الكلمات الرئيسية: اللاتونيات الحلقية، الحركة، Caenorhabditis elegans، Haemonchus contortus، WMicrotracker
تشكل الديدان الخيطية الطفيلية تهديدًا كبيرًا لصحة الحيوانات، مع آثار عميقة على رفاهية وإنتاجية الماشية. من بينها، تبرز Haemonchus contortus كطفيلي ديدان خيطية شديد الضراوة، مما يزيد من التحديات التي يواجهها مالكو الماشية ويؤثر على الرفاهية العامة للحيوانات والإنتاج الاقتصادي . اليوم، يعتمد العلاج الأكثر موثوقية لهذه الأمراض على استخدام الأدوية المضادة للديدان. الإيفرمكتين (IVM) الذي ينتمي إلى فئة اللاتونيات الحلقية (ML)، هو واحد من أهم الأدوية المضادة للديدان المستخدمة في جميع أنحاء العالم في الطب البيطري والإنساني . تم تقديم الموكسي دكتين (MOX)، وهو ML آخر، إلى السوق البيطرية وقد ثبت أنه أكثر فعالية من IVM ضد عزلات ديدان خيطية مقاومة متنوعة في أنواع حيوانية مختلفة . في فرنسا، الإبرينومكتين (EPR) هو الدواء المضاد للديدان الوحيد الذي لا يتطلب فترة سحب الحليب أثناء الرضاعة، مما يضمن استمرار الوصول إلى الأغنام الحلوب والماعز والماشية طوال فترة الرضاعة. لا مفر من أن الاستخدام المكثف لفئة من الأدوية المضادة للديدان قد اختار تجمعات من الطفيليات المقاومة للأدوية عالميًا في العديد من الأنواع الحيوانية. هذه مشكلة عالمية كبيرة الآن في المجترات الصغيرة، وتزداد في الماشية , وفي بعض الطفيليات من الحيوانات الأليفة . في الوقت الحاضر، تؤدي الخسائر الكبيرة في الإنتاجية في الحيوانات الزراعية إلى الفشل في السيطرة على الديدان المقاومة بشكل كافٍ. إن الانتشار السريع لمقاومة ML يهدد ليس فقط السيطرة على الطفيليات في الحيوانات ولكن أيضًا في البشر . وبالتالي، فإن منع وتشخيص وإدارة مقاومة الأدوية المضادة للديدان (AR) تأخذ الأولوية كتركيزات بحثية رئيسية في علم الطفيليات البيطرية وهي أيضًا مصدر قلق للسيطرة على الطفيليات الدودية في البشر .

في هذا السياق، هناك حاجة إلى اتخاذ إجراءات للكشف عن مقاومة الأدوية مبكرًا، والحفاظ على فعالية الأدوية الموجودة قدر الإمكان. يتطلب ذلك فهمًا عميقًا لآليات المقاومة ضد الأدوية المضادة للديدان. إن دراسة آليات AR في الطفيليات هي مهمة صعبة بسبب دورة حياتها المعقدة، التي تعتمد على التكاثر في المضيف. لذلك، تعتبر الدودة الخيطية الحرة Caenorhabditis elegans نموذجًا قويًا ومعترفًا به لدراسة AR . لقد حسنت استخدام هذا النظام النموذجي بشكل كبير من فهم آلية عمل الأدوية المضادة للديدان، حيث تم توضيح أهداف بعضها من خلال فحوصات جينية متقدمة لطرز C. elegans التي كانت مقاومة لتأثيراتها . لقد تطورت سلالات C. elegans المقاومة للأدوية المضادة للديدان وهي نماذج مهمة لفهم مقاومة الأدوية . علاوة على ذلك، فإن نهج استخدام C. elegans كنموذج تجريبي للديدان الطفيلية يعد واعدًا لأنه يسمح بتقدم سريع. بالفعل، بفضل استخدام هذا النموذج، حددنا مؤخرًا منظمًا رئيسيًا جديدًا لتحمل IVM؛ مستقبل الهرمونات النووية NHR- .

في الميدان، يعتمد الكشف عن المقاومة في الطفيليات الدودية المعوية على اختبار تقليل عدد البيض البرازي (FECRT) . يقارن هذا الاختبار عدد البيض قبل وبعد العلاج بمضاد الديدان، ويحسب نسبة فعالية دواء معين. ومع ذلك، فإن سوء فهم العوامل المحتملة التي قد تؤثر على نتائج FECRT يمكن أن يؤدي إلى قرارات خاطئة في الإدارة، مع عواقب كبيرة على السيطرة المستمرة على الطفيليات . في هذا السياق، هناك ضرورة لتطوير طرق قوية للكشف عن مقاومة الأدوية في الطفيليات الميدانية. تم تطوير نظام تتبع الحركة، المقترح كنهج شامل للحيوانات، في البداية لتوصيف سلوك الحركة ونمط النشاط اليومي في البالغين من C. elegans . بعد ذلك، تم فهم فائدة هذا الاختبار بسرعة وظهرت تطبيقات متعددة لـ WMicroTracker One (WMi). بالفعل، تم استخدام هذا الاختبار لدراسة سمية الأصباغ في C. elegans . تم مراجعة تحليل الحركة عالي الإنتاجية من أجل تطبيقه المحتمل في البحث عن مضادات ديدان جديدة في سياق المقاومة . كمثال، تم استخدامه لفحص النشاط المضاد للديدان للنباتات الطبية على . elegans ولزيت أساسي ضد . contortus . يجب الإشارة إلى الاهتمام بشأن الطفيليات المختلفة وتم إجراء عدد من الدراسات. في هذا السياق، ساعدت WMi في إثبات الخصائص المضادة للديدان الواعدة للدواء المعاد استخدامه EVP4593، كمضاد للديدان على من أنواع الطفيليات المختلفة مثل Cooperia oncophora وOstertagia ostertagi وH. contortus وTeladorsagia circumincta . ثم تم تحسين البروتوكول لدراسة حركة الديدان باستخدام WMi كاختبار عالي الإنتاجية لدراسة النشاط المضاد للديدان لمكتبات كبيرة من المركبات على . contortus . في دراسة حديثة، بحث سواريز وآخرون في التفاعل بين IVM وEPR باستخدام WMi على C. elegans. وقد دفعت نتائجهم إلى عدم استخدام هذين الدواءين معًا، وهو ممارسة مقترحة أحيانًا من قبل التركيبات التجارية، حيث لم تكن التأثيرات المشتركة أفضل من تأثيراتهما الفردية . بالتوازي، تم أيضًا تكييف اختبار الهجرة اليرقية الآلي (ALMA) للتطبيقات عالية الإنتاجية وقد ثبت أنه فعال في تقييم . contortus الحركة، خاصة في تحديد قيم للمحفزات الكولينيرجية وMLs. بينما يعتمد ALMA على تحليل الهجرة، فإن WMi يقيس مباشرة حركة الديدان، مما يوفر نهجًا تكميليًا يمكّن من تقييم الحركة المستمرة وغير الغازية. إن الجمع بين هذه الطرق يعزز مجموعة الأدوات المتاحة لفحص الأدوية على نطاق واسع ومراقبة المقاومة في علم الطفيليات . ومع ذلك، نظرًا لأن اختبار حركة WMicrotracker (WMA) لم يُستخدم سابقًا في سياق مقاومة ML، كان الهدف من هذا البحث هو تقييم إمكانيته في التمييز بين الديدان الخيطية الحساسة والمقاومة. كنا نهدف إلى تقييم القياسات المعتمدة على الكمبيوتر للحركة كطريقة لتقييم فعالية الأدوية بسرعة في الديدان الخيطية وتقييم حالة مقاومتها. ثم قمنا بتقييم ملاءمة مثل هذه الطرق لتقييم تحمل الأدوية لـ IVM وMOX وEPR لعدة سلالات من C. elegans ذات حالة مقاومة معروفة واختبرنا قابليتها على طفيلي ميداني ذو اهتمام، H. contortus.

IVM، MOX، EPR، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، بكتو أغار، بكتو بيبتون، ألبومين مصل البقر (BSA)، CaCl2، تم شراء MgSO4 من Sigma-Aldrich (سان كوينتين فالييه، فرنسا). في جميع التجارب، تم إذابة IVM وMOX وEPR في DMSO.

تم الحصول على سلالة C. elegans البرية N2 (N2B) وسلالة الطفرة الحساسة للغاية لـ IVM AE501 (nhr-8(ok186))، بالإضافة إلى سلالات الإشريكية القولونية OP50 من مركز جينات الكاينورهابديتيس (CGC، جامعة مينيسوتا، مينيسوتا، مينيابوليس، MN، الولايات المتحدة الأمريكية). تم توفير السلالة المختارة بواسطة IVM المسماة IVR10 بلطف من قبل الدكتور C. E. James. تم زراعة جميع السلالات والتعامل معها وفقًا للإجراءات الموصوفة سابقًا باختصار، تم زراعة الديدان الخيطية في على أطباق أجار وسط نمو النيماتودا (NGM) أجار باكتو بيكتو بيبتون الكوليسترول ، و25 مليمول من محلول ك phosphate البوتاسيوم) مزروعة بسلالة الإشريكية القولونية OP50 كمصدر غذائي. تم زراعة سلالات N2 Bristol و AE501 على أطباق أجار NGM التقليدية بينما تم زراعة السلالة المختارة بواسطة IVM (IVR10) على أطباق NGM التي تحتوي على من IVM. تم تحضير أطباق NGM المحتوية على IVM على النحو التالي: تم تخفيف المحاليل المخزنة من IVM في NGM بالتركيز المناسب قبل صب الأطباق. تم تنسيق الديدان الخيطية من خلال تحضير البيض باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم. باختصار، تم جمع مجموعة غير متزامنة مع أغلبية من البالغين الحوامل والبيض عن طريق غسل قاع أطباق NGM بمحلول M9 ( 5 جرام من NaCl، 0.25 جرام من MgSO 47 H 2 O في 1 لتر من الماء) وتم الطرد المركزي عند 1300 جرام لمدة 30 ثانية. تم تكسير جميع مراحل الديدان باستثناء البيض باستخدام خليط مبيض (5 م NaOH و هيبوكلوريت). تم إجراء ثلاث غسلات من M 9 لإزالة خليط التبييض السام. ثم تم فقس بيض C. elegans طوال الليل في ، على هزاز مداري، في محلول M9 بدون بكتيريا للحصول على مجموعة متزامنة من اليرقات في المرحلة الأولى ( ).

تم استخدام عزلتين نقيتين من Haemonchus contortus في هذه الدراسة. تم الحصول على عزلة H. contortus R-EPR1-2022 في الأصل من مزرعة أغنام ألبان في جنوب فرنسا، وتم تشخيصها مؤخرًا بفشل علاجي سريري بواسطة اختبار FECRT. ، بينما كانت S-H-2022 عينة حساسة لـ ML تم جمعها سابقًا من مزرعة في نفس المنطقة التي كانت EPR لا تزال فعالة فيها، وتم الاحتفاظ بها في المختبر لعدة أجيال. تم عزل البيض من براز الأغنام المجمعة إما من مزرعة كانت EPR فعالة فيها، أو من مزرعة تم إثبات مقاومة EPR فيها. منذ استعادتها في عامي 2020 و2021، تم تمرير العينات مرتين في السنة في أغنام مصابة بـ 10,000 يرقات معدية. للحفاظ على السلالات. لم يتم تطبيق ضغط دواء ML خلال هذه المراحل. تم إجراء تجارب تشمل الأغنام في مرافق حظائر الأغنام التجريبية في كلية الطب البيطري في تولوز ENVT (رقم الاعتماد E31 555 027). تم تسجيل المشروع وتفويضه تحت الرقم APAFIS #40417-20230119164118 v3 من قبل وزارة التعليم العالي والبحث الفرنسية.

تم تحديد قابلية سلالات C. elegans وعزلات H. contortus للـ MLs في WMA. تم تقييم حركة الديدان الخيطية من خلال تسجيل نشاط النقاط باستخدام WMicroTracker One (WMi) من PhylumTech (سانتا في، الأرجنتين)، والذي يكشف عن انقطاع الأشعة تحت الحمراء الدقيقة بسبب حركة الديدان في الوسائط السائلة. تم تعديل الطريقة المستخدمة من البروتوكولات التي تم وصفها سابقًا لـ C. elegans. و H. contortus تم قياس قدرة IVM و MOX و EPR على تثبيط حركة الديدان في اختبار يعتمد على الجرعة من خلال إضافة الأدوية بتركيزات متزايدة. لـ C. elegans و لمنع التصاق الديدان ولضمان توزيع متساوٍ للديدان في كل بئر، يجب أن تكون جميع المواد البلاستيكية مغطاة بـ BSA (ألبومين مصل البقر). تم إذابة الأدوية في DMSO، وكانت التركيز النهائي لـ DMSO في الاختبار أقل من لاستبعاد الآثار الضارة للمركبة نظرًا للاختلافات الإجرائية الكبيرة بين C. elegans و H. contortus، ولتعزيز الوضوح، تم إعداد نظرة عامة تخطيطية لإجراء تجربة WMi بالإضافة إلى الجدول الزمني المناسب المستوحى من Preez وآخرون. مُقدم في الشكل 1 لـ C. elegans وفي الشكل 2 لـ H. contortus.

يقيس WMA على C. elegans فعالية الأدوية المضادة للديدان في تثبيط الحركة في البالغين الشباب. بعد التبييض، تم صبها على 3 أطباق أجار NGM الكلاسيكية. لكل بئر) تم زراعتها في حجم نهائي من M9 في طبق بئر مسطح 96. تم حضانة الأطباق لمدة 25 دقيقة عند للسماح للديدان بالاستقرار. ثم تم قياس النشاط القاعدي لمدة 30 دقيقة لتطبيع نشاط الحركة في كل بئر في بداية الاختبار. مباشرة بعد علاج الدواء، تم تسجيل كل نشاط لمدة 120 دقيقة. تم حساب الحركة وفقًا للصيغة:
النشاط التقييمي تمت معالجته بشكل جيد – نشاط التقييم تحكم DMSO بدون ديدان)
النشاط القاعدي -النشاط الأساسي تحكم في DMSO بدون دودة.
تم حساب نسب الحركة لكل بئر معالج كتحفيز مضاعف بالنسبة للديدان المعالجة بـ DMSO والتي تم تعيينها على 100. لتسهيل المقارنة مع اختبارات ظاهرة أخرى، يقدم الجدول 1 ملخصًا لـ القيم المستمدة من تجارب مختلفة في C. elegans.

الـ WMA حول . كونتورتوس يقيس فعالية الأدوية المضادة للطفيليات في تثبيط الحركة في الحالة غير المغلفة يرقات . منذ لقد تم إثبات أنها أكثر حساسية بـ 231 مرة على الأقل لـ MOX من مما يدل على زيادة كبيرة في قابلية الإصابة بالعقاقير دون التأثير على بقاء اليرقات، تم استخدامها لـ . ثم، قبل التجربة، تم معالجة يرقات H. contortus للتخلص من الجلد. باختصار، تم حضن الديدان لمدة 20 دقيقة في في مياه الصنبور المدعمة بـ وتم هزها بقوة بواسطة دوامة كل 5 دقائق. لمنع تجمع اليرقات، تم تصفية اليرقات من خلال شبكة في وسط LB. تلقى كل بئر من صفيحة 96 بئر مسطحة معلق في الحجم النهائي لوسط LB. ثم، تم معالجة الأطباق بالمركبات وبعد ذلك تم حضنها في لمدة 24 ساعة داخل حاضنة مرطبة، مع الحفاظ على الغلاف الجوي ومستويات الرطوبة بعد فترة الحضانة، حركة اليرقات تم استعادته عن طريق تعريضهم للضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم تسجيل حركة الديدان داخل كل بئر على مدى 15 دقيقة باستخدام تقنية WMi.

تم بعد ذلك توحيد حركة الديدان في كل بئر مقابل متوسط حركة آبار التحكم لاشتقاق قيم تثبيط الحركة. ). منشور -تحويل تركيزات المركبات، تم ملاءمة منحنيات الاستجابة للجرعة لاختبار الحركة باستخدام نموذج سيغمويدي مع معلمات ميل متغيرة. تم تحديد حدود الثقة ورسمها باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 6.01،https://www.graphpad.com“). IC القيم، أي التركيز الذي عنده تم حساب عدد الديدان التي تم immobilized بواسطة الدواء (GraphPad، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). كانت كل قيمة هي متوسط الثلاث تكرارات وتم إجراء التجارب على الأقل 3 مرات. كانت RF هي نسبة المقاومة بالنسبة إلى مجموعة الديدان الحساسة (N 2 B لـ C. elegans و S-H-2022 لـ . كونتورتوس). كان مساوياً لـ للسكان المقاومين للسكان المعرضين للخطر.

أولاً، تم اختبار بيانات التحليل الحيوي للانتظام باستخدام اختبار داغوستينو وبييرسون الشامل للانتظام. بعد ذلك، تم استخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) لمقارنة تأثير متغيرين تصنيفيين على حركة الديدان: (1) الحالة البيولوجية (تشير إلى حالة تحمل الأدوية للسلالات؛ السيطرة، المقاومة أو فرط الحساسية) و(2) حالة علاج الدواء (IVM، MOX وEPR) بتركيزات مختلفة. تم تطبيق اختبار توكي للمقارنات المتعددة. تُعرف التكرارات البيولوجية على أنها تجارب مستقلة تم إجراؤها.

على مجموعات منفصلة من الحيوانات في أيام مختلفة. تم إجراء هذه التحليلات باستخدام حزمة برامج GraphPad Prism6 (الإصدار 6.01،https://www.graphpad.com).

تم اختبار ظروف مختلفة في البداية للحصول على استجابة مثالية لحركة C. elegans. أولاً، تحققنا من أن DMSO، المستخدم كوسيلة، لم يؤثر على حركة C. elegans البالغة عند استخدامه بتركيزات أقل من . بعد ذلك، تم إجراء جميع التجارب في وسط يحتوي على DMSO تحت ثم حددنا عدد الديدان المطلوبة للتجربة وأسسنا علاقة خطية مع الحركة بين 30 و 90 دودة (البيانات غير معروضة). ثم تم إجراء التجارب باستخدام 40 دودة لكل بئر، في نطاق الخطية، وتم تسجيل الحركة خلال 120 دقيقة. ثم استخدمنا WMA لمقارنة حساسية IVM لعدة سلالات من C. elegans: النوع البري بريستول N2 (N2B)، المختارة بواسطة IVM (IVR10) وفقدان وظيفة nhr-8 (AE501؛ nhr8(ok186)) (الشكل 3).

تظهر الصورة 3A صورًا تمثيلية للديدان بعد 120 دقيقة من الحضانة بدون أو مع زيادة تركيز IVM. توضح الصور بوضوح وجود حيوانات منحنية بشكل جميل في المجموعة الضابطة (DMSO) أو في عينات IVM عند 0.01. من IVM. في هذه الظروف، كانت الحيوانات تتحرك بانتظام مما يدل على أن تركيز IVM المنخفض هذا لم يؤثر على حركة الديدان بغض النظر عن سلالة C. elegans. IVM عند كان قادرًا على تحفيز نمط صلابة الجسم الكلي للسكان، مما يمثل تغييرًا كاملاً في حركة الديدان في جميع السلالات. تكشف الصور عن اختلافات واضحة في نمط الحركة بين السلالات في من IVM. كانت جميع ديدان N2B و AE501 غير متحركة، بينما كانت نسبة كبيرة من ديدان IVR10 لا تزال تتحرك. لتحديد مثل هذه الاختلافات، تم رسم منحنيات الاستجابة للجرعة لـ IVM تجاه حركة البالغين الشباب من سلالة C. elegans الثلاثة، وتم تقديمها في الشكل 3B. ، أي، تركيز IVM الذي عنده الحيوانات غير متحركة وقيم RF، تعكس الفروق في مقارنةً بتلك الخاصة بـ N 2 B، موضحة في الجدول 2.

وفقًا للصور، أظهرت منحنيات الجرعة والاستجابة أن IVM كانت قادرة على تغيير حركة الديدان لجميع السلالات. ومع ذلك، أظهرت IVM قوى مختلفة في التأثير على حركة C. elegans. في الواقع، لوحظت قوة مشابهة لـ IVM في تثبيط الحركة لكل من ديدان N2B و AE501 كما يتضح من تداخل منحنيي الجرعة والاستجابة ومن خلال المقارنة. القيم ( و ، على التوالي). في المقابل، تم إزاحة منحنى الجرعة-الاستجابة بشكل ملحوظ إلى اليمين بالنسبة لسلالة مختارة من IVM، مما يعكس انخفاضًا في القابلية لـ IVM. في الواقع، كان IVM أعلى بمقدار 2.12 مرة لـ IVR10 مقارنة بالنمط البري (71.20 و على التوالي، ) باتفاق مع تحمل أعلى من ديدان IVR10 لـ IVM عند مقارنتها بنوع N2B البري .

لأن المقاومة المتقاطعة بين العوامل المضادة للبكتيريا من نوع ML موصوفة بشكل جيد ثم قمنا بالتحقيق في قدرة اختبار الحركة على التمييز بين تحمل ML بين السلالات، من خلال دراسة تأثير MOX وEPR على حركة كل سلالة. تُظهر الجدول 2 أن سلالة IVR10 كانت أكثر تحملًا للأدوية الثلاثة المختبرة مقارنة بالسلالة البرية، حيث كانت IVM هي الدواء الأكثر فعالية. علاوة على ذلك، كانت سلالة IVR10 أقل حساسية بمقدار 1.85 مرة و1.49 مرة لـ EPR وMOX على التوالي عند مقارنتها بسلالة N2B. كانت IVM أيضًا الدواء الأكثر فعالية لسلالة N2B (الجدول 2). يبدو أن الاتجاه نحو زيادة فعالية IVM على نمط حركة الديدان مستمر أيضًا في ديدان AE501، ومع ذلك، فإن الفروقات ليست ذات دلالة إحصائية مقارنة بعلاج EPR. كان الدواء الأقل فعالية تجاه الحركة في هذه السلالة هو MOX. مجتمعة، تُظهر هذه النتائج بوضوح أن WMA مناسبة لتقييم سمية ML ولتمييز السلالات المقاومة للأدوية من السلالات الحساسة من C. elegans، لكنها ليست مناسبة لتمييز فرط الحساسية في ديدان AE501.

استجابةً للحاجة الملحة للأطباء البيطريين والمزارعين لتأكيد المقاومة، في سياق فشل العلاج والشك في مقاومة الأدوية في الميدان، قررنا تعديل استخدام WMi بناءً على الأعمال السابقة. لمراقبة الحركة في . كونتورتوس وتمييز العزلات الحساسة للأدوية عن تلك التي تطور تحمل الأدوية. تم تحسين عدد يرقات هيمونشوس كونتورتوس لكل بئر من خلال إنشاء علاقة خطية بين الحركة وعدد الديدان، مما يؤكد وجود نطاق خطي بين 20 و 100 دودة (البيانات غير معروضة). بناءً على ذلك، تم إجراء التجارب باستخدام 80 دودة لكل بئر. كانت نتائج استجابة الجرعة

تجارب مع IVM و MOX و EPR ضد تمت مقارنة العزلة من نوع . contortus التي صدرت من مزرعة شهدت فشلًا علاجيًا مع العزلة الحساسة لـ ML في الشكل 4.

كما هو متوقع، كانت التركيزات المتزايدة من جميع الأدوية قادرة على تغيير حركة الديدان لكلا السلالتين. ومع ذلك، كان هناك فرق كبير في قوتها. تم حساب القيم لكل دواء على كلا العزلتين وعرضها في الجدول 3.

أولاً، كانت جميع الأدوية الثلاثة أكثر فعالية على السلالة المرجعية مقارنة بالعزلة الميدانية الأخرى، كما يتضح من الانخفاض في القيم، تكشف أن الديدان المجمعة من المزرعة التي لا تعاني من حساسية ML، كانت واضحة أنها تتحمل ML، عند مقارنتها بنظيراتها الحساسة. ثانياً، على كلا العزلتين، كانت MOX هي الدواء الأكثر فعالية عند مقارنتها بـ IVM و EPR كما يتضح من الأصغر داخل العزلات ومع ذلك، كانت فعالية MOX وIVM منخفضة بشكل مشابه في العزلة المقاومة، مما يكشف عن تحمل عالٍ لهذه الديدان لكلا الدواءين، كما يتضح من نفس معامل المقاومة (5.24 و5.40 لـ IVM وMOX، على التوالي. مقابل العزلة القابلة للإصابة). تم ملاحظة أعلى درجة من المقاومة للعزلة المقاومة بالنسبة لـ EPR. في الواقع، كانت قيمة RF 234، وهي مرتفعة بشكل ملحوظ لهذه المادة، ويظهر ذلك من خلال تحول كبير في المنحنى إلى اليمين. في الواقع، كانت EPR الأقل فعالية مقارنة بالمادتين الأخريين، بينما أظهرت IVM فعالية متوسطة.

لإقامة برامج فعالة لمكافحة النيماتودا، من الضروري دمج طرق حساسة وسهلة للكشف والمراقبة المنتظمة للـ AR. ومع ذلك، في التطبيقات العملية في المزارع، غالبًا ما تكون الاختبارات المتاحة مرهقة. تعتبر الحركة المنخفضة سمة رئيسية لتقييم النشاط الحيوي لمركبات مضادة الديدان. في هذه الدراسة، سعينا لتقييم جدوى قياس WMA باستخدام الجهاز الآلي WMi، كطريقة موثوقة وسريعة نسبيًا لتقييم قابلية النيماتودا للـ ML. كان هدفنا النهائي هو التمييز بين النيماتودا الحساسة والمقاومة. لقد أظهرنا، للمرة الأولى، قابلية تكرار هذه الطريقة، مما يبرز حساسيتها في التمييز بين العزلات الحساسة والمقاومة. . إليغانس و . كونتورتوس.

الهدف الرئيسي من تحقيقنا كان إجراء تحليل مقارن لفعالية الأدوية المضادة للطفيليات IVM وMOX وEPR على سلالات نموذج الديدان الخيطية C. elegans القابلة للإصابة والمقاومة، بالإضافة إلى الطفيلي الذي يصيب المجترات. . كونتورتوس.

كخطوة أولية، استكشفنا أولاً فعالية WMA في التمييز بين سلالات C. elegans القابلة للإصابة والمقاومة، باستخدام هذا النموذج المتاح بسهولة والذي يمكن الحفاظ عليه بعيدًا عن قيود الحيوانات المضيفة المصابة. -لتحقيق التحقق وتحسين الاختبار قبل تطبيقه على الديدان الطفيلية. على الرغم من أن اختبار FECRT لا يزال الاختبار الموصى به لتقييم فعالية الأدوية في المزارع، فإن LDA هي واحدة من الطرق المفضلة لتقييم فعالية ML في C. elegans والديدان المعوية. . بعد ذلك، استكشفنا التطبيق المحتمل لـ WMA ضمن نموذج الديدان الخيطية C. elegans. في هذه الدراسة، أجرينا تحليلات مقارنة لتأثير MLs على تثبيط حركة الديدان عبر ثلاثة سلالات: سلالة بريستول N2 البرية (N2B)، والسلالة المختارة بواسطة IVM IVR10، والسلالة الحساسة بشكل مفرط IVM AE501. بينما تم استخدام اختبار WMi سابقًا لمراقبة فعالية ML في C. elegans. “، هذه الدراسة تمثل الحالة الأولى التي تم فيها استكشاف فائدتها لمقارنة السلالات المقاومة والعرضة للأدوية. كما هو متوقع، كانت IVM وMOX وEPR قادرة على تغيير حركة الديدان لجميع السلالات المدروسة وتم ملاحظة اختلافات في قوة الأدوية بين السلالات. في الواقع، كانت IVM قادرة على تغيير حركة ديدان N2B بقوة عالية جداً، بينما أظهرت MOX وEPR قوة مشابهة، ولكن أقل من IVM. ثم قمنا بقياس تأثير ML على حركة ديدان C. elegans المقاومة لـ ML. تم اختيار هذه السلالة تحت ضغط IVM وهي مقاومة بشدة للثلاثة MLs، كما تم تحديده بواسطة LDA. كانت التركيزات الأعلى بكثير من الثلاثة MLs مطلوبة للتأثير على حركة الديدان من سلالات IVM المختارة، مما يظهر أن سلالة IVR10 لم تكن فقط متحملة لـ IVM ولكن أيضًا لـ MOX و EPR، كما لوحظ باستمرار في بيانات LDA. ومن المثير للاهتمام أن نتائجنا أشارت إلى قوة متساوية لـ IVM في تثبيط حركة كل من سلالة N2B الأبوية وسلالة IVM الحساسة بشكل مفرط، كما يتضح من معامل RF المتطابق، بينما باستخدام LDA، تظهر سلالة AE501 حساسية مفرطة لـ IVM مقارنة بـ N2B. . تشير هذه البيانات إلى احتمال وجود قيود في حساسية اختبار الحركة مقارنةً بـ LDA. ومع ذلك، أظهر اختبار WMi فعاليته في التمييز بين N2B و IVR10. كشفت التحليلات المقارنة للمواد الثلاثة أن IVM هو أكثر الأدوية فعالية في سلالات N2B و IVR10 باستخدام WMi. يتماشى هذا مع النتائج السابقة التي تظهر حساسية حركة N2B لـ IVM و . ومع ذلك، بينما استمرت الاتجاه نحو زيادة فعالية IVM في دودة AE501، لم تكن الفروق ذات دلالة مقارنة بعلاج EPR (الجدول 2). وهذا يكشف عن اختلافات مع بيانات LDA السابقة، التي تظهر فعالية أعلى لـ EPR في IVR10

تمت مقارنة الديدان مع N2B. وهذا بالتأكيد بسبب تأثير الدواء على النمط الظاهري الملحوظ الذي يختلف من اختبار لآخر. تتأثر الحركة بـ ML بطريقة مختلفة عن تطور اليرقات. وهذا يكشف عن تناقضات بين الاختبارات ويشجع على أخذ دقة الفحوصات في الاعتبار عند اختيار اختبار لتقييم فعالية الدواء. تعتبر MLs، وخاصة IVM، موصوفة جيدًا لتأثيرها المثبط على حركة الديدان. ومع ذلك، لوحظت تباينات في التركيز مع دراسات أخرى (الجدول 1). في الواقع، أظهرت نتائجنا تثبيطًا كبيرًا في الحركة عند تركيزات ML أقل من تلك المستخدمة في الدراسات السابقة. كمثال،

أجرى هاهنل وآخرون تحليلًا مقارنًا لفعالية IVM وMOX في قمع حركة N2B باستخدام WMi. كشفت نتائجهم أن MOX أظهر فعالية أكبر بمقدار 2.4 مرة في تثبيط الحركة مقارنةً بـ IVM في تجربتهم. . في نفس النطاق، اختبر ريسي وآخرون تأثير IVM على حركة C. elegans L4 وحصلوا على قيمة لـ . يمكن أن تُعزى مثل هذه التباينات إلى الطريقة المحددة المستخدمة في تطبيق التعلم الآلي على الدودة، والتي تأخذ في الاعتبار توافر الدواء في الاختبار. في نهجنا، نقدم مباشرة من ML في البئر دون تخفيف مسبق في حاوية أخرى. قد يكون الانخفاض في توافر ML الحيوي مرتبطًا بالاحتفاظ بـ ML في البلاستيك، ويعتمد توافره الحيوي على هذه العوامل. نوصي بتجنب اتصال ML مع حاويات متعددة لتحسين توافر ML أثناء الاختبار. يبرز الجدول 1 المزيد من التفاصيل حول أن القيم أقل بشكل ملحوظ بالنسبة لاختبارات LDA مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من اختبارات الحركة. يمكن تفسير ذلك، كما أوضح مونغويا وآخرون، بأن أوقات القراءة الممتدة لاختبارات LDA في . أدى contortus إلى زيادة ملحوظة في الحساسية لمضادات الديدان القياسية، بما في ذلك IVM، مقارنةً باختبار مدته 24 ساعة يقيس مباشرةً تأثيرات مضادات الديدان على الحركة .

مجتمعة، تُظهر هذه النتائج أولياً فائدة WMi في تقييم استجابة ML في C. elegans. ومع ذلك، بينما يميز LDA بشكل فعال ديدان AE501 الحساسة بشكل مفرط، لم يكشف اختبار WMi عن مثل هذه الحساسية المتزايدة تجاه الدواء. ومع ذلك، تبرز دراستنا تعقيد تفسير استجابات تركيز ML عبر دراسات مختلفة، بسبب التباينات في طرق تطبيق الدواء، والأنماط الظاهرة التي تم تقييمها، وعوامل أخرى مساهمة (مدة الحضانة، مرحلة تطور C. elegans…).

بينما يُعتبر اختبار تقليل عدد بيض البراز (FECRT) حاليًا هو الأسلوب المفضل لتحديد مقاومة الأدوية على مستوى المزرعة ، إنها تحمل قيود كونها تتطلب الكثير من العمل، مكلفة، وقادرة على اكتشاف المقاومة فقط عندما تكون قد وصلت بالفعل إلى مستويات مرتفعة نسبياً. تُعتبر الاختبارات في المختبر الأكثر كفاءة للكشف المبكر عن . في هذا السياق، يتم مراقبة حركة الديدان من خلال اختبار هجرة اليرقات في تم اقتراح . contortus . ومع ذلك، فإن العد اليدوي لليرقات في كل بئر، والذي يتطلب جهدًا كبيرًا، قد يكون أحد الأسباب التي تجعل هذا الاختبار لا يُستخدم بشكل شائع في الميدان للكشف عن مقاومة الأدوية. لذلك، درسنا تطبيق WMi على . كونتورتوس اليرقات وقارنت فعالية الـ ML في عزلتين، واحدة حساسة والأخرى، التي تم جمعها من المزرعة، يشتبه في أنها مقاومة للـ ML. في الواقع، الـ القيم التي تم الحصول عليها لـ IVM و MOX (الجدول 3) كانت متسقة مع التركيزات التي تم الإبلاغ عنها سابقًا لاختبارات الحركة في بعد 24 ساعة من الحضانة . ثم، لاحظنا فعالية أقل للأدوية الثلاثة في العزلات المقاومة. كانت نسبة RF، للأدوية الثلاثة، بين العزلات الحساسة والعزلات المقاومة من . كانت مقاومة . contortus باستمرار أكبر من 5، مما يشير إلى مستوى كبير من المقاومة لهذه الأدوية الثلاثة. كان MOX أكثر فعالية من IVM، بينما كان EPR هو الدواء الأقل فعالية، حيث أظهر أعلى RF مقارنة بـ IVM و MOX (RF يصل إلى 234). ومع ذلك، أظهر IVM و MOX نفس RF (5.24 و 5.40 على التوالي). كان ترتيب الفعالية الملحوظ لـ MLs لـ كان تأثير R-EPR1-2022 من H. contortus مشابهًا بشكل وثيق لذلك الذي لوحظ في العزلة المقاومة H. contortus Kokstad، مما يبرز أن MOX أكثر فعالية بشكل ملحوظ من IVM وEPR. حسب علمنا، هذه هي أول تقرير يظهر أهمية تقييم الحركة الكمي عالي الإنتاجية باستخدام WMi في الكشف عن AR في طفيلي ميداني. أظهرت الدراسات أن أدوات التشخيص الأبسط والأسرع قد تدعم زيادة الاستخدام في الممارسة البيطرية، على الرغم من أن التنفيذ يمكن أن يختلف اعتمادًا على السياق والحواجز المتصورة. . من المثير للاهتمام، في فترة أربعة أيام فقط على في المرحلة ومع الحد الأدنى من التدخل البشري، أظهرت نتائجنا أولاً أننا قادرون على تقييم ومقارنة فعالية التعلم الآلي على عزلات H. contortus الحساسة. علاوة على ذلك، تشير نتائجنا إلى أن WMA، باستخدام تقنية الميكروتراكر، يمكن أن توفر طريقة فعالة وعملية لمساعدة الأطباء البيطريين والمزارعين في الميدان في الكشف عن مقاومة الأدوية في عزلات H. contortus، في انتظار مزيد من التحقق على عينات حقلية حقيقية. تم تطوير طريقة ALMA في البداية لتقييم تعديل حساسية ليفاميزول أو بيرنتيل في يرقات H. contortus L2 المعرضة في نفس الوقت لـ siRNA المستهدف لـ Hco-acr- . تم تطبيقه لاحقًا على عزلات H. contortus القابلة للإصابة (S، ويبرج) والمقاومة (R، كوكستاد)، مما أظهر إمكانيته لتحديد المقاومة بشكل منهجي وفحص الأدوية الجديدة. ومع ذلك، لتحفيز مقاومة الأدوية لعزلات المقاومة، قاموا بمعالجة الأغنام بثلاثة أدوية مضادة للطفيليات (ليفاميزول، بيرانتيل، وIVM) بعد الإصابة، مما أدى إلى نسبة مقاومة قدرها 15.1 لـ IVM. . بالمقابل، باستخدام WMi، وجدنا في العزلات المقاومة لدينا RF بقيمة 5 تعكس المقاومة الفطرية لعزلاتنا، دون العامل الإضافي المتمثل في تحفيز المقاومة من خلال العلاج. في الواقع، من الضروري ملاحظة أن لدينا لم يتم إعادة معالجة عزلات . contortus سابقًا بالأدوية، بعد فشل علاج EPR، وكانت أكثر تحملًا بشكل طبيعي لـ EPR، دون علاج IVM. وهذا يدعم المزيد من المقاومة المتقاطعة بين MLs. فيما يتعلق بـ WMi، قام Munguia وآخرون بتقييم حساسية الأدوية في . كونتورتوس اليرقات، تتماشى مع نتائجنا للعزلات الحساسة (كيربي)، ولكن تفتقر إلى بيانات عن السلالة المقاومة. نظامهم الآلي سمح التحليل بالكشف عن المركبات بسرعة عالية ولكنه أظهر قابلية أقل، مما يتطلب تركيزات أعلى من الأدوية المضادة للطفيليات مقارنة بالتحليلات في مرحلة البلوغ. أظهرت دراستنا أن WMi يميز بفعالية بين الأنواع القابلة للإصابة والمقاومة. ديدان .contortus باستخدام عزلات ميدانية نقية تكون طبيعية
متحمل بشكل كبير لـ EPR، دون مقاومة ناتجة عن المختبر. هذا يعكس بشكل أفضل الظروف الواقعية ويبرز قابلية تكيف هذه الطريقة لتقييم فعالية الأدوية في العزلات الميدانية، لا سيما في اكتشاف المقاومة الناشئة. علاوة على ذلك، يجب أن يحسن فهمنا لكيفية تأثير الفئات الفرعية داخل مجموعة أكبر على المقاومة العامة، وهو أمر أساسي لمراقبة وإدارة ديناميات مقاومة الأدوية بشكل فعال. من خلال قياس الحركة بشكل مباشر، يوفر WMi نهجًا قويًا لتقييم AR عبر تنوع. . سكان C. contortus. أخيرًا، القليل من الدراسات استكشفت اختبار الحركة كطريقة فعالة للكشف عن مقاومة الأدوية. كمثال، اقترح تقرير أن حركة الـ كانت المرحلة ظاهرة ضعيفة للكشف وقياس مقاومة الأدوية لمختلف الديدان المعوية. . في الواقع، في هذه الدراسة، لم تحقق تقنية RF أكثر من 2 في النتيجة بغض النظر عن الطفيلي الذي تم اختباره. يمكن تفسير هذه الفروق بـ (i) الاختبار المستخدم الذي كان يعتمد على هجرة اليرقات وهو أقل حساسية من اختبار الحركة المستخدم في الدراسة الحالية و (ii) وجود القشرة حيث عمل المؤلفون على الطفيليات المغلفة. وهو حاجز قوي، يحمي الدودة من بيئتها، خاصة ضد المواد الغريبة. قمنا بإجراء بحثنا حول اليرقات، التي تضمن أن كلا من القابلين للإصابة والمقاومين تم التعرض بشكل مثالي للدواء. أظهرت دراسة أخرى على الدودة الخيطية ديروفيلاريا إيميتيس أن حركة الميكروفيلاريا لم تكن سمة موثوقة للكشف عن المقاومة في هذا الطفيل، مما شجع المحترفين على إجراء اختبارات حية مثل اختبار تثبيط الميكروفيلاريا في وجود حالة مشبوهة من العزلات المقاومة. . هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات لاستكشاف تطبيقاته المحتملة الأوسع على طفيليات أخرى ومواد مضادة للديدان. في الواقع، فإن WMA مناسب للغاية لقياس نشاط مضادات الديدان الأخرى التي تعمل في نظام الأعصاب والعضلات للديدان الخيطية، وخاصة المحفزات لمستقبلات الأسيتيل كولين النيكوتينية (nAChRs) مثل ليفاميسول. بالمقابل، فإن WMi ليس هو الأسلوب الأكثر مباشرة لتقييم نشاط البنزيميدازولات على . كونتورتوس، نظرًا لطريقة عملها من خلال B-tubulin. تعتبر طرق بديلة مثل اختبارات فقس البيض (EHA) أو LDA أكثر ملاءمة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تسلسل البيروسكوب، وPCR، ونهج نيمابيووم مناسبة تمامًا للكشف عن مقاومة BZ، حيث توفر نتائج أسرع، خاصة عند تطبيقها مباشرة على البيض. . علاوة على ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة في أستراليا فعالية استخدام وطريقة نيمابيووم للكشف عن BZ يجب أن يكون من المثير للاهتمام بشكل كبير تطوير تقنية BZ Nemabiome للبيض لتحقيق نتائج أسرع.

بينما نوضح أن WMi هو اختبار ذو صلة لتقييم مقاومة ML في H. contortus، لا تزال هناك عدة تحديات رئيسية. في البداية، ركزنا على المنقى . كونتورتوس للتحقق من صحة الطريقة، حيث أن هذا النوع غالبًا ما يهيمن بعد العلاج بمضادات الديدان في المناخات الأكثر دفئًا حيث يكون شائعًا. يبدو أن استراتيجية WMi ذات صلة خاصة بالتنفيذ في المناخات الحارة والرطبة، حيث . كونتورتوس شائع للغاية وغالبًا ما يكون الطفيل السائد، كما تم الإبلاغ في مناطق مثل أستراليا على الرغم من أن H. contortus يتواجد عادة في المناطق المعتدلة مع أنواع أخرى من الديدان الخيطية المعوية، إلا أنه غالبًا ما يبقى النوع الأكثر مقاومة للأدوية. تدعم هذه النتائج قابلية تطبيق نهج WMi على نطاق أوسع عبر سياقات بيئية وبائية متنوعة. ومع ذلك، تحتوي العينات الميدانية في كثير من الأحيان على مزيج من أنواع الديدان الخيطية، مما يشكل تحديات لتقنية WMi. سيكون من الخطوات الحاسمة معالجة كيفية تأثير تركيب الأنواع في العينات الميدانية على موثوقية الاختبار. علاوة على ذلك، يجب تعديل WMi لتناسب أنواع الديدان الخيطية الشائعة الأخرى، مثل Teladorsagia circumcincta، التي تصيب الأغنام بشكل مشترك وغالبًا ما تكون الأنواع السائدة في المناخات الباردة.

limitation آخر هو الوجود المحتمل لمجموعات مختلطة من الديدان الخيطية المقاومة والحساسة داخل عينة واحدة، مما قد يعيق اكتشاف المقاومة. للتغلب على ذلك، يجب إجراء تجارب لتحديد نسب مختلفة من الديدان الخيطية المقاومة والحساسة. بالإضافة إلى ذلك، فإن توفر مرجع للعزلات الحساسة هو متطلب مهم. لتأسيس قيم مرجعية قوية لفعالية الأدوية، يجب توسيع عدد الاختبارات لتوليد معايير موثوقة للعزلات الحساسة لكل نوع من أنواع الديدان الخيطية. ستساعد هذه الجهود في التحقق من صحة الطريقة للاستخدام الميداني وتوفير أساس للبحوث المستقبلية التي تهدف إلى تحسين اكتشاف مقاومة ML. إن المقاومة لـ MLs في السكان الميدانيين، وخاصة في بعض مناطق الإنتاج مثل Pyrénées-Atlantiques، حيث تنتشر المقاومة لـ EPR بشكل خطير، يبرز الحاجة الملحة لطرق سريعة وموثوقة لتحديد والتفريق بين السكان الحساسة والمقاومة. تعتبر هذه الأدوات ضرورية لتنفيذ تدابير مضادة مناسبة عند وجود المقاومة ولتقليل العلاجات – وبالتالي الضغط الانتقائي – عندما لا تكون المقاومة قد تم تأسيسها بعد، مما يدعم الاستخدام المستدام لمضادات الديدان حيثما أمكن. نهج رئيسي آخر هو السيطرة المعتمدة على الملاذات، التي تحافظ على تجمعات الطفيليات غير المعالجة لإبطاء مقاومة مضادات الديدان. ومع ذلك، لا يزال يتعين تأكيد فعاليتها، مما يتطلب مزيدًا من البحث لتحسين تطبيقها. .

في الختام، تسلط نتائجنا الضوء للمرة الأولى على أن اختبار WMA يعد اختبارًا قويًا يمكن استخدامه بفعالية للتمييز بين الديدان الخيطية C. elegans و H. contortus القابلة للإصابة والمقاومة. بينما يتطلب الاختبار الأيام، تظل أسرع بكثير من العديد من الاختبارات المتاحة حاليًا، لا سيما بالنسبة لـ MLs، التي لا تزال تفتقر إلى علامة جينية للتشخيصات الجزيئية المستقلة. نظرًا لهذه الميزة، تمثل طريقتنا نهجًا عالي الإنتاجية نسبيًا مقارنة بالتقنيات التقليدية، مما يسهل التمييز بشكل أسرع وأكثر موثوقية بين السكان القابلين للإصابة والمقاومين. علاوة على ذلك، يمكن أن يكون هذا الاختبار أداة قيمة للكشف عن مقاومة الأدوية في . كونتورتوس حيث يسمح بـ (i) التمييز بين العزلات المقاومة لـ ML والعزلات الحساسة . contortus من الحقل، (ii) تظهر مقاومة متقاطعة للمواد الثلاثة في العزلات المقاومة، و (iii) تسلط الضوء على مقاومة كبيرة لـ EPR تتماشى مع فشل العلاج المبلغ عنه من الحقل.

جميع البيانات متاحة بالكامل دون قيود. البيانات متاحة على:https://doi.org/10.57745/RTLJVH.
تاريخ الاستلام: 30 أكتوبر 2024؛ تاريخ القبول: 16 مايو 2025
نُشر على الإنترنت: 23 مايو 2025

تم تنفيذ هذا العمل في إطار مشروع ANTHERIN، الذي تم تمويله من قبل كارنو فرنسا مستقبل التربية. DOI: 10.17180/9 gve-v148. نشكر بصدق البروفيسور روجر ك. بريتشارد على مشاركته في مناقشات مثمرة، وإجراء مراجعة دقيقة، وتقديم ملاحظات لا تقدر بثمن على المخطوطة.

تم تصور البحث وتصميم التجارب بواسطة م. أ. و أ. ل. تم الحصول على التمويل بواسطة م. أ. و أ. ل. تم إجراء معظم التجارب بواسطة م. أ. و م. ج. مع مساهمات دقيقة من ج. ب. و س. ب. تم إجراء تجارب الحيوانات لتوفير عزلات H. contortus بواسطة ج. ب. و س. ج. و ب. ج. قام م. أ. بإجراء تحليل البيانات، والتحليل الإحصائي وصياغة المخطوطة، مع مساهمات محددة ومدخلات من جميع المؤلفين.

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

يجب توجيه المراسلات والطلبات للحصول على المواد إلى م.أ. أو أ.ل.
معلومات إعادة الطبع والتصاريح متاحة علىwww.nature.com/reprints.
ملاحظة الناشر: تظل شركة سبرينغر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

الوصول المفتوح هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي النسب 4.0 الدولية، التي تسمح بالاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج بأي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا كانت هناك تغييرات قد أُجريت. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمواد. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي الخاصة بالمقالة وكان استخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، فستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارةhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© المؤلف(ون) 2025

Keywords Macrocyclic lactones, Motility, Caenorhabditis elegans, Haemonchus contortus, WMicrotracker
Parasitic nematodes pose a significant threat to animal health, with profound implications for livestock welfare and productivity. Among them, Haemonchus contortus stands out as a highly pathogenic nematode parasite, exacerbating the challenges faced by livestock owners and impacting overall animal well-being and economic output . Today, the most reliable treatment for these diseases relies on the use of anthelmintic pharmaceuticals. Ivermectin (IVM) belonging to the macrocyclic lactone (ML) class, is one of the most important anthelmintic drug used worldwide in veterinary and human medicine . Moxidectin (MOX), another ML was introduced to the veterinary market and has proven to be more effective than IVM against diverse resistant isolates of nematodes in different animal species . In France, Eprinomectin (EPR) is the only anthelmintic drug that does not necessitate a milk withdrawal period during lactation, ensuring continued accessibility for dairy sheep, goats, and cattle throughout the lactating period. Inevitably, intensive use of an anthelmintic class has selected drug-resistant parasite populations globally in many animal species. This is now a major global problem in small ruminants, increasing in cattle , and in some parasites of companion animals . Nowadays, important losses in productivity in farm animals result from failure to control resistant worms adequately. The rapid spread of MLs resistance compromises not only the control of parasites in animals but also in humans . Consequently, preventing, diagnosing, and managing anthelmintic resistance (AR) take precedence as primary research focuses in veterinary helminthology and is also a concern for control of nematode parasites in humans .

In that context, actions are needed to detect drug resistance early, and to preserve efficacy of existing drugs as much as possible. This requires an in-depth understanding of the mechanisms of resistance to anthelmintics. Investigating mechanisms of AR in parasites is a challenging task because of their complex life cycle, relying on propagation in the host. Therefore, the free-living nematode Caenorhabditis elegans is a powerful and recognized model to study AR . The use of this model system has considerably improved the understanding of the mechanism of action of anthelmintics, as the targets of some of them have been elucidated through advanced genetic screens for C. elegans mutants that were resistant to their effects . C. elegans strains resistant to anthelmintics have evolved and are important models for understanding drug resistance . Moreover, the approach of using C. elegans as an experimental model of parasitic nematodes is promising as it allows fast progress. Indeed, thanks to the use of this model, we have recently identified a new key regulator of IVM tolerance; the nuclear hormone receptor NHR- .

In the field, detecting resistance in gastrointestinal nematode parasites relies on the Faecal Egg Count Reduction Test (FECRT) . This test compares egg counts prior to and post an anthelmintic treatment, computing a specific drug’s efficacy percentage. However, misunderstanding of potential factors that may affect FECRT results can prompt misguided decisions in management, with significant consequences for continuous parasite control . In this context, there is an imperative to develop robust methods for detecting drug resistance in field parasites. Motility tracking system, proposed as a whole animal approach, has been initially developed to fully characterize the locomotor behavior and circadian rhythm of locomotor activity in adult C. elegans . Subsequently, the usefulness of this test was quickly understood and multiple applications of the WMicroTracker One (WMi) emerged. Indeed, this assay has been used to study dye toxicity in C. elegans . High throughput motility analysis has been reviewed for its possible application in the search for new anthelminthics in the context of resistance . As examples, it has been used to screen anthelmintic activity of medicinal plants on . elegans and of essential oil against . contortus . The interest concerning various parasites should be stated and a number of studies were carried out. It is in that context that WMi helped to demonstrate the promising anthelmintic properties of the repurposing drug EVP4593, as an anthelmintic on of different parasite species such as Cooperia oncophora, Ostertagia ostertagi, H. contortus and Teladorsagia circumincta . Then, the protocol to study worm motility with WMi has been improved as a high throughput test to study anthelmintic activity of large libraries of compounds on . contortus . In a recent study, Suarez et al.. investigated the interaction between IVM and EPR using WMi on C. elegans. Their findings dissuaded the concurrent usage of these drugs, a practice occasionally suggested by commercial formulations, as the combined effects were not superior to their individual actions . In parallel, Automated Larval Migration Assay (ALMA) has also been adapted for highthroughput applications and has been proven effective for assessing . contortus motility, particularly in the determination of values for cholinergic agonists and MLs. While ALMA is based on migration analysis, WMi directly quantifies worm movement, providing a complementary approach that enables continuous, noninvasive motility assessment. The combination of these methods strengthens the toolkit available for large-scale drug screening and resistance monitoring in parasitology . Nevertheless, given that the WMicrotracker motility assay (WMA) has not been previously applied in the context of ML resistance, the aim of this research was to evaluate its potential to discriminate susceptible from resistant nematodes. We aimed to assess computer-aided measurements of motility as a method for rapidly evaluating drug efficacy in nematodes and assessing their resistance status. Then, we have evaluated the suitability of such methods for assessing the drug tolerance to IVM, MOX and EPR of several C. elegans strains of known resistance status and tested its applicability on a field parasite of interest, H. contortus.

IVM, MOX, EPR, dimethyl sulfoxide (DMSO), bacto agar, bacto peptone, bovine serum albumin (BSA), CaCl2, and MgSO 4 were purchased from Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, France). For all experiments, IVM, MOX and EPR were dissolved in DMSO.

Wild-type C. elegans strain N2 (N2B) and the hypersusceptible mutant strain to IVM AE501 (nhr-8(ok186)), as well as the OP50 Escherichia coli strains were obtained from the Caenorhabditis Genetics Center (CGC, University of Minnesota, Minnesota, Minneapolis, MN, USA). The IVM-selected strain named IVR10, was kindly provided by Dr C. E. James . All strains were cultured and handled according to the procedures described previously . Briefly, nematodes were cultured at on Nematode Growth Medium (NGM) agar plates ( bacto agar, bacto peptone, cholesterol, , and 25 mM KPO 4 Buffer) seeded with Escherichia coli strain OP50 as a food source. N2 Bristol and AE501 strains were cultured on classic NGM agar plate while IVM-selected strain (IVR10) was cultured on NGM plates containing of IVM. IVM-containing NGM plates were prepared as follows: stock solutions of IVM were diluted in NGM at the adequate concentration before pouring plates. Nematodes were synchronized through egg preparation with sodium hypochlorite. Briefly, an asynchronous population with majority of gravid adults and eggs was collected by washing the bottom of the NGM plates with M9 buffer ( ,5 g NaCl , 0.25 g MgSO 47 H 2 O in 1 l water) and centrifuged at 1300 g for 30 s . All worm stages except eggs were lysed with a bleaching mixture ( 5 M NaOH and hypochlorite). Three washes of M 9 were done to remove the toxic bleaching mixture. C. elegans eggs were then hatched overnight at , on an orbital shaker, in M9 solution without bacteria to obtain a synchronized population of first-stage larvae ( ).

Two purified isolates of Haemonchus contortus were used in this study. The H. contortus isolate R-EPR1-2022 was originally obtained from a dairy sheep farm in South of France, recently diagnosed with clinic therapeutic failure by FECRT , while S-H-2022 was a ML-susceptible isolate previously collected in a farm from the same region where EPR was still effective, and kept in the laboratory for several generations. The eggs were isolated from sheep feces collected either from a farm where EPR was effective, or from a farm where EPR resistance had been demonstrated. Since their recovery in 2020 and 2021, isolates were passaged twice per year in sheep infected with 10,000 infective larvae to maintain the strains. No ML drug pressure was applied during these passages. Experimentations involving sheep were performed in the experimental sheepfold facilities of the veterinary school of Toulouse ENVT (accreditation number E31 555 027). The project has been registered and authorized under the number APAFIS #40417-20230119164118 v3 by the French Ministry of Higher Education and Research.

The susceptibility to MLs of the C. elegans strains and H. contortus isolates was determined in a WMA. Motility of nematodes was assessed from score activity recording using the WMicroTracker One (WMi) from PhylumTech (Santa Fe, Argentina), which detects infrared microbeam interruptions due to worm movement in liquid media. The method used has been adapted from protocols previously described for C. elegans and H. contortus . The capacity of IVM, MOX and EPR to inhibit the worm motility was measured in a dose dependent assay by adding the drugs at increasing concentration ( for C. elegans and for H. contortus). To prevent worm sticking and to ensure uniform distribution of the worms in each well, all plastic material must be coated with BSA (Bovine Serum Albumin). The drugs were solubilized in DMSO, and the final concentration of DMSO in the assay was below , to exclude harmful effects of the vehicle . Given the significant procedural differences between C. elegans and H. contortus, in order to enhance clarity, a schematic overview of the WMi experimental procedure as well as the appropriate timeline inspired from Preez et al. , is provided in Fig. 1 for C. elegans and in Fig. 2. for H. contortus.

The WMA on C. elegans measures the potency of anthelmintics in inhibiting motility in young adults. After bleaching, were poured on 3 classic NGM agar plates. Synchronized young adults ( per well) were seeded into a final volume of M9 in a 96-flat well plate. Plates were incubated 25 min at to allow the worms to settle. Then, basal activity was measured for 30 min to normalize the movement activity in each well at the beginning of the assay. Immediately after drug treatment, each score activity was recorded for a 120 -minute period. Motility was calculated according to the formula:
(Score Activity Treated well – Score Activity Control DMSO without worms)
(Basal Activity -Basal Activity Control DMSO without worm).
Motility percentages were calculated for each treated well as -fold induction relative to DMSO treated worms which was set to 100 . To facilitate comparison with other phenotypic assays, Table 1 provides a summary of values obtained from various assays in C. elegans.

The WMA on . contortus measures the potency of anthelmintics in inhibiting motility in exsheathed larvae . Since have been shown to be at least 231 times more sensitive to MOX than , demonstrating a significant increase in drug susceptibility without affecting larval viability, were used for . Then, prior to the experiment, H. contortus larvae were treated to discard cuticle. Briefly, worms were incubated 20 min at , in tap water supplemented by and vigorously shacken by vortex every 5 min . To prevent larval aggregation, larvae were filtered through a mesh in LB medium. Each well of a 96-flat well plate received suspended in a final volume of LB medium. Then, the plates were treated with compounds and subsequently incubated at for 24 h within a humidified incubator, maintaining a atmosphere and humidity levels . Following the incubation period, motility of the larvae was restored by exposing them to light at room temperature for 5 min . Thereafter, the movement of worms within each well was recorded over a 15-minute duration using WMi technology.

The motility of worms in each well was then standardized against the average motility of control wells to derive the motility inhibition values ( ). Post -transformation of compound concentrations, dose-response curves for the motility assay were fitted using a sigmoidal model with variable slope parameters. The confidence limits were determined and graphed using GraphPad Prism (Version 6.01, https://www.graphpad.com). IC values, i.e., the concentration at which of the worms are immobilized by the drug were then calculated (GraphPad, San Diego, CA, USA). Each value was the mean of triplicate and the experiments were performed at least 3 times. RF was the fold resistance relative to the susceptible worm population ( N 2 B for C. elegans and S-H-2022 for . contortus). It was equal to the for resistant population for susceptible population.

Firstly, the bioassay data were tested for normality using the D’Agostino & Pearson omnibus normality test. Thereafter, a two-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare the effect of two categorical variables on the motility of worms: (i) biological condition (referring to drug tolerance status of strains; control, resistant or hypersensitive) and (ii) drug treatment condition (IVM, MOX and EPR) at different concentrations. Tuckey’s test was applied for multiple comparisons. Biological repeats are defined as independent experiments conducted

on separate populations of animals on different days. These analyses were performed using GraphPad Prism6 software package (Version 6.01, https://www.graphpad.com).

Different conditions were initially tested to obtain an optimal C. elegans motility response. We first verified that DMSO, used as a vehicle did not affect adult C. elegans motility when used at concentrations below . Subsequently all experiments were conducted in medium with DMSO under . We then determined the number of worms required for the experiment and established a linear correlation with motility between 30 and 90 worms (data not shown). The experiments were then performed with 40 worms per well, in the linearity range, and the motility was recorded during 120 min . We then used WMA to compare IVM susceptibility of several C. elegans strains: the wild-type Bristol N2 (N2B), IVM-selected (IVR10) and nhr-8 loss-of-function (AE501; nhr8(ok186)) (Fig. 3).

Figure 3A shows representative images of worms after 120 min incubation without or with increasing concentration of IVM. Images clearly show nice curved animals in control (DMSO) or in IVM samples at 0.01 of IVM. In these conditions, animals were regularly moving revealing that such a low concentration of IVM did not affect worm motility whatever the C. elegans strain. IVM at was able to induce total population body stiffness phenotype representing complete altered worm motility in all strains. Images reveal clear visible differences in motility phenotype between strains at of IVM. All N2B and AE501 worms being immobile, while a significant proportion of IVR10 worms were still moving. To quantify such differences, dose-response curves for IVM toward motility of young adult C. elegans of the three strains were graphed and are presented in Fig. 3B. , i.e., the concentration of IVM at which of animals are immobile and RF values, reflecting differences in the compared with that of N 2 B , are shown in Table 2.

In agreement with the images, dose-response curves showed that IVM was able to alter worm motility of all strains. However, IVM displayed different potencies in affecting C. elegans motility. Indeed, similar potency of IVM to inhibit motility was observed for N2B and AE501 worms as shown by the superposition of the two dose-response curves and by the comparable values ( and , respectively). In contrast, the dose-response curve was significantly shifted to the right for the IVM-selected strain, reflecting a decrease in susceptibility to IVM. Indeed, of IVM was 2.12 -fold higher for IVR10 than wild-type ( 71.20 and respectively, ) in agreement with a higher tolerance of IVR10 worms to IVM when compared with wild-type N2B .

Because cross-resistance between MLs is well described , we then investigated the ability of the motility test to discriminate ML tolerance between strains, by studying MOX and EPR impact on the motility of each strain. Table 2 shows that IVR10 strain was more tolerant to the three drugs tested compared with the wild-type strain with IVM being the most potent drug. Moreover, IVR10 strain was 1.85 -fold and 1.49 -fold less sensitive to EPR and MOX respectively when compared with N2B strain. IVM was also the most potent drug for N2B strain (Table 2). The trend towards greater IVM efficacy on worm motility phenotype seems to be continuing also in AE501 worm, however, differences are not significant compared with EPR treatment. The least potent drug toward motility in this strain was MOX. Taken together, these results clearly show that WMA is suitable to evaluate ML toxicity and to discriminate drug resistant from susceptible C. elegans strains but not appropriate to discriminate hypersensitivity of AE501 worms.

To respond to the urgent need of veterinarians and farmers to confirm resistance, in the context of treatment failure and suspicion of drug resistance in the field, we decided to adapt the use of WMi based on previous work , to monitor motility in . contortus and discriminate drug susceptible isolates from those developing drug tolerance. The number of Haemonchus contortus larvae per well was optimized by establishing a linear correlation between motility and worm count, confirming a linear range between 20 and 100 worms (data not shown). Based on this, experiments were conducted using 80 worms per well. The results of the dose-response

experiments with IVM, MOX and EPR against an . contortus isolate issued from a farm with therapeutic failure was compared with the ML-susceptible isolate in Fig. 4.

As expected, increasing concentrations of all drugs were able to alter worm motility of both strains. However, there was a significant difference on their potency. values for each drug on both isolates have been calculated and are presented in Table 3.

Firstly, all three drugs were more effective on the reference strain than to the other field isolate, as demonstrated by the lower values, revealing that the worms collected form the farm that have no MLsusceptibility, were clearly ML-tolerant, when compared to the sensitive counterparts. Secondly, on both isolates, MOX was the most potent drug when compared with IVM and EPR as shown by the smaller within isolates ( versus IVM treatment.). However, the potency of MOX and IVM was similarly low in the resistant isolate, revealing high tolerance of these worms to both drugs, as demonstrated by the same RF ( 5.24 and 5.40 for IVM and MOX, respectively, versus susceptible isolate). The most substantial degree of resistance of the resistant isolate was observed for EPR. Indeed, the RF was 234 , considerably high for this substance and is reflected by a huge shift of the curve to the right. Indeed, EPR was the least potent compared with the two other substances, while IVM displayed intermediate potency.

To establish robust nematode control programs, it is essential to integrate highly sensitive and easy methods for detecting and regularly monitoring AR. However, in practical farm applications, the available assays are often laborious. Reduced motility is a key phenotype for evaluating the bioactivity of anthelmintic compounds. In this study, we sought to evaluate the feasibility of measuring the WMA using the automated apparatus WMi, as a reliable and relatively rapid method for assessing ML susceptibility in nematodes. Our final objective was to discriminate between susceptible and resistant nematodes. We demonstrated, for the first time, the reproducibility of this method, showcasing its sensitivity in differentiating between susceptible and resistant isolates of . elegans and . contortus.

The primary objective of our investigation was to conduct a comparative analysis of the efficacy of the anthelmintics IVM, MOX and EPR on both susceptible and resistant strains of the nematode model C. elegans, as well as the parasite of ruminants . contortus.

As a preliminary step, we first explored the efficacy of WMA in distinguishing between susceptible and resistant C. elegans strains, using this readily available and easily maintained model-free from the constraints of infected host animals -to validate and optimize the test before applying it to parasitic nematodes. Although FECRT remains the recommended test for assessing drug efficacy on farms, the LDA is one of the preferred methods for evaluating ML efficacy in C. elegans and gastrointestinal nematodes . Subsequently, we explored the potential application of the WMA within the nematode model C. elegans. In this study, we conducted comparative analyses of the impact of MLs on worm motility inhibition across three strains: the wild-type Bristol N2 strain (N2B), the IVM-selected strain IVR10 and the IVM-hypersensitive AE501 strain. While the WMi assay has been previously employed to monitor ML efficacy in C. elegans , this study marks the first instance where its utility was explored to compare drug resistant and susceptible strains. As expected, IVM, MOX and EPR were able to alter worm motility of all strains studied and differences in potency of the drugs were observed between strains. Indeed, IVM was able to alter N2B worm motility with very high potency, while MOX and EPR showed comparable potency, lower than IVM. We then measured the impact of ML on worm motility of ML-resistant C. elegans. This strain has been selected on IVM pressure and is highly resistant to the three MLs, as determined by LDA . Significantly higher concentrations of the three MLs were required to affect the worm motility of the IVM-selected strains, showing that IVR10 strain was not only tolerant to IVM but also to MOX and to EPR, as consistently observed in the LDA data. Interestingly, our results indicated equal potency of IVM in inhibiting the motility of both the parental N2B strain and the IVM-hypersensitive strain, as evidenced by their identical RF, while by using LDA AE501 strain shows hyper-susceptibility to IVM compared with N2B . These data indicate a potential limitation of sensitivity of the motility test compared with the LDA. Nonetheless, the WMi assay was shown to be effective in discriminating between N2B and IVR10. Comparative analyses of the three substances revealed IVM as the most potent drug in the N2B and IVR10 strains using WMi. This aligns with previous findings demonstrating the sensitivity of N 2 B motility to IVM and . However, while the trend towards greater IVM potency persisted in AE501 worm, differences were not significant compared with EPR treatment (Table 2). This reveals differences with previous LDA data, showing a higher potency of EPR in IVR10

worms compared with N2B. This is certainly due to the drug effect on the phenotype observed which is different from one test to another. Motility is affected by ML in a different way than larval development. This reveals discrepancies between tests and encourage one to take into account the assays accuracy when choosing a test to evaluate drug efficacy. MLs, and especially IVM, are well characterized for its inhibitory effect on worm motility. Nevertheless, disparities in concentration with other studies were observed (Table 1). Indeed, our results showed a significant motility inhibition at ML concentrations lower than those used in previous studies. As an example,

Hahnel et al. conducted a comparative analysis of the potency of IVM and MOX in suppressing N2B motility by using WMi. Their findings revealed that MOX exhibited 2.4 times greater potency in inhibiting motility compared to IVM in their experiment . In the same range, Risi et al. tested the effect of IVM on C. elegans L4 motility and obtained an value of . Such discrepancies could be attributed to the specific method employed for the application of ML on the worm, which account for drug bioavailability in the assay. In our approach, we directly introduce of ML into the well without prior dilution in another container. The reduced bioavailability of ML may be associated with the retention of ML in plastic, and bioavailability is contingent on this factor. We recommend avoiding ML contact with multiple containers to improve ML availability during assay. Table 1 further highlights that the values are notably lower for LDA than those obtained from motility tests. It could be explained, as illustrated by Munguia et al., that the extended read-out times of the LDAs in . contortus resulted in notably heightened sensitivity to standard anthelmintics, including IVM, compared to a 24-hour test directly measuring the effects of anthelmintics on motility .

Taken together, these results preliminarily demonstrate the utility of WMi in assessing ML response in C. elegans. However, while the LDA effectively discerns hypersensitivity AE501 worms, the WMi assay did not reveal such heightened sensitivity to the drug. Nevertheless, our study highlights the complexity of interpreting ML concentration responses across various studies, owing to variations in drug application methods, phenotypes assessed, and other contributing factors (time of incubation, C. elegans development stage…).

While the fecal egg count reduction test (FECRT) is presently the favored approach for identifying AR at the farm level , it bears the limitations of being labor-intensive, costly, and capable of detecting resistance only when it has already reached relatively high levels. In vitro assays are regarded as the most efficient for the early detection of . In this context, monitoring worm motility via the larval migration assay in . contortus has been suggested . However, the manual counting of larvae in each well, which is labor-intensive, could be one of the reasons why this test isn’t commonly employed in the field for detecting drug resistance. Therefore, we studied WMi application on . contortus larvae and compared ML efficacy in two isolates, one susceptible and one, collected in farm, suspected of being ML resistant. Indeed, the values obtained for IVM and MOX (Table 3) were consistent with the concentrations previously reported for motility assays in after 24 h of incubation . Then, we observed lower efficacy for the three drugs in the resistant isolates. The RF, for the 3 MLs, between susceptible and resistant isolates of . contortus was consistently greater than 5, indicating a significant level of resistance to these 3 drugs. MOX was more potent than IVM, while EPR was the least potent drug, displaying the highest RF compared to IVM and MOX (RF up to 234). However, IVM and MOX displayed the same RF (5.24 and 5.40 respectively). The observed order of potency of MLs for . contortus R-EPR1-2022 closely mirrored that observed in the resistant H. contortus Kokstad isolate, highlighting MOX as significantly more potent than IVM and EPR . To our knowledge, this is the first report showing the significance of high-throughput quantitative motility assessment using WMi in detecting AR in a field parasite. Studies have shown that simpler and faster diagnostic tools may support greater uptake in veterinary practice, although implementation can vary depending on context and perceived barriers . Interestingly, in just a fourday period on the stage and with minimum human intervention, our results showed first that we were able to evaluate and compare ML efficacy on susceptible H. contortus isolates. Furthermore, our findings suggest that the WMA, using microtracker technology, could provide an efficient and practical method for assisting veterinarians and farmers in the field in detecting AR in H. contortus isolates, pending further validation on real field samples. The ALMA method was initially developed to evaluate levamisole or pyrantel susceptibility modulation in H. contortus L2 larvae co-exposed to siRNA targeting Hco-acr- . It was later applied to susceptible (S, Weybridge) and resistant (R, Kokstad) H. contortus isolates, demonstrating its potential for systematic resistance determination and novel drug screening. However, to induce AR of the resistant isolates, they treated the sheep with the three anthelmintics (levamisole, pyrantel, and IVM) after infestation, resulting in an RF of 15.1 for IVM . In contrast, using WMi, we found on our resistant isolates a RF of 5 reflecting the inherent resistance of our isolates, without the additional factor of inducing resistance through treatment. Indeed, it is crucial to note that our . contortus isolates were not previously re-treated with drugs, after the EPRfailed treatment, and were naturally more tolerant to EPR, without IVM treatment. This further supports crossresistance among MLs. Concerning WMi, Munguia et al. assessed drug susceptibility in . contortus larvae, aligning with our results for susceptible isolates (Kirby), but lacking data on resistant strain. Their automated assay allowed for high-throughput compound screening but showed lower susceptibility, requiring higher anthelmintic concentrations than adult-stage assays . Our study demonstrated that WMi effectively differentiates between susceptible and resistant . contortus worms using purified field isolates that are naturally
highly tolerant to EPR, without laboratory-induced resistance. This better reflects real-world conditions and highlights the adaptability of this method for assessing drug efficacy in field isolates, particularly in detecting emerging resistance. Furthermore, it should improve our understanding of how subpopulations within a larger population can influence overall resistance, which is essential for effectively monitoring and managing drug resistance dynamics. By directly quantifying motility, WMi provides a robust approach for evaluating AR across diverse . contortus populations. Finally, few studies have explored the motility test as an effective method for detecting AR. As an example, a report suggested that motility of the stage was a poor phenotype for detecting and measuring AR of different gastrointestinal nematodes . Indeed, in this study, RF never achieved more than 2 in score whatever the parasite being tested. These differences may be explained by (i) the test used which was based on larval migration less sensitive than the motility assay used in the present study and (ii) the presence of the cuticle as authors worked on sheathed which is a robust barrier, shielding the worm from its environment, especially against xenobiotics . We conducted our research on larvae, which guarantee that both susceptible and resistant were optimally exposed to the drug. Another work on the filarial nematode Dirofilaria immitis, has shown that motility of microfilaria was not a reliable phenotype for detecting resistance in this parasite, encouraging professional to in vivo assay such as the microfilaria suppression test in the presence of a suspect case of resistant isolates . Additional investigations are needed to explore its potential broader applications to other parasites and anthelmintic substances. Indeed, the WMA is also highly appropriate for measuring the activity of other anthelmintics acting in the nematode’s neuromuscular system, in particular the agonists of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) such as levamisole. By contrast, WMi is not the most direct approach for assessing activity of benzimidazoles on . contortus, given their mode of action through B-tubulin. Alternative methods like egg hatch assays (EHA) or LDA are more appropriate. Additionally, pyrosequencing, PCR, and the Nemabiome approach are well-suited for detecting BZ resistance, providing faster results, particularly when applied directly to eggs . Moreover, recent studies in Australia have highlighted the effectiveness of using and the Nemabiome method for BZ detection . It should be of great interest to further develop the BZ Nemabiome technique for eggs to achieve even faster results.

While we demonstrate that WMi is a relevant assay for assessing ML resistance in H. contortus, several key challenges remain. Initially, we focused on purified . contortus to validate the method, as this species often dominates after anthelmintic treatment in warmer climates where it is prevalent. The WMi strategy appears particularly relevant for implementation in hot and humid climates, where . contortus is highly prevalent and often the dominant parasite, as reported in regions such as Australia . Although H. contortus typically coexists in temperate areas with other gastrointestinal nematode species, it frequently remains the most drug-resistant species . These findings support the broader applicability of the WMi approach across diverse environmental and epidemiological contexts. However, field samples frequently contain a mix of nematode species, which poses challenges for the WMi technology. Addressing how species composition in field samples affects assay reliability will be a critical next step. Moreover, WMi needs to be adapted for other common nematode species, such as Teladorsagia circumcincta, which co-infect sheep and are indeed often the dominant species in colder climates.

Another limitation is the potential presence of mixed populations of resistant and sensitive nematodes within a single sample, which could hinder resistance detection. To overcome this, experiments titrating various ratios of resistant and sensitive nematodes should be conducted. Additionally, the availability of a reference for sensitive isolates is an important requirement. To establish robust reference values for drug potency, the number of assays needs to be expanded to generate reliable benchmarks for sensitive isolates for each nematode species. These efforts will help validate the method for field use and provide a foundation for future research aimed at improving ML resistance detection. The resistance to MLs in field populations, particularly in certain production areas such as Pyrénées-Atlantiques, where resistance to EPR is dangerously spreading, underscores the critical need for rapid and reliable methods to identify and differentiate between susceptible and resistant populations . Such tools are essential for implementing appropriate countermeasures when resistance is present and for minimizing treatments-and thus selection pressure-when resistance is not yet established, thereby supporting the sustainable use of anthelmintics wherever possible. Another key approach is refugia-based control, which preserves untreated parasite populations to slow anthelmintic resistance. However, its effectiveness remains to be confirmed, requiring further research to refine its application .

In conclusion, our findings highlight for the first time, that the WMA stands as a robust test to be employed for effectively discerning between ML-susceptible and resistant C. elegans and H. contortus nematodes. While the assay requires days, it remains significantly faster than many currently available tests, particularly for MLs, which still lack a genetic marker for standalone molecular diagnostics. Given this advantage, our method represents a relatively high-throughput approach compared to traditional techniques, facilitating a more rapid and reliable differentiation between susceptible and resistant populations. Moreover, this test could be a valuable tool to detect drug resistance in . contortus as it allows to (i) discriminate ML-resistant from susceptible isolates of . contortus from the field, (ii) show cross-resistance to the three substances in resistant isolates, and (iii) highlight a huge resistance to EPR consistent with the failure of treatment reported from the field.

All data are fully available without restriction. The data is available at: https://doi.org/10.57745/RTLJVH.
Received: 30 October 2024; Accepted: 16 May 2025
Published online: 23 May 2025

This work was realized within the scope of ANTHERIN, a project funded by Carnot France Futur Elevage. DOI: 10.17180/9 gve-v148. We sincerely thank Professor Roger K. Prichard for engaging in fruitful discussions, conducting a meticulous review, and providing invaluable feedback on the manuscript.

The research was conceptualized and the experiments were designed by M. A. and A. L. Funding acquisition was performed by M. A. and A. L. Most of the experiments were conducted by M. A and M. G. with punctual contributions of J. P. and C. B. The animal experiments to provide H. contortus isolates was performed by J. P., S. J. and P. J. M. A. conducted the data analysis, the statistical analysis and drafted the manuscript, with specific contributions and input from all authors.

The authors declare no competing interests.

Correspondence and requests for materials should be addressed to M.A. or A.L.
Reprints and permissions information is available at www.nature.com/reprints.
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2025