DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00644
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39918541
تاريخ النشر: 2025-02-07
المؤلف: Oliver Kardell وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات البروتيوميات المتقدمة وتطبيقاتها
نظرة عامة
يتناول قسم ورقة البحث التقدم في علم البروتيوميات القائم على مطيافية الكتلة (MS) بهدف تعزيز التطبيقات السريرية من خلال إنشاء سير عمل موحدة للعينات السريرية. تم إجراء دراسة طويلة الأمد بالتعاون بين ثمانية مختبرات من مبادرة MSCoreSys لتقييم الأداء التحليلي لعينات البلازما والمصل. استخدمت هذه الدراسة إعدادات مختلفة من الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة المت tandem (LC-MS/MS)، بما في ذلك الأجهزة من ThermoFisher و Bruker، لتقييم مؤشرات الأداء الرئيسية مثل الحساسية والدقة وإمكانية التكرار.
كشفت النتائج أن تحديد البروتينات تراوح بين 300 إلى 400 عبر أدوات MS المختلفة، حيث أظهرت timsTOF Pro و Orbitrap Exploris 480 و Q Exactive HF-X أداءً متفوقًا. ومن الجدير بالذكر أن 71 بروتينًا كانت قابلة للكشف باستمرار عبر جميع الإعدادات في كل من عينات المصل والبلازما، بما في ذلك 22 علامة حيوية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء تم قياسها بشكل متكرر مع معامل تباين (CV) أقل من 20% باستخدام القياس بدون علامات. تؤسس هذه الدراسة الدائرية أساسًا واعدًا للتطبيق السريري للقياسات القائمة على MS في عينات المصل والبلازما.
مقدمة
تناقش مقدمة هذه الورقة البحثية المجال المتنامي للبروتيوميات السريرية، الذي يركز على تحليل ملفات البروتين في العينات السريرية لتعزيز فهم الأمراض والتشخيص والعلاج. يتم تسليط الضوء على مطيافية الكتلة (MS) كتكنولوجيا محورية في هذا المجال، مما يستلزم إنشاء سير عمل موحدة لضمان الدقة وإمكانية التكرار وكفاءة التعامل مع العينات. تشير الورقة إلى عدة دراسات متعددة المراكز التي قامت بتقييم قابلية التكرار وإمكانية التكرار للبروتيوميات القائمة على MS، مع التركيز بشكل خاص على فعالية طرق الاكتساب المستقلة عن البيانات (DIA) مثل SWATH-MS في قياس البروتينات عبر مختبرات متعددة.
تتناول التحديات التي تواجه البروتيوميات السريرية، لا سيما في عينات الدم، مشيرة إلى أن البروتينات ذات الوفرة العالية يمكن أن تعيق الكشف عن البروتينات ذات الوفرة المنخفضة، مما يعقد عملية التعرف. على الرغم من التقدم الذي يسمح بتحديد أكثر من 4000 بروتين في البلازما، يشير المؤلفون إلى وجود ميل في هذا المجال لإعطاء الأولوية لعدد البروتينات المكتشفة على أهميتها السريرية. تهدف دراسة CLINSPECT-M الطويلة الأمد إلى تقييم قابلية تكرار قياس العينات ذات الأهمية السريرية، مع التركيز على مؤشرات الأداء الرئيسية مثل أعداد التعرف والدقة الكمية عبر مختبرات مختلفة. تشمل هذه الدراسة مواقع متعددة في ألمانيا وتستخدم نهجًا موحدًا لحقن العينات بينما يتم تحليل البيانات مركزيًا باستخدام أدوات البرمجيات المعتمدة.
الطرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون الطرق الإحصائية المستخدمة لتحليل ملفات الإخراج من MaxQuant و DIA-NN باستخدام R (الإصدار 4.0.4) مع حزمة mpwR. ركز التحليل على تصفية مخرجات DIA-NN بناءً على معايير صارمة، تحديدًا قيمة q لمجموعة البروتينات وقيمة q للسابقة، وكلاهما محدد بأقل من 1% (PG.Qvalue < 1% و Q.Value < 1%). تم إزالة القيم الشاذة بشكل منهجي بناءً على الانخفاضات الكبيرة في معدلات التعرف أو الأداء، مع استبعاد مجموعات بيانات محددة من التحليل. أسفر ذلك عن 62 مجموعة بيانات للبلازما و 63 للمصل، كما هو موضح في الأشكال S2 و S3. تمت مراقبة الدقة الكمية للبروتينات المختارة على مدى الزمن باستخدام كثافات القياس بدون علامات (LFQ)، مع تقييد التحليل للبروتينات القابلة للكشف عبر جميع مجموعات البيانات. ومن الجدير بالذكر أنه لم يتم حساب قيم LFQ للبروتينات التي تم التعرف عليها بواسطة أقل من ببتيدين، مما أثر على حسابات معامل التباين (CV). تم حساب CV باستخدام الصيغة \( CV = \frac{\sigma}{\mu} \times 100 \)، حيث \( \sigma \) هو الانحراف المعياري و \( \mu \) هو المتوسط لكثافات LFQ. بالإضافة إلى ذلك، أشار المؤلفون إلى غياب بعض القياسات في إعدادات معينة، كما هو موضح في الأشكال الداعمة.
النتائج
حللت الدراسة الدائرية الطويلة الأمد 132 مجموعة بيانات من ثمانية مراكز دراسية، مع التركيز على عينات المصل والبلازما. تم استخدام مجموعة متنوعة من أجهزة مطيافية الكتلة المتطورة، بما في ذلك نماذج Orbitrap من ThermoFisher وأنظمة timsTOF من Bruker، جنبًا إلى جنب مع أنظمة HPLC متعددة التدفق النانوي والميكروي. استخدمت الغالبية العظمى من عمليات جمع البيانات طرق الاكتساب المعتمدة على البيانات (DDA)، مع وجود نتائج مهمة تشير إلى أن إعدادات المختبرات المختلفة والأجهزة أظهرت خصائص أداء مميزة. ومن الجدير بالذكر أنه تم ملاحظة فصل واضح بين أدوات MS من نوع Orbitrap و timsTOF، حيث كانت الإعدادات تنتج بين 300 و 400 معرف بروتين، مع تكتلها بشكل أساسي حسب الإعداد بدلاً من نقطة الزمن.
تمت مراقبة مقاييس الأداء مثل اكتمال البيانات والدقة الكمية بدقة. تراوحت الوسيطات للدقة الكمية للقياس بدون علامات (LFQ) بين 2-12% للبلازما و 2-15% للمصل، مع ملاحظة أعلى دقة في نطاقات الكثافة العليا. تم الكشف عن إجمالي 612 معرف بروتين للبلازما و 653 للمصل عند اعتبار 100% من اكتمال البيانات عبر جميع مجموعات البيانات. من المهم أن 22 من 71 معرف بروتين متداخل تم التعرف عليه عبر جميع الإعدادات تم التعرف عليها كعلامات حيوية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء، مما يوضح الأهمية السريرية لسير عمل LC-MS/MS. تسلط الدراسة الضوء على أن معظم البروتينات حافظت على معامل تباين كمي (CV) أقل من 20%، وهو حد يستخدم عادة في الاختبارات التشخيصية، على الرغم من أن بعض البروتينات الفردية أظهرت تباينًا أعلى في مجموعات بيانات معينة.
المناقشة
هدفت الدراسة الدائرية إلى تقييم أداء قياسات عينات البلازما والمصل على مدى الزمن، مع التركيز على التباين في مؤشرات الأداء الرئيسية مثل عدد البروتينات المعروفة (IDs) واكتمال البيانات والدقة الكمية. من خلال توزيع العينات المهضومة بين المختبرات المشاركة، قللت الدراسة من التباينات الناتجة عن إعداد العينات، موحدة كميات حقن الببتيد عبر إعدادات مختلفة. على الرغم من غياب إرشادات قياس صارمة، كشفت الدراسة أن معظم الإعدادات حققت أكثر من 90% من اكتمال البيانات على مستوى البروتين، مع الكشف المتسق عن 71 معرف بروتين عبر جميع المختبرات، 22 منها معترف بها كعلامات حيوية معتمدة من إدارة الغذاء والدواء.
تشير النتائج إلى أنه بينما تم ملاحظة أعلى معدلات التعرف مع بعض الأجهزة، مثل timsTOF Pro و Q Exactive HF-X، لم يكن هناك ارتباط مباشر بين تباين معدلات التعرف والأداء. ومن الجدير بالذكر أن الدراسة أبرزت أن قابلية التكرار بين المختبرات كانت كبيرة، مع تداخل يزيد عن 60% في معرفات البروتين بين إعدادات مختلفة. كما اقترحت التحليلات أن استخدام استراتيجيات معلوماتية حيوية أكثر شمولاً يمكن أن يعزز قابلية التكرار واكتمال البيانات. بشكل عام، تؤكد الدراسة على إمكانيات قياسات LC-MS/MS في التطبيقات السريرية، مما يظهر الكشف الموثوق عن البروتينات ذات الأهمية السريرية في العينات المشتقة من الدم.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00644
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39918541
Publication Date: 2025-02-07
Author(s): Oliver Kardell et al.
Primary Topic: Advanced Proteomics Techniques and Applications
Overview
The research paper section discusses advancements in mass spectrometry (MS)-based proteomics aimed at enhancing clinical applications through the establishment of standardized workflows for clinical specimens. A collaborative effort involving eight laboratories from the MSCoreSys initiative conducted a longitudinal round-robin study to evaluate the analytical performance of plasma and serum samples. This study utilized various liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) setups, including instruments from ThermoFisher and Bruker, to assess key performance indicators such as sensitivity, precision, and reproducibility.
The findings revealed that protein identifications ranged from 300 to 400 across different MS instruments, with the timsTOF Pro, Orbitrap Exploris 480, and Q Exactive HF-X demonstrating superior performance. Notably, 71 proteins were consistently detectable across all setups in both serum and plasma samples, including 22 FDA-approved biomarkers that were reproducibly quantified with a coefficient of variation (CV) of less than 20% using label-free quantification. This round-robin study establishes a promising foundation for the clinical application of MS-based measurements in serum and plasma samples.
Introduction
The introduction of this research paper discusses the burgeoning field of clinical proteomics, which focuses on analyzing protein profiles in clinical samples to enhance disease understanding, diagnosis, and treatment. Mass spectrometry (MS) is highlighted as a pivotal technology in this domain, necessitating the establishment of standardized workflows to ensure accuracy, reproducibility, and efficient sample handling. The paper references several multicenter studies that have evaluated the repeatability and reproducibility of MS-based proteomics, particularly emphasizing the effectiveness of data-independent acquisition (DIA) methods like SWATH-MS in quantifying proteins across multiple laboratories.
The challenges of clinical proteomics, particularly in blood samples, are addressed, noting that high-abundance proteins can obscure the detection of low-abundance ones, complicating the identification process. Despite advancements that allow for the identification of over 4000 proteins in plasma, the authors point out a tendency in the field to prioritize the sheer number of detected proteins over their clinical relevance. The CLINSPECT-M consortium’s longitudinal study aims to assess the reproducibility of measuring clinically relevant samples, focusing on key performance indicators such as identification numbers and quantitative precision across various laboratories. This study involves multiple sites in Germany and employs a standardized approach to sample injection while analyzing data centrally using established software tools.
Methods
In this section, the authors describe the statistical methods employed for analyzing output files from MaxQuant and DIA-NN using R (version 4.0.4) with the mpwR package. The analysis focused on filtering DIA-NN output based on stringent criteria, specifically a protein group q-value and precursor q-value both set under 1% (PG.Qvalue < 1% and Q.Value < 1%). Outliers were systematically removed based on significant drops in identification rates or performance, with specific datasets excluded from the analysis. This resulted in 62 datasets for plasma and 63 for serum, as detailed in Figures S2 and S3. The quantitative precision of selected proteins was monitored over time using label-free quantification (LFQ) intensities, with the analysis restricted to proteins detectable across all datasets. Notably, LFQ values were not calculated for proteins identified by fewer than two peptides, which affected the coefficient of variation (CV) calculations. The CV was computed using the formula \( CV = \frac{\sigma}{\mu} \times 100 \), where \( \sigma \) is the standard deviation and \( \mu \) is the mean of the LFQ intensities. Additionally, the authors noted the absence of certain measurements in specific setups, as illustrated in the supporting figures.
Results
The longitudinal round-robin study analyzed 132 data sets from eight study centers, focusing on serum and plasma samples. Various state-of-the-art mass spectrometers, including ThermoFisher’s Orbitrap models and Bruker’s timsTOF systems, were employed alongside multiple nanoflow and microflow HPLC systems. The majority of data acquisition utilized data-dependent acquisition (DDA) methods, with significant findings indicating that different laboratory setups and instruments exhibited distinct performance characteristics. Notably, a clear separation was observed between Orbitrap and timsTOF MS instruments, with setups yielding between 300 and 400 protein IDs, predominantly clustering by setup rather than time point.
Performance metrics such as data completeness and quantitative precision were rigorously monitored. The median quantitative precision for label-free quantification (LFQ) ranged from 2-12% for plasma and 2-15% for serum, with the highest precision observed in the upper intensity ranges. A total of 612 protein IDs for plasma and 653 for serum were detected when considering 100% data completeness across all datasets. Importantly, 22 of the 71 overlapping protein IDs identified across all setups were recognized as FDA-approved biomarkers, demonstrating the clinical relevance of the LC-MS/MS workflows. The study highlights that most proteins maintained a quantitative coefficient of variation (CV) below 20%, a threshold commonly used in diagnostic assays, although some individual proteins exhibited higher variability in specific datasets.
Discussion
The round-robin study aimed to assess the performance of plasma and serum sample measurements over time, focusing on variability in key performance metrics such as the number of identified proteins (IDs), data completeness, and quantitative precision. By distributing digested samples among participating laboratories, the study minimized variances from sample preparation, standardizing peptide injection amounts across different setups. Despite the absence of strict measurement guidelines, the study revealed that most setups achieved over 90% data completeness at the protein level, with a consistent detection of 71 protein IDs across all laboratories, 22 of which are recognized FDA-approved biomarkers.
The findings indicate that while the highest ID rates were observed with certain instruments, such as the timsTOF Pro and Q Exactive HF-X, variability in ID rates did not correlate directly with performance. Notably, the study highlighted that interlaboratory reproducibility was substantial, with over 60% overlap in protein IDs between different setups. The analysis also suggested that employing more comprehensive bioinformatic strategies could enhance reproducibility and data completeness. Overall, the study underscores the potential of LC-MS/MS measurements in clinical applications, demonstrating reliable detection of clinically relevant proteins in blood-derived samples.