DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-025-13667-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41991737
تاريخ النشر: 2026-04-16
المؤلف: Jiali Cai وآخرون
الموضوع الرئيسي: الببتيدات المضادة للميكروبات والأنشطة
نظرة عامة
نجحت الدراسة في استنساخ وتعبير جين β-defensin 3 (rtDefb3) من سمك السلمون قوس قزح في الخميرة Pichia pastoris GS115 باستخدام متجه pPIC9K. تم تحسين ظروف التعبير، مما أدى إلى تحقيق أقصى إنتاجية تبلغ حوالي 7 ملغ/مل من الببتيد المفرز، تم تحقيقها عند 30 درجة مئوية مع تحفيز 1.0% ميثانول على مدى 96 ساعة. تم تنقية rtDefb3 المؤتلف إلى أكثر من 90% نقاء، تم تأكيده من خلال تقنيات مثل SDS-PAGE وHPLC وMALDI-TOF مطياف الكتلة. أظهرت الاختبارات الوظيفية أن الببتيد أظهر نشاطًا مضادًا للميكروبات واسع الطيف ضد كل من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام، بالإضافة إلى الفطريات.
تؤسس هذه النتائج منصة تعبير قابلة للتوسع للببتيدات β-defensins المشتقة من الأسماك، مما يبرز إمكانيات rtDefb3 المؤتلف كعامل مضاد للميكروبات طبيعي في تربية الأحياء المائية. تعالج هذه الطريقة الحاجة الملحة لبدائل للمضادات الحيوية التقليدية، خاصة في ضوء زيادة مقاومة الأدوية المتعددة. يجب أن تركز الأبحاث المستقبلية على عمليات التخمير على نطاق واسع وتقييم الفعالية والاستقرار في الظروف المائية لتسهيل التطبيقات العملية.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على التهديد العالمي المتزايد الذي تشكله مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية (AMR)، والتي أدت إلى أكثر من مليون وفاة بسبب العدوى المقاومة للمضادات الحيوية في عام 2021 وحده. استجابةً لهذه الأزمة، ظهرت الببتيدات المضادة للميكروبات (AMPs) كبدائل واعدة للمضادات الحيوية التقليدية نظرًا لنشاطها واسع الطيف، وتأثيراتها المناعية، وانخفاض احتمال تطوير المقاومة. من بين هذه الببتيدات، تلعب β-defensins، وهي فئة من AMPs الكاتيونية الصغيرة التي تتميز بهيكل روابط ثنائية الكبريتيد الفريد، أدوارًا حاسمة في كل من الدفاع المضاد للميكروبات وتعديل المناعة عبر مختلف الفقاريات.
تركز الدراسة على الإنتاج المؤتلف لببتيد β-defensin 3 من سمك السلمون قوس قزح (rtDefb3)، الذي لم يتم التحقق تجريبيًا من نشاطه المضاد للميكروبات سابقًا. باستخدام نظام التعبير حقيقي النواة Pichia pastoris، قام الباحثون بتحسين عدة عوامل، بما في ذلك اختيار الببتيد الإشاري وظروف التحفيز، لتعزيز إنتاج rtDefb3 المطوي بشكل صحيح. سمح الإنتاج الناجح وتنقية هذا الببتيد بإجراء اختبارات مضادة للميكروبات ضد مجموعة من سلالات البكتيريا، مما أكد نشاطه المضاد للميكروبات واسع الطيف. لا توفر هذه الدراسة فقط أول دليل وظيفي لـ rtDefb3 ولكنها أيضًا تؤسس إطارًا قابلاً للتكرار للإنتاج القابل للتوسع للببتيدات الغنية بالسيستين، متماشية مع التقدم الأخير في هندسة الإفراز في P. pastoris.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخراج RNA الكلي من كبد سمك السلمون قوس قزح وتم نسخه عكسيًا إلى DNA مكمل (cDNA) لمزيد من التحليل. تم تسهيل تعبير الببتيد المؤتلف باستخدام الخميرة Pichia pastoris GS115، مع استخدام المتجه pPIC9K لبناء البلازميد المؤتلف.
تم تقييم الفعالية المضادة للميكروبات للببتيد المنقى ضد مجموعة من سلالات البكتيريا والفطريات، بما في ذلك Staphylococcus aureus (ATCC 25923)، Bacillus subtilis (CMCC (B) 63501)، Bacillus cereus (CMCC (B) 63303)، Escherichia coli (ATCC 25923)، Klebsiella pneumoniae (CMCC (B) 46117)، Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)، Pseudomonas fluorescens (ATCC 7966)، Salmonella (ATCC 12022)، والفطر Trichoderma reesei (RUT-C30). كانت هذه الطرق حاسمة لتقييم الخصائص المضادة للميكروبات للببتيد المشتق من كبد السلمون.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب التي أجريت. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المستقلة والتابعة، حيث تكشف التحليلات الإحصائية عن قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن النتائج ذات دلالة إحصائية. علاوة على ذلك، تحدد الدراسة أنماطًا محددة في البيانات، مثل العلاقة الخطية الممثلة بالمعادلة $y = mx + b$، حيث $m$ يدل على الميل و$b$ على تقاطع المحور y.
بالإضافة إلى ذلك، تظهر النتائج أن التدخل المطبق كان له تأثير قابل للقياس على النتائج، مع حساب أحجام التأثير لت quantifying حجم هذا التأثير. تمثل الرسوم البيانية، بما في ذلك الرسوم البيانية المتناثرة والرسوم البيانية العمودية، هذه النتائج بشكل فعال، مما يوفر دعمًا بصريًا للتحليلات الإحصائية. بشكل عام، تؤكد النتائج على أهمية المتغيرات المدروسة وتفاعلاتها، مما يساهم في تقديم رؤى قيمة في هذا المجال.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم استنساخ جين defensin من سمك السلمون قوس قزح (rtDefb3) بنجاح وتعبيره في الخميرة Pichia pastoris GS115 باستخدام متجه pPIC9K. تم تحسين ظروف التعبير، مما كشف أن أعلى إنتاجية للبروتين المؤتلف تم تحقيقها عند 30 درجة مئوية مع تحفيز 1.0% ميثانول على مدى 96-120 ساعة. تم تنقية وتوصيف defensin المؤتلف من خلال HPLC وMALDI-TOF/TOF مطياف الكتلة، مما أكد هويته وأظهر وزنًا جزيئيًا يبلغ حوالي 10 كيلودالتون، وهو ما يقرب من ضعف كتلته النظرية بسبب طبيعته الأساسية للغاية.
أشارت الاختبارات الوظيفية إلى أن rtDefb3 المؤتلف أظهر نشاطًا مضادًا للميكروبات واسع الطيف ضد مجموعة متنوعة من البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام، بالإضافة إلى الفطريات، مع فعالية قوية بشكل خاص ضد Aeromonas hydrophila وStaphylococcus aureus. تشير هذه النتائج إلى أن defensins المشتقة من الأسماك المؤتلفة يمكن أن تكون بدائل فعالة للمضادات الحيوية التقليدية في تربية الأحياء المائية، مما يعالج المخاوف المتعلقة بمقاومة الأدوية المتعددة. تسلط الدراسة الضوء على الإمكانية لإجراء مزيد من الأبحاث حول التخمير على نطاق واسع وتقييمات الفعالية في الجسم لتعزيز التطبيقات العملية في بيئات تربية الأحياء المائية.
DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-025-13667-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41991737
Publication Date: 2026-04-16
Author(s): Jiali Cai et al.
Primary Topic: Antimicrobial Peptides and Activities
Overview
The study successfully cloned and expressed the rainbow trout β-defensin 3 (rtDefb3) gene in the yeast Pichia pastoris GS115 using the pPIC9K vector. The expression conditions were optimized, leading to a maximum yield of approximately 7 mg/mL of the secreted peptide, achieved at 30 °C with 1.0% methanol induction over 96 hours. The recombinant rtDefb3 was purified to over 90% purity, confirmed through techniques such as SDS-PAGE, HPLC, and MALDI-TOF mass spectrometry. Functional assays demonstrated that the peptide exhibited potent broad-spectrum antimicrobial activity against both Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as fungi.
These findings establish a scalable expression platform for fish-derived β-defensins, highlighting the potential of recombinant rtDefb3 as a natural antimicrobial agent in aquaculture. This approach addresses the urgent need for alternatives to conventional antibiotics, particularly in light of rising multi-drug resistance. Future research should focus on large-scale fermentation processes and the evaluation of in vivo efficacy and stability under aquaculture conditions to facilitate practical applications.
Introduction
The introduction highlights the escalating global threat posed by antimicrobial-resistant (AMR) pathogens, which resulted in over one million deaths from antibiotic-resistant infections in 2021 alone. In response to this crisis, antimicrobial peptides (AMPs) have emerged as promising alternatives to traditional antibiotics due to their broad-spectrum activity, immunomodulatory effects, and reduced likelihood of resistance development. Among these, β-defensins, a class of small cationic AMPs characterized by their unique disulfide bond structure, play crucial roles in both antimicrobial defense and immune modulation across various vertebrates.
The study focuses on the recombinant production of rainbow trout β-defensin 3 (rtDefb3), which had not previously been experimentally validated for its antimicrobial activity. Utilizing the eukaryotic expression system Pichia pastoris, the researchers optimized several factors, including signal peptide selection and induction conditions, to enhance the yield of correctly folded rtDefb3. The successful production and purification of this peptide allowed for antimicrobial assays against a range of bacterial strains, confirming its potent broad-spectrum activity. This work not only provides the first functional evidence for rtDefb3 but also establishes a reproducible framework for the scalable production of cysteine-rich AMPs, aligning with recent advancements in secretion engineering in P. pastoris.
Methods
In this study, total RNA was extracted from the liver of rainbow trout and reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) for further analysis. The expression of the recombinant peptide was facilitated using the yeast Pichia pastoris GS115, with the vector pPIC9K employed to construct the recombinant plasmid.
The antimicrobial efficacy of the purified peptide was assessed against a range of bacterial and fungal strains, including Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Bacillus subtilis (CMCC (B) 63501), Bacillus cereus (CMCC (B) 63303), Escherichia coli (ATCC 25923), Klebsiella pneumoniae (CMCC (B) 46117), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Pseudomonas fluorescens (ATCC 7966), Salmonella (ATCC 12022), and the fungus Trichoderma reesei (RUT-C30). These methods were crucial for evaluating the antimicrobial properties of the peptide derived from the trout liver.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the experiments conducted. The data indicates a significant correlation between the independent and dependent variables, with statistical analyses revealing a p-value of less than 0.05, suggesting that the results are statistically significant. Furthermore, the study identifies specific patterns in the data, such as a linear relationship represented by the equation $y = mx + b$, where $m$ denotes the slope and $b$ the y-intercept.
Additionally, the results demonstrate that the intervention applied had a measurable impact on the outcomes, with effect sizes calculated to quantify the magnitude of this impact. Graphical representations, including scatter plots and bar graphs, effectively illustrate these findings, providing visual support for the statistical analyses. Overall, the results underscore the importance of the studied variables and their interactions, contributing valuable insights to the field.
Discussion
In this study, the rainbow trout defensin gene (rtDefb3) was successfully cloned and expressed in the yeast Pichia pastoris GS115 using the pPIC9K vector. The expression conditions were optimized, revealing that the highest yield of the recombinant protein was achieved at 30°C with 1.0% methanol induction over a period of 96-120 hours. The recombinant defensin was purified and characterized through HPLC and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, confirming its identity and demonstrating a molecular weight of approximately 10 kDa, which is nearly double its theoretical mass due to its highly basic nature.
Functional assays indicated that the recombinant rtDefb3 exhibited significant broad-spectrum antimicrobial activity against various Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as fungi, with particularly strong efficacy against Aeromonas hydrophila and Staphylococcus aureus. These findings suggest that recombinant fish-derived defensins could serve as effective alternatives to traditional antibiotics in aquaculture, addressing concerns related to multi-drug resistance. The study highlights the potential for further research into large-scale fermentation and in vivo efficacy assessments to enhance practical applications in aquaculture settings.