DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-58523-w
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40319025
تاريخ النشر: 2025-05-03
المؤلف: Miffy H. Y. Cheng وآخرون
الموضوع الرئيسي: التداخل RNA وتوصيل الجينات
طرق
في هذه الدراسة، تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات الكندية واتبعت إرشادات جامعة كولومبيا البريطانية (A22-0044، A20-0132). تم الحصول على الدهون الأيونية المستخدمة، بما في ذلك nor-MC3 وMC3 وALC-0315 وSM-102، من الدكتور ماركو تشيوفوليني، بينما تم الحصول على الدهون الإضافية والكوليسترول من أفانتي بولار ليبيدز وسيغما ألدريش، على التوالي. تم الحصول على وسط ديلبيكو المعدل (DMEM) ومصل الجنين البقري (FBS) من ثيرمو فيشر ساينتيفيك. تم توفير mRNA الذي يشفر بروتينات التقرير فايرفلاي لوكفيراز (FLuc) وmCherry من نانوفيشن ثيرابيوتيكس إنك.
تم إجراء تحليلات بروتيوميات طيف الكتلة في منشأة بروتيوميات UBC باستخدام مطياف الكتلة TimsTOF Pro2 المدمج مع كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء (UHPLC). عمل النظام بجهد شعري قدره 1700 فولت، وتدفق غاز التجفيف 3 لتر/دقيقة، ودرجة حرارة تجفيف 200 درجة مئوية. تم استخدام طريقة تراكم متوازي-تجزئة متسلسلة (PASEF) للحصول على بيانات مستقلة عن القياس (DIA) لقياسات زمن الرحلة (TOF)، تغطي نطاق m/z من 100-1700 ونطاق حركة الأيونات من 0.7-1.3 فولت•ثانية/سم². استخدم كل دورة TIMS 25 نافذة DIA-PASEF ضمن نطاق m/z من 299.5-1200.5، مع كل نافذة تتكون من سبع مسحات ودورة عمل بنسبة 100%. تم ضبط طاقة الاصطدام بشكل خطي بناءً على قيم الحركة، تتراوح من 20 فولت عند 1/K0 = 0.6 فولت•ثانية/سم² إلى 65 فولت عند 1/K0 = 1.6 فولت•ثانية/سم².
النتائج
تشير النتائج من دراسات الكريو-TEM إلى تقدم مورفولوجي واضح في هياكل الجسيمات النانوية الليبوسومية (LNP) مع انخفاض نسبة مكونات الدهون (R_B/I). عند قيم R_B/I أعلى (9-2.3)، يُلاحظ هيكل ليبوسومي ذو طبقتين مع منطقة مائية ونواة صلبة. مع انخفاض مستويات ESM/الكوليسترول تحت R_B/I = 2، تزداد نسبة النواة الصلبة. تشير التحليلات إلى أن الشكل المحايد من nor-MC3 يقيم في النواة الكارهة للماء، بينما تقع ESM والكوليسترول في الطبقة الأحادية والثنائية من الدهون، مما يتماشى جيدًا مع البيانات التجريبية. من الجدير بالذكر أنه عند R_B/I = 4، يظهر حوالي 84% من LNPs هيكلًا ذو طبقتين مع نواة صلبة تشغل حوالي 30% من الداخل.
أظهرت اختبارات النقل في المختبر أن LNPs ذات قيم R_B/I بين 4 و0.67 أظهرت قدرات نقل قوية، وغالبًا ما تتجاوز تلك الخاصة بتكوين الدهون الشبيه بـ Onpattro. كشفت اختبارات الاستقرار أن LNPs ذات R_B/I أعلى (9-2.3) حافظت على حجمها وتغليف mRNA (>80%) على مدى 63 أسبوعًا عند 4 درجات مئوية، بينما تلك ذات R_B/I أقل (1.5-1) شهدت زيادات كبيرة في الحجم (حتى 300%) وانخفاض في التغليف (حتى 40%). علاوة على ذلك، على الرغم من أن سلامة mRNA كانت مهددة عبر جميع التركيبات أثناء التخزين، فإن تركيبة R_B/I = 4 أظهرت أعلى سلامة وقابلية للترجمة، مما يشير إلى أن LNPs ذات الهياكل الخارجية ذات الطبقتين توفر حماية معززة لشحنة mRNA. كما أشارت صور الكريو-TEM أيضًا إلى تشكيل هياكل حويصلية أكبر عند R_B/I منخفض، مما يدل على اندماج LNP وفقدان تغليف mRNA مع مرور الوقت.
المناقشة
تسلط قسم المناقشة في ورقة البحث الضوء على قدرات النقل الفائقة في الجسم الحي لأنظمة mRNA للجسيمات النانوية الليبوسومية (LNP) مقارنةً بالتركيبات الشبيهة بـ Onpattro. على وجه الخصوص، أظهر نظام LNP الليبوسومي مع نسبة مولارية من الدهون الثنائية إلى الدهون الأيونية (RB/I) تبلغ 4 تعزيزًا كبيرًا في النقل خارج الكبد، مع إشارات لومينسنس ملحوظة تم اكتشافها في أعضاء مثل الطحال والعقد اللمفية الإربية، مما يدل على توصيل فعال لـ mRNA. كشفت دراسات توزيع الأنسجة باستخدام تصوير SPECT/CT أن LNPs الليبوسومية أظهرت عمر نصف دوران أطول بمقدار 15 مرة وتوزيع أنسجة أوسع، يُعزى إلى انخفاض امتصاص بروتينات البلازما مقارنةً بـ LNPs الشبيهة بـ Onpattro.
بالإضافة إلى ذلك، أوضحت الدراسة الآليات الكامنة وراء كفاءة النقل للجسيمات النانوية الليبوسومية. يسهل وجود نواة صلبة محاطة بطبقة ثنائية من الدهون تحميل وتوصيل mRNA بكفاءة. مع انخفاض درجة الحموضة في البيئة الحويصلية، تتحول الدهون الأيونية إلى شكل مشحون إيجابي، مما يعزز التفاعل مع الغشاء الحويصلي المشحون سلبًا ويسهل توصيل mRNA إلى السيتوسول. تشير النتائج إلى أن الخصائص الهيكلية وتقليل غلاف البروتين للجسيمات النانوية الليبوسومية تساهم في دورانها المطول وزيادة قوتها في النقل، مما يستدعي مزيدًا من التحقيق في تطبيقاتها المحتملة في العلاجات القائمة على mRNA.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-58523-w
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40319025
Publication Date: 2025-05-03
Author(s): Miffy H. Y. Cheng et al.
Primary Topic: RNA Interference and Gene Delivery
Methods
In this study, all animal protocols were approved by the Canadian Animal Care Committee and adhered to the University of British Columbia’s guidelines (A22-0044, A20-0132). The ionizable lipids used, including nor-MC3, MC3, ALC-0315, and SM-102, were sourced from Dr. Marco Ciufolini, while additional lipids and cholesterol were obtained from Avanti Polar Lipids and Sigma Aldrich, respectively. Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and fetal bovine serum (FBS) were procured from Thermo Fisher Scientific. The mRNA encoding the reporter proteins Firefly Luciferase (FLuc) and mCherry was provided by NanoVation Therapeutics Inc.
Mass spectrometry proteomics analyses were conducted at the UBC Proteomics Core Facility using a TimsTOF Pro2 mass spectrometer coupled with ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC). The system operated with a capillary voltage of 1700 V, a drying gas flow of 3 L/min, and a drying temperature of 200 °C. The Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) method was employed for data-independent acquisition (DIA) of time-of-flight (TOF) measurements, covering an m/z range of 100-1700 and an ion mobility range of 0.7-1.3 V•s/cm². Each TIMS cycle utilized 25 DIA-PASEF windows within the m/z range of 299.5-1200.5, with each window comprising seven scans and a duty cycle of 100%. Collision energy was adjusted linearly based on mobility values, ranging from 20 eV at 1/K0 = 0.6 V•s/cm² to 65 eV at 1/K0 = 1.6 V•s/cm².
Results
The results from the cryo-TEM studies indicate a clear morphological progression in liposomal nanoparticle (LNP) structures as the ratio of lipid components (R_B/I) is decreased. At higher R_B/I values (9-2.3), a bilayer liposomal structure with an aqueous region and a solid core is observed. As the ESM/cholesterol levels decrease below R_B/I = 2, the proportion of the solid core increases. The analysis suggests that the neutral form of nor-MC3 resides in the hydrophobic core, while ESM and cholesterol are located in the lipid monolayer and bilayer, aligning well with experimental data. Notably, at R_B/I = 4, approximately 84% of the LNPs exhibit a bilayer structure with a solid core occupying about 30% of the interior.
In vitro transfection assays demonstrated that LNPs with R_B/I values between 4 and 0.67 showed potent transfection capabilities, often surpassing those of the Onpattro-like lipid composition. Stability tests revealed that LNPs with higher R_B/I (9-2.3) maintained their size and mRNA encapsulation (>80%) over 63 weeks at 4 °C, while those with lower R_B/I (1.5-1) experienced significant size increases (up to 300%) and reduced encapsulation (as low as 40%). Furthermore, although mRNA integrity was compromised across all formulations during storage, the R_B/I = 4 formulation exhibited the highest integrity and translatability, suggesting that LNPs with external bilayer structures provide enhanced protection for mRNA cargo. Cryo-TEM images also indicated the formation of larger vesicular structures at low R_B/I, indicative of LNP fusion and loss of mRNA encapsulation over time.
Discussion
The discussion section of the research paper highlights the superior in vivo transfection capabilities of liposomal lipid nanoparticle (LNP) mRNA systems compared to Onpattro-like formulations. Specifically, the liposomal LNP system with a molar ratio of bilayer lipid to ionizable lipid (RB/I) of 4 demonstrated significantly enhanced extrahepatic transfection, with notable luminescence signals detected in organs such as the spleen and inguinal lymph nodes, indicating effective mRNA delivery. The biodistribution studies using SPECT/CT imaging revealed that liposomal LNPs exhibited a 15-fold longer circulation half-life and a broader tissue distribution, attributed to lower adsorption of plasma proteins compared to the Onpattro-like LNPs.
Additionally, the study elucidated the mechanisms underlying the transfection efficiency of liposomal LNPs. The presence of a solid core surrounded by a lipid bilayer facilitates efficient mRNA loading and delivery. As the pH decreases in the endosomal environment, ionizable lipids transition to a positively charged form, promoting interaction with the negatively charged endosomal membrane and facilitating cytosolic delivery of mRNA. The findings suggest that the structural characteristics and reduced protein corona of liposomal LNPs contribute to their prolonged circulation and enhanced transfection potency, warranting further investigation into their potential applications in mRNA therapeutics.