تحديد سلالات بوري فوروموناس جينجيفاليس المرتبطة بأمراض اللثة Defining Porphyromonas gingivalis strains associated with periodontal disease

المجلة: Scientific Reports، المجلد: 14، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-024-56849-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38485747
تاريخ النشر: 2024-03-14

افتح

تحديد سلالات بوري فورماناس جينجيفاليس المرتبطة بأمراض اللثة

فيجايا موروغايان سيمران أترجا كاثلين م. هوفي ييجون صن مايكل ج. لامونت جان واكتاوسكي-ويندي باتريشيا إ. دياز و مايكل ج. باك

بروفيورماناس جينجيفاليس، بكتيريا سالبة الغرام لا هوائية توجد عادة في اللويحة تحت اللثة لدى البشر، هي عامل مسبب رئيسي لالتهاب اللثة وقد ارتبطت بالعديد من الأمراض الجهازية. تم تحديد العديد من سلالات P. gingivalis وتمتلك السلالات المختلفة عوامل ضراوة مختلفة. لم تتمكن الأساليب الحالية لدراسة الميكروبيوم الفموي (16S أو شوتغن) من التمييز بين . سلالات بكتيريا اللثة. تقدم هذه الدراسة نهجًا جديدًا يهدف إلى تحسين دقة تحديد السلالات، باستخدام طريقة كشف تعتمد على تسلسل منطقة الفاصل بين الجينات (ISR) التي تتغير بين سلالات .gingivalis نهجنا يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو الخطوتين لتضخيم فقط . منطقة ISR من .gingivalis يتم تسلسل العينات بعد ذلك باستخدام جهاز تسلسل إيلومينا ويتم ربطها بسلالات محددة. تم التحقق من صحة نهجنا من خلال فحص اللويحات تحت اللثة من 153 مشاركًا يعانون من مرض اللثة ومن لا يعانون منه. حددنا السلالة غير الضارة ATCC33277/381 كأكثر السلالات وفرة عبر جميع أنواع العينات. كانت سلالة W83/W50 غنية بشكل ملحوظ في التهاب اللثة، مع للمشاركين الذين يحملون هذا السلالة. بشكل عام، يمكن أن يكون لهذا النهج آثار كبيرة ليس فقط على تشخيص وعلاج أمراض اللثة ولكن أيضًا على أمراض أخرى حيث تم الإشارة إلى . gingivalis أو سمومه، مثل مرض الزهايمر.
التهاب اللثة هو من بين أكثر العدوى شيوعًا في الولايات المتحدة، مع انتشار يقدر بـ للبالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 30 عامًا أو أكثر، و من الأفراد يعانون من التهاب اللثة الشديد يمكن أن تؤدي التهاب اللثة غير المعالج إلى ضعف وظيفة الفم مع فقدان الأسنان في النهاية وتقليل جودة الحياة بشكل عام. لقد ارتبطت التهاب اللثة بمجموعة متنوعة من الاضطرابات الجهازية مثل أمراض القلب والأوعية الدموية، والسكري، ومرض الزهايمر، والعدوى في الجهاز التنفسي، والنتائج السلبية للحمل. .
تمتاز التهاب اللثة بأنه مرض غير متوازن بسبب التحول في المجتمعات الميكروبية تحت اللثة التي تستعمر جيوب اللثة من بكتيريا هوائية إيجابية الجرام في الغالب، إلى هيمنة البكتيريا سالبة الجرام اللاهوائية. ومن أبرز هذه البكتيريا ما يُعرف بـ “مجموعة الأحمر”: بوريهيموناس جينجيفاليس، تانيريلة فورسيتيا، وتريبوينما دينتيكولا. تشير مجموعة متزايدة من الأدبيات إلى أن بكتيريا P. gingivalis، المسبب الرئيسي في التهاب اللثة المزمن، لها تأثيرات على ظهور أمراض نظامية مختلفة، بما في ذلك التهاب المفاصل الروماتويدي، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والأمراض التنكسية العصبية. تقدم دراسة حديثة أدلة على وجود الجينجيباينز، وهو بروتين سام تنتجه . جينغفالس، في دماغ مرضى الزهايمر مما يشير إلى أن ب. جينغفالس قد تلعب دورًا حاسمًا في مسببات مرض الزهايمر .
تم العثور على ب. جينغفالس في الأفراد الأصحاء وكذلك في المرضى الذين يعانون من مرض اللثة المزمن. لقد درست عدة دراسات توصيفية التنوع الجيني بين سلالات ب. غينغيفاليس وقدرتها المتفاوتة على التسبب في أمراض اللثة. تشمل الأساليب مثل التحليل الكهربائي للإنزيمات متعددة المواقع، وبصمة RAPD، وتحليل MLS فصل ب. غينغيفاليس إلى 41-73 سلالة مختلفة. .
حالياً، هناك 67 جينوم فريد من P. gingivalis في قاعدة بيانات NCBI. تجريبياً، تختلف سلالات P. gingivalis في تجلّي الصفات الضارة المقاسة. على سبيل المثال، يمكن أن يسبب الحقن تحت الجلد لبعض السلالات، بما في ذلك W83، انتشار وتقرحات في مواقع بعيدة، بينما تنتج سلالات أخرى فقط خراجات صغيرة ومحدودة. لقد أظهرت الدراسات أن تنشيط الصفائح الدموية، ونشاط الكولاجيناز، وتجنب البلعميات يختلف جميعها حسب السلالة. .
تشمل الأساليب الحالية لميكروبيوم الأمعاء تسلسل المناطق المتغيرة بشكل كبير من جين 16S rRNA أو تسلسل الشوتغن لجميع الحمض النووي المعزول. كلا الطريقتين محدودتان في قدرتهما على اكتشاف الأنواع الفرعية أو السلالات البكتيرية. على سبيل المثال، على الرغم من أن تجارب ميكروبيوم 16S قد كشفت عن تنوع الميكروبيوتا وكشفت عن ارتباطها بصحة الإنسان والمرض. ، العديد من البكتيريا لا يمكن تحديدها على مستوى الأنواع، وتفوت طرق تسلسل 16S تمامًا اختلافات السلالات. بينما يتم استخدام تسلسل الشوتغن بشكل شائع في أبحاث ميكروبيوم الأمعاء، إلا أنه ليس عمليًا لتحليل ميكروبيوم الفم. وذلك لأن جزءًا كبيرًا من ( ) من الحمض النووي المستخرج من الفم هو من المضيف البشري نتيجة لذلك، يمكن أن تكون الطريقة القياسية لتسلسل الشوتغن مكلفة عند محاولة تحديد المجتمعات البكتيرية المتنوعة والمعقدة بدقة عالية. بالإضافة إلى ذلك، عند إجراء تحليل على مستوى السلالات، يتطلب الأمر عمق تسلسل أكبر بكثير، ولتقنيات الحوسبة الحالية المستخدمة في اكتشاف السلالات حدودها. عند فحص عينات اللويحات تحت اللثة، وفرة يمكن أن تتراوح الجيفاليس من 5 إلى في الأفراد الذين يعانون من مرض اللثة المعتدل إلى الشديد . ونتيجة لذلك، فإن تكلفة التسلسل على عمق مطلوب لتحديد السلالات ستكون مكلفة للغاية لأي مشروع كبير النطاق.
لذا، لتحديد سلالات P. gingivalis بطريقة فعالة من حيث التكلفة، قمنا بتكييف الأساليب السابقة التي تفحص منطقة الفاصل بين الجينات (ISR). الـ ISR يقع بين جينات الوحدة الريبوسومية الصغيرة (16S) والكبيرة (23S) وهو متغير بشكل كبير بين السلالات. في هذه الدراسة، حددنا منطقة غنية بالمعلومات تقع ضمن ISR لـ P. gingivalis وأنشأنا بادئات محددة للتسلسل تستهدف فقط P. gingivalis وتحيط بمنطقة تحتوي على اختلافات تحدد السلالات. قمنا بالتحقق من صحة نهجنا من خلال فحص اللويحة تحت اللثة من 153 مشاركًا يعانون من مرض اللثة ومن لا يعانون منه، وأظهرنا ارتباطًا كبيرًا بين سلالة W83 وشدة المرض.

النتائج
الخصوصية والحساسية وقابلية التكرار لـ بادئة محددة لـ ISR لـ . gingivalis

تم محاذاة تسلسلات ISR المتاحة لـ P. gingivalis لتحديد المناطق التي تتراوح بين 200-250 نقطة أساسية تحتوي على أكبر عدد من الاختلافات بين السلالات والتي تحاط بتسلسلات محفوظة لأمبليكون PCR (الشكل 1). ثم تم فحص تسلسلات البرايمر المحفوظة في قاعدة بيانات NCBI لاختبار الهوية مع البكتيريا غير P. gingivalis. تم تحديد مجموعتين من البرايمرات مع مجموعة واحدة موصوفة أدناه على أنها الأكثر إفادة لتحديد السلالات. تم تحديد خصوصية البرايمرات الخاصة بـ P. gingivalis ISR باستخدام لويحات تحت اللثة من مشارك يعاني من مرض اللثة الشديد، وضوابط إيجابية (سلالة P. gingivalis ATCC33277، لويحات تحت اللثة المجمعة من عدة مشاركين)، وضوابط سلبية (DNA زيمو الوهمي، ماء خالي من الحمض النووي الميكروبي) (الشكل 1B). كانت البرايمرات الخاصة بـ جينجيفاليس مضاعف حمض نووي من نوع جينجيفاليس إلى 250 نقطة أساس) في عينة المشاركين والضوابط الإيجابية، في حين لم يتم تضخيم منتجات PCR في الضوابط السلبية. حساسية الـ تم تحديد بادئات محددة لـ P. gingivalis ISR مع وبدون إضافة سلالة P. gingivalis ATCC33277 (1 نانوغرام و 2 نانوغرام) في DNA زيمو الوهمي (الشكل 1C). تم تأكيد حساسية البادئات المحددة لـ ISR من خلال التضخيم حمض نووي من جينجيفاليس فقط في تفاعل الإضافة ويؤكد أن تضخيم لا يتم تثبيط الحمض النووي لـ . gingivalis بوجود حمض نووي ميكروبي آخر في التفاعل.

تحديد سلالات . gingivalis في اللويحة تحت اللثة

لفحص سلالات P. gingivalis المرتبطة بأمراض اللثة، قمنا بفحص عينات من اللويحات تحت اللثة من دراسة هشاشة العظام وأمراض اللثة في بوفالو (OsteoPerio). دراسة أوستروبيريو هي دراسة جماعية مستقبلية تم إنشاؤها لاستكشاف عوامل الخطر لتطور وتقدم هشاشة العظام وأمراض اللثة لدى النساء بعد انقطاع الطمث. تم فحص الميكروبيوم تحت اللثوي سابقًا باستخدام تسلسل جين 16S rRNA. تم فحص ما مجموعه 161 عينة من اللويحات تحت اللثة مع 12 مجموعة من اللويحات، و2 من الضوابط الإيجابية، و6 من الضوابط السلبية.
تم إنتاج الأمبليكون المحدد لـ P. gingivalis ISR باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو الخطوتين، مشابهًا لتحليل 16S (انظر “الطرق”) تم قياس تركيز الحمض النووي لكل مكتبة تسلسل ISR قبل التسلسل. يتم توضيح تركيز الحمض النووي مقابل كل نوع عينة (حالة صحة اللثة – لا شيء / خفيف، معتدل وشديد، ضوابط سلبية وإيجابية) في الشكل 2A. كان تركيز الحمض النووي لـ P. gingivalis أكبر بشكل ملحوظ في مجموعات مرض اللثة المعتدل والشديد مقارنة بمجموعة لا شيء / خفيف، مما يتماشى مع زيادة الوفرة من . جينجيفاليس في مجموعات الأمراض المتوسطة والشديدة. تم الكشف عن كمية غير مهمة من الحمض النووي في الضوابط السلبية (محلول الاستخراج، الحمض النووي الوهمي من زيمو، ماء خالٍ من الحمض النووي الميكروبي). بعد التسلسل، تصفية الجودة، ودمج القراءات المزدوجة، تم تعيين قراءات التسلسل إلى قاعدة بيانات ISR المخصصة التي تحتوي على تسلسلات مرجعية لـ . gingivalis باستخدام DADA2 كان عدد القراءات المتطابقة متسقًا مع تركيز مكتبة التسلسل، حيث كانت مجموعات مرض اللثة المعتدل والشديد تحتوي على عدد أكبر من القراءات. قراءات . gingivalis (الشكل 2B).

كشف عن سلالات . gingivalis

كان هناك 139 تسلسلًا فريدًا من P. gingivalis ISR. يتم تسمية كل سلالة ممكنة بـ الهوية لتسلسلات ISR المتاحة. عندما تحتوي سلالات متعددة على نفس تسلسل ISR، يتم تضمين جميع الأسماء. على سبيل المثال، السلالات المرتبطة W83 و W50 لديها تسلسلات ISR متطابقة لهذه المنطقة ولا يمكن فصلها. العديد من تسلسلات ISR المحددة جديدة وتم تسميتها PG-Strain #. تم تصنيف كل سلالة جديدة بشكل أكبر من خلال تشابه التسلسل (مجموعة البيانات التكميلية 1). احتوت عينتان من عينات التحكم الإيجابية على السلالة ATCC33277. بالنسبة لهذه العينات، أو من القراءات المتسلسلة التي تم تعيينها إلى ATCC33277. بالإضافة إلى ذلك، تم تضمين 5 تكرارات حيث تم تقسيم عينة اللويحة قبل استخراج الحمض النووي. كانت تجارب التكرار مشابهة جدًا لبعضها البعض، مما يظهر قابلية إعادة إنتاج نهجنا (الشكل 3).
تمت مطابقة معظم عينات المشاركين مع سلالتين مختلفتين من P. gingivalis (الشكل 4A)، وهو ما يتماشى مع النتائج السابقة. تنوع ألفا (شانون، تشاو1) مشابه عبر حالة مرض اللثة (الشكل التكميلي 1). لفهم توزيع سلالات . gingivalis في كل عينة نحدد تكرار

أ

* 60 * * *
KCOM 2796
W83 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGG GCAACGGTCATGCAGCCCA ١٢٤
ATCC_33277 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGG GCAACGGTCATGCAGCGCA ١٢٤
ATCC_49417 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA ١٢٤
AJW4 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA ١٢٤
AS2 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA ١٢٤
A7436 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA ١٢٤
KCOM_3001 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTCCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA ١٢٤
HG66 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA ١٢٤
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGAGCAACGGTCATGCAGCGCA ١٢٤
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTTG GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
TDC 60 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———– AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGAGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
A7A1-28 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———–AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
KCOM 3131 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM 2800 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTCCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
RMA 4165 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GA-CTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———–AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 113
RMA GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
RMA_ : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCCAAAAGG ———–AAAAATATAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC GAgcTTTCCCTGCTTCGAACTTTgCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCaAAAAGG
AAAAATAaAGAGAGATAAGGgGCAACGGTCATGCAGC CA
* 180 ٢٠٠ 220
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTT CGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT –غاتات جي تي أغاغ جي تي سي جي جي سي آي جي تي 225
W83 : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT –غاتات جي تي أغاغ جي تي سي جي جي سي آي جي تي تي 225
ATCC_33277 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
ATCC 49417 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
AJW4 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
AS2 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
A7436 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
HG66 : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
TDC_60 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
A7A1-28 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGATGGAAGAGTTCGAATAAGAGACAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCATAC GGAAGAGTTCGAATAAGAGACAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
RMA AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT ٢١٤
RMA AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
RMA : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT AGGAGCTGCCACAGGCAgACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAgAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT –جاتاات جي تي ايه تي جي ايه جي جي تي سي جي جي سي اج تي تي 215
ب
الشكل 1. إنشاء بادئات محددة لـ P. gingivalis. (أ) محاذاة لمناطق سلالة P. gingivalis ISR التمثيلية. تم الإشارة إلى مواقع البادئات. (ب) تم تحسين ظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتكبير مناطق ISR لـ P. gingivalis دون استهداف بكتيريا أخرى. (ج) تسمح ظروف PCR بتكبير P. gingivalis في عينات مختلطة. يحتوي Zymo Mock على الحمض النووي من Listeria monocytogenes وPseudomonas aeruginosa وBacillus subtilis وEscherichia coli وSalmonella enterica وLactobacillus fermentum وEnterococcus faecalis وStaphylococcus aureus؛ Plaque Pool، تجمع من اللويحات تحت اللثة من عدة مشاركين (تحكم إيجابي لمجموعات التسلسل)؛ Pg. DNA، سلالة P. gingivalis ATCC33277. عينة Perio، لويحات تحت اللثة من مشارك يعاني من مرض اللثة الشديد. تم تصور المنتجات النهائية في التحليل الكهربائي لهلام الأجاروز مع صبغة الإيثيديوم بروميد.
السلالة العليا في كل عينة (الشكل 4ب). بالنسبة لمعظم عينات المشاركين بغض النظر عن حالة المرض، تمثل السلالة العليا من جميع قراءات تسلسل .gingivalis

W83/W50 مرتبط بمرض اللثة

لتحديد ما إذا كانت سلالات معينة مرتبطة بمرض اللثة، قمنا بتجميع عيناتنا إلى مجموعتين: لا شيء/خفيف ومتوسط/شديد وقمنا بتصفية تسلسلات ISR بإزالة السلالات ذات الوفرة المنخفضة أو تلك التي تظهر في عينة واحدة فقط (انظر “الطرق”). في المجموع، تم فحص 18 سلالة من P. gingivalis بعد التصفية (الجدول 1).
السلالة الأكثر وفرة في جميع العينات هي السلالة غير الضارة سلالة .gingivalis ATCC33277_381 التي وُجدت في كل من المجموعات غير الشديدة/المعتدلة (CLR 6.38) والمعتدلة/الشديدة (CLR 5.34). الغالبية 15/18 من السلالات كانت أكثر وفرة في الحالات المعتدلة/الشديدة. فقط السلالة W83_W50 كانت غنية بشكل ملحوظ في فئة المعتدلة/الشديدة بعد تصحيح الاختبارات المتعددة. تم اكتشاف W83_W50 فقط في المجموعة المعتدلة/الشديدة، مع للمشاركين الذين يحملون ذلك السلالة. عندما قارنّا مستويات الوفرة باستخدام المركز -نسبة (CLR)-تحويل عدد القراءات، كانت السلالة W83 غنية بشكل ملحوظ في المجموعة المتوسطة/ الشديدة ( تم إظهار سلالة W83 سابقًا من خلال تصنيف الهجينة أنها قوية
الشكل 2. مكتبات ISR وعدد القراءات المرسومة. (A) تركيزات الحمض النووي بعد تشكيل مكتبة تسلسل الجيل التالي مع جولتين من PCR. (B) أعداد القراءات التي تم رسمها على قاعدة بيانات ISR لـ P. gingivalis. يتم عرض تصنيف العينة اللثوي (لا شيء / خفيف، معتدل، شديد) مع عدد العينات لكل مجموعة. Neg، التحكم السلبي المحدد للدفعة (محلول الاستخراج، فراغ PCR)؛ Pos، التحكم الإيجابي مع DNA من ATCC33277؛ مجموعة اللويحات، DNA المعزول من مزيج من اللويحات تحت اللثة من مجموعة من الأشخاص (تحكم إيجابي).
الشكل 3. النسخ التقنية قابلة للتكرار. الوفرة النسبية لخمسة عينات مكررة، مع معامل الارتباط بيرسون (r) بين النسخ.
الشكل 4. عدد السلالات والوفرة (أ) عدد السلالات المكتشفة في كل عينة. (ب) تكرار السلالة الأكثر وفرة في كل عينة.
مرتبط بالتهاب اللثة أظهرت دراسات متعددة أن السلالة W83 كانت أكثر ضراوة من غيرها سلالات . gingivalis .
قمنا بعد ذلك بتقييم الارتباطات الخطية لكل متوسط إجهاد CLR مع القياسات السريرية الكاملة للفم لعمق الجيب المتوسط (PD) ومستوى الارتباط السريري (CAL) (الجدول 1). تراوحت الارتباطات من -0.134 إلى 0.142 لعمق الجيب ومن -0.095 إلى 0.152 لمستوى الارتباط السريري. بعد تصحيح الاختبارات المتعددة، لم تكن أي من الارتباطات ذات دلالة إحصائية.

نقاش

تحديد سلالات P. gingivalis باستخدام طرق الميكروبيوم الحالية كان محدودًا. هناك مشكلتان رئيسيتان تحتاجان إلى معالجة. أولاً، وفرة . الجينغيفاليس في مجموعة الحمض النووي الكلي منخفض جداً. بالنسبة للعينات الفموية، فإن الغالبية العظمى من الحمض النووي المعزول هو من المضيف البشري ووفرة . الجينجيفاليس في الميكروبيوم هو فقط للأشخاص الذين يعانون من مرض اللثة المعتدل إلى الشديد يمكن أيضًا اكتشاف P. gingivalis في المرضى الأصحاء كما هو موضح في نتائجنا ومن خلال دراسات سابقة. . ثانياً، يتطلب تحديد السلالة اختلافات تسلسلية محددة للسلالة في منطقة تم تسلسلها في جميع العينات. نهجنا يعالج كلا القلقين من خلال تضخيم تسلسل ISR المحدد لـ P. gingivalis في منطقة تتميز بتنوع تسلسل السلالات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لطريقتنا الكشف عن مستويات منخفضة من P. gingivalis في المشاركين الأصحاء مما يسمح بفحص قوي للسلالات فيما يتعلق بحالات طبية متنوعة.
في هذه الدراسة، حددنا منطقة غنية بالمعلومات تقع داخل . جينجيفاليس ISR التي يمكن أن تفصل . سلالات الجينجيفاليس بطريقة فعالة من حيث التكلفة. للتحقق من نهج تسلسل ISR الخاص بنا، قمنا بفحص اللويحة تحت اللثة من 153 مشاركًا. فقط منطقة ISR المحددة باسم W83_W50 كانت مرتبطة بشكل كبير بمرض اللثة. وقد أظهر W83 سابقًا أنه مرتبط بالتهاب اللثة. وقد أظهرت دراسات متعددة أن W83 أكثر ضراوة من سلالات أخرى. تم تحديد عدة سلالات فقط في فئة المعتدلة/الشديدة، ولكن بسبب حجم العينة المحدود لم تكن ذات دلالة في هذه الدراسة. كانت السلالة ATCC33277 هي السلالة الأكثر وفرة التي تم تحديدها في هذه الدراسة وكان هناك زيادة طفيفة في فئة لا شيء/خفيف. وقد تم اقتراح أن تكون ATCC33277 سلالة أكثر صحة مع خصائص ضراوة مخفضة. .
بينما نهجنا واعد، إلا أن له بعض القيود التي يجب أخذها بعين الاعتبار. الحد الأول هو أن عددًا كبيرًا من سلالات P. gingivalis لديها تسلسلات متطابقة ضمن هدفنا.
ملصق السلالة فئة أمراض اللثة متوسط الفم بالكامل
لا شيء/خفيف ) متوسط/شديد ) فرانكلين ديلانو روزفلت PD كال
يعني (SE) تكرار متوسط (SE) تكرار قيمة P قيمة-q قيمة P قيمة P
W83_W50 0 (0) 0 1.45 (0.38) 0.13 0.0003 0.005 0.142 0.11 0.096 0.29
PG-strain_10 0 (0) 0 0.33 (0.2) 0.02 0.09 0.43 0.076 0.4 0.152 0.09
PG-strain_45 0 (0) 0 0.18 (0.1) 0.01 0.09 0.43 0.271 0.002 0.23 0.01
KCOM2798 0.21 (0.21) 0.05 0.77 (0.26) 0.11 0.10 0.43 0.052 0.56 0.031 0.73
PG-strain_16 0 (0) 0 0.23 (0.17) 0.02 0.16 0.43 -0.094 0.3 -0.051 0.58
PG-strain_39 0 (0) 0 0.14 (0.1) 0.01 0.16 0.43 -0.075 0.4 -0.025 0.78
PG-strain_43 0 (0) 0 0.12 (0.09) 0.01 0.17 0.43 -0.017 0.85 -0.066 0.46
KCOM3001 0.28 (0.28) 0.05 0.72 (0.27) 0.06 0.27 0.61 -0.134 0.14 -0.064 0.48
ATCC33277_381 6.38 (0.96) 0.71 5.34 (0.52) 0.54 0.34 0.66 -0.028 0.75 -0.014 0.88
PG-strain_18 0.4 (0.23) 0.1 0.64 (0.17) 0.13 0.40 0.66 -0.071 0.43 -0.067 0.46
TDC60_KCOM3131 0.3 (0.3) 0.05 0.61 (0.24) 0.05 0.43 0.66 -0.057 0.53 -0.095 0.29
RMA3725 1.46 (0.78) 0.19 2.16 (0.43) 0.2 0.44 0.66 -0.07 0.44 0.007 0.94
KCOM2796 0.73 (0.73) 0.05 0.33 (0.16) 0.04 0.60 0.82 -0.024 0.79 -0.032 0.72
PG-strain_8 0.29 (0.29) 0.05 0.4 (0.18) 0.03 0.76 0.85 0.034 0.71 0.1 0.27
AJW4 0.64 (0.46) 0.1 0.78 (0.29) 0.06 0.78 0.85 -0.11 0.22 -0.011 0.9
PG-strain_3 ٢.٢١ (٠.٩٧) 0.29 2.48 (0.43) 0.28 0.80 0.85 0.114 0.21 0.108 0.23
PG-strain_14 0.17 (0.17) 0 0.23 (0.16) 0.01 0.80 0.85 -0.004 0.96 -0.009 0.92
PG-strain_9 0.51 (0.51) 0.05 0.44 (0.22) 0.05 0.90 0.90 -0.061 0.5 -0.035 0.7
الجدول 1. سلالات P. gingivalis عبر فئات مختلفة من أمراض اللثة. CAL، مستوى الارتباط السريري؛ PD عمق الجيب. مُعرّف وفقًا لمعايير مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها / الأكاديمية الأمريكية لطب الأسنان اللثوي . مركزي المتوسط -نسبة التحول في الإجهاد. تكرار السلالة المكتشفة مع على الأقل من القراءات. قيمة مقارنة بين لا شيء/خفيف إلى معتدل/شديد. -قيمة لأسلوب بنجاميني هوشبرغ للتحكم في معدل الاكتشافات الخاطئة. معامل ارتباط بيرسون المنتج-اللحظة. قيمة معامل الارتباط.
منطقة ISR. وبالتالي، لا يمكن لطريقتنا الحالية التمييز بين هذه السلالات. إن تحديد مجموعات إضافية من البرايمرات الموجودة في جينات الضراوة من شأنه تعزيز هذه الطريقة وتسهيل تصنيف أنواع سلالات ISR غير المعروفة. ثانياً، تعتمد قدرتنا على تحديد كل سلالة على مطابقة التسلسلات مع قاعدة بيانات للسلالات الموصوفة. ومع ذلك، ستتحسن هذه القيود مع المزيد من تم تسلسل سلالات . gingivalis وتوصيفها على مر الزمن. وأخيرًا، من الجدير بالذكر أن جميع طرق تسلسل الأمبليكون ذات التعقيد المنخفض التي تستخدم تسلسل إيلومينا تتطلب إضافة كبيرة من الحمض النووي. وذلك لأن تقريبًا جميع القواعد على خلية التدفق لها نفس استدعاء القاعدة، مما يؤدي إلى مشاكل في ضبط شدة الفلورسنت. لمعالجة هذه المشكلة، يمكن أن تتضمن بادئاتنا قواعد إضافية لتخفيف التداخل تسمح بالتجمع بكثافة أعلى. أو بدلاً من ذلك، يمكن دمج العينات مع تجارب أخرى ذات تعقيد عالٍ.

طرق
المشاركون

شملت الدراسة الحالية 153 امرأة بعد انقطاع الطمث تم تسجيلهن في دراسة بوفالو لهشاشة العظام والتهاب اللثة (OsteoPerio)، وهي دراسة مساعدة أجريت في مركز بوفالو (نيويورك) السريري لدراسة المبادرة الصحية للنساء (WHI OS). خضعت كل مشاركة في هذه الدراسة لفحص سريري كامل للفم. تم استخدام متوسط عمق الجيب (PD) ومستوى الارتباط السريري (CAL) المحددين بناءً على معايير مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) / الأكاديمية الأمريكية لطب اللثة (AAP) لتحديد حالة مرض اللثة السريري كعدم وجوده، خفيف، معتدل، وشديد. تم جمع عينات من اللويحات تحت اللثة في محلول رينجر باستخدام نقاط ورقية رفيعة وتم تجميدها على الفور عند قدم جميع المشاركين موافقة مستنيرة، وتمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل مجلس مراجعة المؤسسات الصحية بجامعة بوفالو. كانت جميع التجارب متوافقة مع الإرشادات ذات الصلة بشأن أبحاث الموضوعات البشرية.

استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري

تم عزل الحمض النووي الميتاجينومي من عينات اللويحات تحت اللثة باستخدام نظام QIAsymphony SP الآلي كما هو موصوف سابقًا. قبل استخراج الحمض النووي، تم إجراء معالجة إنزيمية مسبقة لعزل أكثر كفاءة للبكتيريا إيجابية الجرام. تم تكوير عينات اللويحات تحت اللثة بواسطة الطرد المركزي عند لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة، وتم إعادة تعليق الرواسب في محلول التحلل مل من الليزوزيم في 20 مللي مولار من تريس-هيدروكلوريد، EDTA؛ ترايتون ) وتم حضنه في لمدة 30 دقيقة. تم استخراج وتنقية الحمض النووي وفقًا لتعليمات استخدام مجموعة Qiasymphony DSP للفيروسات / مسببات الأمراض (دليل المستخدم) وورقة بروتوكول QIAsymphony SP لبروتوكول Complex200_V6_DSP (“Complex200_V6_DSP”). بعد تنقية الحمض النووي، تم استرداد العينات في لوحة مكونة من 96 بئرًا (Qiagen، فالنسيا، كاليفورنيا). كانت كل لوحة تحتوي على 77 عينة من لويحات تحت اللثة، ونسختين من ضوابط استخراج فارغة، و6 مجموعات من اللويحات كـ
تحكم إيجابي. تم استرجاع 60 ميكرولتر من الحمض النووي من كل عينة. تم قياس كمية الحمض النووي المستخرج باستخدام جهاز QuantiT. مجموعة اختبار dsDNA عالية الحساسية (إنفيتروجن).

تحضير مكتبة تسلسل الأمبليكون ISR

تم استخدام الحمض النووي الميتاجينومي من كل عينة للتحضير مكتبات تسلسل الأمبليكون لمنطقة الفاصل بين الجينات (ISR) تستهدف مناطق IRS لبكتيريا P. gingivalis. تم إعداد مكتبات الأمبليكون باستخدام بروتوكول من خطوتين حيث يتم أولاً تضخيم المنطقة المعنية باستخدام بادئات محددة لمنطقة ISR (البادئة الأمامية TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC؛ البادئة العكسية GTC TCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-AACTGCCGACCTCTACATTATC). ثم يتم إضافة مؤشرات مزدوجة من خلال PCR ثانٍ. تم استخدام DNA زيمو الوهمي (معيار DNA المجتمعات الميكروبية ZymoBIOMICS، زيمو ريسيرش، الولايات المتحدة الأمريكية) وماء خالي من DNA الميكروبات (ماء PCR خالي من DNA الميكروبات، كياجين إنك، الولايات المتحدة الأمريكية) كتحكم سلبي، وسلالة P. gingivalis ATCC3372 كتحكم إيجابي خلال عملية التضخيم. تم إجراء تضخيم الأمبليكون باستخدام دورة حرارية مع من الحمض النووي الجينومي، من بادئ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للأمبليكون ) ، من البرايمر العكسي لـ PCR للأمبليكون ( )، و من هوت ستارت ريدي ميكس (كابا بيوسيستمز) في الإنكار الأولي لمدة 3 دقائق، يتبعه 30 دورة من لـ لمدة 30 ثانية، و لمدة 30 ثانية، وتمديد نهائي عند لمدة 5 دقائق. وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة، تم تنظيف التفاعلات باستخدام كرات Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics). تم إجراء ربط المؤشرات المزدوجة مع محولات تسلسل Illumina باستخدام من منتج DNA لعملية تضخيم الأمبليكون من بريمير الفهرسة Illumina Nextera XT 1 (N7xx)، l من برايمر فهرس نيكستيرا إكس تي 2 (S 5 xx )، من كابا هاي فاي هوت ستارت ريدي ميكس، و ماء PCR خالي من الحمض النووي الميكروبي، مع دورة حرارية عند لمدة 3 دقائق، تليها 8 دورات من لـ لمدة 30 ثانية، و لمدة 30 ثانية، وامتداد نهائي عند تم تنقية مكتبات الأمبليكون ISR باستخدام كرات Agencourt AMPure XP وتم قياس كميتها باستخدام Quant-iT لمدة 5 دقائق. مجموعة اختبار dsDNA عالية الحساسية (Invitrogen) ومجموعة قياس مكتبة KAPA (KAPABIOSYSTEMS). تم إجراء مراقبة جودة المكتبة باستخدام جهاز تحليل البيولوجيا Agilent Technologies 2100 لتحديد الجودة وتوزيع الحجم المتوسط. تم تطبيع المكتبات وتجميعها إلى 4 نانومتر بناءً على القيم المؤهلة من Quant-iT. تم تفكيك العينات المجمعة وتخفيفها إلى تركيز نهائي قدره 10 بيكومول. تحكم PhiX (إلومينا). تم إجراء جميع التسلسلات على خلية تدفق واحدة باستخدام جهاز إلومينا ميسيك. تم دمج جميع العينات وتسلسلها بنسبة 1-5 مع عينات الميكروبيوم باستخدام تقنية الشوتغن، لتقليل تأثير مكتبة التعقيد المنخفض.

تحليل البيانات

تم تنزيل الجينومات المتاحة لبكتيريا P. gingivalis من قاعدة بيانات GenBank التابعة لـ NCBI. تم إنشاء قاعدة بيانات ISR الفموية البشرية عن طريق استخراج تسلسلات ISR باستخدام بادئات محيطة بـ ISR باستخدام تطبيق BLASTN الإصدار 2.5.0 من الجينومات المتاحة لجميع سلالات Porphyromonas gingivalis.
خوارزمية إزالة الضوضاء للأمبليكون القابلة للتقسيم 2 (DADA2-متاحة علىhttps://github.com/benjjneb/dada2خط أنابيب الميكروبيوم المستخدم لتمييز المجتمعات الميكروبية من خلال متغيرات التسلسل التي تختلف بمقدار نوكليوتيد واحد فقط الموجودة في البيانات، كمتغيرات تسلسل الأمبليكون (ASVs) . في الخطوة الأولى، تم تحديد كل من البرايمرات الأمامية والعكسية في قراءات تسلسل الأميبلكون ثنائي الطرف وتم إزالتها باستخدام Cutadapt. تم تحديد جودة القراءات من خلال تكرار كل درجة جودة في كل موضع قاعدة باستخدام دالة dada2 PlotQualityProfile. تم إزالة القراءات التي كانت درجة جودتها أقل من 30 من التحليل الإضافي. تم تنفيذ الفلترة والتقليم على القراءات التي تم تصفيتها من حيث الجودة باستخدام دالة dada2 filterAndTrim مع المعلمات القياسية (عدد أقصى من النيوكليوتيدات الغامضة ( )، يقرأ بأخطاء متوقعة ( تم تقدير معدلات أخطاء التسلسل من جميع العينات كمجموعة (وظيفة dada2 learnErrors)، ثم تم إزالة التكرارات من التسلسلات المفلترة (وظيفة dada2 derepFastq) لتوليد تسلسلات فريدة. بعد ذلك، تم معالجة هذه التسلسلات الفريدة باستخدام خوارزمية DADA2 (وظيفة dada2 mergePairs و makeSequenceTable) لاستنتاج متغيرات تسلسل الأمبليكون الدقيقة (ASVs). تم إزالة التسلسلات الشيميرية (وظيفة dada2 removeBimeraDenovo)، وتم إنشاء جدول ASV مقابل العينة و ISR (جداول OTU) (وظيفة phyloseq otu_table)، والذي تم استخدامه للمطابقة ضد قاعدة بيانات ISR المخصصة التي تحتوي على تسلسلات مرجعية فريدة من P. gingivalis لتحديد سلالات P. gingivalis. سيتم إعطاء التسلسلات الجديدة في ISR التي لا تتطابق بدقة اسمًا افتراضيًا والبحث عنها باستخدام BLAST لتحديد أقرب السلالات.
تم تطبيع كل ISR ASV باستخدام تحويل النسبة اللوغاريتمية المركزية (CLR)، مما سيساعد في حساب هيكل البيانات التركيبية، وتقليل احتمالية الارتباطات الزائفة، وزيادة دلالة المقارنة. تم حساب الارتباطات بين النسخ الفنية باستخدام معامل ارتباط بيرسون. تُعرض نتائج تكرار سلالات P. gingivalis كمتوسط. خطأ معياري (SE) لحالات صحة اللثة المختلفة مع قيم p المصححة مع تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ المنفصل للاختبارات المتعددة. العلاقات الخطية بين وفرة CLR لـ تم تقييم سلالة . gingivalis ومتوسط قياسات PD و CAL باستخدام ارتباطات بيرسون. تم إجراء اختبارات تنوع ألفا واختبارات إثراء السلالات الأحادية باستخدام المورد الإلكتروني MicrobiomeAnalyst. .

توفر البيانات

تم رفع بيانات التسلسل الناتجة إلى قاعدة بيانات أرشيف قراءة التسلسل (SRA) التابعة لمركز المعلومات البيولوجية الوطني (NCBI) مع معرف مشروع البيولوجيا # PRJNA982061.
تاريخ الاستلام: 12 يونيو 2023؛ تاريخ القبول: 12 مارس 2024
نُشر على الإنترنت: 14 مارس 2024

References

  1. Eke, P. I., Borgnakke, W. S. & Genco, R. J. Recent epidemiologic trends in periodontitis in the USA. Periodontology 2000(82), 257-267. https://doi.org/10.1111/prd. 12323 (2020).
  2. Bole, C., Wactawski-Wende, J., Hovey, K. M., Genco, R. J. & Hausmann, E. Clinical and community risk models of incident tooth loss in postmenopausal women from the Buffalo Osteo Perio Study. Community Dent. Oral Epidemiol. 38, 487-497. https://doi. org/10.1111/j.1600-0528.2010.00555.x (2010).
  3. Bernabe, E. & Marcenes, W. Periodontal disease and quality of life in British adults. J. Clin. Periodontol. 37, 968-972. https://doi. org/10.1111/j.1600-051X.2010.01627.x (2010).
  4. Genco, R. J., Ho, A. W., Grossi, S. G., Dunford, R. G. & Tedesco, L. A. Relationship of stress, distress and inadequate coping behaviors to periodontal disease. J. Periodontol. 70, 711-723. https://doi.org/10.1902/jop.1999.70.7.711 (1999).
  5. Fiorillo, L. et al. Porphyromonas gingivalis, periodontal and systemic implications: A systematic review. Dentistry J. 7, 114. https:// doi.org/10.3390/dj7040114 (2019).
  6. Khan, S. A., Kong, E. F., Meiller, T. F. & Jabra-Rizk, M. A. Periodontal diseases: Bug induced, host promoted. PLoS Pathog. 11, e1004952. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1004952 (2015).
  7. Li, X. et al. Maladaptive innate immune training of myelopoiesis links inflammatory comorbidities. Cell 185, 1709-1727.e1718. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.043 (2022).
  8. Hajishengallis, G. & Chavakis, T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities. Nat. Rev. Immunol. 21, 426-440. https://doi.org/10.1038/s41577-020-00488-6 (2021).
  9. Dominy, S. S. et al. Porphyromonas gingivalis in Alzheimer’s disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Sci. Adv. 5, eaau3333. https://doi.org/10.1126/sciadv.aau3333 (2019).
  10. Mendez, K. N. et al. Variability in genomic and virulent properties of Porphyromonas gingivalis strains isolated from healthy and severe chronic periodontitis individuals. Front. Cell Infect. Microbiol. 9, 246. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00246 (2019).
  11. Kumawat, R. M., Ganvir, S. M., Hazarey, V. K., Qureshi, A. & Purohit, H. J. Detection of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in chronic and aggressive periodontitis patients: A comparative polymerase chain reaction study. Contemp. Clin. Dent. 7, 481-486. https://doi.org/10.4103/0976-237X. 194097 (2016).
  12. Kulkarni, P. G. et al. Molecular detection of Porphyromonas gingivalis in chronic periodontitis patients. J. Contemp. Dent. Pract. 19, 992-996 (2018).
  13. Lau, L. et al. Quantitative real-time polymerase chain reaction versus culture: A comparison between two methods for the detection and quantification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in subgingival plaque samples. J. Clin. Periodontol. 31, 1061-1069. https://doi.org/10.1111/j.1600-051X.2004.00616.x (2004).
  14. Frandsen, E. V., Poulsen, K., Curtis, M. A. & Kilian, M. Evidence of recombination in Porphyromonas gingivalis and random distribution of putative virulence markers. Infect. Immun. 69, 4479-4485. https://doi.org/10.1128/IAI.69.7.4479-4485.2001 (2001).
  15. Menard, C. & Mouton, C. Clonal diversity of the taxon Porphyromonas gingivalis assessed by random amplified polymorphic DNA fingerprinting. Infect. Immun. 63, 2522-2531. https://doi.org/10.1128/iai.63.7.2522-2531.1995 (1995).
  16. Loos, B. G., Dyer, D. W., Whittam, T. S. & Selander, R. K. Genetic structure of populations of Porphyromonas gingivalis associated with periodontitis and other oral infections. Infect. Immun. 61, 204-212. https://doi.org/10.1128/iai.61.1.204-212.1993 (1993).
  17. Leys, E. J., Smith, J. H., Lyons, S. R. & Griffen, A. L. Identification of Porphyromonas gingivalis strains by heteroduplex analysis and detection of multiple strains. J. Clin. Microbiol. 37, 3906-3911. https://doi.org/10.1128/JCM.37.12.3906-3911.1999 (1999).
  18. Mulhall, H., Huck, O. & Amar, S. Porphyromonas gingivalis, a long-range pathogen: Systemic impact and therapeutic implications. Microorganisms. https://doi.org/10.3390/microorganisms8060869 (2020).
  19. Neiders, M. E. et al. Heterogeneity of virulence among strains of Bacteroides gingivalis. J. Periodontal. Res. 24, 192-198. https:// doi.org/10.1111/j.1600-0765.1989.tb02005.x (1989).
  20. Jockel-Schneider, Y. et al. Wild-type isolates of Porphyromonas gingivalis derived from periodontitis patients display major variability in platelet activation. J. Clin. Periodontol. 45, 693-700. https://doi.org/10.1111/jcpe. 12895 (2018).
  21. Birkedal-Hansen, H., Taylor, R. E., Zambon, J. J., Barwa, P. K. & Neiders, M. E. Characterization of collagenolytic activity from strains of Bacteroides gingivalis. J. Periodontal. Res. 23, 258-264. https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.1988.tb01369.x (1988).
  22. Werheim, E. R., Senior, K. G., Shaffer, C. A. & Cuadra, G. A. Oral pathogen Porphyromonas gingivalis can escape phagocytosis of mammalian macrophages. Microorganisms. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091432 (2020).
  23. Grice, E. A. et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science 324, 1190-1192. https://doi.org/ 10.1126/science. 1171700 (2009).
  24. Franasiak, J. M. & Scott, R. T. Jr. Reproductive tract microbiome in assisted reproductive technologies. Fertil. Steril. 104, 1364-1371. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.012 (2015).
  25. Oh, J. et al. The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome Res. 23, 2103-2114. https://doi.org/10.1101/gr. 159467.113 (2013).
  26. Griffen, A. L. et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16 S pyrosequencing. ISME J. 6, 1176-1185. https://doi.org/10.1038/ismej.2011.191 (2012).
  27. Guerrero-Preston, R. et al. (2016) 16S rRNA amplicon sequencing identifies microbiota associated with oral cancer, human papilloma virus infection and surgical treatment. Oncotarget. 7, 51320-51334. https://doi.org/10.18632/oncotarget.9710.
  28. Marotz, C. A. et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome 6, 42. https://doi.org/ (2018).
  29. Mukherjee, C., Beall, C. J., Griffen, A. L. & Leys, E. J. High-resolution ISR amplicon sequencing reveals personalized oral microbiome. Microbiome 6, 153. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0535-z (2018).
  30. Anyansi, C., Straub, T. J., Manson, A. L., Earl, A. M. & Abeel, T. Computational methods for strain-level microbial detection in colony and metagenome sequencing data. Front. Microbiol. 11, 1925. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01925 (2020).
  31. Genco, R. J. et al. The subgingival microbiome relationship to periodontal disease in older women. J. Dent. Res. 98, 975-984. https:// doi.org/10.1177/0022034519860449 (2019).
  32. Barry, T., Colleran, G., Glennon, M., Dunican, L. K. & Gannon, F. The ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Appl. 1, 51-56. https://doi.org/10.1101/gr.1.1.51 (1991).
  33. Rumpf, R. W., Griffen, A. L., Wen, B. G. & Leys, E. J. Sequencing of the ribosomal intergenic spacer region for strain identification of Porphyromonas gingivalis. J. Clin. Microbiol. 37, 2723-2725. https://doi.org/10.1128/jcm.37.8.2723-2725.1999 (1999).
  34. Aakra, A., Utåker, J. B. & Nes, I. F. RFLP of rRNA genes and sequencing of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region of ammoniaoxidizing bacteria: A phylogenetic approach. Int. J. Syst. Bacteriol. 49(Pt 1), 123-130. https://doi.org/10.1099/00207713-49-1-123 (1999).
  35. Chun, J., Huq, A. & Colwell, R. R. Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2202-2208. https://doi.org/10.1128/aem.65.5.2202-2208.1999 (1999).
  36. Stubbs, S. L., Brazier, J. S., O’Neill, G. L. & Duerden, B. I. PCR targeted to the 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region of Clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes. J. Clin. Microbiol. 37, 461-463. https:// doi.org/10.1128/jcm.37.2.461-463.1999 (1999).
  37. Banack, H. R. et al. Cohort profile: The Buffalo OsteoPerio microbiome prospective cohort study. BMJ Open 8, e024263. https:// doi.org/10.1136/bmjopen-2018-024263 (2018).
  38. Zheng, W. et al. An accurate and efficient experimental approach for characterization of the complex oral microbiota. Microbiome 3, 48. https://doi.org/10.1186/s40168-015-0110-9 (2015).
  39. Callahan, B. J., McMurdie, P. J. & Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643. https://doi.org/10.1038/ismej.2017.119 (2017).
  40. Eke, P. I., Page, R. C., Wei, L., Thornton-Evans, G. & Genco, R. J. Update of the case definitions for population-based surveillance of periodontitis. J. Periodontol. 83, 1449-1454. https://doi.org/10.1902/jop. 2012.110664 (2012).
  41. Griffen, A. L., Lyons, S. R., Becker, M. R., Moeschberger, M. L. & Leys, E. J. Porphyromonas gingivalis strain variability and periodontitis. J. Clin. Microbiol. 37, 4028-4033. https://doi.org/10.1128/jcm.37.12.4028-4033.1999 (1999).
  42. Genco, C. A., Cutler, C. W., Kapczynski, D., Maloney, K. & Arnold, R. R. A novel mouse model to study the virulence of and host response to Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis. Infect. Immun. 59, 1255-1263. https://doi.org/10.1128/iai.59.4.1255-1263. 1991 (1991).
  43. Grenier, D. & Mayrand, D. Selected characteristics of pathogenic and nonpathogenic strains of Bacteroides gingivalis. J. Clin. Microbiol. 25, 738-740. https://doi.org/10.1128/jcm.25.4.738-740.1987 (1987).
  44. Laine, M. L. & van Winkelhoff, A. J. Virulence of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in a mouse model. Oral. Microbiol. Immunol. 13, 322-325. https://doi.org/10.1111/j.1399-302x.1998.tb00714.x (1998).
  45. Naito, M. et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15, 215-225. https://doi.org/10.1093/dnares/ dsn013 (2008).
  46. Igboin, C. O., Griffen, A. L. & Leys, E. J. Porphyromonas gingivalis strain diversity. J. Clin. Microbiol. 47, 3073-3081. https://doi. org/10.1128/JCM.00569-09 (2009).
  47. Handelmann, C. R., Tsompana, M., Samudrala, R. & Buck, M. J. The impact of nucleosome structure on CRISPR/Cas9 fidelity. Nucleic Acids Res. https://doi.org/10.1093/nar/gkad021 (2023).
  48. Brennan, R. M. et al. Bacterial species in subgingival plaque and oral bone loss in postmenopausal women. J. Periodontol. 78, 1051-1061. https://doi.org/10.1902/jop.2007.060436 (2007).
  49. Gordon, J. H. et al. Is the oral microbiome associated with blood pressure in older women?. High Blood Press Cardiovasc. Prev. 26, 217-225. https://doi.org/10.1007/s40292-019-00322-8 (2019).
  50. LaMonte, M. J. et al. Composition and diversity of the subgingival microbiome and its relationship with age in postmenopausal women: An epidemiologic investigation. BMC Oral Health 19, 246. https://doi.org/10.1186/s12903-019-0906-2 (2019).
  51. Callahan, B. J. et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat. Methods 13, 581-583. https:// doi.org/10.1038/nmeth. 3869 (2016).
  52. Gloor, G. B., Macklaim, J. M., Pawlowsky-Glahn, V. & Egozcue, J. J. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional. Front. Microbiol. 8, 2224. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02224 (2017).
  53. Chong, J., Liu, P., Zhou, G. & Xia, J. Using MicrobiomeAnalyst for comprehensive statistical, functional, and meta-analysis of microbiome data. Nat. Protoc. 15, 799-821. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0264-1 (2020).

مساهمات المؤلفين

قام MJB بتصميم البحث (تصور المشروع، تطوير خطة البحث العامة، والإشراف على الدراسة)؛ قام VM بإجراء البحث (تنفيذ التجارب وجمع البيانات)؛ قام VM وSU وKMH وYS وMJL بتحليل البيانات أو إجراء التحليل الإحصائي؛ كتب VM وSU وMJL وJWW وPID الورقة؛ كان لدى MJB المسؤولية الرئيسية عن المحتوى النهائي؛ قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على المخطوطة النهائية.

تمويل

تم دعم هذا المشروع جزئيًا من خلال المنحة رقم OS950077 من وزارة الدفاع، R01DE013505، و R01DE024523 من NIDCR لجون ويليامز.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

معلومات إضافية

المعلومات التكميلية النسخة الإلكترونية تحتوي على مواد تكميلية متاحة على https://doi.org/ 10.1038/s41598-024-56849-x.
يجب توجيه المراسلات وطلبات المواد إلى م.ج.ب.
معلومات إعادة الطبع والتصاريح متاحة على www.nature.com/reprints.
ملاحظة الناشر تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي للاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا تم إجراء تغييرات. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، ستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© المؤلفون 2024

  1. قسم الكيمياء الحيوية، مدرسة جاكوبس للطب والعلوم الطبية الحيوية، جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم علم الأوبئة والصحة البيئية، مدرسة الصحة العامة والمهن الصحية، جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم الميكروبيولوجيا والمناعة، مدرسة جاكوبس للطب والعلوم الطبية الحيوية، جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. مركز ميكروبيوم جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم علم الأحياء الفموية، مدرسة طب الأسنان، جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. قسم المعلوماتية الطبية الحيوية، مدرسة جاكوبس للطب والعلوم الطبية الحيوية، جامعة بافالو، بافالو، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. البريد الإلكتروني: mjbuck@buffalo.edu

Journal: Scientific Reports, Volume: 14, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-024-56849-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38485747
Publication Date: 2024-03-14

OPEN

Defining Porphyromonas gingivalis strains associated with periodontal disease

Vijaya Murugaiyan , Simran Utreja , Kathleen M. Hovey , Yijun Sun , Michael J. LaMonte , Jean Wactawski-Wende , Patricia I. Diaz & Michael J. Buck

Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobic bacterium commonly found in human subgingival plaque, is a major etiologic agent for periodontitis and has been associated with multiple systemic pathologies. Many P. gingivalis strains have been identified and different strains possess different virulence factors. Current oral microbiome approaches ( 16 S or shotgun) have been unable to differentiate . gingivalis strains. This study presents a new approach that aims to improve the accuracy of strain identification, using a detection method based on sequencing of the intergenic spacer region (ISR) which is variable between . gingivalis strains. Our approach uses two-step PCR to amplify only the . gingivalis ISR region. Samples are then sequenced with an Illumina sequencer and mapped to specific strains. Our approach was validated by examining subgingival plaque from 153 participants with and without periodontal disease. We identified the avirulent strain ATCC33277/381 as the most abundant strain across all sample types. The W83/W50 strain was significantly enriched in periodontitis, with of participants harboring that strain. Overall, this approach can have significant implications not only for the diagnosis and treatment of periodontal disease but also for other diseases where . gingivalis or its toxins have been implicated, such as Alzheimer’s disease.
Periodontitis is among the most common infections in the United States, with an estimated prevalence of for adults aged 30 years or older, and of individuals experience severe periodontitis . Untreated periodontitis can lead to impaired oral function with eventual tooth loss and an overall reduced quality of life . Periodontitis has been associated with a variety of systemic disorders such as cardiovascular disease, diabetes, Alzheimer’s disease, respiratory tract infection, and adverse pregnancy outcomes .
Periodontitis has been characterized as a dysbiotic disease owing to a shift in the subgingival microbial communities that colonize the periodontal pockets from a predominantly Gram-positive aerobic bacteria, to a dominance of Gram-negative anaerobes. The most notable are the so-called “red-complex” bacteria: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, and Treponema denticola . A growing body of literature suggests P. gingivalis, the keystone pathogen in chronic periodontitis, has implications in the onset of different systemic pathologies, including rheumatoid arthritis, cardiovascular disease, and neurodegenerative pathologies . A recent study provides evidence of presence of gingipains, a toxic protease produced by . gingvalis, in the brain of Alzheimer’s patients suggesting P. gingvalis may play a critical role in the etiology of Alzheimer’s disease .
P. gingvalis is found in healthy individuals as well as in patients with chronic periodontal disease . Several characterization studies have examined the genetic diversity among . gingivalis strains and their varying potency to cause periodontal diseases. Approaches including multilocus enzyme electrophoresis, RAPD fingerprinting, and MLS analysis have separated P. gingivalis into 41-73 different strains .
Currently, there are 67 unique P. gingivalis genomes in the NCBI database. Experimentally, strains of P. gingivalis vary in the manifestation of measured virulence traits . For example, subcutaneous injection of certain strains, including W83, can cause spreading and ulcerating lesions at distant sites whereas others produce only small, localized abscesses . Platelet activation, collagenase activity, and macrophage avoidance have all been shown to vary by strain .
Current microbiome approaches involve sequencing of the hypervariable regions of the 16S rRNA gene or shotgun sequencing of all isolated DNA. Both approaches are limited in their ability to detect bacterial subspecies or strains. For example, although 16S microbiome experiments have revealed the diversity of the microbiota and have uncovered a connection with human health and disease , many bacteria cannot be identified to the species level, and 16S sequencing approaches completely miss strain differences. While shotgun sequencing is commonly utilized for gut microbiome research, it is not as practical for analyzing the oral microbiome. This is because a substantial portion ( ) of the DNA obtained from the mouth is from the human host . Consequently, the standard approach to shotgun sequencing can be expensive when attempting to identify highly diverse and complex bacterial communities with high accuracy . Additionally, when conducting strain-level analysis, a considerably greater depth of sequencing is required, and current computational techniques for detecting strains have their limitations . When examining subgingival plaque samples, the abundance of givalis can range from 5 to in individuals with moderate to severe periodontal disease . As a result, for any large-scale project, the cost of sequencing at a depth required for strain identification would be cost-prohibitive.
Thus, to determine P. gingivalis strains cost-effectively, we have adapted previous approaches examining the intergenic spacer region (ISR) . The ISR is between the small (16S) and large (23S) ribosomal subunit genes and is highly variable among strains . For this study, we identified an information-rich region located within the P. gingivalis ISR and generated specific primers for sequencing that only target P. gingivalis and flank a region containing strain-identifying differences. We validated our approach by examining subgingival plaque from 153 participants with and without periodontal disease and demonstrated a significant association of the W83 strain with disease severity.

Results
Specificity, sensitivity and reproducibility of . gingivalis ISR-specific primer

Available ISR sequences for P. gingivalis were aligned to identify 200-250 bp regions containing the highest number of differences between strains which are flanked by conserved sequences for PCR amplicons (Fig. 1). The conserved primer sequences were then blasted to the NCBI database to test identity to non- P. gingivalis bacteria. Two sets of primers were identified with a single set described below as being the most informative for strain identification. Specificity of the P. gingivalis ISR-specific primers were determined with subgingival plaque from a participant with severe periodontal disease, positive controls (P. gingivalis strain ATCC33277, pooled subgingival plaque from multiple participants), and negative controls (Zymo mock DNA, Microbial DNA-free water) (Fig. 1B). The primers specific for . gingivalis amplified . gingivalis DNA ( to 250 bp ) in the participant sample and positive controls, whereas PCR products were not amplified in negative controls. Sensitivity of the . gingivalis ISR-specific primer was determined with and without spiking of P. gingivalis strain ATCC33277 (1 ng and 2 ng ) in Zymo mock DNA (Fig. 1C). The sensitivity of ISR-specific primers were confirmed by amplifying . gingivalis DNA only in the spike-in reaction and verifies that amplification of . gingivalis DNA is not inhibited by the presence of other microbial DNA in a reaction.

Identifying . gingivalis strains in sub-gingival plaque

To examine P. gingivalis strains associated with periodontal disease we examined subgingival plaque samples from the Buffalo Osteoporosis and Periodontal Disease (OsteoPerio) Study . The OstroPerio study is a prospective cohort study that was established to explore risk factors for the development and progression of osteoporosis and periodontal disease in postmenopausal women. The subgingival microbiome was previously examined using 16 S rRNA gene sequencing . In total 161 subgingival plaque samples were examined with 12 plaque pools, 2 positive controls, and 6 negative controls.
P. gingivalis ISR specific amplicons were generated using two-step PCR, similar to 16 S analysis (see “Methods”) . DNA concentration of each ISR sequencing library was quantified before sequencing. DNA concentration vs. each sample type (Periodontal health status-None/Mild, Moderate and Severe, negative and positive controls) is illustrated in Fig. 2A. P. gingivalis DNA concentration was significantly greater in the moderate and severe periodontal disease groups than in the none/mild group, consistent with increased abundance of . gingivalis in moderate and severe disease groups. An insignificant amount of DNA was detected in the negative controls (extraction buffer, Zymo mock DNA, Microbial DNA-free water). After sequencing, quality filtering, and pair-read merging, sequence reads were mapped to a custom-built ISR database containing unique . gingivalis reference sequences using DADA2 . The number of reads mapping was consistent with sequencing library concentration with moderate and severe periodontal disease groups having a higher number of . gingivalis reads (Fig. 2B).

Detection of . gingivalis strains

There were 139 unique sequences of P. gingivalis ISR. Each possible strain is named by identity to available ISR sequences. When multiple strains have the same ISR sequence all names are included. For example, the related strains W83 and W50 have identical ISR sequences for this region and cannot be separated. Many identified ISR sequences are novel and named PG-Strain #. Each novel strain has been further characterized by sequence similarity (Supplemental Dataset 1). Two positive control samples contained strain ATCC33277. For these samples, or of sequenced reads mapped to ATCC33277. In addition, 5 replicates were included where the plaque sample was split before DNA extraction. The replicates experiments were very similar to each other, demonstrating the reproducibility of our approach (Fig. 3).
Most participant samples mapped to two different P. gingivalis strains (Fig. 4A), consistent with previous findings . Alpha diversity (Shannon, Chao1) are similar across periodontal disease status (Supplemental Fig. 1). To further understand the distribution of . gingivalis strains in each sample we determine the frequency of the

A

* 60 * * *
KCOM 2796
W83 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGG GCAACGGTCATGCAGCCCA 124
ATCC_33277 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGG GCAACGGTCATGCAGCGCA 124
ATCC_49417 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 124
AJW4 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 124
AS2 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 124
A7436 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 124
KCOM_3001 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTCCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 124
HG66 : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 124
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGGGCAAAAAGAA AAAAATAAAGAGAGATAAGGAGCAACGGTCATGCAGCGCA 124
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTTG GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
TDC 60 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———– AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGGTTTCCCTGCTTCGAACTTTG CTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGAGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
A7A1-28 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTG GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTT GCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———–AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
KCOM 3131 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 114
KCOM 2800 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTCCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
RMA 4165 GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GA-CTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———–AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCGCA 113
RMA GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCAAAAAGG ———-AAAAATAAAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
RMA_ : GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC–GAGCTTTCCCTGCTTCGAACTTTGCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCCAAAAGG ———–AAAAATATAGAGAGATAAGGGGCAACGGTCATGCAGCCCA 114
GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC GAgcTTTCCCTGCTTCGAACTTTgCTTCTTTTTTTGAAGCGAGGCaAAAAGG
AAAAATAaAGAGAGATAAGGgGCAACGGTCATGCAGC CA
* 180 200 220
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTT CGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT –GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
W83 : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT –GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
ATCC_33277 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
ATCC 49417 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
AJW4 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
AS2 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
A7436 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
HG66 : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 225
KCOM : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
TDC_60 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
A7A1-28 AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGATGGAAGAGTTCGAATAAGAGACAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
KCOM AGGAGCTGCCACAGGCATAC GGAAGAGTTCGAATAAGAGACAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
RMA AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 214
RMA AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT–GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
RMA : AGGAGCTGCCACAGGCAGACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAGAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT AGGAGCTGCCACAGGCAgACGGAAGAGTTCGAATAAGAGAgAAGCAGTCCTATAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCTACACT GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT –GATAATGTAGAGGTCGGCAGTT 215
B
Figure 1. Creating P. gingivalis specific primers. (A) Alignment of representative P. gingivalis strain ISR regions. Primer locations are indicated. (B) PCR conditions were optimized to amplify P. gingivalis ISR regions without targeting other bacteria. (C) PCR conditions allow P. gingivalis amplification in mixed samples. Zymo Mock contains DNA from Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella enterica, Lactobacillus fermentum, Enterococcus faecalis, and Staphylococcus aureus; Plaque Pool, pooled subgingival plaque from multiple participants (positive control for sequencing batches); Pg. DNA, P. gingivalis strain ATCC33277. Perio Sample, subgingival plaque from a participant with severe periodontal disease. Amplicons were visualized in agarose gel electrophoresis with ethidium bromide staining.
top strain in each sample (Fig. 4b). For most participant samples regardless of disease state, the top strain represents of all . gingivalis sequence reads.

W83/W50 is associated with periodontal disease

To determine if specific strains are associated with periodontal disease, we grouped our samples into two groups None/Mild and Moderate/Severe and filtered the ISR sequences removing strains with low abundance or ones appearing in a single sample (see “Methods”). In total 18 P. gingivalis strains were examined after filtering (Table 1).
The most abundant strain across all samples is the avirulent . gingivalis strain ATCC33277_381 which was found in both the none/mild (CLR 6.38) and moderate/severe groups (CLR 5.34). The majority 15/18 strains are more abundant in Moderate/Severe cases. Only strain W83_W50 was significantly enriched in the Moderate/Severe category after correcting for multiple testing. W83_W50 was only detected in the moderate/ severe group, with of participants harboring that strain. When we compared the abundance levels using centered -ratio (CLR)-transformed read counts, strain W83 was significantly enriched in the moderate/ severe group ( ). Strain W83 was previously shown by heteroduplex typing to be strongly
Figure 2. ISR libraries and number of mapped reads. (A) DNA concentrations after next-generation sequencing library formation with two rounds of PCR. (B) Numbers of reads that mapped to the P. gingivalis ISR database. The sample periodontal classification (none/mild, moderate, severe) with the number of samples is shown for each group. Neg, batch-specific negative control (extraction buffer, PCR blank); Pos, positive control with ATCC33277 DNA; Plaque pool, DNA isolated from a mixture of subgingival plaques from a group of people (positive control).
Figure 3. Technical replicates are reproducible. Relative abundance for 5 replicate samples, with the Pearson correlation (r) between replicates.
Figure 4. Number of strains and abundance (A) Number of detected strains in each sample. (B) Frequency of the most abundant strain in each sample.
associated with periodontitis . Multiple studies have shown that strain W83 was more virulent than other . gingivalis strains .
We next evaluated the linear correlations for each CLR mean strain with the whole-mouth clinical measurements for mean pocket depth (PD) and clinical attachment level (CAL) (Table 1). Correlations ranged from -0.134 to 0.142 for PD and from -0.095 to 0.152 for CAL. After multiple testing correction none of correlations are significant.

Discussion

Determining P. gingivalis strains with current microbiome methods has been limited. There are two major issues which needed to be addressed. First, abundance of . gingivalis in the total DNA pool is very low. For oral samples, the majority of isolated DNA is from the human host and the abundance of . gingivalis in the microbiome is only for people with moderate to severe periodontal disease . P. gingivalis is also detectable in healthy patents as shown in our results and by previous studies . Second, strain identification requires strain specific sequence differences in a region which was sequenced in all the samples. Our approach addresses both concerns by amplifying a . gingivalis specific ISR sequence at a region with strain defining sequence variability. In addition, our approach can detect low levels of P. gingivalis in healthy participants allowing a robust examination of strains in relationship to various medical conditions.
In this study we identified an information-rich region located within the . gingivalis ISR that can segregate . gingivalis strains in a cost-effective manner. To validate our ISR sequencing approach we examined subgingival plaque from 153 participants. Only the ISR region identified as W83_W50 was significantly associated with periodontal disease. W83 has previously been shown to be associated with periodontitis and multiple studies have shown W83 as being more virulent than other strains . Several strains were identified only in the Moderate/Severe category, but due to the limited sample size were not significant in this study. Strain ATCC33277 was the most abundant strain identified in this study and there was a slight enrichment for the None/Mild category. ATCC33277 has been proposed to be healthier strain with reduced virulence characteristics .
While our approach is promising, it does have some limitations that should be taken into consideration. The first limitation is that a significant number of P. gingivalis strains have identical sequences within our targeted
Strain label Periodontal disease category Whole-mouth mean
None/mild ( ) Moderate/severe ( ) FDR PD CAL
Mean (SE) Freq Mean (SE) Freq P value q-value P value P value
W83_W50 0 (0) 0 1.45 (0.38) 0.13 0.0003 0.005 0.142 0.11 0.096 0.29
PG-strain_10 0 (0) 0 0.33 (0.2) 0.02 0.09 0.43 0.076 0.4 0.152 0.09
PG-strain_45 0 (0) 0 0.18 (0.1) 0.01 0.09 0.43 0.271 0.002 0.23 0.01
KCOM2798 0.21 (0.21) 0.05 0.77 (0.26) 0.11 0.10 0.43 0.052 0.56 0.031 0.73
PG-strain_16 0 (0) 0 0.23 (0.17) 0.02 0.16 0.43 -0.094 0.3 -0.051 0.58
PG-strain_39 0 (0) 0 0.14 (0.1) 0.01 0.16 0.43 -0.075 0.4 -0.025 0.78
PG-strain_43 0 (0) 0 0.12 (0.09) 0.01 0.17 0.43 -0.017 0.85 -0.066 0.46
KCOM3001 0.28 (0.28) 0.05 0.72 (0.27) 0.06 0.27 0.61 -0.134 0.14 -0.064 0.48
ATCC33277_381 6.38 (0.96) 0.71 5.34 (0.52) 0.54 0.34 0.66 -0.028 0.75 -0.014 0.88
PG-strain_18 0.4 (0.23) 0.1 0.64 (0.17) 0.13 0.40 0.66 -0.071 0.43 -0.067 0.46
TDC60_KCOM3131 0.3 (0.3) 0.05 0.61 (0.24) 0.05 0.43 0.66 -0.057 0.53 -0.095 0.29
RMA3725 1.46 (0.78) 0.19 2.16 (0.43) 0.2 0.44 0.66 -0.07 0.44 0.007 0.94
KCOM2796 0.73 (0.73) 0.05 0.33 (0.16) 0.04 0.60 0.82 -0.024 0.79 -0.032 0.72
PG-strain_8 0.29 (0.29) 0.05 0.4 (0.18) 0.03 0.76 0.85 0.034 0.71 0.1 0.27
AJW4 0.64 (0.46) 0.1 0.78 (0.29) 0.06 0.78 0.85 -0.11 0.22 -0.011 0.9
PG-strain_3 2.21 (0.97) 0.29 2.48 (0.43) 0.28 0.80 0.85 0.114 0.21 0.108 0.23
PG-strain_14 0.17 (0.17) 0 0.23 (0.16) 0.01 0.80 0.85 -0.004 0.96 -0.009 0.92
PG-strain_9 0.51 (0.51) 0.05 0.44 (0.22) 0.05 0.90 0.90 -0.061 0.5 -0.035 0.7
Table 1. P. gingivalis strains across different categories of periodontal disease. CAL, clinical attachment level; PD pocket depth. Defined according to Centers for Disease Control and Prevention/American Academy of Periodontology criteria . Mean centered -ratio transformed strain. Frequency of strain detected with at least of reads. value comparing None/Mild to Moderate/Severe. -value for Benjamini Hochberg FDR. Pearson product-moment correlation coefficient. value for correlation coefficient.
ISR region. Consequently, our current approach cannot differentiate between these strains. Identification of additional primer sets located in virulence genes would strength this approach and facilitate the characterization of unknown ISR strain types. Secondly, our ability to identify each strain is dependent on matching sequences to a database of characterized strains. However, this limitation will improve as more . gingivalis strains are sequenced and characterized over time. Lastly, it is worth noting that all low complexity amplicon sequencing approaches that use Illumina sequencing require a large spike-in of DNA. This is because almost all bases on the flow cell have the same base call, leading to issues with adjusting the fluorescence intensity. To address this issue, our primers can include additional dephasing bases that enable clustering at higher density or alternatively, samples can be multiplexed with other high complexity experiments.

Methods
Participants

The present study included 153 postmenopausal women enrolled in the Buffalo Osteoporosis and Periodontitis (OsteoPerio) Study, which is an ancillary study conducted at the Buffalo (NY) clinical center of the Women’s Health Initiative Observational Study (WHI OS). Each participant in this study had a complete clinical oral examination . The mean pocket depth (PD) and clinical attachment level (CAL) measurements define based on the criteria of Centers for Disease Control and Prevention (CDC)/American Academy of Periodontology (AAP) was used to determine the clinical periodontal disease status as none, mild, moderate, and severe . Subgingival plaque samples were collected in Ringer’s solution using fine paper points and frozen immediately at . All participants provided informed consent, and the study protocol was approved by the University at Buffalo’s Health Sciences Institutional Review Board. All experiments were in agreement with relevant guidelines regarding Human Subjects Research.

Bacterial genomic DNA extraction

Metagenomic DNA was isolated from subgingival plaque samples using an the QIAsymphony SP automated system as described previously . Before DNA extraction, an enzymatic pretreatment was performed for more efficient isolation of Gram-positive bacteria. of subgingival plaque samples were pelleted by centrifugation at for 10 min , at room temperature, and the pellet was resuspended in lysis solution ( ml lysozyme in 20 mM Tris-HCl, EDTA; Triton ) and incubated at for 30 min . DNA extraction and purification were done according to the Qiasymphony DSP Virus / Pathogen Kit Instructions for Use (Handbook) and the QIAsymphony SP Protocol Sheet for the Complex200_V6_DSP protocol (“Complex200_V6_DSP”). After DNA purification, samples were eluted in a 96 well plate (Qiagen, Valencia, CA ). Each plate had 77 subgingival plaque samples, duplicate of blank extraction controls, and 6 plaque pool as
a positive control. 60 ul of DNA was eluted from each sample. Extracted DNA were quantified with the QuantiT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit (Invitrogen).

ISR amplicon sequencing library preparation

Metagenomic DNA from each sample was used to prepare Intergenic spacer region (ISR) amplicon sequencing libraries targeting the IRS regions of P. gingivalis bacteria. Amplicon libraries were prepared by using a two-step protocol in which the region of interest is first amplified with ISR region specific primers (Forward TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-GGCCTTGGTTCGTTTATCTTTC; Reverse GTC TCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-AACTGCCGACCTCTACATTATC) Then dual indices are added through a second PCR. Zymo mock DNA (ZymoBIOMICS Microbial Community DNA Standard, Zymo Research, USA) and Microbial DNA-free water (Microbial DNA-free PCR water, Qiagen Inc., USA) as negative control, and P. gingivalis strain ATCC3372 as a positive control was used during the amplification process. Amplicon amplification was performed using thermocycling with of genomic DNA, of amplicon PCR forward primer ( ), of amplicon PCR reverse primer ( ), and of HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems) at initial denaturation for 3 min , followed by 30 cycles of for for 30 s , and for 30 s , and a final extension at for 5 min . According to the manufacturer’s protocol, reactions were cleaned up with Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter Genomics). Attachment of dual indices with Illumina sequencing adapters were performed using of amplicon PCR product DNA, of Illumina Nextera XT Index Primer 1 (N7xx), l of Nextera XT Index Primer 2 (S 5 xx ), of KAPA HiFi Hot Start Ready Mix, and of Microbial DNA-free PCR water, with thermocycling at for 3 min , followed by 8 cycles of for for 30 s , and for 30 s , and a final extension at for 5 min . ISR amplicon libraries were purified with Agencourt AMPure XP beads and quantified with Quant-iT High-Sensitivity dsDNA Assay Kit (Invitrogen) and the KAPA Library Quantification Kit (KAPABIOSYSTEMS). Library quality control was performed with the Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer to ascertain the quality and average size distribution. Libraries were normalized and pooled to 4 nM based on Quant-iT qualified values. Pooled samples were denatured and diluted to a final concentration of 10 pM with a PhiX (Illumina) control. All sequencing was performed on a single flow-cell using the Illumina Miseq with . All samples were multiplexed and sequenced at 1-5 ratio with shotgun microbiome samples, to reduce the effect of the low-complexity library.

Data analysis

Available genomes for the P. gingivalis bacteria were downloaded from NCBI’s GenBank database. The human oral ISR database was created by extracting ISR sequences with ISR-flanking primers using BLASTN application 2.5.0 from available genomes for all the Porphyromonas gingivalis strains.
The Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (DADA2-available at https://github.com/benjjneb/dada2) microbiome pipeline used to distinguish the microbial communities by sequence variants differing by as little as one nucleotide present in the data, as amplicon sequence variants (ASVs) . In the first step, both forward and reverse primers were identified in paired-end ISR amplicon sequencing reads and removed using Cutadapt. Read qualities were determined by the frequency of each quality score at each base position using the dada2 function PlotQualityProfile. Reads with a quality score below 30 were removed from further analysis. Filter and trim were performed on the quality-filtered reads using dada 2 function filterAndTrim with standard parameters (a maximum number of ambiguous nucleotides ( ), reads with expected errors ( )). The sequencing error rates were estimated from all samples as a pool (dada2 function learnErrors), and the filtered sequences were then dereplicated (dada2function derepFastq) to generate unique sequences. These unique sequences were then processed using the DADA2 algorithm (dada2 function mergePairs and makeSequenceTable) to infer exact amplicon sequence variants (ASVs). Chimeric sequences were removed (dada2 function removeBimeraDenovo), a sample vs. ISR ASV table (OTU-tables) was generated (phyloseq function otu_table), which was used for mapping against the custom-built ISR database containing unique P. gingivalis reference sequences to identify the P. gingivalis strains. Novel ISR sequences without an exact match will be given a default name and searched by BLAST to determine the closest strains.
Each ISR ASV was normalized using the centered log (2)-ratio (CLR) transformation, which will help account for the compositional data structure, reduce the likelihood of spurious correlations, and enhance the meaningfulness of comparison . Correlations between technical replicates were calculated using the Pearson correlation coefficient. Results of the frequency P. gingivalis strains are presented as mean standard error (SE) for different periodontal health statuses with corrected p -values with discrete false-discovery rate correction for multiple testing. Linear relationships between CLR abundance of . gingivalis strain and mean PD, and CAL parameter measurements were evaluated using Pearson correlations. Alpha diversity and univariant strain enrichment tests were performed with online resource MicrobiomeAnalyst .

Data availability

The resulting sequencing data has been uploaded to the NCBI Sequence Read Archive (SRA) database with BioProject ID # PRJNA982061.
Received: 12 June 2023; Accepted: 12 March 2024
Published online: 14 March 2024

References

  1. Eke, P. I., Borgnakke, W. S. & Genco, R. J. Recent epidemiologic trends in periodontitis in the USA. Periodontology 2000(82), 257-267. https://doi.org/10.1111/prd. 12323 (2020).
  2. Bole, C., Wactawski-Wende, J., Hovey, K. M., Genco, R. J. & Hausmann, E. Clinical and community risk models of incident tooth loss in postmenopausal women from the Buffalo Osteo Perio Study. Community Dent. Oral Epidemiol. 38, 487-497. https://doi. org/10.1111/j.1600-0528.2010.00555.x (2010).
  3. Bernabe, E. & Marcenes, W. Periodontal disease and quality of life in British adults. J. Clin. Periodontol. 37, 968-972. https://doi. org/10.1111/j.1600-051X.2010.01627.x (2010).
  4. Genco, R. J., Ho, A. W., Grossi, S. G., Dunford, R. G. & Tedesco, L. A. Relationship of stress, distress and inadequate coping behaviors to periodontal disease. J. Periodontol. 70, 711-723. https://doi.org/10.1902/jop.1999.70.7.711 (1999).
  5. Fiorillo, L. et al. Porphyromonas gingivalis, periodontal and systemic implications: A systematic review. Dentistry J. 7, 114. https:// doi.org/10.3390/dj7040114 (2019).
  6. Khan, S. A., Kong, E. F., Meiller, T. F. & Jabra-Rizk, M. A. Periodontal diseases: Bug induced, host promoted. PLoS Pathog. 11, e1004952. https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 1004952 (2015).
  7. Li, X. et al. Maladaptive innate immune training of myelopoiesis links inflammatory comorbidities. Cell 185, 1709-1727.e1718. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.043 (2022).
  8. Hajishengallis, G. & Chavakis, T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities. Nat. Rev. Immunol. 21, 426-440. https://doi.org/10.1038/s41577-020-00488-6 (2021).
  9. Dominy, S. S. et al. Porphyromonas gingivalis in Alzheimer’s disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Sci. Adv. 5, eaau3333. https://doi.org/10.1126/sciadv.aau3333 (2019).
  10. Mendez, K. N. et al. Variability in genomic and virulent properties of Porphyromonas gingivalis strains isolated from healthy and severe chronic periodontitis individuals. Front. Cell Infect. Microbiol. 9, 246. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00246 (2019).
  11. Kumawat, R. M., Ganvir, S. M., Hazarey, V. K., Qureshi, A. & Purohit, H. J. Detection of Porphyromonas gingivalis and Treponema denticola in chronic and aggressive periodontitis patients: A comparative polymerase chain reaction study. Contemp. Clin. Dent. 7, 481-486. https://doi.org/10.4103/0976-237X. 194097 (2016).
  12. Kulkarni, P. G. et al. Molecular detection of Porphyromonas gingivalis in chronic periodontitis patients. J. Contemp. Dent. Pract. 19, 992-996 (2018).
  13. Lau, L. et al. Quantitative real-time polymerase chain reaction versus culture: A comparison between two methods for the detection and quantification of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis and Tannerella forsythensis in subgingival plaque samples. J. Clin. Periodontol. 31, 1061-1069. https://doi.org/10.1111/j.1600-051X.2004.00616.x (2004).
  14. Frandsen, E. V., Poulsen, K., Curtis, M. A. & Kilian, M. Evidence of recombination in Porphyromonas gingivalis and random distribution of putative virulence markers. Infect. Immun. 69, 4479-4485. https://doi.org/10.1128/IAI.69.7.4479-4485.2001 (2001).
  15. Menard, C. & Mouton, C. Clonal diversity of the taxon Porphyromonas gingivalis assessed by random amplified polymorphic DNA fingerprinting. Infect. Immun. 63, 2522-2531. https://doi.org/10.1128/iai.63.7.2522-2531.1995 (1995).
  16. Loos, B. G., Dyer, D. W., Whittam, T. S. & Selander, R. K. Genetic structure of populations of Porphyromonas gingivalis associated with periodontitis and other oral infections. Infect. Immun. 61, 204-212. https://doi.org/10.1128/iai.61.1.204-212.1993 (1993).
  17. Leys, E. J., Smith, J. H., Lyons, S. R. & Griffen, A. L. Identification of Porphyromonas gingivalis strains by heteroduplex analysis and detection of multiple strains. J. Clin. Microbiol. 37, 3906-3911. https://doi.org/10.1128/JCM.37.12.3906-3911.1999 (1999).
  18. Mulhall, H., Huck, O. & Amar, S. Porphyromonas gingivalis, a long-range pathogen: Systemic impact and therapeutic implications. Microorganisms. https://doi.org/10.3390/microorganisms8060869 (2020).
  19. Neiders, M. E. et al. Heterogeneity of virulence among strains of Bacteroides gingivalis. J. Periodontal. Res. 24, 192-198. https:// doi.org/10.1111/j.1600-0765.1989.tb02005.x (1989).
  20. Jockel-Schneider, Y. et al. Wild-type isolates of Porphyromonas gingivalis derived from periodontitis patients display major variability in platelet activation. J. Clin. Periodontol. 45, 693-700. https://doi.org/10.1111/jcpe. 12895 (2018).
  21. Birkedal-Hansen, H., Taylor, R. E., Zambon, J. J., Barwa, P. K. & Neiders, M. E. Characterization of collagenolytic activity from strains of Bacteroides gingivalis. J. Periodontal. Res. 23, 258-264. https://doi.org/10.1111/j.1600-0765.1988.tb01369.x (1988).
  22. Werheim, E. R., Senior, K. G., Shaffer, C. A. & Cuadra, G. A. Oral pathogen Porphyromonas gingivalis can escape phagocytosis of mammalian macrophages. Microorganisms. https://doi.org/10.3390/microorganisms8091432 (2020).
  23. Grice, E. A. et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science 324, 1190-1192. https://doi.org/ 10.1126/science. 1171700 (2009).
  24. Franasiak, J. M. & Scott, R. T. Jr. Reproductive tract microbiome in assisted reproductive technologies. Fertil. Steril. 104, 1364-1371. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.012 (2015).
  25. Oh, J. et al. The altered landscape of the human skin microbiome in patients with primary immunodeficiencies. Genome Res. 23, 2103-2114. https://doi.org/10.1101/gr. 159467.113 (2013).
  26. Griffen, A. L. et al. Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16 S pyrosequencing. ISME J. 6, 1176-1185. https://doi.org/10.1038/ismej.2011.191 (2012).
  27. Guerrero-Preston, R. et al. (2016) 16S rRNA amplicon sequencing identifies microbiota associated with oral cancer, human papilloma virus infection and surgical treatment. Oncotarget. 7, 51320-51334. https://doi.org/10.18632/oncotarget.9710.
  28. Marotz, C. A. et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome 6, 42. https://doi.org/ (2018).
  29. Mukherjee, C., Beall, C. J., Griffen, A. L. & Leys, E. J. High-resolution ISR amplicon sequencing reveals personalized oral microbiome. Microbiome 6, 153. https://doi.org/10.1186/s40168-018-0535-z (2018).
  30. Anyansi, C., Straub, T. J., Manson, A. L., Earl, A. M. & Abeel, T. Computational methods for strain-level microbial detection in colony and metagenome sequencing data. Front. Microbiol. 11, 1925. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01925 (2020).
  31. Genco, R. J. et al. The subgingival microbiome relationship to periodontal disease in older women. J. Dent. Res. 98, 975-984. https:// doi.org/10.1177/0022034519860449 (2019).
  32. Barry, T., Colleran, G., Glennon, M., Dunican, L. K. & Gannon, F. The ribosomal spacer region as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods Appl. 1, 51-56. https://doi.org/10.1101/gr.1.1.51 (1991).
  33. Rumpf, R. W., Griffen, A. L., Wen, B. G. & Leys, E. J. Sequencing of the ribosomal intergenic spacer region for strain identification of Porphyromonas gingivalis. J. Clin. Microbiol. 37, 2723-2725. https://doi.org/10.1128/jcm.37.8.2723-2725.1999 (1999).
  34. Aakra, A., Utåker, J. B. & Nes, I. F. RFLP of rRNA genes and sequencing of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region of ammoniaoxidizing bacteria: A phylogenetic approach. Int. J. Syst. Bacteriol. 49(Pt 1), 123-130. https://doi.org/10.1099/00207713-49-1-123 (1999).
  35. Chun, J., Huq, A. & Colwell, R. R. Analysis of 16S-23S rRNA intergenic spacer regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2202-2208. https://doi.org/10.1128/aem.65.5.2202-2208.1999 (1999).
  36. Stubbs, S. L., Brazier, J. S., O’Neill, G. L. & Duerden, B. I. PCR targeted to the 16S-23S rRNA gene intergenic spacer region of Clostridium difficile and construction of a library consisting of 116 different PCR ribotypes. J. Clin. Microbiol. 37, 461-463. https:// doi.org/10.1128/jcm.37.2.461-463.1999 (1999).
  37. Banack, H. R. et al. Cohort profile: The Buffalo OsteoPerio microbiome prospective cohort study. BMJ Open 8, e024263. https:// doi.org/10.1136/bmjopen-2018-024263 (2018).
  38. Zheng, W. et al. An accurate and efficient experimental approach for characterization of the complex oral microbiota. Microbiome 3, 48. https://doi.org/10.1186/s40168-015-0110-9 (2015).
  39. Callahan, B. J., McMurdie, P. J. & Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643. https://doi.org/10.1038/ismej.2017.119 (2017).
  40. Eke, P. I., Page, R. C., Wei, L., Thornton-Evans, G. & Genco, R. J. Update of the case definitions for population-based surveillance of periodontitis. J. Periodontol. 83, 1449-1454. https://doi.org/10.1902/jop. 2012.110664 (2012).
  41. Griffen, A. L., Lyons, S. R., Becker, M. R., Moeschberger, M. L. & Leys, E. J. Porphyromonas gingivalis strain variability and periodontitis. J. Clin. Microbiol. 37, 4028-4033. https://doi.org/10.1128/jcm.37.12.4028-4033.1999 (1999).
  42. Genco, C. A., Cutler, C. W., Kapczynski, D., Maloney, K. & Arnold, R. R. A novel mouse model to study the virulence of and host response to Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis. Infect. Immun. 59, 1255-1263. https://doi.org/10.1128/iai.59.4.1255-1263. 1991 (1991).
  43. Grenier, D. & Mayrand, D. Selected characteristics of pathogenic and nonpathogenic strains of Bacteroides gingivalis. J. Clin. Microbiol. 25, 738-740. https://doi.org/10.1128/jcm.25.4.738-740.1987 (1987).
  44. Laine, M. L. & van Winkelhoff, A. J. Virulence of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in a mouse model. Oral. Microbiol. Immunol. 13, 322-325. https://doi.org/10.1111/j.1399-302x.1998.tb00714.x (1998).
  45. Naito, M. et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15, 215-225. https://doi.org/10.1093/dnares/ dsn013 (2008).
  46. Igboin, C. O., Griffen, A. L. & Leys, E. J. Porphyromonas gingivalis strain diversity. J. Clin. Microbiol. 47, 3073-3081. https://doi. org/10.1128/JCM.00569-09 (2009).
  47. Handelmann, C. R., Tsompana, M., Samudrala, R. & Buck, M. J. The impact of nucleosome structure on CRISPR/Cas9 fidelity. Nucleic Acids Res. https://doi.org/10.1093/nar/gkad021 (2023).
  48. Brennan, R. M. et al. Bacterial species in subgingival plaque and oral bone loss in postmenopausal women. J. Periodontol. 78, 1051-1061. https://doi.org/10.1902/jop.2007.060436 (2007).
  49. Gordon, J. H. et al. Is the oral microbiome associated with blood pressure in older women?. High Blood Press Cardiovasc. Prev. 26, 217-225. https://doi.org/10.1007/s40292-019-00322-8 (2019).
  50. LaMonte, M. J. et al. Composition and diversity of the subgingival microbiome and its relationship with age in postmenopausal women: An epidemiologic investigation. BMC Oral Health 19, 246. https://doi.org/10.1186/s12903-019-0906-2 (2019).
  51. Callahan, B. J. et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat. Methods 13, 581-583. https:// doi.org/10.1038/nmeth. 3869 (2016).
  52. Gloor, G. B., Macklaim, J. M., Pawlowsky-Glahn, V. & Egozcue, J. J. Microbiome datasets are compositional: and this is not optional. Front. Microbiol. 8, 2224. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02224 (2017).
  53. Chong, J., Liu, P., Zhou, G. & Xia, J. Using MicrobiomeAnalyst for comprehensive statistical, functional, and meta-analysis of microbiome data. Nat. Protoc. 15, 799-821. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0264-1 (2020).

Author contributions

MJB designed research (project conception, development of overall research plan, and study oversight); VM conducted research (hands-on conduct of the experiments and data collection); VM, SU, KMH, YS, MJL analyzed data or performed statistical analysis; VM, SU, MJL, JWW, PID wrote paper; MJB had primary responsibility for final content; All authors read and approved the final manuscript.

Funding

This project was partially supported by grant No. OS950077 from DOD, R01DE013505, and R01DE024523 from NIDCR for JWW.

Competing interests

The authors declare no competing interests.

Additional information

Supplementary Information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/ 10.1038/s41598-024-56849-x.
Correspondence and requests for materials should be addressed to M.J.B.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024

  1. Department of Biochemistry, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. Department of Epidemiology and Environmental Health, School of Public Health and Health Professions, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. Department of Microbiology and Immunology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. UB Microbiome Center, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. Department of Oral Biology, School of Dental Medicine, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. Department of Biomedical Informatics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. email: mjbuck@buffalo.edu