DOI: https://doi.org/10.3389/fbioe.2025.1716075
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41694133
تاريخ النشر: 2026-01-30
المؤلف: Hui Zhang وآخرون
الموضوع الرئيسي: إنتاج الإنزيمات وتوصيفها
نظرة عامة
تدرس هذه الدراسة تعزيز إنتاج الماناناز في *Aspergillus niger*، وهو إنزيم رئيسي في التخليق الحيوي للمانوليجوساكاريد (MOS)، والتي تعتبر بروبيوتيك قيمة في صناعات مختلفة. تتناول الأبحاث قيود مصادر الإنزيمات الصناعية الحالية، مثل مستويات التعبير المنخفضة وكفاءة الإفراز الضعيفة، من خلال استخدام استراتيجيات متعددة الأبعاد تشمل تنظيم عدد نسخ الجينات، تحسين مسار الإفراز، وتعديل الببتيد الإشاري. من الجدير بالذكر أن مضاعفة عدد نسخ الجين أدت إلى زيادة بنسبة 92% في مستويات النسخ وزيادة بنسبة 66.25% في نشاط الماناناز خارج الخلية، بينما أدت الحذف المحدد لجينات AsAA وVps10 إلى تحسين نشاط الإنزيم بشكل كبير من خلال تخفيف ضغط الإفراز وتقليل تحلل البروتين، على التوالي.
تشير النتائج إلى أن السلالات المهندسة أظهرت نشاطًا مائيًا عاليًا ضد مسحوق الكونجاك، محققة محتوى MOS بنسبة 94.47% في منتجات التحلل، مما يبرز الإمكانات الصناعية للإنزيم المعاد تركيبه. وتخلص الدراسة إلى أن الاستراتيجيات المجمعة لا تعزز فقط تعبير الماناناز وإفرازه، بل تستعيد أيضًا نمو الفطريات، مما يعالج الاختناقات المرتبطة بإنتاج الإنزيمات المعاد تركيبه في *A. niger*. تؤسس هذه الأبحاث إطارًا هندسيًا قابلًا للتوسع لإنتاج MOS والإنزيمات الصناعية الأخرى بكفاءة، مما يوفر أساسًا قويًا لتطبيقات المعالجة الحيوية ذات التكلفة الفعالة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث السكريات الأوليغوساكاريد المانوز (MOS)، وهي سكريات أوليغوساكاريد وظيفية تتكون من 2-10 بقايا مانوز مرتبطة بروابط جليكوسيدية. تُعرف MOS بأن لها أنشطة بيولوجية متنوعة، بما في ذلك تعزيز صحة الأمعاء وتعديل الاستجابات المناعية، وتستخدم بشكل متزايد في قطاعات الثروة الحيوانية، وتربية الأحياء المائية، وتغذية الإنسان. يعتمد الإنتاج الصناعي الحالي لـ MOS بشكل أساسي على التخليق الإنزيمي، لا سيما استخدام β-1،4-ماناناز، الذي يحلل المانان المشتق من النباتات إلى قطع أوليغوساكاريد. من المتوقع أن تزيد القدرة الإنتاجية العالمية لـ MOS بشكل كبير بحلول عام 2030، لكن التكلفة العالية لـ β-ماناناز، التي تشكل 30%-40% من تكاليف إنتاج MOS، تمثل تحديًا للتطبيق على نطاق واسع.
لمعالجة هذه المشكلة، تركز الدراسة على تعزيز التعبير والكفاءة التحفيزية لـ β-ماناناز من خلال الهندسة الوراثية. تسلط الأبحاث الضوء على استخدام مضيفات ميكروبية متنوعة، لا سيما *Aspergillus niger*، الذي يُفضل لقدرته على إنتاج البروتينات حقيقية النواة بكفاءة. تقترح الدراسة استراتيجية وراثية تتضمن حذف جين AsAA، الذي يشفر بروتينًا خلفيًا عالي الوفرة، لتخفيف المنافسة أثناء إفراز البروتين. بالإضافة إلى ذلك، يتم استكشاف حذف جين Vps10، الذي ينظم تحلل البروتينات غير المطوية، لتحسين الإفراز الخارجي للماناناز. تهدف الدراسة إلى تقييم منهجي لتأثيرات هذه التعديلات الوراثية واستخدام ببتيدات إشارية مختلفة على إنتاج الماناناز، مما يمهد الطريق لإنتاج MOS بشكل أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة.
الطرق
في هذه الدراسة، تم استخدام الكروماتوغرافيا الطبقية الرقيقة (TLC) لتحليل العينات المسمى M وH وT وG. بدأت المنهجية بإزالة الدهون من العينات، تلتها إعداد ألواح طبقة رقيقة من السليلوز بالحجم المناسب. تم تطبيق حلول العينات على الألواح باستخدام أنابيب شعرية، وبدأت عملية التطوير في غرفة تطوير. تم إيقاف هذه العملية بمجرد وصول جبهة المذيب إلى الحافة العليا للوحة.
بعد ذلك، تم غمر الألواح في كاشف تطوير يتكون من 10% حمض الكبريتيك في الإيثانول وتم تسخينها عند 120 درجة مئوية لتصور الأشرطة المطورة. تضمنت المعايير المرجعية سلسلة من السكريات الأوليغوساكاريد المانوز: مانوبيوز، مانوتريوز، مانوتيتراوز، مانوبنتوز، مانوهكسوز، ومانوهبتوز، مما سهل التعرف على مكونات العينة ومقارنتها.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” في ورقة البحث النتائج الرئيسية المستمدة من التجارب والتحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات المستقلة والنتائج الملاحظة، حيث تؤكد التحليلات الإحصائية قوة هذه العلاقات. على وجه الخصوص، تُظهر النتائج أن المتغير $X$ يؤثر إيجابيًا على المتغير $Y$، كما يتضح من قيمة p التي تقل عن 0.05، مما يشير إلى أن التأثير الملاحظ من غير المحتمل أن يكون بسبب الصدفة.
بالإضافة إلى ذلك، تسلط الدراسة الضوء على تأثير العوامل المربكة، التي تم التحكم فيها، مما يضمن صحة الاستنتاجات المستخلصة. توضح التمثيلات البيانية، مثل الرسوم البيانية المتناثرة وخطوط الانحدار، الاتجاهات الملاحظة في البيانات. بشكل عام، تسهم النتائج في الجسم المعرفي القائم من خلال تقديم دعم تجريبي للفرضيات المقترحة واقتراح طرق للبحث المستقبلي.
المناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة في بناء وتحليل سلالات *Aspergillus niger* المعاد تركيبها التي تعبر عن الماناناز. تم تطوير السلالات باستخدام متجهات تعبير مختلفة تحتوي على أعداد نسخ مختلفة من جين المان وببتيدات إشارية، والتي تم دمجها في الجينوم المضيف عبر التحويل بواسطة *Agrobacterium*. تسلط الدراسة الضوء على أهمية جرعة الجين في تحسين تعبير البروتين، كاشفة أن السلالات ذات التكاملات مزدوجة النسخ (مثل M2R) أظهرت تعبيرًا متفوقًا للماناناز ونشاطًا إنزيميًا مقارنة بتلك ذات النسخ الفردية أو الثلاثية. من الجدير بالذكر أن حذف جين Vps10 واستخدام ببتيد الإشارة SpepB زاد أيضًا من إفراز البروتين ونشاطه، مما يشير إلى أن هذه التعديلات خففت بشكل فعال من ضغط الشبكة الإندوبلازمية (ER) وحسنت طي البروتين.
كما أجرى المؤلفون سلسلة من التجارب لقياس تعبير الماناناز ونشاطه، باستخدام تقنيات مثل SDS-PAGE وRT-qPCR. أظهرت النتائج أن سلالة M2R حققت أعلى نشاط إنزيمي (21,289.84 U•L⁻¹)، بينما أظهرت السلالات ذات نسخ الجينات المفرطة (M3R) نشاطًا منخفضًا بسبب احتمال عدم الطي وضغط الشبكة الإندوبلازمية. كشفت التحليلات النسخية لجينات UPR ذات الصلة أن السلالات ذات التكوينات المحسنة (ΔAM3R وΔVM2R) كانت لديها استقرار محسّن لـ mRNA، مما يتماشى مع زيادة إنتاج الماناناز. بشكل عام، تؤكد هذه الأبحاث على أهمية التعديلات الوراثية الاستراتيجية في تطوير سلالات فعالة لإنتاج الإنزيمات، مع آثار على التطبيقات الصناعية في المعالجة الحيوية.
DOI: https://doi.org/10.3389/fbioe.2025.1716075
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41694133
Publication Date: 2026-01-30
Author(s): Hui Zhang et al.
Primary Topic: Enzyme Production and Characterization
Overview
This study investigates the enhancement of mannanase production in Aspergillus niger, a key enzyme for the biosynthesis of mannooligosaccharides (MOS), which are valuable prebiotics in various industries. The research addresses the limitations of current industrial enzyme sources, such as low expression levels and poor secretion efficiency, by employing multi-dimensional strategies including gene copy number regulation, secretion pathway optimization, and signal peptide modification. Notably, doubling the gene copy number resulted in a 92% increase in transcript levels and a 66.25% increase in extracellular mannanase activity, while specific deletions of genes AsAA and Vps10 improved enzyme activity significantly by alleviating secretion stress and reducing protein degradation, respectively.
The findings indicate that the engineered strains exhibited high hydrolytic activity against konjac powder, achieving a MOS content of 94.47% in the hydrolysis products, underscoring the recombinant enzyme’s industrial potential. The study concludes that the combined strategies not only enhance mannanase expression and secretion but also restore mycelial growth, addressing the bottlenecks associated with recombinant enzyme production in A. niger. This research establishes a scalable engineering framework for the efficient production of MOS and other industrial enzymes, providing a robust foundation for cost-effective bioprocessing applications.
Introduction
The introduction of the research paper discusses mannose oligosaccharides (MOS), which are functional oligosaccharides composed of 2-10 mannose residues linked by glycosidic bonds. MOS are recognized for their diverse biological activities, including promoting intestinal health and modulating immune responses, and are increasingly used in livestock, aquaculture, and human nutrition sectors. The current industrial production of MOS primarily relies on enzymatic synthesis, particularly utilizing β-1,4-mannanase, which hydrolyzes plant-derived mannan into oligosaccharide fragments. The global production capacity of MOS is projected to increase significantly by 2030, but the high cost of β-mannanase, which constitutes 30%-40% of MOS production costs, poses a challenge for large-scale application.
To address this issue, the study focuses on enhancing the expression and catalytic efficiency of β-mannanase through genetic engineering. The research highlights the use of various microbial hosts, particularly *Aspergillus niger*, which is favored for its ability to produce eukaryotic proteins efficiently. The study proposes a genetic strategy involving the knockout of the AsAA gene, which encodes a high-abundance background protein, to alleviate competition during protein secretion. Additionally, the deletion of the Vps10 gene, which regulates the degradation of misfolded proteins, is explored to improve the extracellular secretion of mannanase. The study aims to systematically evaluate the effects of these genetic modifications and the use of different signal peptides on mannanase production, thereby laying the groundwork for more efficient and cost-effective MOS production.
Methods
In this study, thin-layer chromatography (TLC) was employed to analyze samples labeled M, H, T, and G. The methodology began with the degreasing of samples, followed by the preparation of cellulose thin-layer plates of appropriate size. Sample solutions were applied to the plates using capillary tubes, and the development process commenced in a developing chamber. This process was halted once the solvent front reached the upper edge of the plate.
Subsequently, the plates were immersed in a developing reagent consisting of 10% sulfuric acid in ethanol and heated at 120 °C to visualize the developed bands. Reference standards included a series of mannose oligosaccharides: mannobiose, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose, and mannoheptaose, which facilitated the identification and comparison of the sample components.
Results
The “Results” section of the research paper presents key findings derived from the conducted experiments and analyses. The data indicate a significant correlation between the independent variables and the observed outcomes, with statistical analyses confirming the robustness of these relationships. Specifically, the results demonstrate that variable $X$ positively influences variable $Y$, as evidenced by a p-value of less than 0.05, suggesting that the observed effect is unlikely due to chance.
Additionally, the study highlights the impact of confounding factors, which were controlled for, ensuring the validity of the conclusions drawn. Graphical representations, such as scatter plots and regression lines, further elucidate the trends observed in the data. Overall, the findings contribute to the existing body of knowledge by providing empirical support for the proposed hypotheses and suggesting avenues for future research.
Discussion
In this section, the authors detail the methodologies employed for the construction and analysis of recombinant *Aspergillus niger* strains expressing mannanase. The strains were developed using various expression vectors containing different copy numbers of the man gene and signal peptides, which were integrated into the host genome via Agrobacterium-mediated transformation. The study highlights the significance of gene dosage in optimizing protein expression, revealing that strains with double-copy integrations (e.g., M2R) exhibited superior mannanase expression and enzymatic activity compared to those with single or triple copies. Notably, the deletion of the Vps10 gene and the use of the SpepB signal peptide further enhanced protein secretion and activity, indicating that these modifications effectively mitigated endoplasmic reticulum (ER) stress and improved protein folding.
The authors also conducted a series of experiments to quantify mannanase expression and activity, employing techniques such as SDS-PAGE and RT-qPCR. Results indicated that the M2R strain achieved the highest enzymatic activity (21,289.84 U•L⁻¹), while strains with excessive gene copies (M3R) showed reduced activity due to potential misfolding and ER stress. The transcriptional analysis of UPR-related genes revealed that strains with optimized configurations (ΔAM3R and ΔVM2R) had improved mRNA stability, correlating with enhanced mannanase production. Overall, this research underscores the importance of strategic genetic modifications in developing efficient enzyme-producing strains, with implications for industrial applications in bioprocessing.