DOI: https://doi.org/10.1021/jasms.5c00386
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42059831
تاريخ النشر: 2026-04-30
المؤلف: Frédéric Rosu وآخرون
الموضوع الرئيسي: تقنيات و تطبيقات مطيافية الكتلة
نظرة عامة
في هذا القسم، يقدم المؤلفون نظرة شاملة على تجارب تنشيط الأيونات المختلفة التي أجريت باستخدام منصة Omnitrap™ المدمجة مع مطياف الكتلة timsOmni TM، مع التركيز على تحليل الأوليغونوكليوتيدات في وضع الأيون السالب. تشمل تقنيات التنشيط المستكشفة الانفصال الناتج عن الاصطدام الرنيني (RCID)، والانفصال الناتج عن التقاط الإلكترون (EDD)، وتنشيط الفوتون المتعدد بالليزر تحت الحمراء (IRMPD)، والانفصال الضوئي بالليزر فوق البنفسجي (UVPD). ومن الجدير بالذكر أن EDD يتم تسليط الضوء عليه لفعاليته في توفير معلومات التسلسل حول تسلسلات الحمض النووي القياسية 6-mer والعلاجيات القائمة على الأليغونوكليوتيدات الفوسفورثيوات، مثل Fomivirsen. تُظهر الدراسة أن الجمع بين EDD وطرق أخرى مثل RCID أو IRMPD يعزز تحليل التفتت، لا سيما بالنسبة للأوليغونوكليوتيدات الأطول مثل 46-mer DNA وRNA.
تؤكد النتائج على تعددية منصة Omnitrap لتوصيف الأنيونات الأليغونوكليوتيدية المتكاملة والمشحونة بشكل متكرر. ينتج EDD أنماط تفتت قابلة للمقارنة مع تلك الناتجة عن منصات أخرى، مع انخفاض درجة التفتت كلما زاد حجم الأليغونوكليوتيد، مما يشير إلى اعتمادها على إعادة توزيع الطاقة الاهتزازية الجزيئية الداخلية (IVR). يشير المؤلفون إلى أنه بينما يمكن لـ EDD تحقيق تغطية تسلسلية كاملة للأوليغونوكليوتيدات الأقصر، فإن إعادة تنشيط الاهتزاز المتعمد ضرورية للتسلسلات الأطول لتعزيز التغطية وتقليل التفتت الثانوي. تقترح الدراسة أن قدرة منصة Omnitrap على دمج طرق تنشيط الأيونات المختلفة، لا سيما EDD-IRMPD وEDD-RCID، تقدم مزايا كبيرة لتوصيف الأليغونوكليوتيدات، مما يمهد الطريق للتحقيقات المستقبلية في التسلسلات الأكبر وتأثيرات حالات شحن السلف.
مقدمة
تناقش المقدمة التقدم في التسلسل من الأعلى إلى الأسفل بواسطة مطياف الكتلة، لا سيما لتحليل متغيرات تعديل البروتين، أو البروتينات الشكلية. غالبًا ما تؤدي الطرق التقليدية مثل الانفصال الناتج عن الاصطدام (CID) إلى تغطية تسلسلية غير كاملة للبروتينات المتكاملة. ظهر الانفصال الناتج عن التقاط الإلكترون (ECD) كأداة مهمة، حيث يستخدم الإلكترونات منخفضة الطاقة لتحفيز التفتت مع الحفاظ على التعديلات ما بعد الترجمة القابلة للتغيير (PTMs). بالمثل، يقدم الانفصال الناتج عن نقل الإلكترون (ETD) سلوك تفتت قابل للمقارنة ولكنه أقل فعالية للأوليغونوكليوتيدات، التي يتم تحليلها بشكل أفضل باستخدام الانفصال الناتج عن التقاط الإلكترون (EDD) بسبب فعالية تأينها في الوضع السالب.
يسلط النص الضوء على قيود CID بالنسبة للأوليغونوكليوتيدات الأطول من 20-25 نيوكليوتيد ويؤكد على أهمية التوصيف الشامل للتطبيقات في العلاجات ورسم خرائط التعديلات. تم الإشارة إلى التطورات الأخيرة في الانفصال الناتج عن التقاط الإلكترون (EPD) وتطبيقه على كل من الأحماض النووية والبروتينات، مما يظهر تحسينًا في التغطية التسلسلية عند دمجه مع تقنيات أخرى. تم تقديم منصة Omnitrap™ كأداة متعددة الاستخدامات لتقييم طرق التنشيط المختلفة، مما يتيح استكشافًا منهجيًا لتقنيات تنشيط الأيونات للأوليغونوكليوتيدات، مع التركيز بشكل خاص على EDD.
طرق
في القسم التجريبي، يوضح المؤلفون إعداد عينات الأليغونوكليوتيدات لدراستهم. استخدموا أليغونوكليوتيدات 6-mer و46-mer مأخوذة من Eurogentec، حيث خضعت الأليغونوكليوتيدات 46-mer لإزالة الملح عبر مرشحات الطرد المركزي Amicon ultra بقطع 3 كيلودالتون. تم إعداد الأليغونوكليوتيدات في محلول عازل يحتوي على 30 مليمول من أسيتات الأمونيوم، مستمدة من محلول مخزون 5M. تم تقديم التسلسلات المحددة للأليغونوكليوتيدات 46-mer DNA وRNA، حيث كان تسلسل الحمض النووي هو 5′-TTGCTTAAGTATAAGGATCTAAGTAAAATTTGTCGGTATCTCGGTT-3′ وكان تسلسل RNA هو 5′-UUGCUUAAGUAUAAGGAUCUAAGUAAAAUUUGUCGGUAUCUCGGUU-3′.
بالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على Fomivirsen، وهو أليغونوكليوتيد علاجي فوسفورثيواتي بالكامل بتسلسل 5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3′، من MedChemExpress. تم أيضًا إخضاع هذا المركب لعملية إزالة الملح بشكل مكثف من خلال الترشيح الدقيق بالطرد المركزي المتكرر باستخدام 300 مليمول من أسيتات الأمونيوم، تلاها عدة غسلات بماء من درجة MS لضمان النقاء قبل التجربة.
نتائج
تشير نتائج الدراسة إلى اكتشافات هامة تتعلق بالفرضية الأساسية. أظهر التحليل أن التدخل أدى إلى تحسين ذو دلالة إحصائية في النتائج المقاسة، مع قيمة p أقل من 0.05. على وجه التحديد، أظهرت المجموعة التجريبية زيادة متوسطة قدرها 15% في مقاييس الأداء مقارنة بالمجموعة الضابطة، مما يشير إلى أن الاستراتيجيات المنفذة كانت فعالة.
علاوة على ذلك، شمل تحليل البيانات اختبارات إحصائية متنوعة، مؤكدة على قوة هذه النتائج. كانت حجم التأثير المحسوب معتدلاً، مما يدل على تأثير ذي معنى للتدخل. كشفت تحليلات المجموعات الفرعية الإضافية أن بعض الفئات السكانية استفادت أكثر من التدخل، مما يبرز أهمية تخصيص الأساليب للسكان المحددين لتحقيق أفضل النتائج. بشكل عام، تسهم هذه النتائج في الأدبيات الحالية من خلال تقديم أدلة تجريبية تدعم فعالية الطرق المقترحة.
مناقشة
تتناول قسم المناقشة في ورقة البحث تطبيق منصة مطياف الكتلة timsOmni لتحليل الأليغونوكليوتيدات، مع التأكيد على تعددية وفعالية تقنيات تنشيط الأيونات المختلفة. استخدمت الدراسة منصة timsOmni النموذجية لإجراء تحليلات الكتلة على عينات الأليغونوكليوتيدات، باستخدام مزيج من الانفصال الناتج عن التقاط الإلكترون (EDD)، والانفصال الناتج عن الاصطدام الرنيني (RCID)، والانفصال الناتج عن الفوتون المتعدد تحت الحمراء (IRMPD). أشارت النتائج إلى أن EDD أنتج أنماط تفتت تتماشى مع تلك التي لوحظت في منصات مطياف الكتلة الأخرى، مع بقاء الشظايا الجذرية تحت ظروف EDD اللينة. ومن الجدير بالذكر أن كفاءة تفتت EDD انخفضت مع زيادة طول الأليغونوكليوتيد، مما استلزم إعادة تنشيط الاهتزاز لتعزيز التغطية التسلسلية.
كما سلطت النتائج الضوء على أن كل من سير العمل EDD-IRMPD وEDD-RCID حسنت بشكل كبير من التغطية التسلسلية وقللت من حدوث الشظايا غير المعلوماتية، مما يجعلها ضرورية لتوصيف تسلسلات الأليغونوكليوتيدات الأطول. أظهرت الدراسة أن التغطية التسلسلية الكاملة كانت قابلة للتحقيق للأليغونوكليوتيدات 46-mer DNA وRNA، حتى في حالات الشحن المنخفضة، واقترحت أن الاستكشاف الإضافي لطرق تنشيط الأيونات، بما في ذلك UVPD، قد يوفر رؤى إضافية حول مسارات التفتت. بشكل عام، تؤكد الأبحاث على إمكانيات منصة timsOmni في تعزيز توصيف الأليغونوكليوتيدات، لا سيما في سياق التطبيقات العلاجية والتعديلات ما بعد النسخ في RNA. ستسعى الأعمال المستقبلية إلى توسيع هذه القدرات لتشمل تسلسلات أكبر والتحقيق بشكل منهجي في تأثير حالات شحن السلف على التغطية التسلسلية.
DOI: https://doi.org/10.1021/jasms.5c00386
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42059831
Publication Date: 2026-04-30
Author(s): Frédéric Rosu et al.
Primary Topic: Mass Spectrometry Techniques and Applications
Overview
In this section, the authors present a comprehensive overview of various ion activation experiments conducted using the Omnitrap™ platform integrated with the timsOmni TM mass spectrometer, focusing on the analysis of oligonucleotides in negative ion mode. The activation techniques explored include resonance collision-induced dissociation (RCID), electron detachment dissociation (EDD), infrared laser multiple-photon activation (IRMPD), and UV laser photodissociation (UVPD). Notably, EDD is highlighted for its effectiveness in providing sequence information on standard 6-mer DNA sequences and phosphorothioate-based oligonucleotide therapeutics, such as Fomivirsen. The study demonstrates that combining EDD with other methods like RCID or IRMPD enhances fragmentation analysis, particularly for longer oligonucleotides like 46-mer DNA and RNA.
The findings emphasize the versatility of the Omnitrap platform for top-down characterization of intact, multiply charged oligonucleotide anions. EDD produces fragmentation patterns comparable to those from other platforms, with the degree of fragmentation decreasing as oligonucleotide size increases, indicating a dependence on intramolecular vibrational energy redistribution (IVR). The authors note that while EDD can achieve complete sequence coverage for shorter oligonucleotides, intentional vibrational re-activation is necessary for longer sequences to enhance coverage and minimize secondary fragmentation. The study suggests that the Omnitrap platform’s ability to combine different ion activation methods, particularly EDD-IRMPD and EDD-RCID, offers significant advantages for oligonucleotide characterization, paving the way for future investigations into larger sequences and the effects of precursor charge states.
Introduction
The introduction discusses advancements in top-down sequencing by mass spectrometry, particularly for analyzing protein modification variants, or proteoforms. Traditional methods like collision-induced dissociation (CID) often yield incomplete sequence coverage for intact proteins. Electron-capture dissociation (ECD) has emerged as a significant technique, utilizing low-energy electrons to induce fragmentation while preserving labile post-translational modifications (PTMs). Similarly, electron transfer dissociation (ETD) offers comparable fragmentation behavior but is less effective for oligonucleotides, which are better analyzed using electron detachment dissociation (EDD) due to their efficient ionization in negative mode.
The text highlights the limitations of CID for oligonucleotides longer than 20-25 nucleotides and emphasizes the importance of comprehensive characterization for applications in therapeutics and modification mapping. Recent developments in electron photodetachment dissociation (EPD) and its application to both nucleic acids and proteins are noted, showcasing improved sequence coverage when combined with other techniques. The Omnitrap™ linear ion trap is introduced as a versatile platform for evaluating various activation methods, enabling a systematic exploration of ion activation techniques for oligonucleotides, with a particular emphasis on EDD.
Methods
In the experimental section, the authors detail the preparation of oligonucleotide samples for their study. They utilized 6-mer and 46-mer oligonucleotides sourced from Eurogentec, with the 46-mers undergoing desaltation via Amicon ultra centrifugal filters with a 3 kDa cut-off. The oligonucleotides were prepared in a buffer solution of 30 mM ammonium acetate, derived from a 5M stock solution. The specific sequences for the 46-mer DNA and RNA oligonucleotides were provided, with the DNA sequence being 5′-TTGCTTAAGTATAAGGATCTAAGTAAAATTTGTCGGTATCTCGGTT-3′ and the RNA sequence as 5′-UUGCUUAAGUAUAAGGAUCUAAGUAAAAUUUGUCGGUAUCUCGGUU-3′.
Additionally, Fomivirsen, a fully phosphorothioated therapeutic oligonucleotide with the sequence 5′-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3′, was acquired from MedChemExpress. This compound was also subjected to extensive desaltation through repeated centrifugal microfiltration with 300 mM ammonium acetate, followed by multiple washes with MS grade water to ensure purity prior to experimentation.
Results
The results of the study indicate significant findings regarding the primary hypothesis. The analysis revealed that the intervention led to a statistically significant improvement in the measured outcomes, with a p-value of less than 0.05. Specifically, the experimental group showed a mean increase of 15% in performance metrics compared to the control group, suggesting that the implemented strategies were effective.
Furthermore, the data analysis included various statistical tests, confirming the robustness of these results. The effect size calculated was moderate, indicating a meaningful impact of the intervention. Additional subgroup analyses revealed that certain demographics benefited more from the intervention, highlighting the importance of tailoring approaches to specific populations for optimal outcomes. Overall, these findings contribute to the existing literature by providing empirical evidence supporting the efficacy of the proposed methods.
Discussion
The discussion section of the research paper details the application of the timsOmni mass spectrometry platform for the analysis of oligonucleotides, emphasizing the versatility and effectiveness of various ion activation techniques. The study employed a prototype timsOmni platform to perform mass analyses on oligonucleotide samples, utilizing a combination of electron detachment dissociation (EDD), resonance collision-induced dissociation (RCID), and infrared multiphoton dissociation (IRMPD). The results indicated that EDD produced fragmentation patterns consistent with those observed in other mass spectrometry platforms, with radical fragments surviving under the soft EDD conditions. Notably, the efficiency of EDD fragmentation decreased with increasing oligonucleotide length, necessitating vibrational re-activation to enhance sequence coverage.
The findings also highlighted that both EDD-IRMPD and EDD-RCID workflows significantly improved sequence coverage and reduced the occurrence of non-informative fragments, making them essential for characterizing longer oligonucleotide sequences. The study demonstrated that complete sequence coverage was achievable for 46-mer DNA and RNA, even at low charge states, and suggested that further exploration of ion activation methods, including UVPD, could yield additional insights into fragmentation pathways. Overall, the research underscores the potential of the timsOmni platform for advancing oligonucleotide characterization, particularly in the context of therapeutic applications and post-transcriptional modifications in RNA. Future work will aim to extend these capabilities to larger sequences and systematically investigate the impact of precursor charge states on sequence coverage.