DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.02.009
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38471458
تاريخ النشر: 2024-03-01
المؤلف: Axel Rosendahl Huber وآخرون
الموضوع الرئيسي: الجينوميات السرطانية والتشخيصات
نظرة عامة
في هذه الدراسة، أظهرت الثقافة المشتركة للأعضاء المعوية مع سلالة *E. coli* المنتجة للكوليباكتين (EcC) وجود توقيعات طفرية مرتبطة بسرطان القولون والمستقيم (CRC). ومن الملاحظ أن *E. coli* Nissle 1917 (EcN)، وهو بروبيوتيك مستخدم على نطاق واسع، وُجد أنه يحتوي على عملية pks ويؤدي إلى كسر في خيوط الحمض النووي المزدوجة، مما يثير القلق بشأن إمكانيته المسببة للطفرات. قام الباحثون بتقييم الطفرات الناتجة عن EcN جنبًا إلى جنب مع ثلاث سلالات من *E. coli* pks^+ المستمدة من CRC باستخدام إطار تحليلي يركز على خصائص تسلسل الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين.
كشفت النتائج أن جميع السلالات المختبرة، بما في ذلك EcN، أظهرت مستويات متفاوتة من النشاط المسبب للطفرات. كما حدد نهج التعلم الآلي طفرات محددة تعود إلى الكوليباكتين، مما يشير إلى أن المرضى الذين لديهم هذه الطفرات يميلون إلى تشخيصهم بسرطان القولون والمستقيم في سن أصغر. بالإضافة إلى ذلك، أظهر الكوليباكتين أنه يسبب طفرة محددة في جين APC. من المهم أن الدراسة أظهرت القدرة على اكتشاف الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين في 12% من جينومات CRC وفي بيانات تسلسل الإكسوم الكامل، مما يمثل تقدمًا كبيرًا في فهم التأثيرات المسببة للطفرات لسلالات *E. coli* pks^+ المختلفة.
مقدمة
تناقش المقدمة العلاقة بين بعض سلالات *E. coli* التي تمتلك عملية تخليق البوليكيتيد (pks) وزيادة خطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم (CRC). تسهل عملية pks إنتاج الجينوتوكسين الكوليباكتين، الذي ثبت أنه يسبب ألكلة الأدينينات ويؤدي إلى روابط عبر الحمض النووي، مما يؤدي إلى كسر في خيوط الحمض النووي المزدوجة (DSBs) في خطوط الخلايا. ومن الملاحظ أن زراعة *E. coli* pks+ مع الأعضاء المعوية والتسلسل الجيني الكامل (WGS) قد كشفت عن توليد توقيعات طفرية محددة، وهي SBS88 وID18، التي تتميز باستبدالات T > N وحذف T في المناطق الغنية بالأدينين والثايمين. تم اكتشاف وجود هذه الطفرات في جينومات الأورام، بشكل رئيسي في حالات CRC، مما ي implicates الكوليباكتين كعامل مسبب للطفرات في تطور CRC.
تسلط المقدمة الضوء أيضًا على *E. coli* Nissle 1917 (EcN)، وهو سلالة بروبيوتيك تحتوي على عملية pks ولكنها تظهر قدرة مخفضة على تحفيز DSBs مقارنةً بالسلالات الأخرى pks+. بينما أشارت الدراسات السابقة إلى تأثير مسبب للطفرات لـ EcN في خلايا CHO، هناك نقص في الأدلة بشأن قدرتها على التسبب في الطفرات في خلايا الإنسان الأولية. للتحقيق في ذلك، كان هدف المؤلفين هو تقييم التأثيرات الطفرية لـ EcN جنبًا إلى جنب مع ثلاث سلالات pks+ المستمدة من CRC باستخدام نظام زراعة الأعضاء البشرية وWGS. يقترحون طريقتين حسابيتين لتعزيز اكتشاف الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين، مع التركيز على نمط الحمض النووي المستهدف للكوليباكتين واستخدام نموذج الغابة العشوائية.
طرق
تحدد قسم الطرق في ورقة البحث نهجًا شاملاً لدراسة التفاعلات بين الأعضاء وسلالات معينة من *Escherichia coli*، مع التركيز بشكل خاص على السلالات pks+. تشمل المنهجيات الرئيسية زراعة الأعضاء، وتجارب الثقافة المشتركة، وتقنيات مختلفة لت quantifying تلف الحمض النووي، وعزل الحمض النووي، وإجراء التسلسل. تتضمن التحليلات أيضًا رسم الخرائط واستدعاء المتغيرات، وتحليل توقيع الطفرات، واختبار إثراء أنماط السياق الممتدة في عينات السرطان النقيلي. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام تحليلات إعادة أخذ العينات Monte-Carlo ونمذجة الغابة العشوائية لتقدير السمية النسبية لسلالات *E. coli* والتحقيق في الجينات المحركة المرتبطة بالسرطان.
تدعم البحث مصادر تمويل متعددة، بما في ذلك منظمة هولندا للبحث العلمي ومجلس البحث الأوروبي، وتستخدم بيانات من أطلس جينوم السرطان (TCGA). كما يعترف القسم بمساهمات من باحثين ومؤسسات مختلفة، مما يبرز الطبيعة التعاونية للدراسة. تتوفر الطرق التفصيلية في النسخة الإلكترونية من الورقة، مما يضمن الشفافية وإمكانية تكرار النتائج.
نتائج
تشير نتائج الدراسة إلى أن زراعة الأعضاء المعوية مع سلالات مختلفة من *E. coli* pks+، بما في ذلك EcN وCFF16-2F8 (2F8) وCFF159-19H2 (19H2) وEcC، تكشف عن أنشطة محدثة غير متجانسة بين هذه السلالات. أظهرت جميع السلالات ديناميات نمو مشابهة، على الرغم من أن EcN أظهرت قدرة توسع مخفضة قليلاً. ومن الملاحظ أن EcN أحدثت تلفًا في الحمض النووي في الأعضاء، كما يتضح من زيادة مستويات بؤر gH2AX النووية، وهو علامة على الكسر في خيوط الحمض النووي المزدوجة (DSBs). بينما كان تحفيز DSB لـ EcN أقل من ذلك لـ EcC، إلا أنه كان أعلى بشكل ملحوظ من الضوابط السلبية، بما في ذلك حقن الصبغة وسلالة EcC الطافرة غير القادرة على إنتاج الكوليباكتين.
أظهر التحليل الإضافي من خلال تسلسل الجينوم الكامل على مستوى الخلية الواحدة (WGS) أن عدد استبدالات القاعدة الواحدة (SBS) والإدخالات/الحذفات (indels) كانت متقاربة عبر السلالات المختلفة. كشفت ملفات توقيع الطفرات أن الأعضاء المعرضة لـ EcC و2F8 تشترك في تشابه مع التوقيعات المعروفة SBS88 وID18، بينما أظهرت EcN و19H2 تشابهًا محدودًا. ومن الملاحظ أن الأعضاء المعرضة فقط لـ EcC أظهرت مساهمة كبيرة من SBS88 وID18، مما يشير إلى أن EcC لها تأثير مسبب للطفرات أكثر وضوحًا. ومع ذلك، تم أيضًا ملاحظة آثار من SBS88 في الأعضاء المعرضة لـ EcN و19H2، وخاصة 2F8، مما يشير إلى أن تحليل توقيع الطفرات قد يفتقر إلى الحساسية في العينات ذات النسب المنخفضة من الإشارة إلى الضوضاء.
مناقشة
تسلط المناقشة الضوء على التقدم الكبير في اكتشاف الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين من خلال تصفية الأنماط ونمذجة الغابة العشوائية (RF). وجدت الدراسة أن وجود أدينينين في المواقع -3 و-4 upstream من الطفرات T > N (-3-4AA) كان غنيًا بشكل ملحوظ في الأعضاء المعرضة لسلالات مختلفة من *E. coli*، وخاصة EcC، مقارنةً بالضوابط (p < 4.40 × 10⁻⁸⁴). كان هذا النمط مرتبطًا باستمرار بالطفرات الناتجة عن الكوليباكتين عبر سلالات متعددة، مما يشير إلى طريقة قوية لتحديد هذه الطفرات في مجموعات بيانات السرطان. في مجموعة تضم أكثر من 4,800 سرطان نقيلي، أظهر 2.4% إثراءً كبيرًا لنمط الكوليباكتين، مع تصنيف 16% من عينات سرطان القولون والمستقيم (CRC) على أنها إيجابية لتسبب الطفرات بواسطة الكوليباكتين. عزز نموذج RF أيضًا اكتشاف الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين، محققًا ارتباطًا عاليًا مع وجود توقيع SBS88 (معامل ارتباط بيرسون = 0.92، p < 2 × 10⁻¹⁶). ومن الملاحظ أن عينات CRC الإيجابية للكوليباكتين كانت مرتبطة بطفرات محددة في الجينات المحركة مثل APC وBRAF، مما يشير إلى دور محتمل للكوليباكتين في تسريع تطور CRC. تؤكد الدراسة على الحاجة إلى مزيد من التحقيق في الإمكانيات المسببة للطفرات لسلالات *E. coli*، وخاصة EcN، التي تُستخدم عادةً كبروبيوتيك. تؤكد النتائج على أهمية فهم الآثار طويلة الأمد للتعرض للكوليباكتين في البيئات السريرية، خاصة فيما يتعلق بمساهمته المحتملة في الأورام.
القيود
تقر الدراسة بعدة قيود تتعلق بتفسير الميزات الطفرية المرتبطة بالطفرات الناتجة عن الكوليباكتين. ومن الملاحظ أن وجود مستوى منخفض من الخلفية للطفرات داخل نمط -3-4AA، كما تم تصنيفه بواسطة نموذج الغابة العشوائية (RF)، يُلاحظ في جميع كتالوجات الطفرات، بما في ذلك مجموعات البيانات الضابطة الخالية من التعرض للكوليباكتين. وهذا يشير إلى أن هناك حدًا أدنى من الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين ضروريًا للتصنيف الدقيق لـ *E. coli* pks +، مما يعقد نسب الطفرات المحددة إلى سلالات مختلفة من *E. coli* pks +.
علاوة على ذلك، وجدت الدراسة عدم وجود اختلافات كبيرة في الملفات الطفرية عبر سلالات *E. coli* pks + المختلفة، مما يحد من إمكانية التصنيف الخاص بالسلالات أو تقييم العلاجات البروبيوتيك بناءً على خصائص الطفرات. بينما يشير نموذج RF إلى أن بعض الطفرات المحركة قد تكون مرتبطة بالتسبب في الطفرات الناتجة عن الكوليباكتين، إلا أن الدراسة لا تؤسس علاقة سببية مباشرة بين التعرض لـ *E. coli* pks + وتحفيز السرطان. لفهم أفضل لتداعيات التعرض لـ *E. coli* pks + على خطر الإصابة بالسرطان، يُوصى بإجراء مزيد من الدراسات الوبائية المدمجة مع تسلسل الجينوم الكامل (WGS) أو تسلسل الإكسوم الكامل (WES) لتقييم الأنشطة المسببة للطفرات السابقة.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2024.02.009
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38471458
Publication Date: 2024-03-01
Author(s): Axel Rosendahl Huber et al.
Primary Topic: Cancer Genomics and Diagnostics
Overview
In this study, the co-culture of intestinal organoids with a colibactin-producing pks^+ E. coli strain (EcC) demonstrated the presence of mutational signatures associated with colorectal cancer (CRC). Notably, E. coli Nissle 1917 (EcN), a widely used probiotic, was found to harbor the pks operon and induce double-strand DNA breaks, raising concerns about its mutagenic potential. The researchers assessed the mutagenicity of EcN alongside three CRC-derived pks^+ E. coli strains using an analytical framework focused on the sequence characteristics of colibactin-induced mutations.
The findings revealed that all tested strains, including EcN, exhibited varying levels of mutagenic activity. A machine learning approach further identified specific mutations attributable to colibactin, indicating that patients with these mutations tend to be diagnosed with CRC at a younger age. Additionally, colibactin was shown to induce a specific mutation in the APC gene. Importantly, the study demonstrated the capability to detect colibactin-induced mutations in 12% of CRC genomes and in whole exome sequencing data, marking a significant advancement in understanding the mutagenic effects of distinct pks^+ E. coli strains.
Introduction
The introduction discusses the association between certain strains of *E. coli* that possess the polyketide synthase (pks) operon and an increased risk of colorectal cancer (CRC). The pks operon facilitates the production of the genotoxin colibactin, which has been shown to alkylate adenines and induce DNA cross-links, leading to DNA double-strand breaks (DSBs) in cell lines. Notably, co-culturing pks+ *E. coli* with intestinal organoids and subsequent whole genome sequencing (WGS) has revealed the generation of specific mutational signatures, namely SBS88 and ID18, characterized by T > N substitutions and T deletions in adenine- and thymine-rich regions. The presence of these mutations has been detected in tumor genomes, predominantly in CRC cases, implicating colibactin as a mutagenic factor in CRC development.
The introduction also highlights *E. coli* Nissle 1917 (EcN), a probiotic strain that contains the pks operon but exhibits a reduced capacity to induce DSBs compared to other pks+ strains. While previous studies have indicated a mutagenic effect of EcN in CHO cells, there is a lack of evidence regarding its mutagenicity in primary human cells. To investigate this, the authors aimed to assess the mutational effects of EcN alongside three CRC-derived pks+ strains using a human organoid co-culture system and WGS. They propose two computational methods to enhance the detection of colibactin-induced mutations, focusing on the colibactin DNA target motif and employing a random forest model.
Methods
The methods section of the research paper outlines a comprehensive approach to studying the interactions between organoids and specific strains of *Escherichia coli*, particularly focusing on the pks+ strains. Key methodologies include organoid culture, co-culture experiments, and various techniques for quantifying DNA damage, isolating DNA, and performing sequencing. The analysis further involves mapping and variant calling, mutational signature analysis, and enrichment testing of extended context motifs in metastatic cancer samples. Additionally, Monte-Carlo re-sampling analyses and random forest modeling are employed to estimate the relative mutagenicity of the E. coli strains and to investigate driver genes associated with cancer.
The research is supported by multiple funding sources, including the Netherlands Organisation for Scientific Research and the European Research Council, and utilizes data from The Cancer Genome Atlas (TCGA). The section also acknowledges contributions from various researchers and institutions, highlighting the collaborative nature of the study. The detailed methods are available in the online version of the paper, ensuring transparency and reproducibility of the findings.
Results
The results of the study indicate that co-culturing intestinal organoids with various pks+ E. coli strains, including EcN, CFF16-2F8 (2F8), CFF159-19H2 (19H2), and EcC, reveals heterogeneous mutagenic activities among these strains. All strains exhibited similar growth dynamics, although EcN showed a slightly reduced expansion potential. Notably, EcN induced DNA damage in organoids, as evidenced by increased levels of nuclear gH2AX foci, a marker for double-strand breaks (DSBs). While EcN’s DSB induction was lower than that of EcC, it was significantly higher than the negative controls, including a dye injection and an EcC mutant strain incapable of producing colibactin.
Further analysis through single-cell whole genome sequencing (WGS) demonstrated that the number of single base substitutions (SBS) and insertions/deletions (indels) were comparable across the different strains. The mutational signature profiles revealed that organoids exposed to EcC and 2F8 shared similarities with known signatures SBS88 and ID18, while EcN and 19H2 exhibited limited similarity. Notably, only EcC-exposed organoids showed a significant contribution from SBS88 and ID18, suggesting that EcC has a more pronounced mutagenic effect. However, traces of SBS88 were also observed in organoids exposed to EcN, 19H2, and particularly 2F8, indicating that the mutational signature analysis may lack sensitivity in samples with lower signal-to-noise ratios.
Discussion
The discussion highlights the significant advancements in detecting colibactin-induced mutations through motif filtering and random forest (RF) modeling. The study found that the presence of two adenines at positions -3 and -4 upstream of T > N mutations (-3-4AA) was notably enriched in organoids exposed to various strains of *E. coli*, particularly EcC, compared to controls (p < 4.40 × 10⁻⁸⁴). This motif was consistently associated with colibactin-induced mutations across multiple strains, indicating a robust method for identifying these mutations in cancer datasets. In a cohort of over 4,800 metastatic cancers, 2.4% exhibited significant enrichment for the colibactin motif, with 16% of colorectal cancer (CRC) samples classified as positive for colibactin mutagenesis. The RF model further refined the detection of colibactin-induced mutations, achieving a high correlation with the presence of the SBS88 signature (Pearson's correlation = 0.92, p < 2 × 10⁻¹⁶). Notably, colibactin-positive CRC samples were found to be associated with specific mutations in driver genes such as APC and BRAF, suggesting a potential role for colibactin in accelerating CRC development. The study emphasizes the need for further investigation into the mutagenic potential of *E. coli* strains, particularly EcN, which is commonly used as a probiotic. The findings underscore the importance of understanding the long-term implications of colibactin exposure in clinical settings, especially regarding its potential contribution to oncogenesis.
Limitations
The study acknowledges several limitations regarding the interpretation of mutational features associated with colibactin-induced mutations. Notably, the presence of a low background level of mutations within a -3-4AA motif, as classified by the random forest (RF) model, is observed in all mutation catalogs, including control datasets devoid of colibactin exposure. This suggests that a minimal threshold of colibactin-induced mutations is necessary for accurate classification of pks + E. coli, complicating the attribution of specific mutational profiles to different strains of pks + E. coli.
Furthermore, the study found no significant differences in mutational profiles across various pks + E. coli strains, which limits the potential for strain-specific classification or the assessment of probiotic treatments based on mutation characteristics. While the RF model indicates that certain driver mutations may be linked to colibactin-induced mutagenesis, the study does not establish a direct causal relationship between pks + E. coli exposure and cancer induction. To better understand the implications of pks + E. coli exposure on cancer risk, further epidemiological studies combined with whole-genome sequencing (WGS) or whole-exome sequencing (WES) are recommended to evaluate past mutagenic activities.