DOI: https://doi.org/10.1007/s11626-024-00948-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39017752
تاريخ النشر: 2024-07-17
المؤلف: Imogen Targett وآخرون
الموضوع الرئيسي: إصابة الأعصاب وتجديدها
نظرة عامة
يتناول هذا القسم من ورقة البحث تمايز خط خلايا الورم العصبي SH-SY5Y إلى خلايا شبيهة بالعصبونات الناضجة، مع معالجة القيود المرتبطة باستخدام الخلايا العصبية الأولية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (hiPSC) المشتقة من البشر. يقدم المؤلفون بروتوكول تمايز يستخدم حمض الريتينويك وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF)، مما يؤدي إلى نمو كبير في المحاور والتعبير عن علامات عصبية وتشابكية رئيسية خلال 10 أيام. يجادلون بأن هذه الخلايا المتميزة يمكن أن تكون بديلاً قابلاً للتطبيق لدراسات بيولوجيا الخلايا، لا سيما في سياق تكوين الأعصاب والأمراض التنكسية العصبية، مع التحذير من استخدام خلايا SH-SY5Y غير المتميزة بسبب نقص تعبير البروتينات العصبية.
تشير النتائج إلى أن خلايا SH-SY5Y المتميزة تظهر نمطًا كولينيرجيًا/جلوتامينيًا وتوزيعًا نقطيًا لعلامات التشابك، مما يدعم استخدامها في أبحاث تكوين الأعصاب. تبرز الدراسة تنظيم فسفرة تاو خلال التمايز، مما يشير إلى أن التمايز المعطل قد يساهم في علم الأمراض المرتبطة بتاو في مرض الزهايمر (AD). يقترح المؤلفون أن بروتوكول التمايز الخاص بهم يمكن أن يسهل التحقيقات المستقبلية في تأثيرات عوامل مختلفة على تمايز الخلايا العصبية وتطور مرض الزهايمر، مع الاعتراف بحدود نظام الثقافة الأحادية البعد 2D مقارنة بتعقيد الجهاز العصبي المركزي. بشكل عام، يبرز هذا العمل إمكانات خلايا SH-SY5Y كنموذج لدراسة العمليات التنكسية العصبية ويقدم طرقًا لمزيد من البحث.
مقدمة
تسلط المقدمة الضوء على التحديات المرتبطة بنماذج زراعة الخلايا العصبية الموثوقة، لا سيما الاعتماد على الخلايا العصبية الأولية من القوارض أو الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (hIPSC) من البشر، وكلاهما مكلف وعالي الجهد. وقد أدى ذلك إلى زيادة الطلب على نماذج أكثر سهولة وقابلية للتوسع. يتم تقديم خط خلايا الورم العصبي المشتق من البشر SH-SY5Y كبديل قابل للتطبيق للدراسات العصبية في المختبر، حيث يمكن تمييزه إلى نمط عصبي من خلال بروتوكولات مختلفة تتضمن تقييد المصل والتعرض لحمض الريتينويك (RA) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF).
يبلغ المؤلفون عن استخدام بروتوكول تمايز استنادًا إلى أعمال سابقة أثبتت نجاحها في إنتاج خلايا شبيهة بالعصبونات تتميز بنمو محاور واسع وتعبير عن علامات عصبية ناضجة مثل NeuN وβ-III التوبولين. تشير نتائجهم أيضًا إلى أن هذه الخلايا المتميزة تعبر عن علامات رئيسية قبل وبعد التشابك، بالإضافة إلى علامات للخلايا العصبية الكولينيرجية والجلوتامينية، ولكن ليس للخلايا العصبية الدوبامينية. بالإضافة إلى ذلك، تكشف الدراسة عن تغييرات متسقة في فسفرة تاو خلال التمايز، مما يشير إلى أن نموذج خط الخلايا هذا قد يكون مفيدًا في التحقيق في الاضطرابات في تمايز الخلايا العصبية وتكوين الأعصاب المرتبطة بمرض الزهايمر (AD).
الطرق
يستعرض قسم “المواد والطرق” التصميم التجريبي والإجراءات المستخدمة في الدراسة. يوضح المواد المحددة المستخدمة، بما في ذلك أي مواد كيميائية، معدات، وعينات بيولوجية، مما يضمن إمكانية تكرار التجارب. يتم وصف المنهجية بشكل منهجي، تغطي إعداد العينات، والظروف التي أجريت فيها التجارب، والتقنيات التحليلية المستخدمة لجمع البيانات وتحليلها.
بالإضافة إلى ذلك، قد يتضمن القسم معلومات حول الطرق الإحصائية المطبقة لتفسير النتائج، مما يضمن أن النتائج قوية وموثوقة. بشكل عام، يعد هذا القسم أساسًا حيويًا لفهم الإطار التجريبي والتحقق من الاستنتاجات المستخلصة في الدراسة.
النتائج
في هذه الدراسة، ركزنا على بروتوكول تمايز لخلايا SH-SY5Y يستخدم حمض الريتينويك (RA) وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) على مدى 10 أيام، بهدف تحفيز أنماط عصبية كولينيرجية ودوبامينية ذات صلة بالأمراض التنكسية العصبية مثل الزهايمر وباركنسون. البروتوكول بسيط، ولا يتطلب تحضيرات وسائط معقدة أو تمرير خلايا إضافية، وينتج تركيزات كافية من البروتينات لتحليل Western blot. ومن الجدير بالذكر أننا لاحظنا تغييرات مورفولوجية كبيرة، حيث انتقلت الخلايا من شكل ظهاري إلى شكل شبيه بالعصبونات يتميز بنمو محاور واسع، كما تأكد من خلال صبغة β-III التوبولين. كشفت تقنية Western blot عن تحفيز قوي لعلامات عصبية رئيسية، بما في ذلك β-III التوبولين، والسينيبتوفيزين، وPSD-95، مما يشير إلى تشكيل هياكل تشابكية خلال التمايز.
أظهرت التحليلات الإضافية أن خلايا SH-SY5Y المتميزة أظهرت نمطًا كولينيرجيًا، كما يتضح من زيادة تعبير إنزيم أستيل كولين (ChAT) وانخفاض مستويات هيدروكسيل التيروزين (TH)، مما يشير إلى تحول بعيدًا عن الخصائص الدوبامينية. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا زيادة في مستويات ناقل الجلوتامات-أسبارتات (GLAST)، مما يشير إلى نمط مختلط محتمل كولينيرجي وجلوتاميني. كما حققت الدراسة في فسفرة تاو، كاشفة عن علاقة معقدة بين التمايز وأنواع تاو، مع زيادة في تاو الفسفوري عند بقايا محددة (S202/T205 وpS396) جنبًا إلى جنب مع انخفاض في هياكل تاو عالية الترتيب. تشير هذه النتائج إلى أن بروتوكول التمايز لا يعزز فقط الخصائص العصبية، بل يوفر أيضًا رؤى حول الآليات التنظيمية لفسفرة تاو، والتي قد تكون ذات صلة بالعمليات التنكسية العصبية. بشكل عام، يقدم هذا البروتوكول نموذجًا قويًا لدراسة تطوير الخلايا العصبية والأمراض المرتبطة بها.
المناقشة
في هذه الدراسة، نجح المؤلفون في تمييز خط خلايا الورم العصبي SH-SY5Y إلى خلايا شبيهة بالعصبونات الناضجة التي تظهر نمطًا كولينيرجيًا/جلوتامينيًا من خلال بروتوكول يتضمن تقييد المصل، وحمض الريتينويك، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF). عرضت الخلايا المتميزة توزيعًا نقطيًا لعلامات التشابك الأساسية على طول المحاور، مما يبرز أهمية التمايز لتعبير البروتينات العصبية، التي تكون غائبة في الخلايا غير المتميزة. يتماشى هذا الاكتشاف مع الأبحاث السابقة التي تشير إلى تغييرات كبيرة في تعبير بروتين سلف الأميلويد (APP) وتوزيعه خلال تمايز خلايا SH-SY5Y.
تشير الدراسة أيضًا إلى أن بروتوكول التمايز هو نموذج مناسب للتحقيق في تكوين الأعصاب وتمايز الخلايا العصبية، لا سيما في سياق مرض الزهايمر (AD)، حيث يُعرف أن تكوين الأعصاب لدى البالغين ينخفض مع التقدم في العمر. يقترح المؤلفون أن تنظيم فسفرة تاو خلال التمايز قد يربط بين تمايز الخلايا العصبية السلفية غير الوظيفية وعلم الأمراض المرتبطة بتاو في مرض الزهايمر. يمكن أن تستكشف الأبحاث المستقبلية تأثير عوامل مختلفة، مثل بيتا-أميلويد، والعوامل العصبية الالتهابية، والسموم البيئية، على هذه العملية التمايزية. بينما يعترف المؤلفون بحدود نظام الثقافة الأحادية البعد 2D، يؤكدون على فائدته لدراسات إثبات المفهوم والاختبارات عالية الإنتاجية، مما يمهد الطريق لتحقيقات أكثر تعقيدًا في الآليات المرتبطة بمرض الزهايمر.
DOI: https://doi.org/10.1007/s11626-024-00948-6
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39017752
Publication Date: 2024-07-17
Author(s): Imogen Targett et al.
Primary Topic: Nerve injury and regeneration
Overview
This research paper section discusses the differentiation of the SH-SY5Y neuroblastoma cell line into mature neuronal-like cells, addressing the limitations of using primary and human-induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. The authors present a differentiation protocol utilizing retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), which leads to significant neurite outgrowth and the expression of key neuronal and synaptic markers within 10 days. They argue that these differentiated cells can serve as a viable alternative for cell biology studies, particularly in the context of neurogenesis and neurodegenerative diseases, while cautioning against the use of undifferentiated SH-SY5Y cells due to their lack of neuronal protein expression.
The findings indicate that the differentiated SH-SY5Y cells exhibit a cholinergic/glutamatergic phenotype and a punctate distribution of synaptic markers, supporting their use in neurogenesis research. The study highlights the regulation of Tau phosphorylation during differentiation, suggesting that impaired differentiation may contribute to Tau pathology in Alzheimer’s disease (AD). The authors propose that their differentiation protocol could facilitate future investigations into the effects of various factors on neuronal differentiation and AD development, while acknowledging the limitations of their 2D monoculture system compared to the complexity of the central nervous system. Overall, this work underscores the potential of SH-SY5Y cells as a model for studying neurodegenerative processes and offers avenues for further research.
Introduction
The introduction highlights the challenges associated with reliable cell culture models of neurons, particularly the reliance on primary neurons from rodents or human-induced pluripotent stem cell-derived (hIPSC) neurons, both of which are costly and labor-intensive. This has led to a demand for more accessible and scalable models. The human-derived neuroblastoma cell line SH-SY5Y is presented as a viable alternative for in vitro neuronal studies, as it can be differentiated into a neuronal phenotype through various protocols involving serum restriction and exposure to retinoic acid (RA) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
The authors report using a differentiation protocol based on previous work that successfully yields neuronal-like cells characterized by extensive neurite outgrowth and the expression of mature neuronal markers such as NeuN and β-III tubulin. Their findings further indicate that these differentiated cells express key pre- and post-synaptic markers, as well as markers for cholinergic and glutamatergic neurons, but not for dopaminergic neurons. Additionally, the study reveals consistent changes in Tau phosphorylation during differentiation, suggesting that this cell line model may be instrumental in investigating the disruptions in neuronal differentiation and neurogenesis associated with Alzheimer’s disease (AD).
Methods
The “Materials and Methods” section outlines the experimental design and procedures employed in the study. It details the specific materials used, including any reagents, equipment, and biological samples, ensuring reproducibility of the experiments. The methodology is described systematically, covering the preparation of samples, the conditions under which experiments were conducted, and the analytical techniques utilized for data collection and analysis.
Additionally, the section may include information on statistical methods applied to interpret the results, ensuring that the findings are robust and reliable. Overall, this section serves as a critical foundation for understanding the experimental framework and validating the conclusions drawn in the study.
Results
In this study, we focused on a differentiation protocol for SH-SY5Y cells that utilizes retinoic acid (RA) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) over a 10-day period, aiming to induce cholinergic and dopaminergic neuronal phenotypes relevant to neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s. The protocol is straightforward, requiring no complex media preparations or additional cell passaging, and yields sufficient protein concentrations for Western blot analysis. Notably, we observed significant morphological changes, with cells transitioning from an epithelial to a neuron-like morphology characterized by extensive neurite outgrowth, as confirmed by β-III tubulin staining. Western blotting revealed robust induction of key neuronal markers, including β-III tubulin, synaptophysin, and PSD-95, indicating the formation of synaptic structures during differentiation.
Further analysis showed that the differentiated SH-SY5Y cells exhibited a cholinergic phenotype, evidenced by increased expression of choline acetyltransferase (ChAT) and a decrease in tyrosine hydroxylase (TH) levels, suggesting a shift away from dopaminergic characteristics. Additionally, we noted an increase in glutamate-aspartate transporter (GLAST) levels, indicating a potential mixed cholinergic and glutamatergic phenotype. The study also investigated Tau phosphorylation, revealing a complex relationship between differentiation and Tau species, with an increase in phosphorylated Tau at specific residues (S202/T205 and pS396) alongside a decrease in higher-order Tau structures. These findings suggest that the differentiation protocol not only promotes neuronal characteristics but also provides insights into the regulatory mechanisms of Tau phosphorylation, which may be relevant to neurodegenerative processes. Overall, this differentiation protocol presents a robust model for studying neuronal development and associated pathologies.
Discussion
In this study, the authors successfully differentiated the SH-SY5Y neuroblastoma cell line into mature neuronal-like cells exhibiting a cholinergic/glutamatergic phenotype through a protocol involving serum restriction, retinoic acid, and brain-derived neurotrophic factor (BDNF). The differentiated cells displayed a punctate distribution of essential synaptic markers along neurites, highlighting the importance of differentiation for the expression of neuronal proteins, which are absent in undifferentiated cells. This finding aligns with previous research indicating significant changes in amyloid precursor protein (APP) expression and localization during SH-SY5Y cell differentiation.
The study further suggests that the differentiation protocol is a suitable model for investigating neurogenesis and neuronal differentiation, particularly in the context of Alzheimer’s disease (AD), where adult neurogenesis is known to decline with age. The authors propose that the regulation of Tau phosphorylation during differentiation may link dysfunctional neuronal precursor differentiation to Tau pathology in AD. Future research could explore the impact of various factors, such as beta-amyloid, neuroinflammatory agents, and environmental toxins, on this differentiation process. While acknowledging the limitations of a 2D monoculture system, the authors assert its utility for proof-of-concept studies and high-throughput assays, paving the way for more complex investigations into AD-related mechanisms.