تحليل النسخ الجيني المقارن يكشف عن اختلافات في الاستجابات المناعية لأيونات النحاس في Sepia esculenta تحت ظروف درجات الحرارة العالية Comparative transcriptome analysis reveals differences in immune responses to copper ions in Sepia esculenta under high-temperature conditions

المجلة: BMC Genomics، المجلد: 26، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-025-11418-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40097976
تاريخ النشر: 2025-03-17

تحليل النسخ الجيني المقارن يكشف عن اختلافات في الاستجابات المناعية لأيونات النحاس في Sepia esculenta تحت ظروف درجات الحرارة العالية

يانشينغ تشاو دييوان تشانغ يانشوان تشنغ يووي زانغ يونغجي وانغ شياوكاي باو قوهوا صن يانوي فنج زان لي شيو مي ليو وجيانمين يانغ

الملخص

سيبيا إسكولنتا هي واحدة من أكثر تجمعات الحبار الموجودة حاليًا وفرة في جنوب شرق آسيا، وتثير اهتمامًا بسبب معدل تكاثرها السريع وقيمتها التجارية العالية. في السنوات الأخيرة، ومع التطور السريع للصناعة، ظهرت قضايا مثل الاحتباس الحراري وتلوث المعادن الثقيلة في المحيطات، مما يشكل تهديدًا خطيرًا على الأنشطة الحيوية للكائنات البحرية. في هذه الدراسة، استخدمنا تقنيات النسخ الجيني للتحقيق في الفروقات في استجابات المناعة للتعرض للنحاس في يرقات S. esculenta تحت ظروف درجات حرارة مختلفة. كان تركيز جينات عائلة ناقلات المحاليل (SLC) والجينات المتعلقة بتكرار الحمض النووي وإصلاحه أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة CuT مقارنة بمجموعة Cu. كشفت تحليل إثراء الوظائف أن مسارات البلعمة المعتمدة على FcyR ومسارات الالتهام الذاتي كانت غنية في مجموعة CuT. استنادًا إلى تحليل الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) ونتائج إثراء الوظائف، يمكننا أن نستنتج أوليًا أن مجموعة CuT تسببت في اضطراب أكثر حدة في نقل الأيونات بين الخلايا وتكرار الحمض النووي وإصلاحه في اليرقات مقارنة بمجموعة Cu. قد يكون هذا قد أثر بشكل أكبر على الأنشطة الفسيولوجية الطبيعية ليرقات S. esculenta. بشكل عام، عند درجات حرارة مرتفعة، يؤدي التعرض للنحاس إلى استجابة التهابية أكثر حدة. توفر نتائج هذه الدراسة أساسًا نظريًا للباحثين لفهم تأثيرات العوامل البيئية على مناعة يرقات S. esculenta، بالإضافة إلى رؤى أولية حول التأثيرات السامة المعززة للنحاس المعدني على الكائنات المائية تحت ظروف درجات الحرارة العالية.

الكلمات الرئيسية: النسخ الجيني، التعرض المشترك للنحاس، المعادن الثقيلة، المناعة، سيبيا إسكولنتا

مقدمة

مع تقدم التصنيع، أصبحت تلوث المعادن الثقيلة في البحر أكثر خطورة [1]. أظهرت الدراسات الحديثة أن المعادن الثقيلة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نمو وتطور الكائنات البحرية، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة واضطراب المناعة [2]. تشمل الآثار الضارة للمعادن الثقيلة على الكائنات المائية تلف الأنسجة وضعف الجهاز المناعي [3]. على سبيل المثال، في الأسماك، تزيد التركيزات العالية من المعادن الثقيلة بشكل كبير من معدل التشوهات والمراضة، وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إثراء المعادن الثقيلة له آثار خطيرة على العمليات الفسيولوجية للرخويات مثل المناعة والتمثيل الغذائي [4].
لقد أدى التطور السريع في التصنيع إلى زيادة تلوث المعادن الثقيلة، كما زاد من معدل الاحتباس الحراري. أظهرت الدراسات السابقة أن درجة الحرارة تؤدي إلى تغييرات في سمية المعادن الثقيلة للكائنات البحرية. وجد رين وآخرون أن درجات الحرارة العالية تعزز من تسمم المعادن الثقيلة لـ Ruditapes philippinarum، مما يعيق نموه وتطوره بشكل كبير. أظهر مالهوتر وآخرون أن درجة الحرارة ستؤثر على السمية الناتجة عن التعرض للنحاس. مقارنةً بدرجة الحرارة المنخفضة. )، تم تعزيز معدل الذوبان وتجمع أيونات النحاس عند درجات حرارة مرتفعة ( ومع ذلك، لم يتم دراسة تأثير درجات الحرارة العالية على سمية التعرض للنحاس بشكل شامل في الرخويات. لذلك، فإن فهم ما إذا كانت درجات الحرارة العالية تؤثر على السمية الناتجة عن النحاس أمر مهم لأبحاث الرخويات، وتربية الأحياء المائية، والإدارة البيئية السليمة للأنظمة البيئية البحرية.
س. إسكولنتا هي واحدة من أكثر تجمعات الحبار وفرة التي تعيش في جنوب شرق آسيا، حيث تتميز بلحمها اللذيذ، واحتوائها على نسبة عالية من البروتين، وسرعة تكاثرها. لذلك، جذبت بسرعة انتباه العلماء. نتيجة لتدهور البيئة البحرية والاستغلال الواسع النطاق للموارد البحرية من قبل البشر، انخفضت أعداد س. إسكولنتا بشكل كبير، وفي السنوات الأخيرة، أصبحت حتى نوعًا مهددًا بالانقراض. عادةً ما يتم تربية س. إسكولنتا في الأسر في المياه الساحلية الضحلة. تؤثر التركيزات العالية من المعادن الثقيلة ودرجات الحرارة المرتفعة على طول الساحل البحري بشكل عميق على نموها وتطورها. . إسكولنتا [11]. لذلك، من الضروري فهم عواقب درجات الحرارة العالية والمعادن الثقيلة على S. إسكولنتا.
تطورت تقنية تسلسل RNA بسرعة بسبب قدرتها العالية على الإنتاجية والدقة، وقد تم استخدامها على نطاق واسع في السنوات الأخيرة لدراسة الآليات المناعية للكائنات المائية. تشمل الأمثلة استخدام RNA-Seq لدراسة الاستجابة الجزيئية للنحاس تجاه يرقات Argopecten purpuratus، بالإضافة إلى دراسة
آليات الجزيئات لدرجات الحرارة العالية على الأخطبوط العادي واستجابة النسخ الجيني للتعرض للنحاس في Mytilus coruscus [12-14]. لذلك، يمكننا استخدام تسلسل RNA لاستكشاف الآلية السمية للتعرض للنحاس في يرقات S. esculenta عند درجات حرارة عالية.
في دراستنا، استخدمنا تسلسل النسخ الجيني عالي الإنتاجية لاستكشاف الفروق في مناعة التعرض للنحاس في يرقات S. esculenta عند درجات حرارة مختلفة. من خلال تحليل إثراء الوظائف باستخدام GO و KEGG، وُجد أن درجات الحرارة العالية تؤثر بشكل كبير على استجابة المناعة للتعرض للنحاس وتسبب استجابة التهابية أكثر حدة في يرقات S. esculenta. في الوقت نفسه، يمكن أن تؤدي درجات الحرارة العالية إلى إحداث أضرار أكثر شدة في الحمض النووي واضطرابات في نقل الأيونات. توفر نتائجنا أساسًا لاستكشاف الفروق في استجابات التعرض للنحاس في يرقات S. esculenta تحت ظروف درجات حرارة مختلفة وتقديم اقتراحات علمية أكثر لتربية الحبار الذهبي والرأسقدميات.

المواد والطرق

جمع يرقات S. esculenta وتجارب الضغط

خلال موسم التكاثر لـ S. esculenta، تم التقاط عينات من منطقة البحر الأصفر للحصول على آباء برية (بالغين نشطين وبصحة ظاهرة من S. esculenta (طول الزعنفة: ; الوزن: تم جمعها من البحر الأصفر بالقرب من كينغداو، الصين، وتم وضع الأبوين البريين الذين تم اصطيادهم في برك ورش عمل (تقريبًا 8 أمتار طولًا، 1 متر عرضًا و1.2 متر ارتفاعًا، مصنوعة من الخرسانة) للتربية المؤقتة. بعد أسبوع، بدأت الأمهات في وضع البيض، وتم وضع البيض الم collected في مياه البحر المتحركة وتم تربيته مؤقتًا حتى يفقس. في نفس الوقت، فقست بيض S. esculenta إلى يرقات وتم نقلها إلى دلاء بيضاء (سعة 100 لتر). تم تقسيم اليرقات إلى ثلاث مجموعات تشمل مجموعة التحكم (المجموعة C)، التعرض لدرجة حرارة طبيعية من النحاس (مجموعة Cu)، والتعرض لدرجة حرارة عالية من النحاس (مجموعة CuT)، مع 100 يرقة من S. esculenta في كل مجموعة (طول الغلاف (حجم الجسم). ; الوزن ). تم زراعة مجموعة التحكم في مياه البحر العادية (درجة حرارة الماء الأكسجين المذاب في درجة الحموضة لـ ملوحة ، وتزويد مستمر بالأكسجين) لمدة 24 ساعة. خالي من الماء تمت إضافته إلى مياه البحر لتحقيق تركيز النحاس من في مجموعة Cu ومجموعة CuT (كانت يرقات S. esculenta صغيرة جدًا لقياس محتوى النحاس في الجسم). رفعت مجموعة CuT درجة الحرارة إلى كما تحدده التجارب الأولية والمراجع [15]. أخيرًا، خلال التجربة، تم جمع يرقات .esculenta عند 0 ساعة (C_0h) و 4 ساعات (C_4h) و في مجموعة التحكم، عند و في مجموعة Cu، وعند 4 ساعات (CuT_4h)
و 24 ساعة (CuT_24h) في مجموعة CuT. تم تخزين جميع العينات في خزانات النيتروجين السائل حتى استخراج RNA.

استخراج RNA، بناء المكتبة والتسلسل

تمت عملية استخراج RNA وبناء المكتبة والتسلسل بواسطة شركة بكين نوفوزيمز للتكنولوجيا المحدودة، التي استخدمت طريقة TRIzol لاستخراج RNA. ثم خضعت عينات RNA لرقابة جودة صارمة بواسطة محلل Agilent 2100 الحيوي. كانت المجموعة المستخدمة لبناء المكتبة هي NEBNext. ألترا ™طقم تحضير مكتبة RNA لآلة إلومينا تم اختيار تسعة يرقات من كل مجموعة، وتم اختيار ثلاثة بشكل عشوائي لتشكيل تكرار واحد، ليكون المجموع ثلاثة تكرارات. قمنا بتسلسل RNA اليرقات من S. esculenta باستخدام منصة Illumina NovaSeq 6000 (Illumina، الولايات المتحدة الأمريكية) [16].

فحص الجينات المختلفة وتوصيف وظائف الجينات

أولاً، قمنا بإزالة بعض القراءات الخام، والقراءات التي تحتوي على تسلسلات الموصل، وأكثر من قواعد غير محددة، بالإضافة إلى قراءات منخفضة الجودة، وقمنا بتعيين القراءات النظيفة إلى جينوم S. esculenta المرجعي باستخدام برنامج HISAT2 (غير منشور). استخدمنا طريقة DESeq2 لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف وقارنّا هذه الجينات مع قواعد بيانات SwissProt و KEGG و GO وغيرها لمعرفة وظائفها واستخدمناها لتحليل إثراء الوظائف. في دراستنا، تم تعيين عتبة القيمة إلى [17، 18].

تحليل الإثراء

قمنا بإجراء تحليلات GO و KEGG للجينات باستخدام مورد دافيد للمعلوماتية الحيويةhttps://david.ncifcr f.gov/tools.jsp). الشروط والمسارات مع -قيم تم اختيارها لاستخدامها في التحليلات اللاحقة.

تحليل RT-PCR الكمي

في هذه التجربة، قمنا بفحص 15 جينًا معبرًا مصححًا وصممنا بادئات باستخدام برنامج Primer Premier 5.0 (الجدول S1). نظرًا لمستوى التعبير عن -الأكتين يميل إلى أن يكون مستقراً، اخترنا جين الأكتين كجين مرجعي لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي. تم إجراء qRTPCR وفقًا لـ Liu et al. (2017) و Wang et al. (2023). ثم تم إجراء qRT-PCR في محلول يحتوي على 10 نانوغرام من cDNA القالب و SYBR Premix Ex Taq II (تاكارا) باستخدام جهاز LightCycler 480 في لخمس دقائق من التحضين المسبق، تليها 45 دورة من لمدة 15 ثانية و لمدة 45 ثانية. أخيرًا، قمنا بتحليل منحنى الانصهار لاكتشاف التضخيم الفردي. تم تسجيل تراكم الإشارة الفلورية خلال لمدة 45 ثانية في كل دورة باستخدام جهاز LightCycler 480. تم استخدام طريقة Ct المقارنة لحساب الكميات النسبية للجينات المستهدفة المعبر عنها كاختلاف مضاعف على -أكتين. تم تطبيق تقنية RT-PCR الكمية للتحقق من تعبير الجينات الرئيسية والمحورية في هذه الدراسة [19، 20].

النتائج

نتائج تسلسل الترنسكريبتوم

تسلسل يرقات S. esculenta في ظروف صحية، وإجهاد النحاس، ودرجات الحرارة المرتفعة باستخدام طرق RNA-seq؛ تظهر نتائج التسلسل المحددة في الجدول S2. في المتوسط، تمت مطابقة قراءات نظيفة إلى جينومنا المرجعي. تم توضيح هيكل ووظيفة الجينات الفردية في عدة قواعد بيانات، بما في ذلك NR وSwissProt وKEGG وGO وPFAM.

تحليل الجينات المعبر عنها بشكل مختلف

من خلال استخدام مخطط انتشار الفرق الديناميكي متعدد المجموعات (الشكل 1A)، وجدنا أنه تم اكتشاف ما مجموعه 787 جينًا معبرًا عنه بشكل مختلف (DEGs) في الـ مجموعة المقارنة C_4h مقابل.
الشكل 1 أ: مخطط انتشار الفرق الديناميكي متعدد المجموعات لتوزيع التعبير عن الجينات المعبر عنها بشكل مختلف، مع أرقام تمثل مجموعات مختلفة، والنقاط الحمراء تمثل زيادة التعبير عن الجينات المعبر عنها، والنقاط الخضراء تمثل انخفاض التعبير عن الجينات المعبر عنها، وكل نقطة تمثل جينًا؛ ب: مخطط فين للجينات المعبر عنها، مع الأزرق والأخضر والأصفر والأحمر تمثل الجينات المعبر عنها في مجموعات مختلفة، وألوان أخرى مختلفة تمثل عدد الجينات المشتركة بين المجموعات المختلفة.
من بين هذه، كانت 463 جينًا مرتفعة التعبير و324 جينًا منخفضة التعبير. تم اكتشاف ما مجموعه 1,418 جينًا معبرًا عنه بشكل مختلف. مقارنة CuT_4h مقابل C_4h، تم الكشف عن إجمالي 1,021 جينًا مختلف التعبير، منها 566 جينًا تم تنظيمها لأعلى و455 جينًا تم تنظيمها لأسفل. في مجموعة المقارنة CuT_24h مقابل C_24h، تم العثور على إجمالي 2,397 جينًا مختلف التعبير، منها 1,071 جينًا تم تنظيمها لأعلى و1,326 جينًا تم تنظيمها لأسفل.
يوضح مخطط Venn للجينات المعبر عنها بشكل مختلف (الشكل 1B) بوضوح الجينات المعبر عنها بشكل فريد والمشتركة بين كل مجموعة. في كل من مجموعتي Cu و CuT، وجدنا وجود جينات من عائلة SLC (SLC6A9) وعائلة ناقلات ATP (ABC) الفرعية (ABCC10، ABCC1، ABCB1). في مجموعة CuT، وجدنا أن عائلة SLC (SLC16A4، SLC16A14، SLC22A21، SLC35B2، SLC6A9، SLC12A2) وعائلة ABC الفرعية (ABCF2) كانت موجودة. تم العثور على جينات مرتبطة بتكرار الحمض النووي والتلف في الجينات الفريدة لمجموعة CuT، مثل RFC4، RFC5، POLD3، RPA2، وRPA3.
أظهرت نتائج خريطة الحرارة للتجميع أن نمط التعبير لمجموعة CuT كان مختلفًا بوضوح عن نمط مجموعة Cu (الشكل 2).

تحليل GO

تم إثراء 120 و 208 و 85 و 236 مصطلح GO في مقابل C_4h، Cu_24h مقابل C_24h، CuT_4h مقابل C_4h، وCuT_24h مقابل C_24h، على التوالي. تم عرض أول 10 مصطلحات من المجموعات الثلاث (العملية البيولوجية، المكون الخلوي، الوظيفة الجزيئية) المدرجة في كل مجموعة من تحليلات إثراء الوظائف GO في الشكل (الشكل 3A-D). تم تحديد المصطلحات المتعلقة بالمناعة المتداخلة بين جميع المجموعات الأربعة من أعلى 30 مصطلح GO من خلال مخطط Venn الخاص بـ GO (الشكل 3E) والتي تشمل ربط أيون الزنك (GO:0008270)، نشاط الأكسيد والاختزال (GO:0016491)، ونشاط الكحول ديهيدروجيناز (NAD) (GO:0004022). العمليات المميزة والملائمة مناعياً في مجموعة CuT هي العمليات المبرمجة للموت الخلوي (GO:0006915) وإصلاح الحمض النووي (GO:0006281).
لقد اخترنا مصطلحات GO التي تحتوي على كمية كبيرة من إثراء DEGs وأهمية عالية لمراقبة تغييرات إجهاد النحاس في ظروف إجهاد النحاس ودرجات الحرارة المرتفعة في كمية DEGs، كما هو موضح في الرسم البياني (الشكل 3F). وجدنا أنه خلال عملية التعرض للنحاس، سيؤدي ارتفاع درجة الحرارة إلى تغييرات في كمية إثراء DEGs في هذه المصطلحات، والتي أظهرت اتجاهًا تصاعديًا؛ كلما زادت مدة التعرض لدرجات الحرارة المرتفعة، زاد عدد الجينات المثرية.

تحليل KEGG

تم إثراء المسارات 14 و 18 و 8 و 23 في مقابل C_4h، Cu_24h مقابل C_24h، CuT_4h مقابل C_4h، و
مجموعات CuT_24h و C_24h، على التوالي، وتظهر الرسوم البيانية الفقاعية المسارات الستة (الشكل 4A-D). وفقًا لمخطط Venn الخاص بـ KEGG (الشكل 4E)، كانت المسارات المتعلقة بالمناعة المشتركة بين مجموعة Cu ومجموعة CuT تشمل مسار تكرار الحمض النووي، مسار الوصلات الضيقة، ومسار دورة الخلية، وكانت مجموعة CuT غنية بمزيد من الجينات المعبر عنها بشكل مختلف في المسارات مقارنة بمجموعة Cu. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد مسار إصلاح الإخراج النوكليوتيدي، مسار إصلاح الإخراج الأساسي، مسار إصلاح الأخطاء، النوكليوزيد، مسار البلعمة المعتمد على FcyR، ومسار الالتهام الذاتي كمسارات فريدة لمجموعة CuT وذات صلة مناعية.
تتركز العديد من الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) في مسار الإشارات الثانوي KEGG المرتبط بالمناعة (الشكل 5AD)، بما في ذلك نظام المناعة والأمراض المناعية. تم إثراء المزيد من الجينات المعبر عنها بشكل مختلف في المسارات المتعلقة بالمناعة في مجموعة CuT مقارنة بمجموعة Cu، مما قد يشير إلى أن التعرض للنحاس عند درجات حرارة مرتفعة له تأثير أكبر على نظام المناعة ليرقات S. esculenta.

qRT-PCR للتحقق من الجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs)

قمنا بالتحقق من دقة 15 جينًا مرتبطًا بإجهاد النحاس وظروف ارتفاع درجة الحرارة باستخدام qRT-PCR، وأظهرت النتائج أن التغيرات في الطي للجينات المعبر عنها بشكل مختلف (DEGs) التي تم اكتشافها بواسطة qPCR كانت متسقة مع التغيرات في الطي التي تم تحديدها من خلال تحليلات تعبير RNA-Seq، مما يشير إلى أن نتائج تحليلات تعبير RNA-Seq كانت موثوقة (الشكل 6).

نقاش

تحليل التعبير للجينات المعبر عنها بشكل مختلف

استجابة يرقات S. esculenta للتعرض للنحاس (Cu) هي عملية معقدة تشمل مسارات تنظيمية وجينات مختلفة [21]. كشفت نتائجنا أن جينات عائلة SLC، بالإضافة إلى جينات عائلة ABC، كانت أكثر غنى في مجموعة CuT مقارنة بمجموعة Cu. بالإضافة إلى ذلك، حددنا الجينات المعبر عنها بشكل مختلف المرتبطة بعمليات تلف الحمض النووي، والإصلاح، والتكرار.
أظهر شينغ وآخرون أن عائلة SLC يمكن أن تنظم وظيفة البلعميات والخلايا التائية. تلعب دورًا مهمًا في مختلف الأمراض التي تتضمن الالتهاب والاستجابات المناعية. يمكن أن تحسن هذه الخلايا الناقلة الاستجابات المناعية، مثل تنشيط الخلايا التائية، لذا تلعب SLCs دورًا مهمًا في العملية المناعية [22].
لقد أظهرت الدراسات أن عائلة ABC تعتبر تلعب دورًا أساسيًا في الخط الأول من الدفاع الخلوي. عندما يحدث التهاب في الجسم، تقوم الجينات في عائلة ABC بتقليل الالتهاب من خلال تنظيم NF- بشكل إيجابي. مسار وتعزيز التعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات [23]. يتم التعبير عن بروتينات الناقل ABC أيضًا في مجموعة واسعة من خلايا المناعة وتعتبر حلقة وصل رئيسية بين المناعة الفطرية والمناعة التكيفية. في
الشكل 2 خريطة حرارة DEGs للتجميع الهرمي. يمثل كل عمود مجموعة، ويمثل كل صف جين. يشير اللون الأخضر إلى الأحمر إلى مستويات التعبير المنخفضة إلى العالية
في اللافقاريات، تنظم بروتينات الناقل ABCB و ABCC دخول المواد الخارجية من البيئة الخارجية وتعتبر الوسيلة الرئيسية للدفاع في اللافقاريات [24].
استنادًا إلى وظائف عائلتي ABC و SLC، نفترض أن معدل تراكم أو ذوبان أيونات النحاس في يرقات S. esculenta قد يزداد تحت درجات حرارة مرتفعة، مما يؤدي إلى استجابة مناعية أقوى. في هذه الدراسة، اختلف عدد DEGs في عائلتي SLC و ABC قبل وبعد زيادة درجة الحرارة. نحن نعتقد أن التعرض للنحاس (Cu) تحت
قد تؤدي ظروف درجات الحرارة العالية إلى تفاقم الاستجابة الالتهابية في يرقات S. esculenta.
علاوة على ذلك، في المقارنة بين مجموعة Cu ومجموعة CuT، حددنا حديثًا DEGs رئيسية أخرى غنية في مسارات متعددة في مجموعة CuT؛ على سبيل المثال، RFC4، RFC5، POLD3، RPA2، و RPA3، وتم تقليل تعبيرها. تلعب هذه الجينات دورًا رئيسيًا في تلف الحمض النووي، التكرار، والإصلاح [25-27].
الشكل 3 أ: مصطلحات GO الغنية لمجموعة Cu_4h مقابل C_4h؛ ب: مصطلحات GO الغنية لمجموعة Cu_24h مقابل C_24h؛ ج: مصطلحات GO الغنية لمجموعة CuT_4h مقابل C_4h؛ د: مصطلحات GO الغنية لمجموعة CuT_24h مقابل C_24h. تشير الإحداثيات الأفقية إلى عدد DEGs الغنية بالمصطلح؛ تشير الإحداثيات الرأسية إلى مصطلحات محددة قائمة على GO، وتمثل الألوان الثلاثة الثلاثة الأنطولوجيات. هـ: مخطط فين لمصطلحات GO، مع الأحمر والأخضر والأصفر والأزرق تمثل المجموعات المختلفة والألوان الأخرى تمثل مصطلحات GO المشتركة بين المجموعات المختلفة؛ و: مخططات خطية لمجموعات مصطلحات GO الأربعة في DEGs Cu_4h مقابل C_4h و CuT_4h مقابل C_4h، Cu_24h مقابل C_24h، و CuT_24h مقابل C_24h، مع الإحداثيات الرأسية تمثل عدد DEGs، والإحداثيات الأفقية تمثل المجموعات، والنقاط بألوان مختلفة تمثل مصطلحات GO المختلفة
تؤدي تقليل تعبير هذه الجينات، الذي نعتقد أنه بسبب زيادة الالتهاب، إلى تكرار وإصلاح الحمض النووي بشكل غير وظيفي في يرقات S. esculenta.
باختصار، نفترض أن تأثيرات التعرض للنحاس على نقل الأيونات، بالإضافة إلى تكرار الحمض النووي وإصلاحه، أقوى في يرقات S. esculenta عند درجات حرارة مرتفعة، وأن درجات الحرارة العالية قد تؤدي إلى معدلات أعلى
من التجميع أو الذوبان لأيونات النحاس في يرقات S. esculenta.

تحليل إثراء الوظائف GO

تحليل مصطلحات GO المشتركة بين مجموعتي Cu و cut

في تحليل إثراء الوظائف GO، وجدنا ثلاثة مصطلحات GO التي تشترك فيها مجموعة Cu مع مجموعة CuT، وهي ربط أيونات الزنك (GO:0008270)، والأكسيدوريدوكتاز
الشكل 4 أ: مسارات KEGG الغنية لمجموعة Cu_4h مقابل C_4h؛ ب: مسارات KEGG الغنية لمجموعة Cu_24h مقابل C_24h؛ ج: مسارات KEGG الغنية لمجموعة CuT_4h مقابل C_4h؛ : مسارات KEGG الغنية لمجموعة CuT_24h مقابل C_24h. مخطط فقاعات KEGG، مع حجم النقاط يمثل عدد DEGs والألوان تمثل الأهمية؛ الإحداثي العمودي هو اسم المسار، والإحداثي الأفقي هو نسبة DEGs إلى العدد الإجمالي لـ DEGs في المسار. هـ: مخطط فين KEGG، مع الأحمر والأخضر والأصفر والأزرق تمثل المجموعات المختلفة والألوان الأخرى تمثل المسارات المشتركة بين المجموعات المختلفة
النشاط (GO:0016491)، ونشاط ديهيدروجيناز الكحول (NAD) (GO:0004022).
أظهرت الدراسات السابقة أن أيونات الزنك تلعب دورًا مهمًا في العمليات المناعية وتنظيم الإشارات، وأن نقص أيونات الزنك يؤدي إلى خلل في العديد من الأعضاء والجهاز المناعي [28].
الأكسيدوريدوكتاز هو منظم مهم لمسارات المناعة. زيادة نشاط الأكسيدوريدوكتاز تعزز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وقد تعدل هذه المنتجات الثانوية المسارات المؤيدة للالتهاب [29].
الشكل 5 تصنيفات مسارات الإشارة KEGG من الفئة 2؛ تشير الإحداثيات الرأسية إلى نوع فئة KEGG 2، وتشير الإحداثيات الأفقية إلى عدد DEGs المقابلة. أ: مسارات الإشارة KEGG الغنية من الفئة 2 لمجموعة Cu_4h مقابل C_4h؛ ب: مسارات الإشارة KEGG الغنية من الفئة 2 لمجموعة Cu_24h مقابل C_24h؛ ج: مسارات الإشارة KEGG الغنية من الفئة 2 لمجموعة CuT_4h مقابل C_4h؛ د: مسارات الإشارة KEGG الغنية من الفئة 2 لمجموعة CuT_24h مقابل C_24h
الشكل 6 نتائج qRT-PCR و RNA-Seq لـ DEGs الرئيسية. تمثل الإحداثيات الرأسية التغير النسبي، وتمثل الإحداثيات الأفقية مدة التعرض
ديهيدروجيناز الكحول ضروري لتمثيل الكائنات الحية وتنظيم وظيفة البلعميات. يتم استخدامه بشكل أساسي لإزالة الخلايا الميتة من الجسم [30].
قد يشير إثراء هذه المصطلحات إلى أن التعرض للنحاس قد يؤدي إلى انخفاض في قدرة ربط الأيونات ونشاط الأكسيدوريدوكتاز في يرقات S. esculenta، مما قد يؤدي إلى عدم توازن في جهاز المناعة ليرقات S. esculenta أو تعزيز الالتهاب. وجدنا أيضًا أن عدد DEGs في مصطلحات ربط أيونات الزنك (GO:0008270) ونشاط الأكسيدوريدوكتاز (GO:0016491) اختلف بين مجموعة Cu ومجموعة CuT، مع زيادة في DEGs في مجموعة CuT. قد تشير هذه الاتجاهات إلى أن درجات الحرارة العالية يمكن أن تعزز الآثار الضارة للتعرض للنحاس على S. esculenta.

تحليل مصطلحات GO الفريدة في مجموعة CuT

مصطلحات GO الفريدة الغنية في مجموعة CuT مقارنة بمجموعة Cu والتي تتعلق بالمناعة تشمل موت الخلايا المبرمج (GO:0006915) وإصلاح الحمض النووي (GO:0006281).
موت الخلايا المبرمج مهم في الحفاظ على توازن الأنسجة وتقليل الالتهاب، ويمكن للكائنات الحية أن تتخلص تدريجياً من الالتهاب أو تقلله من خلال تجديد الخلايا عبر موت الخلايا المبرمج في الجسم [31]. إصلاح تلف الحمض النووي والمناعة الفطرية هما آليتان محفوظتان تلعبان دورًا في كل من الإجهاد الخلوي
الاستجابات، وقد وُجد أن إصلاح الحمض النووي مرتبط ارتباطًا وثيقًا بالالتهاب وأن الكائنات الحية يمكن أن تتحكم بفعالية في الالتهاب من خلال إصلاح الحمض النووي الخاص بها [32].
من خلال تحليل إثراء GO، تمكنا من الافتراض أن التهاب التعرض للنحاس في . يرقات esculenta أكثر حدة تحت ظروف درجات الحرارة العالية وأن يرقات S. esculenta قد تقلل الالتهاب في الجسم من خلال تسريع موت الخلايا المبرمج للخلايا التالفة بنفسها. علاوة على ذلك، قد يؤدي التعرض للنحاس عند درجات حرارة مرتفعة إلى خلل في إصلاح الحمض النووي في يرقات S. esculenta، مما يؤثر على وظيفتها المناعية وقد يؤدي إلى التهاب أكثر حدة.

تحليل إثراء الوظائف KEGG تحليل المسارات KEGG المشتركة بين مجموعتي Cu و CuT

كانت المسارات التي وجدت أنها مشتركة بين مجموعتي Cu و CuT وذات صلة مناعية من خلال تحليل إثراء الوظائف KEGG هي مسار تكرار الحمض النووي، ومسار الوصلات الضيقة، ومسار دورة الخلية.
يرتبط تكرار الحمض النووي بالمناعة الفطرية في الحيوانات، وبعض الأخطاء المناعية الفطرية ناتجة عن طفرات في عوامل تكرار الحمض النووي. الحمض النووي
مسار النسخ هو مسار إشارة معقد يلعب دورًا مهمًا في تنظيم إصلاح تلف الحمض النووي وتحفيز موت الخلايا المبرمج. في بحثنا، من المحتمل أن يكون الثراء الكبير لمسار نسخ الحمض النووي في يرقات S. esculenta ناتجًا عن التعرض للنحاس مما يؤدي إلى أخطاء في نسخ الحمض النووي في يرقات S. esculenta، مما يؤدي إلى اضطرابات في المناعة الفطرية في يرقات S. esculenta. وقد وجدت الأبحاث أن الالتهاب يمكن أن يزيد من تلف الجهاز العصبي من خلال تدهور بروتينات الوصلات الضيقة. هناك تفاعل بين بروتينات الوصلات الضيقة والالتهاب، وحماية هذه البروتينات يمكن أن تخفف أيضًا من الاستجابات الالتهابية، مما يقلل من إمكانية ضعف الوظيفة العصبية. أظهرت الجينات في مسار الوصلات الضيقة، مثل TUBA1C و MICALL2، تعبيرًا منخفضًا، ونفترض أن يرقات S. esculenta تمر بالتهاب داخل الجسم بعد التعرض للنحاس وتدهور بروتينات الوصلات الضيقة. نشاط دورة الخلية مرتبط بالوظيفة المناعية، وغالبًا ما يشير عدم تنظيم دورة الخلية إلى وجود خلايا مناعية غير طبيعية. يمكن لبعض منظمات دورة الخلية تعديل دورة الخلية لتحقيق تأثيرات مناعية، وقد تكون برامج دورة الخلية مرتبطة بالسلوك المناعي من خلال آليات يمكن أن تؤثر على المناعة. وجدنا انخفاضًا في تعبير جين CDK1، وهو كيناز معتمد على بروتين دورة الخلية، في نتائج النسخ الجيني لدينا. يؤثر CDK1 على نشاطه التحفيزي من خلال تفاعلات فريدة مع مجمعات بروتين دورة الخلية المختلفة، مما يضمن عدم تعطل تقدم دورة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يلعب CDK1 دورًا تنظيميًا كبيرًا في تعديل استجابات المناعة الخلوية المختلفة أثناء الالتهاب. لذلك، فإن انخفاض تعبير جين CDK1 بعد تحفيز النحاس في يرقات S. esculenta يشير على الأرجح إلى وجود شذوذ في دورة الخلية.
في الختام، قد يكون تفعيل مسار تكرار الحمض النووي، ومسار الوصلات الضيقة، ومسار دورة الخلية بعد التعرض للنحاس مرتبطًا بوجود الالتهاب في يرقات S. esculenta. كما لاحظنا توزيعًا مختلفًا للجينات المعبر عنها بشكل مختلف عبر المسارات الثلاثة المشتركة بين مجموعتي النحاس والنحاس المعالج، مع زيادة عدد الجينات المعبر عنها بشكل مختلف في مجموعة النحاس المعالج. تشير هذه الاتجاهات إلى أن التعرض للنحاس في ظل ظروف درجات الحرارة المرتفعة قد يزيد من الآثار السلبية على . إسكولنتا.

تحليل المسارات الفريدة في KEGG في مجموعة CuT

أظهر مقارنة مجموعة النحاس (Cu) مع مجموعة النحاس المعدل (CuT) أن المسارات الفريدة لمجموعة النحاس المعدل المتعلقة بالمناعة كانت مسار إصلاح الإخراج النووي، مسار إصلاح الإخراج القاعدي، مسار البلعمة المعتمد على FcyR، ومسار الالتهام الذاتي.
إصلاح الإخراج النووي فريد من نوعه لأنه يتعرف على الأضرار المقطوعة في الحمض النووي ويزيلها و
المشاركة في إصلاح الحمض النووي، والذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالمناعة الذاتية والالتهاب الموجود في الذات [39-41]. إصلاح الإخراج القاعدي (BER) هو المسار الرئيسي للخلايا حقيقية النواة لحل الأضرار الناتجة عن قاعدة مفردة، مما يمكّن من إصلاح الأضرار في الحمض النووي بسرعة وكفاءة [42]. لذلك، استنتجنا أن إثراء الجينات المعبر عنها بشكل مختلف في مسار إصلاح الإخراج النووي ومسار إصلاح الإخراج القاعدي كان على الأرجح ناتجًا عن التعرض للنحاس عند درجات حرارة مرتفعة، مما أدى إلى مزيد من تعطيل عملية تكرار حمض نووي لليرقات من S. esculenta. البلعمة هي عملية بيولوجية؛ عادة ما تكون البلعمة مصحوبة بالالتهاب؛ البلعمة أساسية للاستجابة المناعية وتضمن أن الجسم يزيل مسببات الأمراض والخلايا المبرمجة للموت. تنشيط البلعمة بواسطة FcyR يحفز نشاط الفوسفوليباز D (PLD) وينشط غشاء البلازما للماكروفاج لإنتاج حمض الفوسفاتييد (PA)، مما يزيد من كفاءة البلعمة. قد يؤدي تنشيط مسار البلعمة في يرقات S. esculenta إلى تفاقم الالتهاب في الجسم الحي بسبب التعرض للنحاس عند درجات حرارة مرتفعة، وتكون البلعمة مطلوبة لإزالة الخلايا التالفة في الجسم الحي وبالتالي تثبيط الالتهاب. الالتهام الذاتي مرتبط بالعديد من العمليات البيولوجية الأساسية، والتي تشمل المناعة، وتطور الخلايا، وتمايز الخلايا من خلال تنظيم الالتهاب. من خلال الخلايا الملتهمة ذاتياً، يمكن القضاء على المكونات التالفة أو الضارة. وجدنا أن جيني Prkcd و Sqstm1 كانا غنيين ومُعززين في هذا المسار. لذلك، نفترض أن التعرض للنحاس عند درجات حرارة مرتفعة والالتهاب في يرقات S. esculenta يؤديان إلى زيادة عدد الخلايا التالفة في الجسم وزيادة الالتهام الذاتي، مما يسرع من إزالة الخلايا التالفة من الجسم وبالتالي يقلل من الاستجابة الالتهابية.
في الختام، أدت درجات الحرارة المرتفعة إلى زيادة سمية أيونات النحاس المعدنية، مما أدى بدوره إلى تلف الحمض النووي في يرقات S. esculenta وتداخل مع قدرة اليرقات على تكرار وإصلاح الحمض النووي. كان التعرض للنحاس في ظل ظروف درجات الحرارة المرتفعة قادرًا على التسبب في التهاب أكثر حدة في يرقات S. esculenta، مما خفف من الاستجابة الالتهابية من خلال تعزيز الالتهام الذاتي والبلعمة في الكائن الحي.

الخاتمة

استخدمنا تسلسل النسخ الجيني للتحقيق في تأثير النحاس التعرض على الاستجابات المناعية لـ يرقات S. esculenta تحت ظروف درجات الحرارة العالية. من خلال تحليل (DEGs ومسارات الإثراء الوظيفي، لاحظنا أولياً أن مجموعة CuT أظهرت اضطراباً أكثر وضوحاً في نقل الأيونات بين الخلايا، ووظيفة المناعة، وتكرار الحمض النووي وإصلاحه مقارنة بمجموعة Cu فقط. من المحتمل أن يتداخل هذا الاضطراب مع العمليات الفسيولوجية الطبيعية ليرقات S. esculenta، مما قد يؤدي إلى
لزيادة الالتهاب. كانت الاستجابات الالتهابية أكثر حدة في مجموعة CuT، كما يتضح من زيادة تلف الحمض النووي واستجابة المناعة الأقوى التي لوحظت في اليرقات. تسهم هذه الدراسة في سد الفجوة المعرفية بشأن التأثيرات المشتركة لدرجة الحرارة والمعادن الثقيلة على يرقات S. esculenta، مقدمة رؤى جديدة حول كيفية تفاقم تفاعلاتها للمخاطر الصحية على هذه الكائنات. علاوة على ذلك، توفر نتائجنا مرجعًا قيمًا لفهم تحديات البقاء والتكاثر التي تواجهها الرخويات الأخرى في ظروف بيئية مماثلة. في سياق ارتفاع درجات الحرارة العالمية وزيادة تلوث المعادن الثقيلة، تعتبر هذه الدراسة دليلًا عمليًا مهمًا لتربية S. esculenta وغيرها من الرخويات. ستساعد البيانات المرجعية والنظريات التي نقدمها مؤسسات تربية الأحياء المائية أو الأفراد على فهم هذه التحديات والتعامل معها بشكل أفضل، مما يعزز التنمية المستدامة للصناعات ذات الصلة.

الاختصارات

تسلسل RNA تسلسل RNA
RT-qPCR تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي
جينات التعبير المختلفة الجينات المعبر عنها بشكل مختلف
اذهب علم الجينات
كيج موسوعة كيوتو للجينات والجينومات

معلومات إضافية

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi.or .
المادة التكميلية 1
المادة التكميلية 2

شكر وتقدير

غير قابل للتطبيق.

مساهمات المؤلفين

كتب زهاو. ي. المخطوطة الأصلية؛ قام تشانغ. د.، تشنغ. ي.، وزانغ. ي. بتحليل البيانات؛ قدم وانغ. ي.، باو. إكس.، وسون. ج. المساعدة في البرمجيات؛ نظم فنغ. ي. وليو. إكس. الرسوم البيانية والجداول؛ قدم لي. ز.، ليو. إكس.، ويانغ. ج. أفكار البحث وراجعوا المخطوطة؛ وقد راجع جميع المؤلفين ووافقوا على المخطوطة.

تمويل

تم دعم هذا البحث من قبل الصندوق المخصص لنظام أبحاث تكنولوجيا الزراعة الحديثة (CARS-49) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة شاندونغ (رقم ZR2019BC052).

توفر البيانات

المجموعات البيانية التي تم إنشاؤها وتحليلها خلال الدراسة الحالية متاحة في مستودع NCBI، رقم الوصول SRR19578100، SRR19578102، SRR19578103، SRR19578104، SRR19578105، SRR19578106، SRR19578107، SRR19578108، SRR19578109، SRR19578110، SRR19578111، SRR19578112، SRR19578113، SRR19578114، SRR31864754، SRR31864755، SRR31864756، SRR31864757، SRR31864758، SRR31864759 على الرابط التالي: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PRJNA844162%26;o=library_name_s%3Aa.

الإعلانات

تمت مراجعة البروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات في جامعة لودونغ (رقم البروتوكول: LDU-IRB20210308NXY). تم الإبلاغ عن الدراسة الحالية وفقًا لتوصيات إرشادات ARRIVE لأبحاث الحيوان. تم تنفيذ الطريقة والعملية وفقًا للإرشادات واللوائح ذات الصلة.
غير قابل للتطبيق.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
تاريخ الاستلام: 17 ديسمبر 2024 / تاريخ القبول: 28 فبراير 2025
تم النشر عبر الإنترنت: 17 مارس 2025

References

  1. Bhuyan MS, Haider SMB, Meraj G, Bakar MA, Islam MT, Kunda M, et al. Assessment of heavy metal contamination in beach sediments of Eastern St. Martin’s Island, Bangladesh: implications for environmental and human health risks[J]. Water. 2023;15:2494.
  2. Ali MM, Ali ML, Bhuyan MS, Islam MS, Rahman MZ, Alam MW, et al. Spatiotemporal variation and toxicity of trace metals in commercially important fish of the tidal Pasur river in Bangladesh[J]. Environ Sci Pollut Res. 2022;29:40131-45.
  3. Wang , Wang , Jiang , Jordan RW, Gu -G. Bioenrichment preference and human risk assessment of arsenic and metals in wild marine organisms from Dapeng (Mirs) Bay, South China Sea[J]. Mar Pollut Bull. 2023;194:115305.
  4. Sfakianakis DG, Renieri E, Kentouri M, Tsatsakis AM. Effect of heavy metals on fish larvae deformities: a review[J]. Environ Res. 2015;137:246-55.
  5. Al-Ghussain L. Global warming: review on driving forces and mitigation[J]. Environ Prog Sustain Energy. 2019;38:13-21.
  6. Bethke K, Kropidłowska K, Stepnowski P, Caban M. Review of warming and acidification effects to the ecotoxicity of pharmaceuticals on aquatic organisms in the era of climate change[J]. Sci Total Environ. 2023;877:162829.
  7. Ren J, Liu S, Zhang Q, Zhang Z, Shang S. Effects of cadmium exposure on haemocyte immune function of clam Ruditapes philippinarum at different temperatures[J]. Mar Environ Res. 2024;195:106375.
  8. Malhotra N, Ger T-R, Uapipatanakul B, Huang J-C, Chen KH-C, Hsiao C-D. Review of copper and copper nanoparticle toxicity in fish[J]. Nanomaterials. 2020;10:1126.
  9. Wang Y, Liu X, Wang W, Sun G, Feng Y, Xu X, et al. The investigation on stress mechanisms of Sepia esculenta larvae in the context of global warming and ocean acidification[J]. Aquaculture Rep. 2024;36:102120.
  10. Gong H, Li C, Zhou Y. Emerging global ocean deoxygenation across the 21st century[J]. Geophys Res Lett. 2021;48:e2021GL095370.
  11. Liu X, Bao X, Yang J, Zhu X, Li Z. Preliminary study on toxicological mechanism of golden cuttlefish (Sepia esculenta) larvae exposed to Cd[J]. BMC Genomics. 2023;24:503.
  12. García-Fernández P, Prado-Alvarez M, Nande M, De La Garcia D, Perales-Raya C, Almansa E, et al. Global impact of diet and temperature over aquaculture of Octopus vulgaris paralarvae from a transcriptomic approach[J]. Sci Rep. 2019;9:10312.
  13. Zapata M, Tanguy A, David E, Moraga D, Riquelme C. Transcriptomic response of Argopecten purpuratus post-larvae to copper exposure under experimental conditions[J]. Gene. 2009;442:37-46.
  14. Xu M, Jiang L, Shen K-N, Wu C, He G, Hsiao C-D. Transcriptome response to copper heavy metal stress in hard-shelled mussel (Mytilus coruscus)[J]. Genomics Data. 2016;7:152-4.
  15. Liu Y, Chen L, Meng F, Zhang T, Luo J, Chen S, et al. The effect of temperature on the embryo development of cephalopod Sepiella japonica suggests crosstalk between autophagy and apoptosis[J]. Int J Mol Sci. 2023;24:15365.
  16. Liu X, Li Z, Li Q, Bao X, Jiang L, Yang J. Acute exposure to polystyrene nanoplastics induced oxidative stress in Sepia esculenta larvae[J]. Aquaculture Rep. 2024;35:102004.
  17. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated Estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biol. 2014;15:550.
  18. Li Z, Ndandala CB, Guo Y, Zhou Q, Huang C, Huang H, et al. Impact of IGF3 stimulation on spotted scat (Scatophagus argus) liver: implications for a role in ovarian development. Agric Commun. 2023;1:100016.
  19. Liu X, Li Z, Wu W, Liu Y, Liu J, He Y, et al. Sequencing-based network analysis provides a core set of gene resources for Understanding kidney immune response against Edwardsiella tarda infection in Japanese flounder[J]. Fish Shellfish Immunol. 2017;67:643-54.
  20. Wang Y, Chen X, Xu X, Yang J, Liu X, Sun G, et al. Weighted gene co-expression network analysis based on stimulation by lipopolysaccharides and polyinosinic:polycytidylic acid provides a core set of genes for Understanding hemolymph immune response mechanisms of Amphioctopus fangsiao[J]. Animals. 2023;14:80.
  21. Bao X, Li Y, Liu X, Feng Y, Xu X, Sun G, et al. Effect of acute Cu exposure on immune response mechanisms of golden cuttlefish (Sepia esculenta)[J]. Fish Shellfish Immunol. 2022;130:252-60.
  22. Sheng L, Luo Q, Chen L. Amino acid solute carrier transporters in inflammation and autoimmunity[J]. Drug Metab Dispos. 2022;50:1228-37.
  23. Luo S-S, Chen X-L, Wang A-J, Liu Q-Y, Peng M, Yang C-L, et al. Genome-wide analysis of ATP-binding cassette (ABC) transporter in Penaeus vannamei and identification of two ABC genes involved in immune defense against Vibrio parahaemolyticus by affecting NF-kB signaling pathway[J]. Int J Biol Macromol. 2024;262:129984.
  24. Luckenbach T, Epel D. ABCB- and ABCC-type transporters confer multixenobiotic resistance and form an environment-tissue barrier in bivalve gills[J]. Am J Physiology-Regulatory Integr Comp Physiol. 2008;294:R1919-29.
  25. Cui K, Qin L, Tang X, Nong J, Chen J, Wu N, et al. A single amino acid substitution in RFC4 leads to endoduplication and compromised resistance to DNA damage in Arabidopsis thaliana[J]. Genes. 2022;13:1037.
  26. Murga M, Lecona E, Kamileri I, Díaz M, Lugli N, Sotiriou SK, et al. POLD3 is haploinsufficient for DNA replication in mice[J]. Mol Cell. 2016;63:877-83.
  27. Elmayan T, Proux F, Vaucheret H. Arabidopsis RPA2: A genetic link among transcriptional gene silencing, DNA repair, and DNA replication[J]. Curr Biol. 2005;15:1919-25.
  28. Li T, Jiao R, Ma J, Zang J, Zhao G, Zhang T. Zinc binding strength of proteins dominates zinc uptake in Caco-2 cells[J]. RSC Adv. 2022;12:21122-8.
  29. Abou-Hamdan A, Mahler R, Grossenbacher P, Biner O, Sjöstrand D, Lochner M, et al. Functional design of bacterial superoxide:quinone oxidoreductase[J]. Biochim Et Biophys Acta (BBA) – Bioenergetics. 2022;1863:148583.
  30. Mahida RY, Lax S, Bassford CR, Scott A, Parekh D, Hardy RS, et al. Impaired alveolar macrophage -hydroxysteroid dehydrogenase type 1 reductase activity contributes to increased pulmonary inflammation and mortality in sepsis-related ARDS[J]. Front Immunol. 2023;14:1159831.
  31. Arienti S, Barth ND, Dorward DA, Rossi AG, Dransfield I. Regulation of apoptotic cell clearance during resolution of inflammation[J]. Front Pharmacol. 2019;10:891.
  32. Shah A, Bennett M. Controlling inflammation through DNA damage and repair[J]. Circul Res. 2016;119:698-700.
  33. Willemsen M, Staels F, Gerbaux M, Neumann J, Schrijvers R, Meyts I, et al. DNA replication-associated inborn errors of immunity[J]. J Allergy Clin Immunol. 2023;151:345-60.
  34. Zhao B, Yin Q, Fei Y, Zhu J, Qiu Y, Fang W, et al. Research progress of mechanisms for tight junction damage on blood-brain barrier inflammation[J]. Arch Physiol Biochem. 2022;128:1579-90.
  35. Li J, Stanger BZ. Cell cycle regulation Meets tumor immunosuppression[J]. Trends Immunol. 2020;41:859-63.
  36. Bonelli M, La Monica S, Fumarola C, Alfieri R. Multiple effects of CDK4/6 Inhibition in cancer: from cell cycle arrest to immunomodulation[J]. Biochem Pharmacol. 2019;170:113676.
  37. Jones MC, Askari JA, Humphries JD, Humphries MJ. Cell adhesion is regulated by CDK1 during the cell cycle[J]. J Cell Biol. 2018;217:3203-18.
  38. Yamamura M, Sato Y, Takahashi K, Sasaki M, Harada K. The cyclindependent kinase pathway involving CDK1 is a potential therapeutic target for cholangiocarcinoma[J]. Oncol Rep. 2020;43:306-17.
  39. Kuper J, Kisker C. At the core of nucleotide excision repair[J]. Curr Opin Struct Biol. 2023;80:102605.
  40. Li W, Jones K, Burke TJ, Hossain MA, Lariscy L. Epigenetic regulation of nucleotide excision repair[J]. Front Cell Dev Biology. 2022;10:847051.
  41. Cohen I. DNA damage talks to inflammation[J]. Cytokine Growth Factor Rev. 2017;33:35-9.
  42. Raper AT, Maxwell BA, Suo Z. Dynamic processing of a common oxidative DNA lesion by the first two enzymes of the base excision repair pathway[J]. J Mol Biol. 2021;433:166811.
  43. Tanguy E, Tran Nguyen AP, Kassas N, Bader M-F, Grant NJ, Vitale N. Regulation of phospholipase D by Arf6 during FcyR-mediated phagocytosis[J]. J Immunol. 2019;202:2971-81.
  44. Huang F, Lu X, Kuai L, Ru Y, Jiang J, Song J, et al. Dual-site biomimetic Cu/ZnMOF for atopic dermatitis catalytic therapy via suppressing FcyR-mediated phagocytosis[J]. J Am Chem Soc. 2024;146:3186-99.
  45. Hortová-Kohoutková M, Tidu F, De Zuani M, Šrámek V, Helán M, Frič J. Phagocytosis-inflammation crosstalk in sepsis: new avenues for therapeutic intervention[J]. Shock. 2020;54:606-14.
  46. Shao B-Z, Yao Y, Zhai J-S, Zhu J-H, Li J-P, Wu K. The role of autophagy in inflammatory bowel disease[J]. Front Physiol. 2021;12:621132.
  47. Lee J, Kim HS. The role of autophagy in eosinophilic airway inflammation[J]. Immune Netw. 2019;19:e5.

ملاحظة الناشر

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
  1. *المراسلة:
    زان لي
    lizanlxm@163.com
    شيوميي ليو
    xiumei0210@163.com
    جيانمين يانغ
    ladderup@126.com
    كلية مصايد الأسماك، جامعة لودونغ، يانتاي 264025، الصين
    كلية علوم الحياة، جامعة يانتاي، يانتاي 264005، الصين
    مركز رصد ومراقبة المصايد البحرية والتخفيف من المخاطر، رشان 264500، الصين

Journal: BMC Genomics, Volume: 26, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-025-11418-y
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40097976
Publication Date: 2025-03-17

Comparative transcriptome analysis reveals differences in immune responses to copper ions in Sepia esculenta under hightemperature conditions

Yancheng Zhao , Deyuan Chang , Yanxuan Zheng , Yuwei Zhang , Yongjie Wang , Xiaokai Bao , Guohua Sun , Yanwei Feng , Zan Li , Xiumei Liu and Jianmin Yang

Abstract

Sepia esculenta is one of the most abundant extant squid populations in Southeast Asia and is of interest due to its rapid reproductive rate and high commercial value. In recent years, with the rapid development of industrialization, issues such as global warming and heavy metal pollution in the oceans have emerged, posing a serious threat to the life activities of marine organisms. In this study, we used transcriptomic techniques to investigate the differences in Cu exposure immune responses in S . esculenta larvae under different temperature conditions. The enrichment of solute carrier family (SLC) genes and genes related to DNA replication and damage was significantly higher in the CuT group than in the Cu group. Functional enrichment analysis revealed that the FcyR-mediated phagocytosis and autophagy pathways were enriched in the CuT group. Based on the analysis of differentially expressed genes (DEGs) and functional enrichment results, we can preliminarily infer that the CuT group caused more severe disruption of intercellular ion transport and DNA replication and repair in larvae compared to the Cu group. This may have further interfered with the normal physiological activities of S. esculenta larvae. Overall, at high temperatures, Cu exposure induces a more intense inflammatory response. The results of this study provide a theoretical foundation for researchers to further understand the effects of environmental factors on the immunity of S. esculenta larvae, as well as preliminary insights into the enhanced toxic effects of metallic copper on aquatic organisms under high-temperature conditions.

Keywords Transcriptome, Cu co-exposure, Heavy metal, Immunity, Sepia esculenta

Introduction

As industrialization progresses, heavy metal pollution in the sea is becoming more and more serious [1]. Recent studies have demonstrated that heavy metals can severely influence the growth and development of marine organisms, inducing tissue damage and immune dysfunction [2]. Harmful effects of heavy metals on aquatic organisms include tissue damage and impairment of the immune system [3]. For example, in fish, high concentrations of heavy metals significantly increase the rate of malformations and morbidity, and previous studies have shown that heavy metal enrichment has serious effects on molluscan physiological processes such as immunity and metabolism [4].
The rapid development of industrialization has not only led to the intensification of heavy metal pollutions but has also increased the rate of global warming [5]. Previous studies have shown that temperature induces changes in the toxicity of heavy metals to marine organisms [6]. Ren et al. found that high temperatures enhanced the intoxication of heavy metals to Ruditapes philippinarum, significantly inhibiting its growth and development [7]. Malhotra et al. showed that temperature would affect the toxicity induced by Cu exposure. Compared with low temperature ( ), the dissolution rate and aggregation of copper ions were enhanced at high temperature ( ) [8]. However, the effect of high temperatures on Cu exposure toxicity has not been thoroughly studied in mollusks. Therefore, understanding whether high temperatures have an effect on cop-per-induced toxicity is important for mollusk research, aquaculture, and the environmentally sound management of marine ecosystems.
S. esculenta is one of the most abundant squid populations surviving in Southeast Asia, with tasty meat, high protein content, and rapid reproduction [9], Therefore, it quickly attracted the attention of scholars. As a result of the degradation of the marine environment and the largescale exploitation of marine resources by human beings, the population of S. esculenta has declined drastically, and in recent years, it has even become an endangered species [10]. Usually, S. esculenta is cultured in captivity in shallow coastal waters. High concentrations of heavy metals and high temperatures along the ocean coast have a profound effect on the growth and development of . esculenta [11]. Therefore, it is essential to understand the consequences of high temperatures and heavy metals on S. esculenta.
RNA sequencing technology has developed rapidly due to its high throughput and accuracy, and it has been widely used in recent years to study the immune mechanisms of aquatic organisms. Examples include the use of RNA-Seq to study the molecular response of Cu to Argopecten purpuratus larvae, as well as the study of the
molecular mechanisms of high temperature on Octopus vulgaris and the response of the transcriptome to Cu exposure in Mytilus coruscus [12-14]. Therefore, we can use RNA-Seq to preliminarily explore the toxicological mechanism of Cu exposure in S. esculenta larvae at high temperature.
In our study, we used high-throughput transcriptome sequencing to explore differences in Cu exposure immunity in S. esculenta larvae at different temperatures. By GO and KEGG functional enrichment analysis, it was found that high temperature significantly affected the Cu exposure immune response and induced a more intense inflammatory response in S. esculenta larvae. At the same time, high temperatures can induce more severe DNA damage and ion transport disorders. Our findings provide a basis for further exploration of differences in Cu exposure imaginal responses in S. esculenta larvae under different temperature conditions and provide more scientific breeding suggestions for golden squid and cephalopods.

Materials and methods

Collection of S. esculenta larvae and stress experiments

During the breeding season of S. esculenta, captures were made from the Yellow Sea area to obtain wild parents(Active and apparently healthy adult S. esculenta (manth length: ; weight: ) were collected from the Yellow Sea near Qingdao, China.), and the captured wild parents were placed in workshop pools (Approximately 8 m long, 1 m wide and 1.2 m high, made of concrete) for transient rearing. After a week, the female parents began to lay eggs, with the collected eggs placed in moving seawater and temporarily raised until they hatched. At the same time, S. esculenta eggs hatched into larvae and were transferred to white buckets ( 100 L capacity). The larvae were divided into three groups including control (Group C), normal temperature Cu exposure (Cu Group), and high temperature Cu exposure (CuT Group), with 100 S. esculenta larvae in each group (mantle length (body size) ; weight ). The control group was grown in normal seawater (water temperature of , dissolved oxygen of , pH of , salinity of , and continuous oxygenation) for 24 h . Anhydrous was added to seawater to achieve a Cu concentration of in the Cu group and the CuT group(S. esculenta larvae were too small to measure Cu content in the body). The CuT group raised the temperature to , as determined by preliminary experiments and references [15]. Finally, during the experiment, . esculenta larvae were collected at 0 h (C_0h), 4 h (C_4h), and in the control group, at and in the Cu group, and at 4 h (CuT_4h)
and 24 h (CuT_24h) in the CuT group. All samples were stored in liquid nitrogen tanks until RNA extraction.

RNA extraction, library construction and sequencing

RNA extraction, library construction, and sequencing were performed by Beijing Novozymes Technology Co., Ltd., which used the TRIzol method for RNA extraction. The RNA samples were then subjected to stringent quality control by the Agilent 2100 bioanalyzer. The kit used for library construction was the NEBNext Ultra ™ RNA Library Prep Kit for Illumina . Nine larvae were selected from each group, and three were randomly selected to form one replicate, for a total of three replicates. We sequenced S. esculenta larval RNA using the Illumina NovaSeq 6000 platform (Illumina, USA) [16].

Screening of differential genes and annotation of gene functions

First, we removed some raw reads, reads containing adapter sequences, and more than of unidentified bases, as well as low-quality reads, and mapped the clean reads to the S. esculenta reference genome using HISAT2 software (unpublished). We used the DESeq2 method to identify DEGs and compared these genes with SwissProt, KEGG, GO, and other databases to find out their functions and used them for functional enrichment analysis. In our study, the -value threshold was set to [17, 18].

Enrichment analysis

We performed GO and KEGG analyses of genes using the DAVID bioinformatics resource (https://david.ncifcr f.gov/tools.jsp). Terms and pathways with -values were selected to be used in subsequent analyses.

Quantitative RT-PCR analysis

In this experiment, we screened 15 DEGs and designed primers using Primer Premier 5.0 (Table S1). Since the expression level of -actin tends to be stable, we chose the -actin gene as the reference gene for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction. qRTPCR was performed according to Liu et al. (2017) and Wang et al. (2023). Then, qRT-PCR was conducted in a solution containing 10 ng of template cDNA and SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa) using a LightCycler 480 at for 5 min pre-incubation, followed by 45 cycles of for 15 s and for 45 s . Finally, we analyzed the melting curve to detect single amplification. Fluorescent signal accumulation was recorded during the for 45 s phase of each cycle using the LightCycler 480. The comparative Ct method was used to calculate the relative quantities of the target genes expressed as fold variation over -actin. Quantitative RT-PCR was applied for the expression verification of key and hub genes in this investigation [19, 20].

Results

Transcriptome sequencing results

Sequencing of healthy, copper stress, and elevated temperature conditions copper stress S. esculenta larvae using RNA-seq methods; specific sequencing results are shown in Table S2. On average, of clean reads were mapped to our reference genome. The structure and function of unigenes were annotated into several databases, including NR, SwissProt, KEGG, GO, and PFAM.

Analysis of DEGs

By means of a dynamic multi-group difference scatter plot (Fig. 1A), we found that a total of 787 DEGs were detected in the vs. C_4h comparison group. Of
Fig. 1 A: Dynamic multi-group difference scatter plot of the distributional expression of DEGs, with numbers representing different groups, red dots representing up-regulation of DEGs, and green dots representing down-regulation of DEGs, and each dot representing a gene; B: Venn diagram of DEGs, with blue, green, yellow, and red representing DEGs in different groups, and other different colors representing the number of shared genes between different groups
these, 463 were up-regulated genes and 324 were downregulated genes. A total of 1,418 DEGs were detected in the vs. C_24h comparison group, of which 680 were up-regulated genes and 738 were down-regulated genes. A total of 1,021 DEGs were detected in the CuT_4h vs. C_4h comparator group, with 566 up-regulated genes and 455 down-regulated genes. A total of 2,397 DEGs were found in the CuT_24h vs. C_24h comparison group, of which 1,071 were up-regulated and 1,326 were down-regulated.
The DEGs Venn diagram (Fig. 1B) clearly shows the unique and shared DEGs between each group. In both the Cu and CuT groups, we found the presence of genes from the SLC family (SLC6A9) and the ATP-binding cassette(ABC) subfamily (ABCC10, ABCC1, ABCB1). In the CuT group, we found that the SLC family (SLC16A4, SLC16A14, SLC22A21, SLC35B2, SLC6A9, SLC12A2) and the ABC subfamily (ABCF2) were present. Genes related to DNA replication and damage were found in genes unique to the CuT group, such as RFC4, RFC5, POLD3, RPA2, and RPA3.
The results of the clustering heat map showed that the expression pattern of the CuT group was obviously not the same as that of the Cu group (Fig. 2).

GO analysis

120, 208, 85, and 236 GO terms were enriched in the vs. C_4h, Cu_24h vs. C_24h, CuT_4h vs. C_4h, and CuT_24h vs. C_24h groups, respectively. The first 10 terms of the three clusters (biological process, cellular component, molecular function) included in each set of GO functional enrichment analyses are shown in the figure (Fig. 3A-D). Immunity-related overlapping terms between all four groups of the top 30 GO terms were identified through the GO Venn diagram (Fig. 3E) as including zinc ion binding (GO:0008270), oxidoreductase activity (GO:0016491), and alcohol dehydrogenase (NAD) activity (GO:0004022). Unique and immunologically relevant in the CuT group are apoptotic processes (GO:0006915) and DNA repair (GO:0006281).
We selected the GO terms with a large amount of DEGs enrichment and high significance to observe their copper stress and elevated temperature conditions copper stress changes in the amount of DEGs, as shown in the line chart (Fig. 3F). We found that during the Cu exposure process, the increase in temperature would lead to changes in the amount of DEGs enrichment in these terms, which showed an upward trend; the longer the high-temperature duration, the greater the number of enriched genes.

KEGG analysis

14, 18, 8, and 23 pathways were enriched in the vs. C_4h, Cu_24h vs. C_24h, CuT_4h vs. C_4h, and
CuT_24h vs. C_24h groups, respectively, and the bubble plots show the six pathways (Fig. 4A-D). According to the KEGG Venn diagram (Fig. 4E), the immune-related pathways shared by the Cu group and CuT group included the DNA replication pathway, tight junction pathway, and cell cycle pathway, and the CuT group was enriched with more DEGs in the pathways compared to the Cu group. In addition, the nucleotide excision repair pathway, base excision repair pathway, mismatch repair pathway, nucleoside, FcyR-mediated phagocytosis pathway, and autophagy pathway were identified as unique to the CuT group and immunologically relevant.
Many DEGs are concentrated in the secondary KEGG signaling pathway associated with immunity (Fig. 5AD), including the immune system and immune diseases. More DEGs were enriched in immune-related pathways in the CuT group than in the Cu group, which may imply that Cu exposure at high temperatures has a greater impact on the immune system of S. esculenta larvae.

qRT-PCR to verify DEGs

We verified the accuracy of 15 genes related to copper stress and elevated temperature conditions copper stress genes using qRT-PCR, and the results showed that the folding changes of DEGs detected by qPCR were consistent with the folding changes determined by RNA-Seq expression analyses, suggesting that the results of the RNA-Seq expression analyses were reliable (Fig. 6).

Discussion

Expression analysis of DEGs

The response of S. esculenta larvae to copper (Cu) exposure is a complex process involving various regulatory pathways and genes [21]. Our findings revealed that SLC family genes, as well as ABC family genes, were more highly enriched in the CuT group compared to the Cu group. Additionally, we identified DEGs associated with DNA damage, repair, and replication processes.
Sheng et al. demonstrated that the SLC family can regulate the function of macrophages and T cells. It plays an important role in various diseases involving inflammation and immune responses. These transporter cells can improve immune responses, such as T-cell activation, so SLCs play an important role in the immune process [22].
It has been shown that the ABC family is considered to play an essential role in the first line of cellular defense. When inflammation occurs in the body, genes in the ABC family reduce inflammation by positively regulating the NF- pathway and promoting the expression of antimicrobial peptides [23]. ABC transporter proteins are also expressed in a wide range of immune cells and are a key link between innate and adaptive immunity. In
Fig. 2 DEGs heat map of hierarchical clustering. Each pillar represents a group, and each row represents a gene. Green to red indicates low to high expression levels
invertebrates, ABCB and ABCC transporter proteins regulate the entry of exogenous substances from the external environment and are the main mode of defense in invertebrates [24].
Based on the functions of the ABC and SLC families, we hypothesize that the accumulation or dissolution rate of copper ions in S. esculenta larvae may increase under elevated temperatures, leading to a stronger immune response. In this study, the number of DEGs in the SLC and ABC families varied before and after the temperature increase. We speculate that copper ( Cu ) exposure under
high-temperature conditions may exacerbate the inflammatory response in S. esculenta larvae.
Furthermore, in the comparison of the Cu group with the CuT group, we newly identified other key DEGs enriched in multiple pathways in the CuT group; for example, RFC4, RFC5, POLD3, RPA2, and RPA3, and their expressions were down-regulated. These genes play a key role in DNA damage, replication, and repair [25-27]. The
Fig. 3 A: Enriched GO terms for the Cu_4h vs. C_4h group; B: Enriched GO terms for the Cu_24h vs. C_24h group; C: Enriched GO terms for the CuT_4h vs. C_4h group; D: Enriched GO terms for the CuT_24h vs. C_24h group. The horizontal coordinate indicates the number of DEGs enriched to the term; the vertical coordinates denote specific GO-based terms, and the three colors represent the three ontologies. E: Venn diagram of GO, with red, green, yellow, and blue representing the different groups and the other colors representing GO terms shared between the different groups; F: Line plots of the four groups of GO terms in the Cu_4h vs. C_4h and CuT_4h vs. C_4h, Cu_24h vs. C_24h, and CuT_24h vs. C_24h DEGs, with the vertical coordinates representing the number of DEGs, the horizontal coordinates representing the groups, and the dots in different colors representing the different GO terms
downregulation of the expression of these genes, which we speculate is due to increased inflammation, leads to dysfunctional DNA replication and repair in S. esculenta larvae.
In summary, we speculate that Cu exposure effects on ion transport, as well as DNA replication and repair, are stronger in S. esculenta larvae at high temperatures, and that high temperatures may be able to lead to higher rates
of aggregation or solubilization of Cu ions in S. esculenta larvae.

GO functional enrichment analysis

Analysis of common GO terms between Cu and cut groups

In the GO functional enrichment analysis, we found three GO terms the Cu group shared with the CuT group, namely zinc ion binding (GO:0008270), oxidoreductase
Fig. 4 A Enriched KEGG pathways for the Cu_4h vs. C_4h group; B: Enriched KEGG pathways for the Cu_24h vs. C_24h group; C: Enriched KEGG pathways for the CuT_4h vs. C_4h group; : Enriched KEGG pathways for the CuT_24h vs. C_24h group. KEGG bubble plot, with the size of the dots representing the number of DEGs and the colors representing significance; the vertical coordinate is the name of the pathway, and the horizontal coordinate is the ratio of DEGs to the total number of DEGs in the pathway. E: KEGG Venn diagram, with red, green, yellow, and blue representing the different groups and the other colors representing pathways shared between the different groups
activity (GO:0016491), and alcohol dehydrogenase (NAD) activity (GO:0004022).
Previous studies have shown that zinc ions play an important role in immune processes and signal regulation, and that a deficiency of zinc ions leads to dysfunction in many organs and the immune system [28].
Oxidoreductase is an important regulator of immune pathways. An increase in oxidoreductase activity promotes the generation of reactive oxygen species, and these by-products may modulate pro-inflammatory pathways [29]. Alcohol dehydrogenase activity is closely related to autoimmune inflammation, and alcohol
Fig. 5 Class 2 KEGG signaling pathway annotations; vertical coordinates indicate the type 2 KEGG category, and horizontal coordinates indicate the number of corresponding DEGs. A: Enriched Class 2 KEGG signaling pathways for the Cu_4h vs. C_4h group; B: Enriched Class 2 KEGG signaling pathways for the Cu_24h vs. C_24h group; C: Enriched Class 2 KEGG signaling pathways for the CuT_4h vs. C_4h group; D: Enriched Class 2 KEGG signaling pathways for the CuT_24h vs. C_24h group
Fig. 6 qRT-PCR and RNA-Seq results of key DEGs. The vertical coordinates represent the fold change, and the horizontal coordinate represents the duration of exposure
dehydrogenase is essential for the metabolism of organisms and the regulation of macrophage function. It is mainly used to remove apoptotic cells from the body [30].
The enrichment of these terms may indicate that Cu exposure may lead to a decrease in ion binding ability and reductase activity in S. esculenta larvae, which may result in an imbalance of the immune system of S. esculenta larvae or promote inflammation. We also found that the number of DEGs in the terms zinc ion binding (GO:0008270) and oxidoreductase activity (GO:0016491) differed between the Cu group and CuT group, with an increase in DEGs in the CuT group. This trend may indicate that high temperature can enhance the harmful effects of copper exposure on S. esculenta.

Analysis of unique GO terms in the CuT group

Unique GO terms enriched in the CuT group compared to the Cu group that are relevant to immunity include apoptosis (GO:0006915) and DNA repair (GO:0006281).
Apoptosis is important in the maintenance of tissue homeostasis and the reduction of inflammation, and organisms can gradually eliminate or reduce inflammation by renewing cells through apoptosis in vivo [31]. DNA damage repair and innate immunity are two conserved mechanisms that play a role in both cellular stress
responses, and it has been found that DNA repair is closely linked to inflammation and that organisms can effectively control inflammation through their own DNA repair [32].
Through GO enrichment analysis, we were able to speculate that Cu exposure inflammation in . esculenta larvae is more severe under high-temperature conditions and that S. esculenta larvae may reduce inflammation in vivo by accelerating apoptosis of damaged cells themselves. Moreover, Cu exposure at high temperatures may lead to DNA repair dysfunction in S. esculenta larvae, thereby affecting their immune function and potentially resulting in more severe inflammation.

KEGG functional enrichment analysis Analysis of common KEGG pathways between Cu and CuT groups

The pathways found to be common to the Cu and CuT groups and immunologically relevant through KEGG functional enrichment analysis were the DNA replication pathway, the tight junction pathway, and the cell cycle pathway.
DNA replication is associated with innate immunity in animals, and some innate immune errors are caused by mutations in DNA replication factors. The DNA
replication pathway is a complex signaling pathway that plays an important role in regulating the repair of DNA damage and inducing cell apoptosis [33]. In our research, the significant enrichment of the DNA replication pathway in S. esculenta larvae is likely due to Cu exposure leading to errors in DNA replication in S. esculenta larvae, which results in innate immune disorders in S. esculenta larvae. Research has found that inflammation can increase damage to the nervous system by degrading tight junction proteins. There is an interaction between tight junction proteins and inflammation, and protecting these proteins can also alleviate inflammatory responses, thereby reducing the potential for impaired neurological function [34]. Genes in the tight junction pathway, such as TUBA1C and MICALL2, showed down-regulated expression, and we speculate that S. esculenta larvae undergo in vivo inflammation following Cu exposure and degradation of tight junction proteins. Cell cycle activity is related to immune function, and dysregulation of the cell cycle often indicates the presence of abnormal immune cells. Some cell cycle regulators can modulate the cell cycle to exert immunomodulatory effects, and cell cycle programs may be linked to immune behavior through mechanisms that can influence immunity [35, 36]. We found down-regulation of the CDK1 gene, a cell cycle protein-dependent kinase, in our transcriptome results. CDK1 influences its catalytic activity through unique interactions with various cell cycle protein complexes, ensuring that cell cycle progression is not impaired. Additionally, CDK1 plays a significant regulatory role in modulating various cellular immune responses during inflammation [37, 38]. Therefore, the downregulation of the CDK1 gene after copper induction in S. esculenta larvae likely indicates an abnormality in the cell cycle.
In conclusion, the activation of the DNA replication pathway, tight junction pathway, and cell cycle pathway following Cu exposure may be linked to the presence of inflammation in S. esculenta larvae. We also observed a differential distribution of DEGs across the three shared pathways between the Cu and CuT groups, with an increased number of DEGs in the CuT group. This trend suggests that copper exposure under elevated temperature conditions may exacerbate the adverse effects on . esculenta.

Analysis of unique KEGG pathways in the CuT group

Comparison of the Cu group with the CuT group revealed that the pathways unique to the CuT group related to immunity were the nucleotide excision repair pathway, base excision repair pathway, FcyR -mediated phagocytosis pathway, and autophagy pathway.
Nucleotide excision repair is unique in that it recognizes and removes truncated damage in DNA and is
involved in the repair of DNA, which is closely linked to autoimmunity and inflammation present in the self [39-41]. Base excision repair (BER) is the primary pathway for eukaryotic cells to resolve single-base damage, enabling rapid and efficient DNA damage repair [42]. Therefore, we deduced that the enrichment of DEGs in the nucleotide excision repair pathway and base excision repair pathway was most likely caused by high-temperature Cu exposure, resulting in further disruption of the replication of . esculenta larval DNA. Phagocytosis is a biological process; phagocytosis is usually accompanied by inflammation; phagocytosis is fundamental to the immune response and ensures that the body removes pathogens and apoptotic cells. Activation of phagocytosis by FcyR stimulates phospholipase D (PLD) activity and stimulates the macrophage plasma membrane to produce phosphatidic acid (PA), thereby increasing phagocytic efficiency [43-45]. Activation of the phagocytosis pathway in S. esculenta larvae may further exacerbate inflammation in vivo due to Cu exposure at elevated temperatures, and phagocytosis is required to remove damaged cells in vivo and thereby inhibit inflammation. Autophagy is associated with many essential biological processes, which include immunity, cell development, and the differentiation of cells through the regulation of inflammation. Through autophagic cells, damaged or harmful components can be eliminated [46, 47]. We found that the Prkcd and Sqstm1 genes were enriched and up-regulated in this pathway. Therefore, we postulate that high-temperature Cu exposure and inflammation in S. esculenta larvae result in an increase in the number of damaged cells in the body and an increase in autophagy, which accelerates the clearance of damaged cells from the body and thus reduces the inflammatory response.
In conclusion, high temperatures enhanced the toxicity of metallic copper ions, which further led to DNA damage in S. esculenta larvae and interfered with the ability of the larvae to replicate and repair DNA. Cu exposure under high-temperature conditions was able to cause more severe inflammation in S. esculenta larvae, which attenuated the inflammatory response by enhancing autophagy and phagocytosis in vivo.

Conclusion

We employed transcriptome sequencing to investigate the impact of copper exposure on the immune responses of . esculenta larvae under high-temperature conditions. Through the analysis of (DEGs and functional enrichment pathways, we preliminarily observed that the CuT group exhibited a more pronounced disruption of intercellular ion transport, immune function, and DNA replication and repair compared to the Cu-only group. This disruption likely interfered with the normal physiological processes of S. esculenta larvae, potentially leading
to enhanced inflammation. Inflammatory responses were more intense in the CuT group, as indicated by the increased DNA damage and stronger immune response observed in the larvae. This study contributes to bridging the knowledge gap regarding the combined effects of temperature and heavy metals on S. esculenta larvae, offering new insights into how their interactions exacerbate the health risks to these organisms. Furthermore, our findings provide a valuable reference for understanding the survival and reproductive challenges faced by other cephalopods in similar environmental conditions. In the context of rising global temperatures and increasing heavy metal pollution, the present study is an important practical guide for the breeding of S. esculenta and other cephalopods. The reference data and theories we provide will help aquaculture enterprises or individuals to better understand and cope with these challenges, thus promoting the sustainable development of related industries.

Abbreviations

RNA-seq RNA sequencing
RT-qPCR Quantitative reverse-transcription PCR
DEGs Differentially expressed genes
GO Gene Ontology
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

Supplementary Information

The online version contains supplementary material available at https://doi.or .
Supplementary Material 1
Supplementary Material 2

Acknowledgements

Not applicable.

Author contributions

Zhao. Y. wrote the original manuscript; Chang. D., Zheng. Y., and Zhang. Y. analyzed the data; Wang. Y., Bao. X., and Sun. G. provided help with the software; Feng. Y. and Liu. X. organized the graphs and tables; Li. Z., Liu. X., and Yang. J. provided research ideas and revised the manuscript; all authors have reviewed and approved the manuscript.

Funding

This research was supported by the earmarked fund for the Modern Agro-industry Technology Research System (CARS-49), the Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2019BC052).

Data availability

The datasets generated and analysed during the current study are available in the NCBI repository, accession number SRR19578100, SRR19578102, SRR19578103, SRR19578104, SRR19578105, SRR19578106, SRR19578107, SRR19578108, SRR19578109, SRR19578110, SRR19578111, SRR19578112, SRR19578113, SRR19578114, SRR31864754, SRR31864755, SRR31864756, SRR31864757, SRR31864758, SRR31864759 at the following link: https://www .ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=PRJNA844162%26;o=library_name_s% 3Aa.

Declarations

The experimental protocols were reviewed and approved by the Animal Care and Ethics Committee of the Ludong University (protocol number: LDU-IRB20210308NXY). The present study was reported according to the recommendation of ARRIVE guidelines for animal research. The method and process were carried out in accordance with relevant guidelines and regulations.
Not applicable.

Competing interests

The authors declare no competing interests.
Received: 17 December 2024 / Accepted: 28 February 2025
Published online: 17 March 2025

References

  1. Bhuyan MS, Haider SMB, Meraj G, Bakar MA, Islam MT, Kunda M, et al. Assessment of heavy metal contamination in beach sediments of Eastern St. Martin’s Island, Bangladesh: implications for environmental and human health risks[J]. Water. 2023;15:2494.
  2. Ali MM, Ali ML, Bhuyan MS, Islam MS, Rahman MZ, Alam MW, et al. Spatiotemporal variation and toxicity of trace metals in commercially important fish of the tidal Pasur river in Bangladesh[J]. Environ Sci Pollut Res. 2022;29:40131-45.
  3. Wang , Wang , Jiang , Jordan RW, Gu -G. Bioenrichment preference and human risk assessment of arsenic and metals in wild marine organisms from Dapeng (Mirs) Bay, South China Sea[J]. Mar Pollut Bull. 2023;194:115305.
  4. Sfakianakis DG, Renieri E, Kentouri M, Tsatsakis AM. Effect of heavy metals on fish larvae deformities: a review[J]. Environ Res. 2015;137:246-55.
  5. Al-Ghussain L. Global warming: review on driving forces and mitigation[J]. Environ Prog Sustain Energy. 2019;38:13-21.
  6. Bethke K, Kropidłowska K, Stepnowski P, Caban M. Review of warming and acidification effects to the ecotoxicity of pharmaceuticals on aquatic organisms in the era of climate change[J]. Sci Total Environ. 2023;877:162829.
  7. Ren J, Liu S, Zhang Q, Zhang Z, Shang S. Effects of cadmium exposure on haemocyte immune function of clam Ruditapes philippinarum at different temperatures[J]. Mar Environ Res. 2024;195:106375.
  8. Malhotra N, Ger T-R, Uapipatanakul B, Huang J-C, Chen KH-C, Hsiao C-D. Review of copper and copper nanoparticle toxicity in fish[J]. Nanomaterials. 2020;10:1126.
  9. Wang Y, Liu X, Wang W, Sun G, Feng Y, Xu X, et al. The investigation on stress mechanisms of Sepia esculenta larvae in the context of global warming and ocean acidification[J]. Aquaculture Rep. 2024;36:102120.
  10. Gong H, Li C, Zhou Y. Emerging global ocean deoxygenation across the 21st century[J]. Geophys Res Lett. 2021;48:e2021GL095370.
  11. Liu X, Bao X, Yang J, Zhu X, Li Z. Preliminary study on toxicological mechanism of golden cuttlefish (Sepia esculenta) larvae exposed to Cd[J]. BMC Genomics. 2023;24:503.
  12. García-Fernández P, Prado-Alvarez M, Nande M, De La Garcia D, Perales-Raya C, Almansa E, et al. Global impact of diet and temperature over aquaculture of Octopus vulgaris paralarvae from a transcriptomic approach[J]. Sci Rep. 2019;9:10312.
  13. Zapata M, Tanguy A, David E, Moraga D, Riquelme C. Transcriptomic response of Argopecten purpuratus post-larvae to copper exposure under experimental conditions[J]. Gene. 2009;442:37-46.
  14. Xu M, Jiang L, Shen K-N, Wu C, He G, Hsiao C-D. Transcriptome response to copper heavy metal stress in hard-shelled mussel (Mytilus coruscus)[J]. Genomics Data. 2016;7:152-4.
  15. Liu Y, Chen L, Meng F, Zhang T, Luo J, Chen S, et al. The effect of temperature on the embryo development of cephalopod Sepiella japonica suggests crosstalk between autophagy and apoptosis[J]. Int J Mol Sci. 2023;24:15365.
  16. Liu X, Li Z, Li Q, Bao X, Jiang L, Yang J. Acute exposure to polystyrene nanoplastics induced oxidative stress in Sepia esculenta larvae[J]. Aquaculture Rep. 2024;35:102004.
  17. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated Estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biol. 2014;15:550.
  18. Li Z, Ndandala CB, Guo Y, Zhou Q, Huang C, Huang H, et al. Impact of IGF3 stimulation on spotted scat (Scatophagus argus) liver: implications for a role in ovarian development. Agric Commun. 2023;1:100016.
  19. Liu X, Li Z, Wu W, Liu Y, Liu J, He Y, et al. Sequencing-based network analysis provides a core set of gene resources for Understanding kidney immune response against Edwardsiella tarda infection in Japanese flounder[J]. Fish Shellfish Immunol. 2017;67:643-54.
  20. Wang Y, Chen X, Xu X, Yang J, Liu X, Sun G, et al. Weighted gene co-expression network analysis based on stimulation by lipopolysaccharides and polyinosinic:polycytidylic acid provides a core set of genes for Understanding hemolymph immune response mechanisms of Amphioctopus fangsiao[J]. Animals. 2023;14:80.
  21. Bao X, Li Y, Liu X, Feng Y, Xu X, Sun G, et al. Effect of acute Cu exposure on immune response mechanisms of golden cuttlefish (Sepia esculenta)[J]. Fish Shellfish Immunol. 2022;130:252-60.
  22. Sheng L, Luo Q, Chen L. Amino acid solute carrier transporters in inflammation and autoimmunity[J]. Drug Metab Dispos. 2022;50:1228-37.
  23. Luo S-S, Chen X-L, Wang A-J, Liu Q-Y, Peng M, Yang C-L, et al. Genome-wide analysis of ATP-binding cassette (ABC) transporter in Penaeus vannamei and identification of two ABC genes involved in immune defense against Vibrio parahaemolyticus by affecting NF-kB signaling pathway[J]. Int J Biol Macromol. 2024;262:129984.
  24. Luckenbach T, Epel D. ABCB- and ABCC-type transporters confer multixenobiotic resistance and form an environment-tissue barrier in bivalve gills[J]. Am J Physiology-Regulatory Integr Comp Physiol. 2008;294:R1919-29.
  25. Cui K, Qin L, Tang X, Nong J, Chen J, Wu N, et al. A single amino acid substitution in RFC4 leads to endoduplication and compromised resistance to DNA damage in Arabidopsis thaliana[J]. Genes. 2022;13:1037.
  26. Murga M, Lecona E, Kamileri I, Díaz M, Lugli N, Sotiriou SK, et al. POLD3 is haploinsufficient for DNA replication in mice[J]. Mol Cell. 2016;63:877-83.
  27. Elmayan T, Proux F, Vaucheret H. Arabidopsis RPA2: A genetic link among transcriptional gene silencing, DNA repair, and DNA replication[J]. Curr Biol. 2005;15:1919-25.
  28. Li T, Jiao R, Ma J, Zang J, Zhao G, Zhang T. Zinc binding strength of proteins dominates zinc uptake in Caco-2 cells[J]. RSC Adv. 2022;12:21122-8.
  29. Abou-Hamdan A, Mahler R, Grossenbacher P, Biner O, Sjöstrand D, Lochner M, et al. Functional design of bacterial superoxide:quinone oxidoreductase[J]. Biochim Et Biophys Acta (BBA) – Bioenergetics. 2022;1863:148583.
  30. Mahida RY, Lax S, Bassford CR, Scott A, Parekh D, Hardy RS, et al. Impaired alveolar macrophage -hydroxysteroid dehydrogenase type 1 reductase activity contributes to increased pulmonary inflammation and mortality in sepsis-related ARDS[J]. Front Immunol. 2023;14:1159831.
  31. Arienti S, Barth ND, Dorward DA, Rossi AG, Dransfield I. Regulation of apoptotic cell clearance during resolution of inflammation[J]. Front Pharmacol. 2019;10:891.
  32. Shah A, Bennett M. Controlling inflammation through DNA damage and repair[J]. Circul Res. 2016;119:698-700.
  33. Willemsen M, Staels F, Gerbaux M, Neumann J, Schrijvers R, Meyts I, et al. DNA replication-associated inborn errors of immunity[J]. J Allergy Clin Immunol. 2023;151:345-60.
  34. Zhao B, Yin Q, Fei Y, Zhu J, Qiu Y, Fang W, et al. Research progress of mechanisms for tight junction damage on blood-brain barrier inflammation[J]. Arch Physiol Biochem. 2022;128:1579-90.
  35. Li J, Stanger BZ. Cell cycle regulation Meets tumor immunosuppression[J]. Trends Immunol. 2020;41:859-63.
  36. Bonelli M, La Monica S, Fumarola C, Alfieri R. Multiple effects of CDK4/6 Inhibition in cancer: from cell cycle arrest to immunomodulation[J]. Biochem Pharmacol. 2019;170:113676.
  37. Jones MC, Askari JA, Humphries JD, Humphries MJ. Cell adhesion is regulated by CDK1 during the cell cycle[J]. J Cell Biol. 2018;217:3203-18.
  38. Yamamura M, Sato Y, Takahashi K, Sasaki M, Harada K. The cyclindependent kinase pathway involving CDK1 is a potential therapeutic target for cholangiocarcinoma[J]. Oncol Rep. 2020;43:306-17.
  39. Kuper J, Kisker C. At the core of nucleotide excision repair[J]. Curr Opin Struct Biol. 2023;80:102605.
  40. Li W, Jones K, Burke TJ, Hossain MA, Lariscy L. Epigenetic regulation of nucleotide excision repair[J]. Front Cell Dev Biology. 2022;10:847051.
  41. Cohen I. DNA damage talks to inflammation[J]. Cytokine Growth Factor Rev. 2017;33:35-9.
  42. Raper AT, Maxwell BA, Suo Z. Dynamic processing of a common oxidative DNA lesion by the first two enzymes of the base excision repair pathway[J]. J Mol Biol. 2021;433:166811.
  43. Tanguy E, Tran Nguyen AP, Kassas N, Bader M-F, Grant NJ, Vitale N. Regulation of phospholipase D by Arf6 during FcyR-mediated phagocytosis[J]. J Immunol. 2019;202:2971-81.
  44. Huang F, Lu X, Kuai L, Ru Y, Jiang J, Song J, et al. Dual-site biomimetic Cu/ZnMOF for atopic dermatitis catalytic therapy via suppressing FcyR-mediated phagocytosis[J]. J Am Chem Soc. 2024;146:3186-99.
  45. Hortová-Kohoutková M, Tidu F, De Zuani M, Šrámek V, Helán M, Frič J. Phagocytosis-inflammation crosstalk in sepsis: new avenues for therapeutic intervention[J]. Shock. 2020;54:606-14.
  46. Shao B-Z, Yao Y, Zhai J-S, Zhu J-H, Li J-P, Wu K. The role of autophagy in inflammatory bowel disease[J]. Front Physiol. 2021;12:621132.
  47. Lee J, Kim HS. The role of autophagy in eosinophilic airway inflammation[J]. Immune Netw. 2019;19:e5.

Publisher’s note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
  1. *Correspondence:
    Zan Li
    lizanlxm@163.com
    Xiumei Liu
    xiumei0210@163.com
    Jianmin Yang
    ladderup@126.com
    School of Fisheries, Ludong University, Yantai 264025, China
    College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China
    Rushan Marine and Fishery Monitoring and Hazard Mitigation Center, Rushan 264500, China