DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-70336-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41775714
تاريخ النشر: 2026-03-03
المؤلف: Daiyu Miao وآخرون
الموضوع الرئيسي: مركبات الكبريت في علم الأحياء
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة الدور الحاسم للثيولات في مختلف العمليات الحيوية الكيميائية، بما في ذلك التحفيز، توازن الأكسدة والاختزال، واستقلاب الطاقة. يقدم المؤلفون استراتيجية متكاملة جديدة لتوصيف الثيولات على مستوى الخلية الواحدة، مع معالجة التحديات التي تطرحها وفرتها المنخفضة وقابليتها للأكسدة. تجمع هذه الطريقة بين وضع العلامات على الخلايا الحية مع قياس الكتلة العضوية، مما يسمح بالقياس الشامل للثيولات الذاتية مع حساسية محسنة وتغطية موسعة. تمكن هذه الطريقة من القياس المتزامن لـ 27 ثيول موسوم و355 مستقلب إضافي من خلايا فردية.
تظهر فعالية هذه المنهجية المتكاملة من خلال تقييم التقلبات الأيضية عند التحفيز، مما يبرز قدراتها في مراقبة نشاط المسارات، ورسم خرائط الشبكات الأيضية، وتوصيف الميتابولوم غير المستهدف. علاوة على ذلك، يكشف تطبيق هذه التقنية لدراسة الموت الخلوي الناتج عن RSL3 أن RSL3 يثبط تخليق الجلوتاثيون عبر محور العامل النووي E2 المرتبط بالعامل 2-جلوتاثيون، مما يؤدي إلى استقلاب غير متجانس للجلوتاثيون بين أنواع الخلايا المختلفة.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث أهمية الميتابولوميات على مستوى الخلية الواحدة في فهم تباين الأنماط الظاهرية الخلوية تحت الظروف الفسيولوجية، مع التركيز بشكل خاص على المستقلبات الذاتية مثل الثيولات. تعتبر الثيولات، بما في ذلك الجلوتاثيون (GSH)، المساعد الإنزيمي A (CoA)، والسيستين (Cys)، ضرورية لمختلف العمليات الحيوية الكيميائية، وترتبط اختلالاتها بمشاكل صحية خطيرة مثل التنكس العصبي، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والسرطان. تسلط الورقة الضوء على التحديات في قياس مستويات الثيول بدقة بسبب قابليتها للأكسدة أثناء إعداد العينة، مما قد يؤثر على موثوقية البيانات.
لمعالجة هذه التحديات، يقترح المؤلفون طريقة جديدة تجمع بين وضع العلامات على الخلايا الحية وقياس الكتلة العضوية لتوصيف الثيولات على مستوى الخلية الواحدة. تستخدم هذه الطريقة مجسات قياس الكتلة التفاعلية مع الثيول (SMPs) لحماية الثيولات من الأكسدة في الموقع، مما يسمح بالكشف الدقيق عن أنواع متعددة من الثيولات ومستقلبات أخرى على مستوى الخلية الواحدة. تظهر الطريقة فعاليتها من خلال مراقبة التقلبات في تخليق GSH وكشف الأنواع الفرعية المتميزة من الخلايا ذات استقلاب الثيول والدهون غير المتجانس في سياق الموت الخلوي الناتج عن RSL3. تعد هذه التقنية المبتكرة بزيادة فهمنا لاستقلاب الثيول وآثاره في مسارات أيضية مختلفة.
طرق
في هذه الدراسة، تم استخدام ثلاثة خطوط خلوية—HeLa (CCL-2)، NE-4C (CRL-2925)، وJurkat (TIB-152)—جميعها مأخوذة من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) وتم التأكد من خلوها من تلوث الميكوبلازما. تم زراعة خلايا HeLa في وسط Eagle المعدل من دولبيكو (DMEM) عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂، مع إضافة 10% مصل بقري جنيني (FBS)، و100 وحدة/مل من البنسلين، و100 وحدة/مل من الستربتوميسين. في المقابل، تم الحفاظ على خلايا NE-4C في وسط أساسي أدنى (MEM) تحت نفس ظروف الحرارة وCO₂، مع إضافة مماثلة من FBS والمضادات الحيوية، بالإضافة إلى 1 مللي مول من البيروفات الصوديوم و2 مللي مول من الألانين-جلوتامين.
تم وضع الخلايا بكثافة 10^6 خلية لكل طبق 60 مم وتم إعادة زراعتها كل 1-2 يوم عند الوصول إلى حوالي 70% من التلاصق. ضمنت هذه الطريقة المنهجية ظروف نمو مثلى لخطوط الخلايا، مما يسهل نتائج تجريبية موثوقة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج المستخلصة من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من الإجراءات التجريبية أو التحليلية المستخدمة. تشير البيانات إلى اتجاهات وارتباطات مهمة تدعم الفرضيات الأولية. يتم الإبلاغ عن مقاييس محددة، مثل قيم p أو فترات الثقة، لدعم الأهمية الإحصائية للنتائج.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم تمثيلات بصرية، مثل الرسوم البيانية أو الجداول، لتوضيح العلاقات بين المتغيرات بوضوح. تعزز هذه المساعدات البصرية فهم النتائج وتوفر نظرة شاملة على النتائج التجريبية. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة للمجال، مما يشير إلى آثار محتملة للبحث المستقبلي أو التطبيقات العملية.
مناقشة
في هذه الدراسة، طور المؤلفون نهج كيمياء النقر للثيول-كرومين لقياس الكتلة (MS) لوضع العلامات وقياس الثيولات داخل الخلايا، وخاصة الجلوتاثيون (GSH)، في الخلايا الحية. أظهر المجس المختار، SMP2، نفاذية غشائية فائقة وتوافق حيوي، مما يسمح بوضع علامات فعالة على الثيولات دون سمية خلوية كبيرة. تم تحديد ظروف وضع العلامات المثلى عند 80 ميكرومول من SMP2 لمدة 10 دقائق، مما حقق كفاءة وضع علامات عالية مع الحفاظ على بقاء الخلايا فوق 90%. مكنت هذه الطريقة من تحديد 69 نوعًا من الثيولات، مما وسع التغطية بشكل كبير مقارنة بالتقنيات التقليدية، وكشفت عن تعديلات مختلفة من GSH والسيستين، مما يشير إلى أدوارها في الإشارات الخلوية والاستقلاب.
سمح دمج هذه التقنية لوضع العلامات مع قياس الكتلة العضوية بتحليل الخلايا الفردية، مما كشف عن تباين أيضي في استقلاب GSH خلال الموت الخلوي الناتج عن RSL3. وجدت الدراسة أن معالجة RSL3 أدت إلى توزيع ثنائي القمة لمستويات GSH في خلايا HeLa، مما يشير إلى وجود تجمعات فرعية مقاومة لـ RSL3 وحساسة لـ RSL3. افترض المؤلفون أن RSL3 يقلل من تخليق GSH من خلال تثبيط NRF2، وهو ما تم دعمه من خلال التحليلات متعددة الأبعاد. تبرز هذه الأبحاث إمكانيات طريقة وضع علامات الثيول المدمجة مع قياس الكتلة العضوية لتوصيف الأيض التفصيلي على مستوى الخلية الواحدة، مما يوفر رؤى حول التنظيم المعقد لاستقلاب الثيول استجابةً للضغوط الخلوية.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-026-70336-z
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41775714
Publication Date: 2026-03-03
Author(s): Daiyu Miao et al.
Primary Topic: Sulfur Compounds in Biology
Overview
This section discusses the critical role of thiols in various biochemical processes, including catalysis, redox homeostasis, and energy metabolism. The authors present a novel integrated strategy for profiling thiols at the single-cell level, addressing the challenges posed by their low abundance and susceptibility to oxidation. This approach combines live-cell labeling with organic mass cytometry, allowing for the comprehensive measurement of intrinsic thiols with enhanced sensitivity and expanded coverage. The method enables the simultaneous quantification of 27 labeled thiols and 355 additional metabolites from individual cells.
The effectiveness of this integrated methodology is demonstrated through the assessment of metabolic fluctuations upon stimulation, showcasing its capabilities in pathway activity monitoring, metabolic network mapping, and untargeted metabolome profiling. Furthermore, the application of this technique to study RSL3-triggered ferroptosis reveals that RSL3 inhibits glutathione synthesis via the nuclear factor E2-related factor 2-glutathione axis, leading to heterogeneous glutathione metabolism among different cell subtypes.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the significance of single-cell metabolomics in understanding the heterogeneity of cellular phenotypes under physiological conditions, particularly focusing on endogenous metabolites such as thiols. Thiols, including glutathione (GSH), coenzyme A (CoA), and cysteine (Cys), are crucial for various biochemical processes, and their dysregulation is linked to serious health issues like neurodegeneration, cardiovascular diseases, and cancer. The paper highlights the challenges in accurately measuring thiol levels due to their susceptibility to oxidation during sample preparation, which can compromise data reliability.
To address these challenges, the authors propose a novel method that combines live-cell labeling with organic mass cytometry for single-cell thiol profiling. This approach utilizes sulfhydryl-reactive mass spectrometry probes (SMPs) to protect thiols from oxidation in situ, allowing for accurate detection of multiple thiol species and other metabolites at the single-cell level. The method demonstrates its efficacy by monitoring fluctuations in GSH synthesis and revealing distinct subtypes of cells with heterogeneous thiol and lipid metabolism in the context of RSL3-triggered ferroptosis. This innovative technique promises to enhance our understanding of thiol metabolism and its implications in various metabolic pathways.
Methods
In this study, three cell lines—HeLa (CCL-2), NE-4C (CRL-2925), and Jurkat (TIB-152)—were utilized, all sourced from the American Type Culture Collection (ATCC) and confirmed to be free from mycoplasma contamination. HeLa cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) at 37°C with 5% CO₂, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin, and 100 U/mL streptomycin. In contrast, NE-4C cells were maintained in minimum essential medium (MEM) under the same temperature and CO₂ conditions, with similar FBS and antibiotic supplementation, along with additional 1 mM sodium pyruvate and 2 mM alanyl-glutamine.
Cells were plated at a density of 10^6 cells per 60 mm dish and were subcultured every 1-2 days upon reaching approximately 70% confluency. This systematic approach ensured optimal growth conditions for the cell lines, facilitating reliable experimental outcomes.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the experimental or analytical procedures employed. The data indicate significant trends and correlations that support the initial hypotheses. Specific metrics, such as p-values or confidence intervals, are reported to substantiate the statistical significance of the results.
Additionally, the section may include visual representations, such as graphs or tables, to illustrate the relationships between variables clearly. These visual aids enhance the understanding of the results and provide a comprehensive overview of the experimental outcomes. Overall, the findings contribute valuable insights to the field, suggesting potential implications for future research or practical applications.
Discussion
In this study, the authors developed a thiol-chromene click chemistry approach for mass spectrometry (MS) to label and quantify intracellular thiols, particularly glutathione (GSH), in living cells. The selected probe, SMP2, demonstrated superior membrane permeability and biocompatibility, allowing for effective thiol labeling without significant cytotoxicity. The optimal labeling conditions were established at 80 µM SMP2 for 10 minutes, achieving high labeling efficiency while maintaining cell viability above 90%. This method enabled the identification of 69 thiol species, significantly expanding the coverage compared to traditional techniques, and revealed various modifications of GSH and cysteine, suggesting their roles in cellular signaling and metabolism.
The integration of this labeling technique with organic mass cytometry allowed for single-cell analysis, uncovering metabolic heterogeneity in GSH metabolism during ferroptosis induced by RSL3. The study found that RSL3 treatment led to a bimodal distribution of GSH levels in HeLa cells, indicating the presence of RSL3-resistant and RSL3-sensitive subpopulations. The authors hypothesized that RSL3 downregulates GSH synthesis through inhibition of NRF2, which was supported by multimodal analyses. This research highlights the potential of the thiol labeling method combined with organic mass cytometry for detailed metabolic profiling at the single-cell level, offering insights into the complex regulation of thiol metabolism in response to cellular stressors.