خلية

التسلل الورمي اليومي ووظيفة CD8 تحدد خلايا T فعالية العلاج المناعي

ملخص رسومي

أهم النقاط

المؤلفون

المراسلات

باختصار

تسلل الأورام الدائري ووظيفة خلايا CD8+ T تحدد فعالية العلاج المناعي

مقدمة

النتائج

تظهر تسرب الكريات البيضاء إلى الأورام تذبذبات يومية

تتحكم خلايا البطانة في تسرب الكريات البيضاء الدائرية

الشكل 1. وقت الحصاد يحدد أعداد الكريات البيضاء المتسللة إلى الورم
(أ) الأعداد الكلية المعيارية لكريات الدم البيضاء المتسللة إلى الورم في ورم B16-F10-OVA، التي تم جمعها في 4 أوقات مختلفة من اليوم (وقت الزايتgeber [ZT])؛ 12 فأرًا من 4 تجارب مستقلة، تحليل كوزينور. المناطق المظللة تشير إلى مراحل الظلام.
(ب) التصوير (يسار) والتquantification (يمين) لـ CD4 و CD8 خلايا T في أورام B16-F10-OVA التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13؛ فئران، اختبار ستودنت غير المقترن اختبار، قضبان القياس: .
(C) أعداد الكريات البيضاء المتسللة إلى الورم في Tyr::CreERT2، BRaf بتن الفئران التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13؛ فئران، اختبار t لطلبة غير المقترنين.
(د) الأعداد الكلية المعنوية لكريات الدم البيضاء المتسللة إلى الورم في ورم B16-F10-OVA، التي تم جمعها في أوقات مختلفة من اليوم تحت ظروف ظلام دائم (الوقت اليومي [CT])؛ الفئران، من 3 تجارب مستقلة، تحليل التباين الأحادي.
جدول زمني خفيف من الضوء:الظلام (LD)، والظلام:الضوء المعكوس (DL)، وظروف اضطراب الساعة البيولوجية (JL). تشير المناطق المظللة إلى مراحل الظلام، وتدل الأرقام على أوقات الحصاد.
(F) أعداد الكريات البيضاء المتسللة إلى الورم في ورم B16-F10-OVA، التي تم جمعها في النقاط الزمنية المحددة (1 أو 13 ساعة في E) بعد بدء الدورة تحت الضوء: الظلام (LD، فئران)، مقلوب داكن:فاتح (DL، الفئران)، أو ما يتCorresponding jet lag (JL، ظروف (فئران) من 3 تجارب مستقلة، اختبار t لطلاب غير المتزاوج. المناطق المظللة تشير إلى المراحل المظلمة. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM، غير دال إحصائيًا، . انظر أيضًا الشكل S1.

الشكل 2. خلايا البطانة تتحكم في تسرب الكريات البيضاء الدائرية وعلاج الخلايا التائية
(أ) الأعداد الكلية المعيارية لكريات الدم البيضاء المتسللة إلى الورم في نموذج B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13، بعد 24 ساعة من علاج الأجسام المضادة للتحكم في النمط أو الأجسام المضادة المضادة لـ LFA-1؛ الفئران، من 5 تجارب مستقلة، اختبار t غير المتزاوج لستودنت.
(ب) استراتيجية البوابة وقياس الخلايا المنقولة بالتبني في أورام B16-F10-OVA بعد ساعتين من الحقن الوريدي عند ZT1 أو ZT13؛ الفئران، من تجربتين مستقلتين، اختبار ستودنت غير المقترن اختبار.
(ج) التصوير (يسار) والتquantification (يمين) للتعبير عن ICAM-1 على CD31 الخلايا البطانية في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13 من المجموعة الضابطة (مجموعة من فئران B6 و Bmal1 الفئران)، NSG أو Bmal1 فئران؛ الأقسام، من الفئران، على التوالي، من 4 تجارب مستقلة، اختبار t لعينات غير مرتبطة وتحليل كوزينور، شريط القياس: .
(د) أعداد الكريات البيضاء في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13 من مجموعة التحكم أو Bmal1 فئران؛ الفئران، من 4 تجارب مستقلة، اختبار ستودنت غير المقترن اختبار.
الأعداد المعيارية لكريات الدم البيضاء المنقولة بالتبني التي تم جمعها من أورام B16-F10-OVA بعد ساعتين من الحقن الوريدي في ZT1 أو ZT13 إلى مجموعة التحكم من نفس السلالة أو Bmal1 فئران؛ الفئران، من تجربتين مستقلتين، اختبار t غير المتزاوج لستودنت.
الأعداد المعيارية للخلايا المنقولة بالتبني OT-I في أورام B16-F10-OVA بعد ساعتين من الحقن في ZT1 أو ZT13؛ الفئران، من تجربتين مستقلتين، اختبار t غير المتزاوج لطلاب.
حجم الورم بعد الحقن الوريدي بـ خلايا OT-I المفعلة عند ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( فئران)، التحكم ( الفئران)، من 3 تجارب مستقلة، اختبار ت الطالب.
(H) حجم الورم بعد الحقن الوريدي لـ خلايا OT-I المفعلة عند ZT1 (Bmal1 الفئران، بمال1 الفئران) أو ZT13 ( فئران)، التحكم ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، اختبار t لستودنت، *Bmal1 ZT1 مقابل ZT13.
حجم الورم بعد الحقن الوريدي بـ CAR-CD28-CD3 البشري CD19 الخلايا في فئران NSG الحاملة لورم DoHH2 عند ZT1 (UT، خلايا T غير المعدلة، CAR T الفئران) أو ZT13 (UT، فئران، CAR T، فئران)، التحكم ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، تحليل التباين ثنائي الاتجاه.
(ج) عدد خلايا CAR T في أورام DoHH2 بعد 24 ساعة من الحقن الوريدي في ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، اختبار t لطلاب غير المتزاوج. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM، غير دال إحصائيًا، ; ; ; . انظر أيضًا الشكل S2.

فعالية علاج خلايا CAR T تعتمد على وقت اليوم

اختلافات يومية في نمط TIL

اختلافات وقت اليوم في الورم نمط الخلية

CD8 تذبذب نمط الخلية

الشكل 3. الفروق اليومية في معايير خلايا T

علاج مضاد PD-1 يعتمد على وقت اليوم

الشكل 4. تذبذب نمط الخلية
خريطة حرارية لتحليلات تسلسل RNA أحادي الخلية خلايا T الفعالة، تم جمعها في أربع أوقات مختلفة من اليوم.
(ب) تعبير Pdcd1 بواسطة تسلسل RNA أحادي الخلية لـ CD8 خلايا T الفعالة في أوقات مختلفة من اليوم.
(C) تعبير Pdcd1 بواسطة qPCR لفرز الخلايا المعتمد على الفلورية (FACS) لخلية CD8 الخلايا من أورام B16-F10-OVA عند ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( الفئران)، من 3 تجارب مستقلة، اختبار الطالب غير المتزاوج اختبار.
(د) تعبير PD-1 بواسطة تحليل تدفق الخلايا للورم الخلايا التي تم حصادها في أوقات مختلفة الفئران)، من 5 تجارب مستقلة، تحليل التباين الأحادي وتحليل الكوسينور.
تعبير PD-1 بواسطة تحليل التدفق الخلوي ل CD8 الورمي الخلايا، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13 من التحكم في الأشقاء الفئران) أو Bmal1 فئران ( فئران)، اختبار الطالب غير المتزاوج اختبار.
الضوء الحيوي النسبي المنشط الخلايا الناتجة من فئران PER2::LUC بعد التزامن، بيانات تمثيلية من فئران.
(G) تعبير Pdcd1 في CD8 المنشط الخلايا بعد التزامن من التحكم ( الفئران) أو بمال فئران ( الفئران) أو Per1 بير2 فئران ( الفئران) من 4 تجارب مستقلة، ***تحليل كوزينور. #تحليل التباين ثنائي الاتجاه.
(H) تعبير PDCD1 في خلايا CD8 المنشطة لدى البشر خلايا T بعد التزامن، ، من 4 تجارب مستقلة، تحليل كوزينور. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM . انظر أيضًا الشكل S6.

الظاهرة الدورية لخلايا المناعة في السرطانات البشرية

الشكل 5. الفعالية اليومية لعلاج مضاد PD-1
حجم الورم بعد علاج مضاد PD-1 (الأسهم) المطبق في ZT1 أو ZT13، مضاد PD-1 ( فئران)، التحكم ( الفئران)، من 3 تجارب مستقلة، تحليل التباين ثنائي الاتجاه.
(ب) حجم الورم بعد 14 يومًا من زراعة الورم، مضاد PD-1 ( فئران)، التحكم ( الفئران)، من 3 تجارب مستقلة، تحليل كوزينور.
حجم الورم بعد علاج anti-PD-1 (الأسهم) المطبق في ZT1 أو ZT13 مع أو بدون نقص CD8 في الفئران.
حجم الورم بعد علاج مضاد PD-1 (الأسهم) المطبق في ZT1 أو ZT13 في المجموعة الضابطة (ZT1، فئران، ZT13، الفئران) أو في Bmal1 (ZT1، فئران، ZT13، الفئران)، من 3 تجارب مستقلة، تحليل التباين ثنائي الاتجاه.
حجم الورم بعد جرعتين من علاج مضاد PD-1 (الأسهم) المقدم عند ZT1 أو ZT13؛ الفئران، من تجربتين مستقلتين، تحليل التباين ثنائي الاتجاه. (F) النمط الظاهري للورم خلايا تم جمعها في ZT1 أو ZT13، 24 ساعة بعد التحكم المتساوي الفئران) أو علاج مضاد PD-1 (ZT1، فئران، ZT13، الفئران)، من 4 تجارب مستقلة، تحليل التباين ثنائي الاتجاه، واختبار سيداكس بعد ذلك.
إنتاج السيتوكينات بواسطة خلايا CD8 الورمية خلايا T التي تم جمعها في ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( الفئران) 24 ساعة بعد علاج anti-PD-1، من 4 تجارب مستقلة، اختبار t غير المتزاوج.
حجم الورم بعد السيطرة ( الفئران) أو العلاج المركب من مضاد PD-1 وإدارة خلايا OT-I (السهم)، تم إعطاؤه في ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( 5 فئران)، من تجربتين مستقلتين، تحليل التباين الثنائي الاتجاه. الخطوط المنقطة تشير إلى نمو الورم من الشكل 2F. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM، غير دال إحصائيًا، . انظر أيضًا الشكل S6.

الشكل 6. نمط الخلايا المناعية اليومية في السرطانات البشرية (A و B) التصوير (يسار) والتquantification (يمين) لـ CD4 المرضى) و CD8 خلايا T في الميلانوما البشرية، تم جمعها في أوقات مختلفة من اليوم، تحليل كوزينور، شريط القياس: تلوين CD8 أو CD4 باللون الأحمر.
(C) مخطط لتدريب الخوارزمية والتحقق منها للتنبؤ بوقت اليوم في العينات غير الموقعة زمنياً. تم استخدام خوارزمية نهائية تحتوي على 57 جينًا للتحقق الخارجي والتنبؤ.
(D و E) خطأ (ساعات) خوارزمية توقع الوقت في التحقق الخارجي في الفأر ( الفئران) (D) والبشر ( عينات) (E) الأنسجة.
(F) مرهق/غير مرهق نسبة خلايا T في أنسجة الميلانوما الأولية من مجموعة بيانات TCGA للميلانوما، تم رسمها باستخدام الخوارزمية للتنبؤ بوقت الخزعات، صباحاً، المرضى؛ بعد الظهر، المرضى، طالب اختبار.
(G) إثراء تعبير جين ZT13 في الفئران لدى المرضى الذين يستجيبون أو لا يستجيبون لعلاج ICB (غير المستجيبين، الخلايا؛ المستجيبين، الخلايا). يتم تمثيل جميع البيانات كوسيط وربع. انظر أيضًا الشكل S6 والجدولين S2 وS3.

نقاش

قيود الدراسة

طرق النجوم *

• جدول الموارد الرئيسية
• توافر الموارد
• جهة الاتصال الرئيسية
• توفر المواد
• توفر البيانات والشيفرة
• نموذج تجريبي وتفاصيل المشاركين في الدراسة – الحيوانات
• تفاصيل الطريقة
• خطوط خلايا الورم والتطعيم
• تنشيط خلايا T في الفئران
• تزامن خلايا T في الفئران
• إنسان تنشيط خلايا T والتزامن
• تعبير لوكفيراز خلايا
• هضم الأنسجة وتحضير الخلايا المفردة
• تدفق الخلايا
• نقل كريات الدم البيضاء من الفئران
• اختبار EdU
• فرز خلايا CD8 T واستخراج RNA
• استخراج RNA، النسخ العكسي و qPCR
• علاجات الأجسام المضادة في الجسم الحي
• توليد خلايا CAR T البشرية
• نقل خلايا CAR T البشرية
• تصوير المناعة الفلورية
• التشخيص المناعي النسيجي البشري
• تسلسل الخلايا المفردة والتحليل
• تحليل زايتيزايجر
• تقدير تركيبة الخلايا في مرضى الميلانوما في TCGA
• التكميم والتحليل الإحصائي

معلومات إضافية

شكر وتقدير

مساهمات المؤلفين

إعلان المصالح

REFERENCES

1. Mellman, I., Coukos, G., and Dranoff, G. (2011). Cancer immunotherapy comes of age. Nature 480, 480-489. https://doi.org/10.1038/ nature10673.
2. Tawbi, H.A., Schadendorf, D., Lipson, E.J., Ascierto, P.A., Matamala, L., Castillo Gutiérrez, E., Rutkowski, P., Gogas, H.J., Lao, C.D., De Menezes, J.J., et al. (2022). Relatlimab and Nivolumab versus Nivolumab in Untreated Advanced Melanoma. N. Engl. J. Med. 386, 24-34. https://doi. org/10.1056/NEJMoa2109970.
3. Cappell, K.M., and Kochenderfer, J.N. (2023). Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20, 359-371. https://doi.org/10.1038/s41571-023-00754-1.
4. Flugel, C.L., Majzner, R.G., Krenciute, G., Dotti, G., Riddell, S.R., Wagner, D.L., and Abou-El-Enein, M. (2023). Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat. Rev. Clin. Oncol. 20, 49-62. https://doi.org/10.1038/s41571-022-00704-3.
5. Tumeh, P.C., Harview, C.L., Yearley, J.H., Shintaku, I.P., Taylor, E.J.M., Robert, L., Chmielowski, B., Spasic, M., Henry, G., Ciobanu, V., et al.
   (2014). PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance. Nature 515, 568-571. https://doi.org/10.1038/nature13954.
6. Wang, C., Barnoud, C., Cenerenti, M., Sun, M., Caffa, I., Kizil, B., Bill, R., Liu, Y., Pick, R., Garnier, L., et al. (2023). Dendritic cells direct circadian anti-tumour immune responses. Nature 614, 136-143. https://doi.org/ 10.1038/s41586-022-05605-0.
7. Scheiermann, C., Gibbs, J., Ince, L., and Loudon, A. (2018). Clocking in to immunity. Nat. Rev. Immunol. 18, 423-437. https://doi.org/10.1038/ s41577-018-0008-4.
8. Arjona, A., Silver, A.C., Walker, W.E., and Fikrig, E. (2012). Immunity’s fourth dimension: approaching the circadian-immune connection. Trends Immunol. 33, 607-612. https://doi.org/10.1016/j.it.2012.08.007.
9. Curtis, A.M., Bellet, M.M., Sassone-Corsi, P., and O’Neill, L.A.J. (2014). Circadian clock proteins and immunity. Immunity 40, 178-186. https:// doi.org/10.1016/j.immuni.2014.02.002.
10. Cermakian, N., Stegeman, S.K., Tekade, K., and Labrecque, N. (2022). Circadian rhythms in adaptive immunity and vaccination. Semin. Immunopathol. 44, 193-207. https://doi.org/10.1007/s00281-021-00903-7.
11. Man, K., Loudon, A., and Chawla, A. (2016). Immunity around the clock. Science 354, 999-1003. https://doi.org/10.1126/science.aah4966.
12. Palomino-Segura, M., and Hidalgo, A. (2021). Circadian immune circuits. J. Exp. Med. 218, e20200798. https://doi.org/10.1084/jem. 20200798.
13. Wang, C., Lutes, L.K., Barnoud, C., and Scheiermann, C. (2022). The circadian immune system. Sci. Immunol. 7, eabm2465. https://doi.org/10. 1126/sciimmunol.abm2465.
14. He, W., Holtkamp, S., Hergenhan, S.M., Kraus, K., de Juan, A., Weber, J., Bradfield, P., Grenier, J.M.P., Pelletier, J., Druzd, D., et al. (2018). Circadian Expression of Migratory Factors Establishes Lineage-Specific Signatures that Guide the Homing of Leukocyte Subsets to Tissues. Immunity 49, 1175-1190.e7. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.10.007.
15. Druzd, D., Matveeva, O., Ince, L., Harrison, U., He, W., Schmal, C., Herzel, H., Tsang, A.H., Kawakami, N., Leliavski, A., et al. (2017). Lymphocyte Circadian Clocks Control Lymph Node Trafficking and Adaptive Immune Responses. Immunity 46, 120-132. https://doi.org/10.1016/j.immuni. 2016.12.011.
16. Shimba, A., Cui, G., Tani-ichi, S., Ogawa, M., Abe, S., Okazaki, F., Kitano, S., Miyachi, H., Yamada, H., Hara, T., et al. (2018). Glucocorticoids Drive Diurnal Oscillations in T Cell Distribution and Responses by Inducing Interleukin-7 Receptor and CXCR4. Immunity 48, 286-298.e6. https:// doi.org/10.1016/j.immuni.2018.01.004.
17. Casanova-Acebes, M., Nicolás-Ávila, J.A., Li, J.L., García-Silva, S., Balachander, A., Rubio-Ponce, A., Weiss, L.A., Adrover, J.M., Burrows, K., AGonzález, N., et al. (2018). Neutrophils instruct homeostatic and pathological states in naive tissues. J. Exp. Med. 215, 2778-2795. https://doi.org/ 10.1084/jem. 20181468.
18. Nguyen, K.D., Fentress, S.J., Qiu, Y., Yun, K., Cox, J.S., and Chawla, A. (2013). Circadian gene Bmal1 regulates diurnal oscillations of Ly6C(hi) inflammatory monocytes. Science 341, 1483-1488. https://doi.org/10. 1126/science. 1240636.
19. Cervantes-Silva, M.P., Carroll, R.G., Wilk, M.M., Moreira, D., Payet, C.A., O’Siorain, J.R., Cox, S.L., Fagan, L.E., Klavina, P.A., He, Y., et al. (2022). The circadian clock influences cell responses to vaccination by regulating dendritic cell antigen processing. Nat. Commun. 13, 7217. https:// doi.org/10.1038/s41467-022-34897-z.
20. Ince, L.M., Barnoud, C., Lutes, L.K., Pick, R., Wang, C., Sinturel, F., Chen, C.S., de Juan, A., Weber, J., Holtkamp, S.J., et al. (2023). Influence of circadian clocks on adaptive immunity and vaccination responses. Nat. Commun. 14, 476. https://doi.org/10.1038/s41467-023-35979-2.
21. Nobis, C.C., Dubeau Laramée, G., Kervezee, L., Maurice De Sousa, D., Labrecque, N., and Cermakian, N. (2019). The circadian clock of CD8 T cells modulates their early response to vaccination and the rhythmicity of related signaling pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116, 2007720086. https://doi.org/10.1073/pnas.1905080116.
22. Gibbs, J., Ince, L., Matthews, L., Mei, J., Bell, T., Yang, N., Saer, B., Begley, N., Poolman, T., Pariollaud, M., et al. (2014). An epithelial circadian clock controls pulmonary inflammation and glucocorticoid action. Nat. Med. 20, 919-926. https://doi.org/10.1038/nm.3599.
23. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Lucas, D., Chow, A., Jang, J.E., Zhang, D., Hashimoto, D., Merad, M., and Frenette, P.S. (2012). Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity 37, 290-301. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2012.05.021.
24. Hazan, G., Duek, O.A., Alapi, H., Mok, H., Ganninger, A., Ostendorf, E., Gierasch, C., Chodick, G., Greenberg, D., and Haspel, J.A. (2023). Biological rhythms in COVID-19 vaccine effectiveness in an observational cohort study of 1.5 million patients. J. Clin. Invest. 133, e167339. https://doi.org/ 10.1172/JCl167339.
25. Long, J.E., Drayson, M.T., Taylor, A.E., Toellner, K.M., Lord, J.M., and Phillips, A.C. (2016). Morning vaccination enhances antibody response over afternoon vaccination: A cluster-randomised trial. Vaccine 34, 26792685. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2016.04.032.
26. Ho, P.C., Bihuniak, J.D., Macintyre, A.N., Staron, M., Liu, X., Amezquita, R., Tsui, Y.C., Cui, G., Micevic, G., Perales, J.C., et al. (2015). Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell 162, 1217-1228. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.08.012.
27. Raskov, H., Orhan, A., Christensen, J.P., and Gögenur, I. (2021). Cytotoxic CD8+ T cells in cancer and cancer immunotherapy. Br. J. Cancer 124, 359-367. https://doi.org/10.1038/s41416-020-01048-4.
28. National Comprehensive Cancer Network (2024). B-Cell Lymphomas. https://www.nccn.org/guidelines/guidelines-detail?category=1&id=1480.
29. Neelapu, S.S., Dickinson, M., Munoz, J., Ulrickson, M.L., Thieblemont, C., Oluwole, O.O., Herrera, A.F., Ujjani, C.S., Lin, Y., Riedell, P.A., et al. (2022). Axicabtagene ciloleucel as first-line therapy in high-risk large B-cell lymphoma: the phase 2 ZUMA-12 trial. Nat. Med. 28, 735-742. https://doi. org/10.1038/s41591-022-01731-4.
30. Arjona, A., and Sarkar, D.K. (2005). Circadian oscillations of clock genes, cytolytic factors, and cytokines in rat NK cells. J. Immunol. 174, 76187624. https://doi.org/10.4049/jimmunol.174.12.7618.
31. Hughey, J.J., Hastie, T., and Butte, A.J. (2016). ZeitZeiger: supervised learning for high-dimensional data from an oscillatory system. Nucleic Acids Res. 44, e80. https://doi.org/10.1093/nar/gkw030.
32. Zhao, Y., Liu, M., Chan, X.Y., Tan, S.Y., Subramaniam, S., Fan, Y., Loh, E., Chang, K.T.E., Tan, T.C., and Chen, Q. (2017). Uncovering the mystery of opposite circadian rhythms between mouse and human leukocytes in humanized mice. Blood 130, 1995-2005. https://doi.org/10.1182/blood-2017-04-778779.
33. Sade-Feldman, M., Yizhak, K., Bjorgaard, S.L., Ray, J.P., de Boer, C.G., Jenkins, R.W., Lieb, D.J., Chen, J.H., Frederick, D.T., Barzily-Rokni, M., et al. (2018). Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell 175, 998-1013.e20. https://doi. org/10.1016/j.cell.2018.10.038.
34. Naulaerts, S., Datsi, A., Borras, D.M., Antoranz Martinez, A., Messiaen, J., Vanmeerbeek, I., Sprooten, J., Laureano, R.S., Govaerts, J., Panovska, D., et al. (2023). Multiomics and spatial mapping characterizes human CD8 T cell states in cancer. Sci. Transl. Med. 15, eadd1016. https://doi.org/ 10.1126/scitransImed.add1016.
35. Qian, D.C., Kleber, T., Brammer, B., Xu, K.M., Switchenko, J.M., Jano-paul-Naylor, J.R., Zhong, J., Yushak, M.L., Harvey, R.D., Paulos, C.M., et al. (2021). Effect of immunotherapy time-of-day infusion on overall survival among patients with advanced melanoma in the USA (MEMOIR): a propensity score-matched analysis of a single-centre, longitudinal study. Lancet Oncol. 22, 1777-1786. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(21) 00546-5.
36. Yeung, C., Kartolo, A., Tong, J., Hopman, W., and Baetz, T. (2023). Association of circadian timing of initial infusions of immune checkpoint inhibitors with survival in advanced melanoma. Immunotherapy 15, 819-826. https://doi.org/10.2217/imt-2022-0139.
37. Gonçalves, L., Gonçalves, D., Esteban-Casanelles, T., Barroso, T., Soares de Pinho, I., Lopes-Brás, R., Esperança-Martins, M., Patel, V., Torres, S., Teixeira de Sousa, R., et al. (2023). Immunotherapy around the Clock: Impact of Infusion Timing on Stage IV Melanoma Outcomes. Cells 12, 2068. https://doi.org/10.3390/cells12162068.
38. Karaboué, A., Collon, T., Pavese, I., Bodiguel, V., Cucherousset, J., Zakine, E., Innominato, P.F., Bouchahda, M., Adam, R., and Lévi, F. (2022). Time-Dependent Efficacy of Checkpoint Inhibitor Nivolumab: Results from a Pilot Study in Patients with Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. Cancers (Basel) 14, 896. https://doi.org/10.3390/cancers14040896.
39. Rousseau, A., Tagliamento, M., Auclin, E., Aldea, M., Frelaut, M., Levy, A., Benitez, J.C., Naltet, C., Lavaud, P., Botticella, A., et al. (2023). Clinical outcomes by infusion timing of immune checkpoint inhibitors in patients with advanced non-small cell lung cancer. Eur. J. Cancer 182, 107-114. https://doi.org/10.1016/j.ejca.2023.01.007.
40. Nomura, M., Hosokai, T., Tamaoki, M., Yokoyama, A., Matsumoto, S., and Muto, M. (2023). Timing of the infusion of nivolumab for patients with recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the esophagus influences its efficacy. Esophagus 20, 722-731. https://doi.org/10.1007/s10388-023-01006-y.
41. Landré, T., Karaboué, A., Buchwald, Z.S., Innominato, P.F., Qian, D.C., Assié, J.B., Chouaïd, C., Lévi, F., and Duchemann, B. (2024). Effect of immunotherapy-infusion time of day on survival of patients with advanced cancers: a study-level meta-analysis. ESMO Open 9, 102220. https://doi. org/10.1016/j.esmoop.2023.102220.
42. Martin, A.M., Cagney, D.N., Catalano, P.J., Alexander, B.M., Redig, A.J., Schoenfeld, J.D., and Aizer, A.A. (2018). Immunotherapy and Symptomatic Radiation Necrosis in Patients With Brain Metastases Treated With Stereotactic Radiation. JAMA Oncol. 4, 1123-1124. https://doi.org/10. 1001/jamaoncol.2017.3993.
43. Postow, M.A., Goldman, D.A., Shoushtari, A.N., Betof Warner, A., Callahan, M.K., Momtaz, P., Smithy, J.W., Naito, E., Cugliari, M.K., Raber, V., et al. (2022). Adaptive Dosing of Nivolumab + Ipilimumab Immunotherapy Based Upon Early, Interim Radiographic Assessment in Advanced Melanoma (The ADAPT-IT Study). J. Clin. Oncol. 40, 1059-1067. https://doi. org/10.1200/JCO.21.01570.
44. Arlauckas, S.P., Garris, C.S., Kohler, R.H., Kitaoka, M., Cuccarese, M.F., Yang, K.S., Miller, M.A., Carlson, J.C., Freeman, G.J., Anthony, R.M., et al. (2017). In vivo imaging reveals a tumor-associated macrophagemediated resistance pathway in anti-PD-1 therapy. Sci. Transl. Med. 9, eaal3604. https://doi.org/10.1126/scitransImed.aal3604.
45. Conforti, F., Pala, L., Bagnardi, V., De Pas, T., Martinetti, M., Viale, G., Gelber, R.D., and Goldhirsch, A. (2018). Cancer immunotherapy efficacy and patients’ sex: a systematic review and meta-analysis. Lancet Oncol. 19, 737-746. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(18)30261-4.
46. Lévi, F.A., Okyar, A., Hadadi, E., Innominato, P.F., and Ballesta, A. (2024). Circadian Regulation of Drug Responses: Toward Sex-Specific and Personalized Chronotherapy. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 64, 89-114. https://doi.org/10.1146/annurev-pharmtox-051920-095416.
47. Duan, J., Ngo, M.N., Karri, S.S., Tsoi, L.C., Gudjonsson, J.E., Shahbaba, B., Lowengrub, J., and Andersen, B. (2023). tauFisher accurately predicts circadian time from a single sample of bulk and single-cell transcriptomic data. Preprint at bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2023.04.04.535473.
48. Welz, P.-S., Zinna, V.M., Symeonidi, A., Koronowski, K.B., Kinouchi, K., Smith, J.G., Guillén, I.M., Castellanos, A., Furrow, S., Aragón, F., et al. (2019). BMAL1-Driven Tissue Clocks Respond Independently to Light to Maintain Homeostasis. Cell 177, 1436-1447.e12. https://doi.org/10. 1016/j.cell.2019.05.009.
49. Wang, H., van Spyk, E., Liu, Q., Geyfman, M., Salmans, M.L., Kumar, V., Ihler, A., Li, N., Takahashi, J.S., and Andersen, B. (2017). Time-Restricted Feeding Shifts the Skin Circadian Clock and Alters UVB-Induced DNA Damage. Cell Rep. 20, 1061-1072. https://doi.org/10.1016/j.celrep. 2017.07.022.
50. Tsujihana, K., Tanegashima, K., Santo, Y., Yamada, H., Akazawa, S., Nakao, R., Tominaga, K., Saito, R., Nishito, Y., Hata, R.-I., et al. (2022). Circadian protection against bacterial skin infection by epidermal CXCL14mediated innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 119, e2116027119. https://doi.org/10.1073/pnas.2116027119.
51. Geyfman, M., Kumar, V., Liu, Q., Ruiz, R., Gordon, W., Espitia, F., Cam, E., Millar, S.E., Smyth, P., Ihler, A., et al. (2012). Brain and muscle Arnt-like protein-1 (BMAL1) controls circadian cell proliferation and susceptibility to UVB-induced DNA damage in the epidermis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 11758-11763. https://doi.org/10.1073/pnas.1209592109.
52. Spörl, F., Korge, S., Jürchott, K., Wunderskirchner, M., Schellenberg, K., Heins, S., Specht, A., Stoll, C., Klemz, R., Maier, B., et al. (2012). Krüp-pel-like factor 9 is a circadian transcription factor in human epidermis that controls proliferation of keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 10903-10908. https://doi.org/10.1073/pnas.1118641109.
53. del Olmo, M., Spörl, F., Korge, S., Jürchott, K., Felten, M., Grudziecki, A., de Zeeuw, J., Nowozin, C., Reuter, H., Blatt, T., et al. (2022). Inter-layer and inter-subject variability of diurnal gene expression in human skin. NAR Genom. Bioinform. 4, Iqac097. https://doi.org/10.1093/nargab/Iqac097.
54. Wu, G., Ruben, M.D., Schmidt, R.E., Francey, L.J., Smith, D.F., Anafi, R.C., Hughey, J.J., Tasseff, R., Sherrill, J.D., Oblong, J.E., et al. (2018). Popula-tion-level rhythms in human skin with implications for circadian medicine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, 12313-12318. https://doi.org/10.1073/ pnas. 1809442115.
55. Sherrill, J.D., Finlay, D., Binder, R.L., Robinson, M.K., Wei, X., Tiesman, J.P., Flagler, M.J., Zhao, W., Miller, C., Loftus, J.M., et al. (2021). Transcriptomic analysis of human skin wound healing and rejuvenation following ablative fractional laser treatment. PLoS One 16, e0260095. https://doi.org/10.1371/journal.pone. 0260095.
56. Hao, Y., Hao, S., Andersen-Nissen, E., Mauck, W.M., 3rd, Zheng, S., Butler, A., Lee, M.J., Wilk, A.J., Darby, C., Zager, M., et al. (2021). Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell 184, 3573-3587.e29. https:// doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.048.
57. Wu, T., Hu, E., Xu, S., Chen, M., Guo, P., Dai, Z., Feng, T., Zhou, L., Tang, W., Zhan, L., et al. (2021). clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb) 2, 100141. https://doi. org/10.1016/j.xinn.2021.100141.
58. Carlucci, M., Kriščiūnas, A., Li, H., Gibas, P., Koncevičius, K., Petronis, A., and Oh, G. (2019). DiscoRhythm: an easy-to-use web application and package for discovering rhythmicity. Bioinformatics 36, 1952-1954. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btz834.
59. Hänzelmann, S., Castelo, R., and Guinney, J. (2013). GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics 14, 7. https://doi.org/10.1186/1471-2105-14-7.
60. Colaprico, A., Silva, T.C., Olsen, C., Garofano, L., Cava, C., Garolini, D., Sabedot, T.S., Malta, T.M., Pagnotta, S.M., Castiglioni, I., et al. (2016). TCGAbiolinks: an R/Bioconductor package for integrative analysis of TCGA data. Nucleic Acids Res. 44, e71. https://doi.org/10.1093/nar/ gkv1507.
61. Leek, J.T., Johnson, W.E., Parker, H.S., Jaffe, A.E., and Storey, J.D. (2012). The sva package for removing batch effects and other unwanted variation in high-throughput experiments. Bioinformatics 28, 882-883. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts034.
62. Holtkamp, S.J., Ince, L.M., Barnoud, C., Schmitt, M.T., Sinturel, F., Pilorz, V., Pick, R., Jemelin, S., Mühlstädt, M., Boehncke, W.H., et al. (2021). Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nat. Immunol. 22, 1375-1381. https://doi.org/10.1038/s41590-021-01040-x.
63. Wittenbrink, N., Ananthasubramaniam, B., Münch, M., Koller, B., Maier, B., Weschke, C., Bes, F., de Zeeuw, J., Nowozin, C., Wahnschaffe, A., et al. (2018). High-accuracy determination of internal circadian time from a single blood sample. J. Clin. Invest. 128, 3826-3839. https://doi.org/ 10.1172/JCI120874.
64. Newman, A.M., Steen, C.B., Liu, C.L., Gentles, A.J., Chaudhuri, A.A., Scherer, F., Khodadoust, M.S., Esfahani, M.S., Luca, B.A., Steiner, D., et al. (2019). Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat. Biotechnol. 37, 773-782. https://doi. org/10.1038/s41587-019-0114-2.

طرق النجوم

جدول الموارد الرئيسية

توافر الموارد

جهة الاتصال الرئيسية

توفر المواد

توفر البيانات والشيفرة

• تم إيداع بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية في GEO: GSE260641 وهي متاحة للجمهور اعتبارًا من تاريخ النشر. أرقام الوصول للبيانات العامة المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول الموارد الرئيسية. جميع البيانات التي تدعم استنتاجات هذه الورقة متاحة على الإنترنت.https://doi.org/10.26037/yareta:5rmtlmd5sreo7bmcbe44bbijfm).
• تم إيداع جميع الشيفرات الأصلية في GitHubhttps://github.com/zqun1/circadian_immune_mouse_melanomaوهو متاح للجمهور اعتبارًا من تاريخ النشر.
• أي معلومات إضافية مطلوبة لإعادة تحليل البيانات المبلغ عنها في هذه الورقة متاحة من جهة الاتصال الرئيسية عند الطلب.

تفاصيل النموذج التجريبي وشارك الدراسة

الحيوانات

تفاصيل الطريقة

خطوط خلايا الورم والتطعيم

تنشيط خلايا T في الفئران

تزامن خلايا T في الفئران

إنسان تنشيط خلايا T والتزامن

تعبير لوكفيراز خلايا

هضم الأنسجة وتحضير الخلايا المفردة

تدفق الخلايا

نقل كريات الدم البيضاء من الفئران

اختبار EdU

فرز خلايا T CD8 واستخراج RNA

استخراج RNA، النسخ العكسي و qPCR

علاجات الأجسام المضادة في الجسم الحي

إنتاج خلايا CAR T البشرية

نقل خلايا CAR T البشرية

تصوير المناعة الفلورية

التشخيص المناعي النسيجي البشري

تسلسل الخلايا الفردية والتحليل

تحليل ZeitZeiger

تقدير تركيبة الخلايا في مرضى الميلانوما في TCGA

التكميم والتحليل الإحصائي

الرسوم التوضيحية الإضافية

الشكل S1. وقت الحصاد يحدد أعداد الكريات البيضاء المتسللة إلى الورم، مرتبط بالشكل 1
استراتيجية البوابة لكريات الدم البيضاء في B16-F10-OVA و Tyr::Cre ; بتين ; براف أورام.
(ب) الأعداد الكلية الطبيعية لمجموعات الكريات البيضاء في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في 4 أوقات مختلفة من اليوم (وقت الزايتgeber [ZT])؛ فئران من 4 تجارب مستقلة، تحليل كوزينور.
(ج) أعداد كريات الدم البيضاء المأخوذة في 4 أوقات مختلفة من اليوم من فئران تحمل ورم B16-F10-OVA، فئران من 5 تجارب مستقلة، تحليل كوزينور.
حجم ورم B16-F10-OVA، الذي تم قياسه 3 مرات في اليوم، فئران.
(هـ) قياس CD31 منطقة في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13، الفئران، تحليل التباين الأحادي، واختبار الطالب غير المتزاوج اختبار.
(F) الأعداد المعيارية لكريات الدم البيضاء المأخوذة عند ZT1 أو ZT13 من Tyr::Cre ; بتين ; BRaf فئران تحمل الأورام فئران من تجربتين مستقلتين، اختبار t لطلبة المزدوج. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM، غير دال إحصائيًا. *** ; **** .

الشكل S2. تسلل الكريات البيضاء الدائري وعلاج الخلايا التائية، متعلق بالشكل 2
(أ) استراتيجية البوابة وقياس EdU الكريات البيضاء في أورام B16-F10-OVA، فئران، اختبار t لطلبة غير المقترنين.
(ب) استراتيجية البوابة وقياس الكاسبيز-3/-7 في كريات الدم البيضاء في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 ( الفئران) أو ZT13 ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، اختبار ستودنت غير المقترن اختبار.
(ج) الأعداد المعيارية للخلايا المتبقية في الأورام بعد 24 ساعة من الحقن داخل الورم الكريات البيضاء عند ZT1 الفئران) أو ZT13 ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، اختبار ستودنت غير المتزاوج اختبار.
حجم الورم بعد علاج مضاد LFA-1 ( فئران)، التحكم في النوع المتماثل ( الفئران)، من تجربتين مستقلتين، تحليل التباين ثنائي الاتجاه.
(E) قياس VCAM-1 ( أقسام من 3 فئران) أو E-selectin ( تعبير الأقسام من 4 فئران على CD31 الخلايا في أورام B16-F10-OVA، التي تم جمعها في ZT1 أو ZT13، من تجربتين مستقلتين، اختبار t لطلاب غير المتزاوج. جميع البيانات ممثلة كمتوسط SEM، غير دال إحصائيًا.
حجم الورم بعد الحقن الوريدي بـ خلايا OT-I المفعلة عند ZT1 الفئران) أو ZT13 ( الفئران)، من 3 تجارب مستقلة.