671). Hoechst (1/1000; Sigma) was used for fluorescent nuclear counterstaining.
Tissue Clearing
We used an adapted version of the previously published iDISCO+ clearing protocol. All incubation steps were performed at RT in a fume hood, on a tube rotator (SB3, Stuart) at 0.045 g , using a 15 mL centrifuge tube (Falcon) covered with aluminum foil to block light. E16.5 brain samples were first dehydrated by sequential 90 min incubation in a graded series , and ) of methanol ( MeOH , Sigma-Aldrich) diluted in . This was followed by de-lipidation in dichloromethane (DCM; SigmaAldrich) for 30 min . Finally, samples were cleared overnight in dibenzylether (DBE; Sigma-Aldrich) and then stored in brown glass vials filled with DBE in the dark at RT.
Tissue preparation for transmission electron microscopy (TEM)
E14.5 mouse embryos were perfused with 4% PFA, 2.5% glutaraldehyde (EM grade) in PBS. Fixed embryos, wrapped in aluminum foil, were kept on ice for 30 min to allow glutaraldehyde impregnation. Brains were then dissected out of embryos and incubated at overnight in a buffer of PFA in PBS. vibratome sections were collected, washed 3 times in PBS and fixed in osmium tetroxide in PBS for 2 h . Samples were colored en bloc with aqueous uranyl acetate at for 1.5 h . Then, the samples were then dehydrated by sequential 10 min incubation in graded concentrations of ethanol and three times ) and rinsed by incubation in anhydrous acetone 3 times for 10 min . Samples were infiltrated with graded concentrations of Araldite 502 resin ( hour per step) and incubated for 2 h in freshly prepared pure resin. Samples were then mounted in a minimal amount of resin between two ACLAR 33C films, with polymerization performed at for 48 h . Before cutting, sample blocks were glued parallel to the flat surface of a cylinder bloc of resin used as a support. 70 nm ultrathin sections of the samples were obtained using an ultramicrotome (UC6, Leica). Ultrathin sections were collected on formvar-coated slot ( ) grids. Positive staining of grids was performed by 2 min incubation in UranyLess aqueous solution (Delta Microscopy) followed by lead citrate staining for 1 min .
MRI scans
After fixation, embryos were stored in a 1:250 mixture of 0.5 mmol gadoteric acid (Dotarem ®, Guerbet) in PBS for at least 72 h . For imaging, the embryos were embedded in low melting point agar gel (Sigma-Aldrich) and were placed in small Plexiglass containers. Acquisitions were performed on a 17.2 T ( 1 H Larmor frequency ) Bruker Biospec preclinical scanner equipped with a 25 mm inner diameter quadrature birdcage volume coil (Rapid Biomedical). T1 weighted 3D images were acquired using a Fast-Low Angle Shot (FLASH) sequence with 40 micrometers isotropic resolution.
Induction of in utero cortical lesions
Pregnant female mice at E14.5 were anesthetized with isoflurane ( for induction, during the surgery) and given of buprenorphine injected subcutaneously for analgesia. The uterine horns were exposed after laparotomy. Cortical in utero lesions were induced unilaterally using a diameter glass capillary, by poking through the cortical plate up to the lateral ventricle,
as usually done for in utero electroporation or viral infection. Lesioned embryos were left to recover in the mother’s womb for 2.5 h after surgery, after which their brains were collected and fixed in PFA at overnight.
Ex vivo phagocytic assay
Slice preparation was performed as previously described with the following modifications. Dissecting medium was prepared from minimum essential medium (MEM) (Gibco) with 20 mM TRIS powder pH7-9 (Sigma) and 45 mM D-glucose (Sigma). After telencephalic brains were cut into vibratome coronal sections, slices of interest were stored in this medium on ice until use. For ex vivo phagocytosis, pH-rodo (Life technologies) was resuspended at in dissection medium containing 2.5 mM and with HEPES (Gibco) per 50 mL . After careful removal of MEM, of pHrodo solution was added to the top of each slice and incubated for 1 h at in . The reaction was stopped by adding cold pH-rodo suspension medium. After three washes, slices were fixed in PFA in PBS for 45 min, followed by immunohistochemistry as described above.
Preparation of brain slices and electrophysiological recordings
Adult ( P60 ) mice were deeply anesthetized with isoflurane and decapitated. The brain was quickly removed and placed in ice-cold sucrose-based ACSF, which contained (in mM): glucose and 75 sucrose continuously bubbled with carbogen ( O2/ CO2). Acute coronal slices ( -thick) containing the amygdala were prepared using a 7000 SMZ-2 Vibratome (Camden Instruments Ltd, UK) in ice-cold sucrose-based ACSF. Slices were transferred for 30 minutes in warm ( ) ACSF which contained (in mM): and 25 glucose, saturated with 95 % O2-5 % CO2., and then placed in a recording chamber and continuously perfused with ACSF bubbled with O2/5% CO2 ( ). Recorded neurons were visualized with an Olympus BX51WIF microscope (Olympus, France) equipped with a Qimaging RETIGA 2000R camera (Teledyne Photometrics, USA) run by Micro-Manager (Vale Lab, USCF, USA). Electrophysiological signals were recorded with a Multiclamp 700B amplifier (CV-7B headstage), a Digidata 1440A acquisition board and pClamp 10.3 software (Molecular Devices, USA). Electrophysiological signals were filtered at 2 kHz and sampled at 10 kHz . Data were analysed off-line (pClamp-10 software, Axon Instruments). Series resistances were compensated up to maximum. Whole-cell patch-clamp recordings were performed in pyramidal neurons of the basolateral amygdala (BLA) using borosilicate glass pipettes ( resistance) containing (in mM): – creatine phosphate; 15 BAPTA; 4 Na2-ATP; 0.4 Na2-GTP; 1 QX314. Values were not corrected for the liquid junction potential. Glutamatergic currents (EPSCs) were measured at the reversal potential for GABA-A receptor mediated events ( -70 mV ) and GABA-A receptor mediated currents (IPSCs) were measured at the reversal potential of glutamatergic events ( +5 mV ) in external solution (ACSF) containing the NMDA receptor antagonist ( D-AP5) (Figure S6C). Extracellular synaptic stimulation was obtained by applying extracellular voltage pulses ( 0.1 Hz , A-M systems USA) delivered using a second patch pipette filled with HEPES-buffered solution placed within the vicinity the amygdalar capsule (Figure S6C). The intensity of the stimulation has been adapted for each cell in order to evoke a comparable EPSC. The I/E ratio was then calculated by dividing IPSC and EPSC amplitudes measured in the same neuron by keeping the same position and intensity of the stimulation.
Image acquisition and analysis
Slice imaging
Images of immunohistochemistry on sections were acquired with a fluorescence binocular microscope (Leica MZ16 F), a fluorescence microscope (Leica DMi8) or a confocal microscope (Leica TCS SP5 and TSP8). Image analyses were performed with FIJI (ImageJ; RRID: SCR_003070), Imaris (Bitplane; RRID:SCR_007370) and Adobe Photoshop CS6 software (Adobe Sytems; RRID:SCR_014199).
iDISCO 3D Imaging and Processing
3D imaging was performed with an ultramicroscope II (LaVision BioTec) using ImspectorPro software (LaVision BioTec). The light sheet was generated by a laser (wavelength 488 Coherent Sapphire Laser, LaVision BioTec) and two cylindrical lenses. Samples were placed in an imaging reservoir made of 100% quartz (LaVision BioTec) filled with ethyl cinnamate and illuminated from the side by the laser light. Images were acquired with a PCO Edge SCMOS CCD camera ( -pixel size, LaVision BioTec). The step size between each image was fixed at . For all samples, background fluorescence recorded from exposure to the 488 nm wavelength was acquired in order to reconstruct brain morphology and lesions. Images, 3D volume, and movies were generated using Imaris x64 software (version 10.0, Bitplane; RRID:SCR_007370). Stack images were first converted to an imaris file (.ims) using ImarisFileConverter. File size was next reduced to 8 bits. 3D reconstruction of the sample was performed using “volume rendering” (Imaris). The sample could be optically sliced at any angle using the “orthoslicer” or “obliqueslicer” tools to validate phenotypic alterations. Lesions due to microglial depletion were highlighted by creating a mask around the volume using the “surface” tool. To this end, low intensity pixels resulting from low background fluorescence (i.e. absence of cells in the lesions) in the 488 nm exposure condition were selected in order to create the “surface” volume. The volume values of the created surfaces were automatically obtained from the Imaris software and compared between different conditions (Figure 2C). 3D pictures and movies were generated using the “snapshot” and “animation” tools. Movie legends were generated using FIJI ImageJ software.
3D Imaging and processing of microglia and Fibronectin 1 staining
3D reconstruction of microglia and Fibronectin 1 (FN1) staining (Figures 5J, 5K, and S7B) was performed using Imaris 10.0.0 (Bitplane; Zurich, Switzerland). For each animal, two to five CSA microglial cells were acquired as z-stacks on a confocal microscope (Leica TCS SP8) with a objective and a zoom factor, using an optimal -step size of and identical settings. Only microglial cells within the focal plane of FN1 staining were used for the analyses. Acquisitions were then smoothed and background was subtracted in FIJI ImageJ software (NIH) according to The resulting images were converted to an Imaris file (.ims) using ImarisFileConverter, then processed and analyzed in Imaris 10.0.0 (Bitplane; Zurich, Switzerland) as previously described. Briefly, 3D reconstruction of the sample was performed using the Surface rendering option in the Surpass view, with a thresholding method based on the Absolute Intensity of the signal. For 3D rendering of the microglial cell volume, threshold of IBA1 (for E14.5/E15 time point) or Cx3cr1-GFP (for P3 time point) signal was manually adjusted to surface the cell appropriately. For 3D rendering of the FN1 signal, threshold for reconstruction was set at 2 times the automatically detected threshold, to surface the high intensity accumulations. For quantification of FN1 signal within microglia, a channel was created by using the mask function, masking the FN1 signal within the microglia surface. 3D rendering of the microglia-masked FN1 signal was performed using the same threshold value that was set for rendering the total FN1 signal. The volume of each surface expressed in was recorded from the Graph tab. Then, the volume of the masked FN1 was expressed as a percentage of microglial volume (using the IBA1/Cx3cr1-GFP volume) for normalization. Unbiased quantification of all images was performed blind to treatment of animals. 3D pictures were generated using the Imaris “snapshot” tool.
Transmission electron microscopy (TEM) imaging
TEM was performed using a Philips Tecnai 12 Transmission Electron Microscope (Philips/FEI, Eindhoven, The Netherlands) at the electronic imaging department of the Imachem imaging platform (France Biolmaging) at the Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supérieure, Paris. The Gatan DigitalMicrograph software was used to acquire TEM images at various magnifications with a 4K CCD Orius 1000 camera (Gatan).
QUANTIFICATION AND STATISTICAL ANALYSIS
Co-labeling of IBA1 or macrophages with P2Y12 microglial marker and ATM markers was performed on 25x, zoom 1x confocal stacks (Leica DM6 FS) with thickness and z-step size and quantified specifically in cells accumulated along the CSA, adjacent cortical ramified microglia, as well as cells accumulated at the CSB and around in utero-induced lesions in the cortex using the Cell Counter tool in FIJI ImageJ software (Figures 1, 4F, and S1). Co-labeling of Cx3cr1-GFP macrophages with ATM markers was performed on 10x, zoom 1x confocal stacks (Leica DM6 FS) with thickness and -step size and quantified specifically in cells accumulated along the CSA in control and PLX3397-treated pups at P3 using the Cell Counter tool in FIJI ImageJ software (Figure 7A).
Analysis of CD68 coverage in ATMs at E14.5 was performed on 40x, zoom 1x confocal stacks (Leica TCS SP8) with thickness and z-step size (Figure S1K). At least 5 amoeboid ATM-like microglia at the CSA (Spp1+) and at least 5 adjacent neocortex ramified microglia (Spp1-) were analysed per animal for a total of E14.5 embryos. For each cell, masks were created for GFP (cell outline) and CD68 (intracellular lysosomal signal) stainings and the area of each mask was measured in FIJI ImageJ software. CD68 coverage was calculated as the percentage of CD68 signal (CD68 mask) covering microglial area (GFP mask area).
Microglial distribution in the CSA region in E18.5 control and Emx1 ; mutant mice was quantified using the Cell Counter tool in FIJI ImageJ on 10x, zoom 1x confocal stacks with a thickness of and z-stack confocal acquisitions (Leica DM6 FS). Quantification was performed in 3 distinct areas defined as follows: (1) the CSA, centered on the boundary and with a width of , (2) the Surrounding area to the CSA with a width of and (3) the Remote area, which encircles the Surrounding area (2) with a width of (Figure S3). Microglial distribution in the CSA region in P3 control and PLX3397 mice was quantified using the Cell Counter tool in FIJI ImageJ on 10x, zoom 1x confocal stacks with a thickness of and z-stack confocal acquisitions (Leica DM6 FS) (Figure 6D). Quantification was performed in 2 distinct areas defined as follows: (1) the CSA, centered on the boundary and with a width of , (2) the Surrounding area to the CSA with a width of .
For assessing post-depletion lesion severity in ; RhoA mice, Brn4 ; Wnt3A mice (Figures 3C-3G), or PLX3397exposed embryos and pups (Figure 7) we established a scoring system based on the lesion area measured via FIJI ImageJ software, as controls may display some microcavities (Figures 3A and 3B). For each brain, the area of the largest lesion observed on the slice was selected, and scores were assigned based on the absence of lesion (score 0), mild lesion (score 1) or severe lesions (score 2). Table S2 displays the detailed scoring of lesions. The mean scores for lesion severity across different experimental conditions were then compared statistically.
Quantification of extracellular staining of Spp1 and FN1 at the CSA in P3 control and PLX3397 was performed on 20x, zoom 1x confocal stacks (Leica TCS SP8) with thickness and z-step size (Figures 7 and S7). Mean signal intensity was measured in FIJI ImageJ software in 3 regions of interest ( squares) that excluded microglial cell bodies (GFP+) for each brain: at the level of the CSA, as well as the adjacent the neocortex and BLA. For both Spp1 and FN1, a ratio was then calculated as the mean signal intensity at the CSA divided by the averaged mean intensity of the adjacent neocortex and BLA.
Cell Article
Data are presented as mean standard error of the mean (SEM), except when explicitly stated in the Figure legend. Non-parametric two-sided Mann-Whitney U-tests were used to compare two distributions in the co-labeling, CD68 coverage, lesion severity and signal intensity experiments. Fisher’s exact test was used to compare contingent presence or absence of CSA/CSB lesions in controls, Spp1-/-, and PLX3397-treated mice. All graphs and statistical analyses were generated using GraphPad Prism 8.0 software (GraphPad Software; RRID:SCR_002798). ; ns, non significant ( ).
For single cell transcriptomic analyses on wild-type and Spp1-/- mutants, all statistical analyses were performed using (version 4.2.2).
Cell
Article
Supplemental figures
Cell
Article
Cell Article
Figure S3. Microglial recruitment is modulated by global changes in brain morphogenesis, related to Figure 3
(A) IBA1 immunolabeling in coronal sections shows the distribution of microglia in control and ; mutant brains at E18.5. Mutant mice display accumulations of microglia at the lesioned CSA and reduced numbers in surrounding areas, despite lack of overall difference in microglial numbers in the caudal CSA region or the rostral neocortex ( at least from 2 distinct litters for both controls and mutants).
(B) Quantifications of the IBA1+ cells in all the CSA region, rostral neocortex and within CSA subregions (1-3).
Graphs show means SEM. Mann-Whitney U tests were performed for statistical comparison, *p < 0.05. Scale bars, .
Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex; Str, striatum.
Cell Article
Figure S4. Spp1 inactivation transiently alters CSA and CSB integrity, related to Figure 5
(A) Dot plot reporting the average expression level of Spp1 and Gpnmb in various cell types of La Manno et al. scRNA-seq data across different embryonic time points (229,948 cells). Color represents the average expression level across all cells within a cluster, while the dot size indicates the percentage of cells expressed in that cluster.
(B) E14.5 coronal hemisection stained with Hoechst, showing the integrity of the CSA in control mice and Gpnmb mutants (open arrowheads) ( , , from at least 2 distinct litters).
(C) L1 immunolabeling showing the integrity at the CSB in control mice and Gpnmb mutants (open arrowheads) ( , from at least two distinct litters).
(D) CSA and CSB lesions in Spp1-/- mutants are transient and have resorbed, respectively, by E18.5 ( , from at least 2 distinct litters) and P3 ( , from at least two distinct litters). Graphs show the percentages of brain with lesions, but individual dots represent brains with lesion (100) or no lesion (0), to illustrate sample numbers.
(E) UMAP visualization of all sorted cells (from wild-type [WT] and Spp1-/- E14.5 and E18.5 embryos) colored by annotated clusters (BroadCellType).
(F) UMAP of all sorted cells split and colored by WT (light gray) and Spp1-/- (dark gray) conditions.
(G) Dot plot of scaled average expression and percentage of top 5 differentially expressed genes (DEGs) by annotated macrophage clusters (RefinedCellType). Scale bars, .
ATM, axon-tract associated microglia; BAM, border associated macrophages; CC, corpus callosum; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; CSB, corticoseptal boundary; Fx, fornix; Ncx, neocortex; MG, microglia; PVM, perivascular macrophages; Se, septum; Str, striatum; WT, wild-type.
Figure S5. CSB lesion closure timeline is similar to the one at the CSA, related to Figure 6
(A) Coronal sections counterstained with Hoechst showing the CSB region in Csf1r mice. Cavitary lesions (solid arrowheads) were systematically observed in mutants up to P7, while they were absent in controls or resorbed in mutants at P30 (open arrowheads), similarly to what was observed at the CSA ( ).
(B) Coronal sections showing the CSB region (open arrowheads) in pups prenatally exposed to PLX3397 at P0, P3, P7, and P20. Cavitary lesions (solid arrowheads) progressively resorbed during the first post-natal week, with a similar timeline to the CSA ( ; ).
Graphs show the percentages of brain with lesions, but individual dots represent brains with lesion (100) or no lesion (0) to illustrate variability. Fisher’s exact test was performed for statistical comparison, ; ns, non significant ( ). Scale bars, .
CC, corpus callosum; Ncx, neocortex; Se, septum.
Figure S6. Long-term impact on the CSA region after lesion closure, related to Figure 6
(A) P28 coronal hemisections of brains immunostained with the pan axonal neurofilament marker SMI-312 and myelin basic protein (MBP) and Hoechst reveal alterations in the CSA region in Csf1r mice. Axonal tracts of the amygdalar capsule, located between the neocortex and the basolateral nucleus of the amygdala (BLA), are disorganized in mutants (solid arrowheads) compared with controls (open arrowheads), highlighting long-term morphological consequences of microglial absence and early life CSA lesions, even after lesion closure ( , from at least two distinct litters).
(B) P20 coronal hemisections of brains immunostained with the pan axonal neurofilament marker SMI-312 and myelin basic protein (MBP) (left) or with MBP and FOXP2 (right) reveal alterations in the CSA region of mice prenatally exposed to PLX3397 (solid arrowheads) compared with controls (open arrowheads). Axonal tracts of the amygdalar capsule and associated FOXP2-positive inhibitory interneurons are disorganized, highlighting long-term morphological consequences of early microglial absence and transient CSA lesions ( ; from at least two distinct litters for each condition).
(C) Schematic representation of the experimental approach (left) used to record in P60 slices both excitatory post-synaptic currents (EPSCs) and inhibitory postsynaptic currents (IPSCs) from BLA pyramidal neurons in response to stimulation of the amygdalar capsule. Importantly, amygdalar capsule stimulation was designed to trigger EPSCs with an amplitude between -150 and -350 pA in both mutants and PLX3397-prenatally exposed mice, and IPSCs were subsequently measured by changing the holding potential in order to evaluate the inhibition/excitation ratio (I/E). EPSCs and IPSCs amplitude and I/E ratio (right) show an altered balance in PLX3397-exposed embryos, compared with controls at P60 ( cells from 5 animals and at least 2 distinct litters, cells, from 5 animals and at least 2 distinct litters).
Scale bars, (A and B, low magnification) and (B, high magnification). Graphs show means SEM. Mann-Whitney U tests were performed for statistical comparison, ****p < 0.0001.
Am, amygdala; ampl, amplitude; BLA, basolateral nucleus of the amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; EPSCs, excitatory post-synaptic currents; I/E, inhibition/excitation ratio; IPSCs, inhibitory post-synaptic currents; Ncx, neocortex.
Cell
Article
Figure S7. Microglia engulf fibronectin 1 during CSA lesion repair, related to Figure 7
(A) Fibronectin 1 (FN1) signal after immunostaining accumulates at the P 3 resorbing CSA in Cx3cr1 pups prenatally exposed to PLX3397 in both repopulating microglia and in the tissue surrounding them, whereas little FN1 signal is detected beyond blood vessels in controls. Dotted boxes represent the areas in which the intensity of the FN1 signal in the extracellular space was measured in the CSA, neocortex (Ncx) and amygdala (Am). The quantification (right) shows the intensity of CSA FN1 signal, normalized relative to the mean of neocortex and amygdala signals in both controls and prenatally exposed PLX3397 pups ( 4; , from at least two distinct litters).
(B) High magnification and 3D reconstruction of CSA microglia identified as Cx3cr1 -positive cells show a slight increase in the volume of FN1 inside microglia ( mice; mice; from at least two distinct litters and at least 2 cells quantified and averaged per animal) and a significant increase in the number of microglia with FN1 inclusions in P3 resorbing brains compared with controls ( ; ; mice from at least two distinct litters). Graphs show means SEM. Mann-Whitney U test was performed for statistical comparison, ; ns, non significant ( ). Scale bars: in ( A ); in ( B , immunolabelings); and in (3D reconstructions).
Am, amygdala; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex.
Figure 2. Microglia are required for tissue integrity at the embryonic CSA and CSB
(A) Hoechst staining of hemibrain coronal sections from E14.5 or E15.5 embryos, showing CSA integrity in controls (open arrowhead) and cavitary lesions in the absence of microglia (solid arrowheads) ( ); and from E18.5 embryos, showing the localization of CSA cavitary lesions, bordering the neocortex (Ncx), striatum (Str), and amygdala (Am) ( 11, ).
(B) L1-immunolabeling stains the corpus callosum (CC) and fornix (Fx), highlighting CSB integrity in controls (open arrowheads) and cavitary lesions (solid arrowheads) in various models disrupting microglial colonization ( ).
(C) Cavity reconstruction (yellow) after whole hemibrain clearing using iDISCO, highlighting the absence of cavities in controls and stereotypically located cavities in two depletion models ( ) and enabling 3D quantification of lesion volumes (Imaris Software).
(D) Whole-head MRI scans of E15.5 or P0 mice, showing low-intensity signals confirming the formation of lesions at the CSA of PLX3397-treated embryos (yellow solid arrowheads) in contrast to controls (yellow open arrowheads) ( ).
(E) Whole-head MRI scans of E15.5 or E18.5 mice, showing low-intensity signals confirming the formation of lesions at the CSA of Csf1r embryos (yellow solid arrowheads) in contrast to controls (yellow open arrowheads; ).
(F) Whole-head MRI scans of E18.5 mice, showing low-intensity signals confirming the formation of lesions at the CSB of Csf1r embryos (yellow solid arrowheads) in contrast to controls (yellow open arrowheads) ( ).
Graphs show means SEM. Mann-Whitney tests were performed for statistical comparison, **p < 0.01. Scale bars: in (A) and (B); in (C); and .
Am, amygdala; CC, corpus callosum; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; CSB, cortico-septal boundary; Fx, fornix; Ncx, neocortex; OB, olfactory bulb; Se, Septum; Str, striatum.
See also Figure S2 and Videos S1-S4.
(C and D) E14.5 (C) and E18.5 (D) coronal hemisections showing no differences in Mac2 and GPNMB co-expressing microglia at the CSA and CSB of controls (open arrowheads) and Spp1-/- embryos ( , at each stage from at least two distinct litters).
(E) UMAP visualization of single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data representing macrophage subsets extracted from wild-type (WT) and Spp1-/- E14.5 and E18.5 embryos colored by annotated clusters (RefinedCellType).
(F) Violin plot of normalized and scaled Spp1 expression across annotated clusters between wild-type (WT) (light gray) and Spp1-/- (KO)(dark gray) mice showing that Spp1 expression is largely restricted to WT ATM (cluster 5).
(G) Volcano plot of differentially expressed genes (DEGs) between WT and Spp1-/- conditions in ATM cells (false discovery rate[FDR]-adjusted and avgerage_ ). Genes downregulated in Spp1-/- embryos are displayed in orange, while the upregulated ones are shown in green, and some genes were manually annotated.
(H) Bar plots of top Metascape gene set enrichment of DEGs (G) in both WT or Spp1-/- conditions, highlighting upregulated (green) and downregulated pathways (orange) in Spp1-/- embryos versus controls, with pathways related to phagocytosis highlighted by a red arrowhead.
(I) Brain sections from E15 Cx3cr1 mice showing specific fibronectin 1 (FN1) labeling within GFP- and Mac2-positive ATM microglia at the CSA (performed on brain sections of at least three mice from two distinct litters).
(J) High magnification confocal acquisition and 3D cell reconstructions (Imaris software) of immunolabeled sections from E14.5 embryonic brains showing Cx3cr1 -positive CSA microglia with FN1 signal inside cell bodies (performed on brain sections of at least three mice from two distinct litters).
(K) Comparison of the percentage of FN1 volume measured (Imaris software) inside individual CSA microglia shows a reduction in Spp1 mutants versus controls ( , from at least two distinct litters).
Graphs show percentages in and and means SEM for all others. Fisher’s exact test was performed to compare distributions of cases with lesions in controls, Spp1-/- and PLX3397-exposed embryos (A and B), and Mann-Whitney U tests were performed for statistical comparison in all other graphs, ; , non significant ( ). Scale bars: (A, B low magnification, and D); (C and F ); (G, left); and (3D reconstructed cells in F and G).
ATM, axon-tract-associated microglia; BAM, border associated macrophages; CC, corpus callosum; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; CSB, corticoseptal boundary; DEGs, differentially expressed genes; Fx, fornix; Intravasc mac, intravascular macrophages; Ncx, neocortex; PVM, perivascular macrophages; Se, Septum; Str, striatum; WT, wild type.
See also Figure S4 and Tables S3-S6.
Figure S1. Embryonic ATM-like cells resemble post-natal ATM, related to Figure 1
(A) Dot plot showing the relative expression levels of core ATM genes in embryonic ATM-like microglia (MG) compared with non-cycling or cycling embryonic MG in the La Manno scRNA-seq dataset. The color represents the normalized expression level across all cells within a cluster, while the dot size indicates the percentage of cells expressing each gene in that cluster.
(B) Projection of the post-natal PAM signature from the Li dataset onto the UMAP plot from Figure 1A showing embryonic ATM-like cells.
(C) Venn diagram highlighting the overlap between embryonic brain ATM differentially expressed genes (DEGs) identified in the La Manno dataset, post-natal ATM in the Hammond dataset, and post-natal PAM in the Li dataset.
(D) Reproduced tSNE plot of the 76,149 cells characterized by scRNA-seq in the La Manno dataset.
(E and F) Projections of the embryonic ATM signature defined in the La Manno dataset and the PAM signature defined in the Li dataset , showing the overlap with the Hammond ATM cluster 4.
(G) Low magnification of brain sections from embryonic mice at E15.0 and E18.5 showing that accumulations of SPP1-expressing microglia, identified as Cx3cr1 -positive or IBA1-positive parenchymal cells, are restricted to the CSA and CSB.
(H) Immunolabeling of embryonic E15.0 CD11c-EYFP brain section showing IBA1-positive microglia expressing YFP ( ) and ATM marker CLEC7A ( ) at the CSA.
(I) Comparison of ATM marker expression between microglia located in the neocortex and CSA in E15.0 CD11c-EYFP and Cx3cr1 -positive brains, showing examples of CSA and neocortical areas used for quantification; immunolabeling was performed on brain sections from at least 3 mice from 2 different litters.
(J) pHrodo assay conducted on ex vivo brain slices (at least from 2 distinct litters) showing intense staining in CSA microglia at E14.5.
(K) Immunolabeling for CD68 showing intense staining inside CSA microglia at E14.5 in physiological conditions and comparison between mean CD68 coverage of SPP1-negative ramified microglia and SPP1-positive CSA ATM ( cells in 4 mice from 2 distinct litters).
(L) Immunolabeling of human GW9 and GW14 human brain transverse sections showing co-expression of ATM markers with IBA1 at the CSA.
Graphs (ATM markers co-expression and CD68 coverage) show means SEM. Mann-Whitney U test were performed for statistical comparison, ; . Scale bars: in (G left) and (L right); in (G, right); in (I)-(K); in (H); in (L, upper left); and in (L, lower left).
ATM, axon-tract-associated microglia; CC, corpus callosum; CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; DEGs, differentially expressed genes; GW, gestational week; MG, microglia; Ncx, neocortex; PAM, proliferative-region associated microglia; Se, septum; Str, striatum.
Figure S2. Models of macrophage depletion and functional alteration, related to Figure 2
(A-C) Confirmation of the depletion of microglia in brains of embryonic Cx3cr1 mice at E14.5 and E18.5, where pregnant dams were subjected to (A) intraperitoneal injection of a CSF1R blocking antibody (AFS) at E6.5 and E7.5 (E14.5, ); (B) feeding with PLX3397, a pharmacological inhibitor of the CSF1R pathway, from E6.5 to E15.0 (E14.5, ; E18.5, ); and (C) feeding with PLX3397 from E12.5 to E15.0 (E15.5, ). Open and solid arrowheads indicate the accumulation of GFP-positive cells at the CSA and local CSA tissue lesion in the absence of GFP-positive cells, respectively.
(D) Transmission electron microscopy image of the CSA lesion in the brain of E14.5 embryos from PLX3397-treated dams, showing the presence of cell debris (solid arrowheads) but the absence of basal membrane ( ).
(E) Coronal sections through hemibrains of E14.5 embryos from wild-type mice; those exposed to mild maternal immune activation (MIA); and Cx3cr1-/-, Dap12/ Tyro , and mutant embryos showing the absence of CSA lesions (open arrowheads) (at least for each condition).
Scale bars: in (A)-(C), and (E); in (D, low magnification); and in (D, high magnification).
CSA, cortico-striato-amygdalar boundary; Ncx, neocortex; Str, striatum.
