جزيئات السيلينيوم النانوية المغلفة بالكيتوزان النانوي، المُصنَّعة بطريقة خضراء، كعامل مضاد للفطريات جديد ضد Sclerotinia sclerotiorum: دراسة في المختبر Nano-chitosan-coated, green-synthesized selenium nanoparticles as a novel antifungal agent against Sclerotinia sclerotiorum: in vitro study

المجلة: Scientific Reports، المجلد: 15، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-024-79574-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39762311
تاريخ النشر: 2025-01-06

افتح

جزيئات السيلينيوم النانوية المغلفة بالكيتوزان النانوي، المُصنَّعة بطريقة خضراء، كعامل مضاد للفطريات جديد ضد Sclerotinia sclerotiorum: دراسة في المختبر

محمد م. دسوقي رضوى ح. أبو صالح طارق أ. أ. موسى وهبة م. فهمي

تم استخدام المبيدات الفطرية الكيميائية للسيطرة على الأمراض الفطرية مثل Sclerotinia sclerotiorum. يجب تقييد هذه المبيدات بسبب سميتها وتطور سلالات مقاومة. لذلك، فإن استخدام المواد الطبيعية على النانو في الإنتاج الزراعي هو بديل محتمل. كان الهدف من هذا العمل هو دراسة الخصائص المضادة للفطريات لمركب نانو (جزيئات السيلينيوم التي تم تصنيعها بطريقة خضراء والمغلفة بالكيتوزان) ضد الفطر الممرض للنبات S. sclerotiorum. تم استخدام الاختزال الكيميائي لإنتاج جزيئات السيلينيوم من مستخلصات قشور الحمضيات، وتم استخدام التجلط الأيوني لإنتاج جزيئات الكيتوزان. تم إنتاج المركب النانوي باستخدام جزيئات السيلينيوم المستقرة بواسطة الكيتوزان والمترابطة مع فوسفات الصوديوم ثلاثي البولي. تم استخدام المجهر الإلكتروني الناقل، وتشتت الضوء الديناميكي، وحيود الأشعة السينية، وطيف الأشعة فوق البنفسجية-المرئية، وطيف الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه لتوصيف جميع الهياكل النانوية المنتجة. تم التحقيق في النشاط المضاد للفطريات في المختبر والتركيز المثبط الأدنى لجميع الهياكل الضخمة والنانوية في تركيزات ppm. تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح للكشف عن التشوهات الهيكلية في الفطريات. تدعم النتائج التخليق الناجح وتوصيف جميع الجسيمات النانوية. أنتج مستخلص قشر الليمون جسيمات نانوية من السيلينيوم أصغر وأكثر استقرارًا وتوزيعًا. من مستخلص قشر البرتقال لقد أظهرت الهياكل النانوية، وخاصة النانو مركبات، زيادة ملحوظة في الفعالية المضادة للفطريات مقارنة بالهياكل الكبيرة. عند تركيز مثبط أدنى يبلغ 0.5 جزء في المليون، أظهرت النانو مركب النشاط المثبط. أظهر النانو مركب بتركيز 0.5 جزء في المليون أقل متوسط للكتلة الحيوية الفطرية ( بين جميع الهياكل النانوية المختبرة. أظهرت خيوط الفطريات المعالجة بتركيز 0.5 جزء في المليون من النانو مركب خلال 18 ساعة من المعالجة أضرارًا وتشوهات كبيرة. توفر هذه النتائج رؤى جديدة حول النانو مركب كعامل مضاد للفطريات صديق للبيئة وواعد ضد الفطريات الممرضة للنباتات الأخرى.
الكلمات الرئيسية: التخليق الأخضر، الكيتوزان، السيلينيوم، النانو مركب، سكليروتينيا سكليروتيوم
س. سكليروتيوم، أو العفن الأبيض، له تأثيرات سلبية مختلفة على نمو النبات. على سبيل المثال، يمكن أن يتسبب في انخفاض وزن ساق النبات وجذوره، سواء كانت طازجة أو جافة، مما يؤدي إلى موت أنسجة العائل. يعتبر حمض الأكساليك وإنزيمات تكسير جدران الخلايا (CWDEs) سمومًا مبكرة لمرضية S. sclerotiorum، تليها إزالة المغذيات من الخلية المضيفة. على الرغم من كونه مُمْرِضًا نخرًا، إلا أنه يدخل مرحلة حيوية قصيرة، تستمر لمدة نصف يوم أو يوم واحد بعد العدوى. . إنه يعيق الحواجز الدفاعية للمضيف خلال المرحلة . بعد ذلك، تمتد خيوط الفطر تحت الجلد S. sclerotiorum إلى العديد من طبقات الخلايا. بعد أن تنجح في استعمار خيوطها المتفرعة، تنتقل S. sclerotiorum إلى مرحلة نخرية،
إنتاج كميات كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية، والسموم، وإنزيمات تكسير جدران الخلايا (CWDEs). تؤدي هذه العملية في النهاية إلى تحفيز موت خلايا العائل وظهور أعراض نخرية. .
تظهر الدراسات الحديثة تأثير السيلينيوم المضاد للفطريات ضد S. sclerotiorum كمادة طبيعية على شكل سيلينيت الصوديوم. يمكن للسيلينيوم حماية أنسجة جسم الإنسان والحيوانات من الأضرار التي تسببها الجذور الحرة. . ومع ذلك، فإن أشكال السيلينات والسيلينيت من السيلينيوم لها أعلى تأثيرات سامة بسبب ذوبانها العالي وتوافرها البيولوجي . بالمقابل، يتمتع السيلينيوم النانوي بميزة على السيلينيوم الكتلي لأنه يمكن استخدامه في حالته صفر الأكسدة ( )، الذي يتمتع بسمية منخفضة وتوافر حيوي كبير مقارنة بالحالة الكتلية . علاوة على ذلك، اكتسبت جزيئات السيلينيوم النانوية (Se NPs) اهتمامًا للاستخدام في الزراعة خلال السنوات العشر الماضية نظرًا لزيادة تأثيراتها المضادة للأكسدة والمضادة للميكروبات مع انخفاض السمية مقارنة بالسيلينيوم الضخم. .
تم مؤخرًا اختبار النشاط المضاد للفطريات لجزيئات نانو السيلينيوم المصنعة كيميائيًا ضد S. sclerotiorum ، مما يوفر فرصة كبيرة لمكافحة S. sclerotiorum. ومع ذلك، فإن إنتاج نانو جزيئات السيلينيوم عبر التخليق الكيميائي أو الفيزيائي له العديد من القيود، بما في ذلك عدة خطوات خلال عملية التخليق، واستهلاك كبير للطاقة، وتكاليف مرتفعة، وتأثيرات سامة. من ناحية أخرى، فإن التخليق البيولوجي هو بديل قابل للتطبيق ومنخفض التكلفة وصديق للبيئة لأنه يستخدم الموارد الطبيعية مثل الميكروبات ومواد النباتات. يعتبر استخدام مستخلصات المواد النباتية لتقليل أيونات المعادن إلى نانو جزيئات عملية تخليق خضراء ذات خطوة واحدة. بسبب أنشطتهم الملحوظة، تم استخدام مستخلصات الحمضيات على نطاق واسع في تخليق الجسيمات النانوية المعدنية. حمض الأسكوربيك، الذي يتواجد بكميات أكبر بثلاث مرات في قشور الحمضيات مقارنة بأجزاء الفاكهة الأخرى، هو عامل مختزل قوي يمكنه تقليل SS إلى نانو جزيئات السيلينيوم بفعالية. لذلك، تم اختيار مستخلصات قشور الحمضيات المتنوعة كمواد نباتية لتكون فعالة للغاية في تقليل SS إلى جزيئات نانوية كروية من السيلينيوم مقارنةً بمستخلصات نباتية أخرى. .
الكيتوزان (CS) هو مبيد فطري طبيعي محتمل تم اختياره في هذه الدراسة مع جزيئات السيلينيوم النانوية لعلاج العدوى بعد الحصاد في الفواكه والخضروات. . أظهرت النتائج أن العلاج باستخدام CS عند تركيزه المثالي المثبط لـ تسبب في مقاومة العائل لـ S.sclerotiorum . درست دراسات أخرى النشاط المضاد للفطريات لجزيئات الكيتوزان (CS NPs) عند التركيزات المثلى المثبطة لـ ضد S. sclerotiorum، مما يسبب أضرارًا واسعة النطاق في الغشاء البلازمي .
تتناول الدراسة الحالية نهجًا منهجيًا لتحضير وتوصيف جزيئات السيلينيوم المغلفة بالشيتيزان النانوي (NCS-Se NPs) التي تم تحضيرها بطريقة خضراء. ستلعب جزيئات الشيتيزان دورًا مزدوجًا كعامل مثبت لجزيئات السيلينيوم وكعامل مضاد للفطريات طبيعي مع جزيئات السيلينيوم ضد نفس المسبب المرضي، S. sclerotiorum. تم اختبار النشاط المضاد للفطريات في الدراسات المخبرية لتركيزات مختلفة من الجزيئات الكبيرة والنانويّة، مقارنةً بالنانوجزيئات الكاملة (NCS-Se NPs)، لدراسة تأثيرها التآزري وتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC). تم اختبار النشاط المضاد للفطريات للهياكل النانوية عند نفس تركيزات أشكالها الكبيرة، متأثرةً بحجم جزيئاتها. غالبًا ما يكون الحجم أحد العوامل الأكثر أهمية التي تؤثر على النشاط المضاد للفطريات للمادة المختبرة. تم أيضًا الكشف عن التغيرات الشكلية للمرض بعد العلاج.

النتائج والمناقشة

تحديد العزلة الفطرية

تم تسلسل منطقة ITS الفطرية باستخدام PCR وتم التحقق منها مع قواعد بيانات تسلسل GenBank. تم محاذاة جميع التسلسلات المستخرجة وتحليلها. كان أفضل نموذج استبدال مناسب للمحاذاة هو نموذج كيمورا ذو المعاملين مع توزيع غاما. تم بناء شجرة انضمام الجوار استنادًا إلى تسلسل ITS لجميع السلالات (الشكل 1). أعطى تسلسل ITS تشابهًا عاليًا مع S. sclerotiorum، وكان رقم الوصول للتسلسل هو LC799483.

تحسين التخليق الأخضر لجزيئات السيلينيوم النانوية

تم تحسين عملية التحضير واختيار قشر الحمضيات المناسب لإنتاج الجسيمات النانوية بأحجام أصغر، واستقرار أعلى، وتشتت أفضل. عادةً ما تُعرف الجسيمات النانوية الأصغر بأنها تمتلك نشاطًا مضادًا للفطريات أكثر فعالية من الجسيمات النانوية الأكبر. تم تصوير توزيع حجم جزيئات السيلينيوم النانوية (Se NPs) التي تم تصنيعها بواسطة مستخلص قشر الليمون (L.P. -Se NPs) ومستخلص قشر البرتقال (O.P. -Se NPs) باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). تم الكشف عن شحنة سطح الهيكل النانوي في كلا الحالتين باستخدام تحليل الجهد الزتاوي. كما تم إجراء مزيد من التوصيفات باستخدام طيف الأشعة فوق البنفسجية (UV) وطيف الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) وطيف الأشعة السينية (XRD) لتأكيد وتحسين التخليق الأخضر لجزيئات السيلينيوم النانوية.
الشكل 2أ، ب يظهر صور TEM لجزيئات L.P. -Se NPs و O.P. -Se NPs، على التوالي، مع عرض توزيع الحجم في الرسم البياني المرفق (في كل منهما). أكدت النتائج التخليق الأخضر لجزيئات Se NPs مع توزيع حجم أفضل لجزيئات L.P. -Se NPs دون تكتلات، كما هو موضح في الشكل 2أ. في هذه الحالة، كان متوسط القطر هو ، بينما كان متوسط قطر O.P. -Se NPs هو تم تأكيد تشتت كلا النوعين من الجزيئات من خلال قياس مؤشر التوزيع المتعدد (PDI) لكل من العينتين باستخدام جهاز قياس زتا. أظهرت النتائج أن (PDI) كان أفضل في حالة L.P. -Se NPs، بقيمة 0.196 مقارنة بـ 0.277 في حالة O.P. -Se NPs. تم دراسة سابقًا أن قيم PDI التي تقل عن 0.05 لوحظت بشكل رئيسي في العينات ذات أحجام الجسيمات المتجانسة نسبيًا. في المقابل، تشير قيم PDI التي تتجاوز 0.7 إلى نطاق واسع بشكل ملحوظ من توزيع أحجام الجسيمات تظهر النتائج لكلتا العينتين نطاقات حجم أقل من 0.7، مما يشير إلى تشتت الجزيئات مع قيم توزيع حجم أفضل لجزيئات L.P. -Se NPs .
الشكل 2ج، د يقدم جهد زتا لجزيئات L.P. -Se NPs و O.P. -Se NPs ليكون -19 مللي فولت و +12 مللي فولت، على التوالي. جهد الزتا هو الجهد الكهروستاتيكي عند قياسه عند الطبقة الكهربائية المزدوجة حول جزيء نانوي في المحلول. تحتوي الجزيئات النانوية المحايدة على جهد زتا بين -10 و +10 مللي فولت، بينما تحتوي الجزيئات النانوية الكاتيونية بشدة والجزيئات النانوية الأنيونية بشدة على جهود زتا أكبر من +30 مللي فولت أو أقل من . لذلك، تشير كلا القيمتين إلى استقرار كولوي قليل يمكن تحسينه باستخدام عامل مثبت . ومع ذلك، أظهرت جزيئات L.P. -Se NPs استقرارًا أعلى من O.P. -Se NPs، موزعة دون تكتل أو تجمع. كانت هذه النتائج متوافقة مع الدراسات السابقة لجزيئات المعادن المصنعة باستخدام مستخلص قشر الليمون .
الشكل 1. شجرة انضمام الجيران لسلالات Sclerotinia sclerotiorum المعزولة. تم إيداع S. sclerotiorum في هذه الدراسة في GeneBank برقم الوصول LC799483.1.
الشكل 2. صورة TEM لجزيئات Se NPs المصنعة بواسطة (أ) مستخلص قشر الليمون (L.P.- Se NPs) مع رسم بياني مرفق يظهر القطر الذروي عند (ب) مستخلص قشر البرتقال (O.P.- Se NPs) مع رسم بياني مرفق يظهر القطر الذروي عند . ( & د) يمثل جهد الزتا و PDI لجزيئات L.P.-Se NPs و O.P.- Se NPs، على التوالي.
كما هو موضح في الشكل 3أ، كشفت نتائج تحليل UV عن قمم تظهر عند 222 نانومتر و 226 نانومتر في حالة L.P. -Se NPs و O.P. -Se NPs، على التوالي؛ تمثل هذه القمم تكوين جزيئات Se NPs بسبب اختزال أيونات السيلينيت بواسطة حمض الأسكوربيك الموجود في مستخلصات قشر الليمون والبرتقال إلى سيلينيوم عنصري . كان الحد الأقصى لامتصاص UV-visible بسبب الرنين البلازمي السطحي (SPR) لجزيئات Se NPs بين 200 و . كان الانزياح الأزرق الكبير في نطاق الامتصاص لجزيئات L.P. -Se NPs و O.P. -Se NPs بسبب الأصل البيولوجي لجزيئات Se NPs المصنعة . يشير الانزياح الأحمر الطفيف في نطاق الامتصاص لجزيئات O.P. -Se NPs مقارنة بتلك الخاصة بجزيئات L.P. -Se NPs إلى حجم جسيمات أكبر .
كما هو موضح في الشكل 3ب، ج، تم استخدام شعاع ليزر في البداية لتأكيد تكوين الجزيئات في كلا الحالتين بسبب تأثير تيندال. تم اختبار تأثير تيندال للتحقق من الهيكل الكولوي والموزع للجزيئات النانوية . تعكس الاختلافات في الألوان بين كلا العينتين حجم الجسيمات في كلا الحالتين، حيث يظهر محلول O.P.-Se NPs باللون الأحمر مقارنة باللون البرتقالي الفاتح أو الأصفر في حالة L.P. -Se NPs . تتعلق هذه التغيرات اللونية مباشرة بميزات الامتصاص للجزيئات النانوية في منطقة الطيف المرئي، وبالتالي، أحجام جسيماتها. تتوافق هذه النتائج جيدًا مع دراسة سابقة تتعلق بالامتصاص المعتمد على الحجم لـ . يؤثر تركيز العامل المختزل في كلا المستخلصين على تسلسل النواة والنمو حيث يؤدي التركيز الأعلى من حمض الأسكوربيك في مستخلص قشر الليمون إلى حجم جسيمات أصغر . تتفق هذه النتيجة مع الدراسات السابقة، التي وجدت أن مستخلص قشر الليمون يحتوي على أعلى نسبة من حمض الأسكوربيك مقارنة بجميع مستخلصات قشر الحمضيات الأخرى .
في الشكل 4، قدم تحليل FT-IR التخليق الأخضر لجزيئات Se NPs، باستخدام مستخلص قشر الليمون أو البرتقال، في المنطقة من إلى . تعود الأطياف المتعددة الممتصة تحت الأشعة تحت الحمراء إلى اهتزازات الروابط الأيونية الموجودة في معدن Se. يمثل نطاق اهتزاز في الهاليدات الألكيلية. تمثل نطاقات و اهتزاز للأمينات، بينما يرتبط النطاق بالانحناء في الألكانات، لوحظ نطاق قوي عند ، والذي يعود إلى اهتزاز C-C الذي حدث في حلقة العطرية. تتضمن المنطقة التشخيصية نطاقًا مرتبطًا بـ اهتزاز الأحماض الكربوكسيلية. يظهر هذا النطاق المعزز في طيف L.P. -Se NPs بشكل أكثر دقة وحدّة من تلك الخاصة بـ O.P. -Se NPs، مما قد يشير إلى التخفيض القوي لـ SS في حالة مستخلص الليمون لتكوين جزيئات Se NPs مقارنة بتلك في حالة مستخلص البرتقال . تتوافق نطاقات الامتصاص القوية والحادة عند و مع اهتزاز للألكينات. يرتبط النطاق العريض O-H الذي لوحظ عند بامتداد O-H في الكحول؛ تتماشى هذه النطاقات الممتصة مع دراسة أخرى لجزيئات Se NPs البيولوجية .
كما لوحظ في الشكل 4، فإن شدة معظم نطاقات الامتصاص في حالة L.P. -Se NPs أعلى من نطاقات O.P.-Se NPs. سبب هذا الاختلاف هو انخفاض حجم الجسيمات وزيادة مساحة السطح إلى
الشكل 3. يظهر توصيف الجزيئات المصنعة، (أ) طيف UV لجزيئات O.P.- Se NPs و L.P.- Se NPs ( و ج) يظهر شعاع الليزر المستخدم للكشف عن تحضير الجزيئات النانوية من قشور البرتقال والليمون على التوالي.
الشكل 4. طيف FT-IR لجزيئات Se NPs المصنعة بواسطة مستخلصات قشر الليمون والبرتقال.
نسبة الحجم، مما يؤدي إلى زيادة شدة نطاقات الامتصاص في طيف FT-IR حيث تحتوي الجزيئات الأصغر على نسبة أكبر من الذرات على السطح، والتي يمكن أن تتفاعل بشكل أكثر سهولة مع الإشعاع تحت الأحمر الساقط، مما يؤدي إلى إشارة امتصاص أقوى . بالإضافة إلى ذلك، قد تظهر الجزيئات الأصغر تأثيرات حصر كمومي، مما يؤدي إلى تغييرات في الخصائص الإلكترونية والاهتزازية التي يمكن أن تؤثر على شدة نطاقات الامتصاص في طيف FT-IR. وبالتالي، تؤكد نتائج تحليل FT-IR نتائج تحليل UV، مما يشير إلى حجم جسيمات أقل في حالة L.P. -Se NPs مقارنة بحالة O.P. -Se NPs .
تمت دراسة بلورية L.P. -Se NPs بشكل أكبر باستخدام تحليل حيود الأشعة السينية (XRD). يظهر الشكل 5 نمط XRD نموذجي للهيكل الثلاثي لجزيئات L.P. -Se NPs حيث تتوافق قمم الحيود مع مؤشرات ميلر التالية: (100)، (101)، (110)، (102)، (111)، (200)، (201)، (112)، (202)، (210)، (113). أكدت بعض الدراسات السابقة هذه النتيجة . ترتبط جميع هذه القمم الحيودية بالهيكل الثلاثي لجزيئات Se NPs مع حجم بلوري متوسط قدره . تتفق هذه البيانات مع تلك الموثقة في بطاقة JCPDS القياسية (رقم 06-0362) لجزيئات Se NPs.
حجم الجسيمات لجزيئات NPs المصنعة هو أحد العوامل الأكثر أهمية التي تؤثر على النشاط المضاد للميكروبات والفطريات للجزيئات النانوية. لاحظ Sribenjarat وآخرون أن جزيئات Se NPs ذات النطاق الأصغر أظهرت نشاطًا مضادًا للميكروبات أعلى . تظهر جزيئات L.P. -Se NPs استقرارًا وتشتتًا أعلى مقارنةً بجزيئات O.P. -Se NPs ذات حجم الجسيمات الأقل، مما قد يكون بسبب المحتوى الأعلى من حمض الأسكوربيك وعوامل التغطية الأخرى في مستخلص قشر الليمون، والتي تُعتبر ضرورية للتقليل والتثبيت لـ Se . ومع ذلك، يمكن أن يحسن عامل التثبيت الاستقرار القليل لجزيئات L.P. -Se NPs السالبة الشحنة بسبب قيمتها الزتا المنخفضة. وفقًا لذلك، تم اختيار جزيئات L.P. -Se NPs السالبة الشحنة في هذه الدراسة ليتم تثبيتها بواسطة الكيتوزان النانوي الكاتيوني، مما يحسن استقرارها ونشاطها المضاد للفطريات ضد العامل المسبب .
الشكل 5. نمط XRD لجزيئات L.P.-Se NPs.

تحضير وتوصيف جزيئات CS NPs و NCS-Se NPs

بسبب عدد مجموعات الأمين على سطحها، فإن الطبيعة الكاتيونية للكيتوزان هي سبب جهد الزتا الإيجابي له تساعد هذه الطبيعة الكاتيونية في عملية الطلاء واستقرار الجسيمات النانوية L.P. -Se المشحونة سلبًا لتشكيل الجسيمات النانوية NCS-Se. تم تحضير الجسيمات النانوية CS والجسيمات النانوية NCS-Se كما هو موضح أعلاه في قسم الطريقة.
تظهر الصورة TEM في الشكل 6a جزيئات نانوية من CS بحجم جزيئي صغير بمتوسط قطر تمت دراسة بلورية جزيئات نانو الكولاجين (CS NPs) أيضًا من خلال نمط حيود متعدد البلورات (في الزاوية في الشكل 6a). عرض الشكل 6b صورة مجهر إلكتروني (TEM) لجزيئات نانو L.P. -Se (غير المغلفة) بحجم جزيئات صغير وتشتت جيد بسبب وجود جزيئات حيوية مستخرجة تعمل كعوامل تغليف توفر الاستقرار وتقلل من حجم الجسيمات بمتوسط قطر . ومع ذلك، فإن وجود جزيئات النانو CS كعامل طلاء زود جزيئات النانو L.P. -Se بمزيد من الاستقرار وأنتج جزيئات النانو L.P. -Se (المطلية) بحجم جزيئات أصغر بمتوسط قطر كما هو موضح في صور TEM (الشكل 6c، d). النتائج السابقة أكدت البيانات المستخلصة من صور TEM. قد يكون تجميع الجسيمات في وجود الكيتوزان (CS) ناتجًا عن استخدام كيتوزان عالي الوزن الجزيئي. يُعتبر الكيتوزان عالي ومتوسط الوزن الجزيئي عامل تجميع يعزز تكتل الجسيمات من خلال الربط بين الجسيمات. .
تم استخدام تقنية تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لقياس حجم الجسيمات الهيدروديناميكي لجزيئات CS NPs و NCS-Se NPs المحضرة. الشكل 7a b يظهر و قمم حجم جزيئات CS NPs و NCSSe NPs، على التوالي. الحجم الذي تم قياسه بواسطة تشتت الضوء الديناميكي أكبر بكثير من الحجم الفعلي للجزيئات النانوية، حيث أن DLS يحلل الحجم الهيدروديناميكي للجزيئات في حالتها المائية. تظهر الشكل 7c نتائج جهد زتا لجزيئات CS NPs بمقدار +4.49 مللي فولت. يزيد تغليف جزيئات L.P.-Se NPs بجزيئات CS NPs من جهد زتا من -19 مللي فولت (كما هو موضح في الشكل 2) إلى -7.24 مللي فولت بسبب جهد زتا الإيجابي لجزيئات CS NPs (الشكل 7d)، مما يشير إلى تغليف فعال لجزيئات CS NPs بجزيئات Se NPs لتشكيل نانو مركب NCS-Se NPs. تم تأكيد هذه البيانات من خلال دراسات كيمياء السطح السابقة لجزيئات Se-NPs بعد تغليفها بالكيتوزان. تم توضيح حجم الجسيمات المقدر وإمكانات زيتا لجسيمات L.P. -Se، وجسيمات O.P. -Se، وجسيمات CS، وجسيمات NCS-Se في الجدول 1.
تظهر الشكل 8a نمط حيود الأشعة السينية (XRD) لـ CS و CS NPs و L.P. -Se NPs و NCS-Se NPs. يظهر نمط حيود الأشعة السينية لـ CS NPs قمة بارزة أوسع مع شدة أقل من (CS) عند نمط XRD لجزيئات NCS-Se يحتوي على قمتين بارزتين في ، المتعلقة بالنانو-كيتوزان، و مرتبط بـ L.P. – NPs ذات الكثافات المنخفضة . تشير هذه النتيجة إلى الطلاء الفعال لجزيئات L.P.-Se النانوية باستخدام جزيئات CS النانوية لتشكيل جزيئات NCS-Se النانوية.
الشكل 6. صور TEM لـ (أ) جزيئات CS النانوية مع صورة مصغرة تظهر نمط التشتت متعدد البلورات لجزيئات CS النانوية، (ب) جزيئات Se النانوية، (ج) جزيئات NCS-Se النانوية، (د) لوحة مكبرة من (ج) تظهر جزيئات NCS-Se النانوية مع صورة مصغرة تظهر توزيع الحجم مع قطر ذروة .
قد يتسبب السيلينيوم النانوي الموزع بشكل جيد في مصفوفة النانو كومبوزيت في تداخل القمم المميزة لـ Se NPs و CS NPs، ويشير ظهور قمم إضافية في هيكل النانو كومبوزيت إلى أن التفاعلات الأيونية تؤثر على الشبكة البلورية. أكدت الدراسات السابقة هذه النتائج في تحليل حيود الأشعة السينية. .
تظهر الشكل 8ب نمط FT-IR لـ CS و CS NPs و NCS-Se NPs و L.P. -Se NPs للتحقيق في التفاعل بين الجزيئات لجزيئات النانو. في النانو كيتوزان، تم ملاحظة عدة قمم للتوصيف. القمة الأولى، عند ، كان يُفترض أن يمثل تمدد. ذروات عند و يمثل يمتد من الأميد انحناء، و يمتد من الأميد II، على التوالي. إضافي 1458، 1376، و تم نسب القمم على التوالي إلى اهتزاز الهيكل العظمي لـ تمدد انحناء، و تشوه متماثل. تتماشى هذه النتائج مع النتائج السابقة، مما يشير إلى تشكيل جزيئات نانوية من الكربون. . تم تأكيد التفاعل الكهروستاتيكي بين جزيئات L.P. -Se و مجموعات الأمين في NCS من خلال تحول في قمم الامتصاص لطيف NCS من الأميد I من إلى وأميد II من إلى عند مقارنتها بطيف جزيئات NCS-Se، يوحي أن NCS قد يرتبط بجزيئات L.P.-Se عن طريق تشكيل روابط هيدروجينية مع شدة نطاقات الامتصاص المرتبطة بجزيئات نانو السيلينيوم L.P. و انخفض في طيف NCS-Se NPs بسبب الطلاء الفعال لـ NCS مع L.P. -Se NPs في مصفوفته .
الشكل 7. توزيع الحجم لـ (أ) جزيئات نانو الكيتوزان، (ب) جزيئات نانو NCS-Se، وإمكانات زيتا لـ (ج) جزيئات نانو الكيتوزان، و (د) جزيئات نانو NCS-Se، على التوالي.
الجسيمات النانوية نطاق الحجم (نانومتر) القطر المتوسط (نانومتر) إمكانات زيتا (ملي فولت)
إل.بي.-سي 42.28 -19.0
أو.بي.-سي 85.7 +12.0
CS 6.43 +4.49
NCS-Se ٣٢.٧ -7.24
الجدول 1. توزيع حجم الجسيمات وإمكانات زتا لجزيئات السيلينيوم النانوية التي تم تصنيعها حيوياً باستخدام مستخلصات قشور الليمون والبرتقال (L.P.-Se، O.P.-Se)، جزيئات الكيتوزان (CS)، ونانومركبها (NCS-Se).

النشاط المضاد للفطريات في المختبر

اختبار نمو الفطريات

تمت دراسة النشاط المضاد للفطريات للهياكل النانوية الثلاثة المعدة (جسيمات نانوية من الكيتوزان، جسيمات نانوية من السيلينيوم، وجسيمات نانوية من الكيتوزان والسيلينيوم) مقارنة بمصادرها الكبيرة الكيتوزان، والسيلينيوم، ومزيج من الكيتوزان مع السيلينيوم. ) بنفس التركيزات ( ) باستخدام طريقة الانتشار الجيد.
جميع القيم المحسوبة في الجدولين أعلاه معروضة كمتوسط تم تحليل البيانات داخل المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار دانكان المتعدد النطاقات (DMRT)، LSD = أقل فرق ذي دلالة.
أظهرت النتائج نشاطًا مضادًا للفطريات لجميع المواد السائبة عند جميع التركيزات، كما هو موضح في الجدول 2، والذي يتوافق مع التقارير السابقة حول النشاط المضاد للفطريات لـ CS و SS ضد S. sclerotiorum. غشاء البلازما للفطريات S. sclerotiorum المعالجة بهذه التركيز المثالي المثبط لـ وتم إظهار أن الرقم الهيدروجيني 5 من الكيتين عالي الوزن الجزيئي قد تعرض لأضرار كبيرة كان قطر نمو الفطريات لعينات SS وCS ومزيجها عند الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) البالغ 0.5 جزء في المليون ، و ، على التوالي. كانت النسبة المئوية المثبطة المحسوبة لديهم ، و على التوالي (الشكل 9أ).
كما هو موضح في الجدول 3، كانت الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MIC) للثلاثة هياكل نانوية عند أدنى تركيزات 0.5 جزء في المليون مع نسب تثبيط تبلغ ، و على التوالي (الشكل 9ب).
الشكل 8. (أ) حيود الأشعة السينية لـ CS، جزيئات CS النانوية، جزيئات L.P.-Se النانوية وجزيئات NCS-Se النانوية & (ب) مطياف الأشعة تحت الحمراء لـ CS، جزيئات CS النانوية، جزيئات L.P.-Se النانوية وجزيئات NCS-Se النانوية.
التركيز (جزء في المليون) قطر النمو (سم)
علاج SS علاج CS SS + CS ( )
0
0.5
1
٥
10
50
100
إل إس دي 0.72 0.59 0.66
الجدول 2. عدد قطر النمو لـ S. sclerotiorum المعالج بتركيزات مختلفة من ثلاثة مواد خام مختبرة (SS، CS، ومزيج من SS + CS) )). هذه الحروف تخص اختبار دنكان المتعدد، مما يعني أن العلاجات التي تحمل نفس الحرف ليست مختلفة بشكل ملحوظ، ولكن العلاجات التي تحمل حروفًا مختلفة هي مختلفة بشكل ملحوظ.
التأثير المضاد للفطريات لجزيئات نانو LP-Se بتركيز منخفض قدره 0.5 جزء في المليون مع تم دعم النسبة المثبطة بشكل كبير بعد التغطية بجزيئات النانو من الكيتوزان. تم الحصول على النسبة المثبطة بواسطة جزيئات نانو السيلينيوم NCS-Se، حيث تعمل جزيئات نانو الكيتوزان CS كعامل مثبت، بالإضافة إلى تأثيرها القوي المضاد للفطريات، مما يعزز النشاط المضاد للفطريات لجزيئات نانو السيلينيوم التي تم تصنيعها بطريقة خضراء. تتفق هذه النتيجة مع دراسة سابقة. الذي وجد أن الجسيمات النانوية من السيلينيوم المصنعة كيميائيًا مع بولي-ل-لايسين (PLL.P.-Se NPs) يمكن أن تثبط بشكل كبير نمو S. sclerotiorum ولكن بتركيز أقصى يبلغ 100 جزء في المليون.

اختبار الكتلة الحيوية الفطرية

تم تجفيف الكتلة الحيوية الفطرية المحضرة حديثًا المعالجة بكل هيكل نانوي تم اختباره بتركيز الحد الأدنى المثبط (MIC) قدره 0.5 جزء في المليون، بالإضافة إلى التحكم، وتم وزنها بعد خمسة أيام من الحضانة الديناميكية باستخدام جهاز اهتزاز مداري. و 180 دورة في الدقيقة. أظهرت النتائج تثبيطًا قويًا لنمو العوامل الممرضة المختبرة، خاصة في حالة جزيئات NCS-Se النانوية مع أقل متوسط للكتلة الحيوية عند مقارنةً بمتوسط الكتلة الحيوية الفطرية للهياكل النانوية الأخرى والضبط، كما هو موضح في (الجدول 4). تعكس هذه النتيجة فعالية جزيئات NCS-Se النانوية كعامل مضاد للفطريات صديق للبيئة ضد S. sclerotiorum.

التغيرات الشكلية في خيوط S. sclerotiorum

تم الكشف عن التغيرات فوق الهيكلية في خيوط S. sclerotiorum الناتجة عن 0.5 جزء في المليون من جزيئات NCS-Se النانوية باستخدام مجهر إلكتروني مسح (SEM). كانت خيوط S. sclerotiorum غير المعالجة تبدو سليمة وكثيفة وطويلة وأسطوانية، كما هو موضح في الشكل 10a وb وc. في المقابل، أظهرت الخيوط المعالجة بـ 0.5 جزء في المليون من جزيئات NCS-Se النانوية
الشكل 9. نمو الفطريات لـ S. sclerotiorum المعالجة بتركيز الحد الأدنى المثبط (MIC) من (أ) SS، CS، ومزيج من SS + CS ) و (ب) نانو جزيئات Se، نانو جزيئات CS، ونانو جزيئات NCS-Se.
التركيز (جزء في المليون) قطر النمو (سم)
علاج NPs Se علاج CS NPs علاج NCS-Se NPs
0
0.5 غير متوفر غير متوفر
1 غير متوفر
٥
10
50
100
إل إس دي 0.56 0.63 0.65
الجدول 3. عدد أقطار النمو لـ S. sclerotiorum المعالجة بتركيزات مختلفة من ثلاثة هياكل نانوية مختبرة (جزيئات السيلينيوم النانوية، جزيئات الكيتوزان النانوية، وجزيئات الكيتوزان-سيلينيوم النانوية). يعني أن العلاجات التي تحمل نفس الحرف ليست مختلفة بشكل ملحوظ، ولكن العلاجات التي تحمل حروفًا مختلفة هي مختلفة بشكل ملحوظ.
الحضانة الديناميكية تركيز العلاج
تحكم CS NPs Se NPs نقاط NCS-Se
متوسط الكتلة الحيوية
الجدول 4. وزن الجفاف الناتج من S. sclerotiorum المعالج بـ 0.5 جزء في المليون من جزيئات CS النانوية، وجزيئات Se النانوية، وجزيئات NCS-Se النانوية.
تشوهات وشذوذات في شكلها. تشمل هذه التغيرات الشكلية الانكماش، والانفصال الخلوي، والتشوه، والانهيار في خيوط الفطريات، كما هو موضح في الشكل 10د، هـ، و، وبالتالي، تمزق وتلف هيفات السكليروتيوم، مما يدل على قدرة نانومركبنا على قمع وظائفهم الحيوية.

آلية مضادة للفطريات لجزيئات نانو NCS-Se

لقد تم إثبات أن CS و Se يمكن أن يحميان النباتات من العدوى الفطرية. في التحقيق الحالي، اكتشفنا أن النمو الفطري لـ تم تثبيط السكليروتيوم بشكل كبير بواسطة التركيز المثبط الأدنى لجزيئات نانو NCS-Se (0.5 جزء في المليون)، مما يغير أيضًا شكل الكائن الحي ويضر بخيوطه. قد يكون هذا التأثير ناتجًا عن تفاعل المجموعات الأمينية الإيجابية في غلاف الكومبوزيت النانوي مع بقايا الجزيئات الكبيرة المشحونة سلبًا على غشاء الخلية الفطرية، مما يغير نفاذية الغشاء البلازمي. بعد ذلك، كما هو موضح في الشكل 11، يمكن أن تدخل جزيئات النانو الصغيرة CS وبعض جزيئات النانو L.P. -Se التي تم تصنيعها بطريقة خضراء إلى الهيفا وتفاعل مع العضيات/الأنظمة الحيوية داخل الخلايا لتعطيل وظائفها الأساسية، مما يؤدي بالتالي إلى تشوه الفطريات وانحلالها. علاوة على ذلك، قد تعمل L.P. المحررة -Se NPs على تحسين إطلاق إلكتروليتات S. sclerotiorum قد تكون التغيرات في مستويات الأسموليت في فطريات S. sclerotiorum ضرورية لكي يتكيف الكائن مع بيئته ويحمي نفسه من سمية السيلينيوم، مما يؤدي إلى تلف نظام الغشاء واضطراب الأيض. معلومات إضافية مطلوبة حول آلية تأثير الحماية، والتي يجب أن تكون
الشكل 10. صور TEM لخيوط S. sclerotiorum من (أ-ج): صور التحكم و (د-و): صور معالجة 0.5 جزء في المليون من جزيئات NCS-Se.
الشكل 11. مخطط توضيحي يوضح امتصاص جزيئات نانو NCS-Se مع فطريات S. sclerotiorum وتأثيرها الضار.
تم التحقيق. ومع ذلك، فإن تحديد الآلية المضادة للفطريات التي تسببها جزيئات نانو سيلينيوم الكربون (NCS-Se NPs) في خيوط فطر S. sclerotiorum سيساعد في تطوير استراتيجية فعالة وآمنة ومستدامة للسيطرة على S. sclerotiorum وإدارته.

المواد والطرق الكيميائية

تم شراء سيلينيت الصوديوم اللامائي AR من شركة SDFCL، الهند. كيتوزان عالي الوزن الجزيئي بوزن 350 كيلو دالتون ومستوى إزالة الأسيتيل من تم شراؤه من شركة هونان يوان بانغ للصيدلة، الصين. ثلاثي فوسفات الصوديوم (TPP)، كريات هيدروكسيد الصوديوم، وحمض الهيدروكلوريك المركز تم شراءها من شركة سيغما ألدريتش، أمريكا. تم شراء أجار دكستروز البطاطس (PDA) ومرق دكستروز البطاطس (PDB) من شركة ميرك، ألمانيا. تم استخدام جميع المواد الكيميائية مباشرة دون أي تنقية إضافية.

عزل وتحديد سلالة الفطر

مرض فطري شائع يسمى تعفن سكليروتينيا، والذي يُطلق عليه أحيانًا العفن الأبيض في بعض المحاصيل، ينجم عن أعضاء فطرية ممرضة من جنس سكليروتينيا. على وجه الخصوص، يُعتبر S. sclerotiorum واحدًا من أكثر الإصابات النباتية ضررًا وانتشارًا. يسبب الفطر الممرض النخرى S. sclerotiorum (ليب.) دي باري أمراضًا في نباتات متنوعة. تم عزل الفطر من حبوب الكلى المريضة، مثل الفطريات القطنية، على وسط البطاطا دكستروز (PDA). تم تحديد الفطر مورفولوجيًا وميكروسكوبياً وتم تأكيده من خلال التعريف الجزيئي باستخدام ITS. تم إيداع التسلسل الناتج في NCBI للحصول على رقم الوصول. تم تسلسل منطقة ITS، وتم عزل الحمض النووي من العزلة الفطرية لتسهيل التعريف الجزيئي.
تم استرداد 0.5 جرام من الفطريات بعد خمسة أيام من الحضانة في عملية عزل مطحنة الخلاط. تم استخراج الحمض النووي، وتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ثلاث مرات. 1x محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل، خليط dNTP بتركيز 2 مللي مول لكل بادئ (ITS-F -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’، ITS-R -GGAAGTA AAAGTCGTAA CAAGG-3′) من تم إضافة بوليميراز الحمض النووي (فيرمينتاس، سان ليون-روت، ألمانيا)، و1 نانوجرام من الحمض النووي النموذجي إلى الحجم المستخدم في التفاعل. كانت عملية تضخيم PCR تتضمن ت denaturation أولية عند لـ دورات من لـ لعملية التلدين لمدة 45 ثانية، و لفترة تمديد تستمر 45 ثانية لكل منها. تم تنقية وتسلسل منتجات PCR الناتجة عن العزلة الفطرية التي ظهرت كحزمة واحدة. ثم تم استشارة قواعد بيانات تسلسل GenBank. في MEGA5، تم محاذاة التسلسل المكتسب وفحصه. كان نموذج استبدال Kimura 2 مع توزيع غاما هو النموذج الأنسب للمحاذاة. تم بناء شجرة أقصى احتمال استنادًا إلى تسلسل ITS وقيم bootstrap البالغة 1000 المقدمة عند العقد.

التركيب الأخضر لجزيئات السيلينيوم النانوية

تم اختيار مستخلصات قشور الحمضيات من الليمون (Citrus limon) والبرتقال (Citrus reticulata)، حيث يحتوي كلاهما على أعلى محتوى من حمض الأسكوربيك. تم شراء جميع الفواكه من السوق المحلي. تم تنظيف عينات من الحمضيات بالماء المقطر مرتين وتجفيفها باستخدام مناديل ورقية معقمة. تم تقشير الحمضيات المجففة، وقطع القشور إلى قطع صغيرة باستخدام سكين نظيف. تم وزن قطع قشر الحمضيات بدقة باستخدام ميزان رقمي حساس وتم تخزينها في ظروف معقمة. ثم تم طحن القشور الموزونة في هاون وتحويلها إلى خليط ناعم ذو مظهر مبلل. بعد ذلك، تم غلي الخليط في 150 مل من الماء المقطر المزدوج لمدة 15 دقيقة حتى تغير لون الماء إلى الأخضر-الأصفر، ثم تم تصفيته باستخدام ورق فلتر وتمان رقم. .
50 مل من مستخلص قشر الحمضيات الطازج (تم تسخين مستخلص قشر الليمون أو البرتقال بدقة باستخدام جهاز تسخين مغناطيسي مع خلاط، وتم ضبط الظروف على و pH 4.5 مل من (0.1 م) سيلينيت الصوديوم تمت الإضافة على الفور. تم تأكيد تشكيل جزيئات السيلينيوم النانوية من خلال تكوين محلول بلون برتقالي-أحمر في هذه الحالة المثلى. تم طرد الخليط مركزيًا عند لمدة 30 دقيقة، تم غسلها ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج، وغسل نهائي بالإيثانول، ثم جففت، وتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة. .

تحضير محلول CS وجزيئات CS النانوية

تحضير محلول CS

حول تم استخدام مستوى إزالة الأسيتيل ووزن جزيئي متوسط قدره 350 كيلودالتون من مسحوق الكيتوزان لتحضير تركيز المخزون من حل CS في عن طريق التحريك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب المجموع بالكامل. و تم استخدامها لضبط المحلول عند الرقم الهيدروجيني 5.

تحضير جزيئات نانوية من الكيتوزان

تم تحضير NP من الكيتوزان باستخدام طريقة التجلط الأيوني بين الكيتوزان وTPP. باختصار، تم إذابة TPP في ماء مقطر مزدوج بتركيز تحت التحريك المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة. ثم أضيف 10 مل من محلول TPP بالتنقيط بمعدل تدفق إلى 50 مل من التركيز المخفف الذي تم تحضيره مسبقًا حل CS بنسبة على التوالي، تم ضبط مستوى pH لمحلولي CS و TPP إلى pH 5 و pH 2 على التوالي. تم تحريك المزيج بسرعة 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. أخيرًا، تم جمع NCS عن طريق الطرد المركزي (عند لمدة 28 دقيقة غُسِل ثلاث مرات بماء مزدوج التقطير، وجفف في الفرن عند بين عشية وضحاها، وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.

تركيب جزيئات نانو NCS-Se

تم تصنيع جزيئات نانو السيلينيوم (Se NPs) بطريقة خضراء كما هو موصوف سابقًا ولكن بوجود الكيتوسان (CS)، مع بعض التعديلات التي وصفها شاو وآخرون. زينغ وآخرون ، وأيوب وآخرون خليط (CS-SS) بنسبة تم تحريكه بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة وأضيف بالتدريج إلى مستخلص قشر الحمضيات المحضر حديثًا. تُرك المحلول طوال الليل مع تحريك خفيف. بعد تغليف جزيئات السيلينيوم النانوية بـ CS، تم أخذ 1 مل من تم إضافة رابط TPP بالتنقيط لتجليد الأيونات. ثم يتغير لون المحلول من الأصفر إلى البرتقالي المحمر.
الذي يؤكد تشكيل جزيئات NCS-Se. تم إزالة CS غير المتفاعل، , وTPP عن طريق الدياليز (MWCO: ) لمدة 48 ساعة عند , وتم الحصول على محلول من جزيئات NCS-Se.

دراسات في المختبر للنشاط المضاد للفطريات

تم تقييم النشاط المضاد للفطريات للمواد الكتلية (CS، SS، ومزيج من كلا المادتين بنسبة ضد . sclerotiorum عند تركيزات مختلفة ( و )، ثم تم أيضًا تقييم النشاط المضاد للفطريات للمواد النانوية المختبرة (جزيئات Se، جزيئات CS، وجزيئات NCS-Se) عند نفس التركيزات باستخدام طريقة الانتشار الصحي لتحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) لكل مادة مختبرة . أخيرًا، تم تقييم الكتلة الحيوية الفطرية الطازجة عند MIC لتقييم التأثير المثبط لكل مادة نانوية على حدة وكذلك التأثير التآزري للمركب النانوي.

قياس نمو الفطريات

تم عزل S. sclerotiorum من حبة الفاصوليا الخضراء المصابة وتم الاحتفاظ بها على أجار دكستروز البطاطس (PDA). وفقًا لـ Qing و Yao ، تم تقييم تأثير كل مادة تم إعدادها مسبقًا على نمو الفطريات. باختصار، تم إعداد 20 مل من PDA المعقمة ووضعها في أطباق معقمة بقطر 9 سم. ثم، تم وضع أقراص فطرية بقطر 5 مم من الثقافات القديمة (نمت لمدة 10 أيام في درجة حرارة الغرفة) في مركز كل طبق، وتم عمل ثلاثة ثقوب باستخدام رؤوس معقمة في كل PDA معقم حول كل قرص، وتم سحب 1 مل من محلول كل تركيز تم إعداده في ظروف معقمة وتوزيعه في الثقوب الثلاثة. تم تكرار كل معالجة ثلاث مرات، وتم تكرار التجربة مرتين. تم استخدام PDA بدون أي تركيز كتحكم. تم حضانة الأطباق الضابطة والمعالجة عند لمدة 5 أيام. بعد الحضانة، تم تحديد نمو الفطريات عن طريق قياس قطر النمو لكل تركيز مختبر؛ تم حساب النشاط المضاد للفطريات لجميع التركيزات المختبرة على نمو الفطريات لـ S. sclerotiorum وفقًا للصيغة التالية:

اختبار الكتلة الحيوية الفطرية

تم إعداد 100 مل من مرق دكستروز البطاطس (PDB) ووضعها في قنينة مخروطية سعة 250 مل. تم تخفيف كل PDP بواسطة MIC لكل هيكل نانوي مختبر (جزيئات Se، NCS، وجزيئات NCS-Se) حتى تم الحصول على التركيزات المختبرة. ثم، تم إدخال أقراص فطرية بقطر 5 مم من الثقافات القديمة (نمت لمدة 10 أيام في درجة حرارة الغرفة) في كل PDB معالج عند . تم تكرار كل معالجة 3 مرات، وتم تكرار التجربة مرتين. تم استخدام PDB بدون أي تركيزات كتحكم. بعد جمع الكتلة الحيوية الفطرية، تم غسلها ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج وتركها لتجف على ورق الترشيح لمدة ساعتين. ثم، تم تجفيف الكتلة الحيوية الفطرية الطازجة لكل مجموعة معالجة ومجموعة تحكم وتم وزنها بعد خمسة أيام من الحضانة.

التغيرات الشكلية في خيوط S. sclerotiorum

بعد 18 ساعة من التعرض للحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) لجزيئات NCS-Se النانوية (NPs)، تم تثبيت خيوط S. sclerotiorum باستخدام محلول من الجلوتارالدهيد وغسلها ثلاث مرات لمدة 10 دقائق باستخدام محلول فوسفات 100 مليمول. ثم تم تثبيت الخيوط المثبتة بعد ذلك لمدة ثلاث ساعات في أكسيد الأوزميوم ( ) وتم تجفيفها من خلال تدرج الإيثانول لفحص التغيرات فوق الهيكلية في الخيوط باستخدام مجهر إلكتروني مس扫描 (SEM) بعد الطلاء بالذهب .

توصيف الهياكل النانوية المعدة

مجهر الإلكترون الناقل (TEM)

تم تأكيد تشكيل الهياكل النانوية التالية، جزيئات Se التي تم تصنيعها بطريقة خضراء، جزيئات CS، وجزيئات NCS-Se باستخدام مجهر إلكترون ناقل (TEM) (JEM-2100 PLUS). عند جهد تسريع قدره 200 كيلو فولت، تم استخدام TEM لدراسة الحجم والشكل وحالات التكتل لجزيئات Se، جزيئات CS، وجزيئات NCS-Se. تم وضع قطرة من العينات المخففة على شبكة كربونية مطلية بالنحاس وتركها لتجف لمدة حوالي 15 دقيقة. تم استخدام ورق الترشيح لإزالة العينة الزائدة، ثم تم ترك الشبكة في الهواء لتجف قبل إدخالها إلى TEM.

تشتت الضوء الديناميكي (DLS)

تم قياس حجم الجسيمات لجميع الهياكل النانوية المعدة، جزيئات Se، جزيئات CS، وجزيئات NCS-Se باستخدام جهاز قياس زتا نانو (ZEN3600، مالفرن، المملكة المتحدة) مع نطاق حجم (من ) عند . تم تخفيف العينات بالماء المقطر قبل إدخالها إلى جهاز قياس الزتا لقياس متوسط قطرها وتوزيع الحجم. تم تجهيز الجهاز باستخدام شعاع إشعاع الليزر عند 633 نانومتر، وتم وضع تعليق العينة في قنينة شعرية. اكتشف أنبوب مضاعف الضوء الضوء المرتد، وتم حساب متوسط حجم العينات. يوفر DLS أيضًا معلومات حول الشحنات السطحية (زتا المحتمل) التي تم قياسها باستخدام نفس القنينة الشعرية مباشرة بعد قياس حجم الجسيمات في نطاق زتا المحتمل (-200:200 مللي فولت).

تحليل حيود الأشعة السينية (XRD)

تم إجراء تحليل حيود الأشعة السينية (XRD) لدراسة التركيب البلوري، والتكوين، وحجم الحبيبات للهياكل النانوية باستخدام جهاز حيود الأشعة السينية (جهاز Angstrom -ADX8000) مع مصدر إشعاع CuKal بطول موجي وزوايا ثنائية ثيتا من 100 إلى 800.

طيف الأشعة فوق البنفسجية-المرئية (Uv-Vis)

تم تحديد طيف الامتصاص لجميع الهياكل النانوية المعدة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية-المرئية (BioWave3-USA) مع نطاق طول موجي من بدقة 1 نانومتر.

مطياف الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR)

شمل التوصيف الإضافي مطياف الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (Nicolet iS50 FTIR Spectrometer في KBr مع امتصاص في النطاق ( ) بدقة تم استخدامه لتقييم المجموعات الوظيفية المشاركة في تشكيل جزيئات Se التي تم تصنيعها بطريقة خضراء وبعد الطلاء بالكتوزان النانوي. تم تطهير الجهاز باستمرار بالهواء الجاف لإزالة بخار الماء من الجو. يساعد FTIR في ملاحظة التغيرات الظاهرة في بنية المركب من خلال دراسة التغيرات في عرض النطاق وطول الموجة وكذلك شدة وتردد أوضاع الاهتزاز.

مجهر إلكتروني مس扫描 (SEM)

تمت ملاحظة التغيرات الشكلية في خيوط الممرض بعد المعالجة بالهياكل النانوية من خلال تصوير SEM (TESCAN VEGA COMPACT، برنو، كوهوتوفيتس، جمهورية التشيك) عند جهد تسريع قدره 10 كيلو فولت.

التحليل الإحصائي

تم إجراء التحليل الإحصائي للبيانات المجمعة عبر تحليل ANOVA أحادي الاتجاه (عند )، وحالات النطاق المتعددة لدنكان، وبيان الفرق الأقل دلالة (LSD) . تم فحص النتائج والبيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج SPSS الإصدار.

الاستنتاج

بشكل عام، استنتجنا أن جزيئات L.P.-Se تظهر أحجامًا أصغر من وتوزيعًا أفضل من جزيئات O.P.-Se. القيمة السالبة الأقل لجزيئات L.P.-Se وحجم الجسيمات الأصغر عززت اختيارها للطلاء بالكتوزان النانوي الموجب الشحنة لتحسين استقرارها وفعاليتها المضادة للفطريات ضد . sclerotiorum. أظهرت جزيئات CS أحجام جسيمات صغيرة من مع قيمة زتا إيجابية. هذه الطبيعة الكاتيونية وحجم الجسيمات الصغيرة عززت خصائص جزيئات CS وحسنت نشاطها المضاد للفطريات ضد نفس الممرض المسبب مع نسبة مثبطة قدرها . القيم المنخفضة لزتا لجزيئات L.P.-Se وجزيئات CS -19 مللي فولت و +4.49 مللي فولت، على التوالي، حدت من استقرارها ونشاطها الحيوي. أدى دمج NCS مع جزيئات L.P.-Se لتشكيل جزيئات NCS-Se إلى تقليل حجمها الجزيئي بمتوسط قطر قدره وزيادة استقرارها ونشاطها المضاد للفطريات. تم زيادة النشاط المضاد للفطريات لجزيئات L.P. Se-NPs من 69 إلى نسبة مثبطة بعد الطلاء بالكتوزان النانوي عند نفس MIC من 0.5 جزء في المليون. تم تقليل الكتلة الحيوية الفطرية المعالجة بجزيئات NCS-Se عند MIC من 0.5 جزء في المليون إلى مقارنة بتلك المعالجة بجزيئات L.P.-Se وجزيئات CS. تسبب الفعالية المضادة للفطريات المعززة للمركب النانوي NCS-Se في حدوث أضرار ملحوظة لخيوط الفطريات، مما يقدم عامل مضاد للفطريات جديد وواعد وصديق للبيئة ضد فطريات نباتية ممرضة أخرى.

توفر البيانات

جميع البيانات التي تم إنشاؤها أو تحليلها خلال هذه الدراسة مدرجة في هذه المخطوطة.
تاريخ الاستلام: 29 يوليو 2024؛ تاريخ القبول: 11 نوفمبر 2024
تم النشر عبر الإنترنت: 06 يناير 2025

References

  1. Perveen, K., Haseeb, A. & Shukla, P. K. Effect of Sclerotinia sclerotiorum on the disease development, growth, oil yield and biochemical changes in plants of Mentha arvensis. Saudi J. Biol. Sci. 17 (4), 291-294. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2010.05.008 (2010).
  2. Rollins, J. A. & Dickman, M. B. pH signaling in Sclerotinia sclerotiorum: Identification of a pacC/RIM1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 67 (1), 75-81. https://doi.org/10.1128/AEM.67.1.75-81.2001 (2001).
  3. Qin, L. et al. SsCak1 regulates growth and pathogenicity in Sclerotinia Sclerotiorum. Int. J. Mol. Sci. 24 (16), 1-14. https://doi.org/ 10.3390/ijms241612610 (2023).
  4. Ding, Y. et al. Host-Induced Gene silencing of a multifunction gene Sscnd1 enhances Plant Resistance against Sclerotinia Sclerotiorum. Front. Microbiol. 12 (October), 1-15. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2021.693334 (2021).
  5. Seifbarghi, S. et al. Changes in the Sclerotinia sclerotiorum transcriptome during infection of Brassica napus. BMC Genom. 18 (1), 1-37. https://doi.org/10.1186/s12864-017-3642-5 (2017).
  6. Williams, B., Kabbage, M., Kim, H. J., Britt, R. & Dickman, M. B. Tipping the balance: Sclerotinia sclerotiorum secreted oxalic acid suppresses host defenses by manipulating the host redox environment. PLoS Pathog. 7 (6). https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 10 02107 (2011).
  7. Chittem, K., Yajima, W. R., Goswami, R. S. & del Río Mendoza, L. E. Transcriptome analysis of the plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum interaction with resistant and susceptible canola (Brassica napus) lines. PLoS One. 15 (3), 1-29. https://doi.org/10.13 71/journal.pone. 0229844 (2020).
  8. Jia, W. et al. Action of selenium against Sclerotinia sclerotiorum: Damaging membrane system and interfering with metabolism. Pestic Biochem. Physiol. 150 (June), 10-16. https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2018.06.003 (2018).
  9. Xu, J. et al. Selenium as a potential fungicide could protect oilseed rape leaves from Sclerotinia sclerotiorum infection. Environ. Pollut. 257, 113495. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.113495 (2020).
  10. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E. & Carmona, M. Biosynthesis of selenium nanoparticles by Azoarcus Sp. CIB Microb. Cell. Fact. 15 (1), 1-10. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0510-y (2016).
  11. Wang, H., Zhang, J. & Yu, H. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: comparison with selenomethionine in mice. Free Radic Biol. Med. 42 (10), 1524-1533. https://doi.org/10 .1016/j.freeradbiomed.2007.02.013 (2007).
  12. Chen, T., Wong, Y. S., Zheng, W., Bai, Y. & Huang, L. Selenium nanoparticles fabricated in Undaria pinnatifida polysaccharide solutions induce mitochondria-mediated apoptosis in A375 human melanoma cells. Colloids Surf. B Biointerfaces. 67 (1), 26-31. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2008.07.010 (2008).
  13. Quiterio-Gutiérrez, T. et al. The application of selenium and copper nanoparticles modifies the biochemical responses of tomato plants under stress by Alternaria Solani. Int. J. Mol. Sci. 20 (8). https://doi.org/10.3390/ijms20081950 (2019).
  14. Vrandečić, K. et al. Antifungal activities of silver and selenium nanoparticles stabilized with different surface coating agents. Pest Manag Sci. 76 (6), 2021-2029. https://doi.org/10.1002/ps. 5735 (2020).
  15. Dhawan, G., Singh, I., Dhawan, U. & Kumar, P. Synthesis and characterization of Nanoselenium: A step-by-step guide for undergraduate students. J. Chem. Educ. 98 (9), 2982-2989. https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.0c01467 (2021).
  16. Cittrarasu, V. et al. Green synthesis of selenium nanoparticles mediated from Ceropegia bulbosa Roxb extract and its cytotoxicity, antimicrobial, mosquitocidal and photocatalytic activities. Sci. Rep. 11 (1), 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-80327-9 (2021).
  17. Alvi, G. B. et al. Biogenic selenium nanoparticles (SeNPs) from citrus fruit have anti-bacterial activities. Sci. Rep. 11 (1), 1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-021-84099-8 (2021).
  18. Balakrishnaraja, R., Sasidharan, S. & Biosynthesis of Selenium Nanoparticles Using Citrus Reticulata Peel Extract. Vol 4. (2015).
  19. Mittal, A. K., Chisti, Y. & Banerjee, U. C. Synthesis of metallic nanoparticles using plant extracts. Biotechnol. Adv. 31 (2), 346-356. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.01.003 (2013).
  20. Rao, A. V. & Rao, L. G. Carotenoids and human health. Pharmacol. Res. 55 (3), 207-216. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.01.012 (2007).
  21. Salem, S. S. et al. Green biosynthesis of Selenium nanoparticles using orange peel waste: Characterization, antibacterial and antibiofilm activities against multidrug-resistant bacteria. Life. 12 (6). https://doi.org/10.3390/life12060893 (2022).
  22. Awad, H. Antifungal potentialities of Chitosan and Trichoderma in controlling Botrytis cinerea, causing strawberry gray mold disease. J. Plant. Prot. Pathol. 8 (8), 371-378. https://doi.org/10.21608/jppp. 2017.46342 (2017).
  23. Wang, Q., Zuo, J., Wang, Q., Na, Y. & Gao, L. Inhibitory effect of chitosan on growth of the fungal phytopathogen, Sclerotinia Sclerotiorum, and sclerotinia rot of carrot. J. Integr. Agric. 14 (4), 691-697. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(14)60800-5 (2015).
  24. Molloy, C., Cheah, L. H. & Koolaard, J. P. Induced resistance against Sclerotinia sclerotiorum in carrots treated with enzymatically hydrolysed chitosan. Postharvest Biol. Technol. 33 (1), 61-65. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2004.01.009 (2004).
  25. El-mohamedy, R. S. R., El-aziz, M. E. A. & Kamel, S. Antifungal activity of chitosan nanoparticles against some plant pathogenic fungi in vitro. 21(4):201-209. (2019).
  26. Slavin, Y. N. & Bach, H. Mechanisms of antifungal properties of metal nanoparticles. Nanomaterials. 12 (24). https://doi.org/10.3 390/nano12244470 (2022).
  27. Martínez, A. et al. Dual antifungal activity against Candida albicans of copper metallic nanostructures and hierarchical copper oxide marigold-like nanostructures grown in situ in the culture medium. J. Appl. Microbiol. 130 (6), 1883-1892. https://doi.org/1 0.1111/jam. 14859 (2021).
  28. De La Rosa-García, S. C. et al. Antifungal activity of ZnO and MgO nanomaterials and their mixtures against colletotrichum gloeosporioides strains from tropical fruit. J Nanomater. 2018 (2018). https://doi.org/10.1155/2018/3498527
  29. Danaei, M. et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 1-17. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics10020057 (2018).
  30. Rao, S., Song, Y., Peddie, F. & Evans, A. M. Particle size reduction to the nanometer range: A promising approach to improve buccal absorption of poorly water-soluble drugs. Int. J. Nanomed. 6, 1245-1251. https://doi.org/10.2147/ijn.s19151 (2011).
  31. Clogston, J. D. & Patri, A. K. Zeta Potential Measurement. Methods Mol. Biol. 697, 63-70. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-19 8-1_6 (2011).
  32. Hasani Bijarbooneh, F. et al. Aqueous colloidal stability evaluated by Zeta potential measurement and resultant TiO 2 for superior photovoltaic performance. J. Am. Ceram. Soc. 96 (8), 2636-2643. https://doi.org/10.1111/jace. 12371 (2013).
  33. JAHAN, I. Lemon Peel Extract for synthesizing non-toxic silver nanoparticles through one-step microwave-accelerated Scheme. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Tarım ve Doğa. Derg. 24 (1), 1-10. https://doi.org/10.18016/ksutarimdoga.vi. 737063 (2021).
  34. Singh, N., Saha, P., Rajkumar, K. & Abraham, J. Biosynthesis of silver and selenium nanoparticles by Bacillus sp. JAPSK2 and evaluation of antimicrobial activity. Der Pharm. Lett. 6 (1), 175-181 (2014).
  35. Ramamurthy, C. H. et al. The extra cellular synthesis of gold and silver nanoparticles and their free radical scavenging and antibacterial properties. Colloids Surf. B Biointerfaces. 102, 808-815. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2012.09.025 (2013).
  36. Khandsuren, B. & Prokisch, J. The production methods of selenium nanoparticles. Acta Univ. Sapientiae Aliment. 14 (1), 14-43. https://doi.org/10.2478/ausal-2021-0002 (2021).
  37. Peng, S., McMahon, J. M., Schatz, G. C., Gray, S. K. & Sun, Y. Reversing the size-dependence of surface plasmon resonances. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107 (33), 14530-14534. https://doi.org/10.1073/pnas. 1007524107 (2010).
  38. İpek, P. et al. Green synthesis and evaluation of antipathogenic, antioxidant, and anticholinesterase activities of gold nanoparticles (au NPs) from Allium cepa L. peel aqueous extract. Biomass Convers. Biorefinery. 14 (9), 10661-10670. https://doi.org/10.1007/s1 3399-023-04362-y (2024).
  39. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L. & Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem. B. 107 (3), 668-677. https://doi.org/10.1021/jp026731y (2003).
  40. Jiang, F., Cai, W. & Tan, G. Facile synthesis and Optical properties of Small Selenium nanocrystals and Nanorods. Nanoscale Res. Lett. 12, 0-5. https://doi.org/10.1186/s11671-017-2165-y (2017).
  41. Lin, Z. H. & Wang, C. R. C. Evidence on the size-dependent absorption spectral evolution of selenium nanoparticles. Mater. Chem. Phys. 92 (2-3), 591-594. https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2005.02.023 (2005).
  42. Wahab, A., Abou Elyazeed, A. M. & Abdalla, A. E. Bioactive compounds in some Citrus peels as affected by drying processes and quality evaluation of cakes supplemented with Citrus peels powder. 44.; (2018).
  43. El-ghfar, M. H. A. A., Ibrahim, H. M., Hassan, I. M., Abdel Fattah, A. A. & Mahmoud, M. H. Peels of lemon and orange as valueadded ingredients: Chemical and antioxidant properties. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 5 (12), 777-794. https://doi.org/10.2054 6/ijcmas.2016.512.089 (2016).
  44. Udvardi, B. et al. Effects of particle size on the attenuated total reflection spectrum of minerals. Appl. Spectrosc. 71 (6), 1157-1168. https://doi.org/10.1177/0003702816670914 (2017).
  45. Alagesan, V. & Venugopal, S. Green synthesis of selenium nanoparticle using leaves extract of Withania somnifera and its biological applications and photocatalytic activities. Bionanoscience. 9 (1), 105-116. https://doi.org/10.1007/s12668-018-0566-8 (2019).
  46. Gulley-Stahl, H. J., Haas, J. A., Schmidt, K. A., Evan, A. P. & Sommer, A. J. Attenuated total internal reflection Fourier transform infrared spectroscopy: A quantitative approach for kidney stone analysis. Appl. Spectrosc. 63 (7), 759-766. https://doi.org/10.1366 /000370209788701044 (2009).
  47. Khater, S., Ali, I., Khater, Ahmed, A. & abd el-megid, S. Preparation and characterization of Chitosan-stabilized selenium nanoparticles for ameliorating experimentally Induced Diabetic Nephropathy in rats. Arab. J. Nucl. Sci. Appl. 0 (0), 1-9. https://do i.org/10.21608/ajnsa.2020.19809.1300 (2020).
  48. Saeed, M. et al. Assessment of antimicrobial features of selenium nanoparticles (SeNPs) using cyclic voltammetric strategy. J. Nanosci. Nanotechnol. 19 (11), 7363-7368. https://doi.org/10.1166/jnn.2019.16627 (2019).
  49. Sribenjarat, P., Jirakanjanakit, N. & Jirasripongpun, K. Selenium nanoparticles biosynthesized by garlic extract as antimicrobial agent. Sci. Eng. Heal Stud. 14 (1), 22-31 (2020).
  50. Javed, R. et al. Role of capping agents in the application of nanoparticles in biomedicine and environmental remediation: Recent trends and future prospects. J. Nanobiotechnol. 18 (1), 1-15. https://doi.org/10.1186/s12951-020-00704-4 (2020).
  51. Collado-González, M., Montalbán, M. G., Peña-García, J., Pérez-Sánchez, H. & Víllora, G. Díaz Baños FG. Chitosan as stabilizing agent for negatively charged nanoparticles. Carbohydr. Polym. 161, 63-70. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.12.043 (2017).
  52. Aibani, N., Cuddihy, G. & Wasan, E. K. Chitosan Nanoparticles at the Biological interface: Implications for drug delivery. Published online 2021.
53．Salem，M．F．，Abd－elraoof，W．A．，Tayel，A．A．，Alzuaibr，F．M．＆Abonama，O．M．Antifungal application of biosynthesized selenium nanoparticles with pomegranate peels and nanochitosan as edible coatings for citrus green mold protection．J．Nanobiotechnol． Published Online 2022，1－12．https：／／doi．org／10．1186／s12951－022－01393－x
54．Alghuthaymi，M．A．et al．Green biosynthesized selenium nanoparticles by cinnamon extract and their antimicrobial activity and application as edible coatings with nano－chitosan．J Food Qual． 2021 （2021）．https：／／doi．org／10．1155／2021／6670709
55．Soleimani Asl，S．et al．Chitosan－coated selenium nanoparticles enhance the efficiency of stem cells in the neuroprotection of streptozotocin－induced neurotoxicity in male rats．Int．J．Biochem．Cell．Biol． 141 （September），1－9．https：／／doi．org／10．1016／j．bioce 1．2021．106089（2021）．
56．Kulikouskaya，V．et al．Chitosan－capped silver nanoparticles：A comprehensive study of polymer molecular weight effect on the reaction kinetic，physicochemical properties，and synergetic antibacterial potential．SPE Polym． 3 （2），77－90．https：／／doi．org／10．10 02／pls2．10069（2022）．
57．Rao，L．et al．Chitosan－decorated selenium nanoparticles as protein carriers to improve the in vivo half－life of the peptide therapeutic BAY 55－9837 for type 2 diabetes mellitus．Int．J．Nanomed．9，4819－4828．https：／／doi．org／10．2147／IJN．S67871（2014）．
58．Shao，C．et al．Chitosan－coated selenium nanoparticles attenuate PRRSV replication and ROS／JNK－mediated apoptosis in vitro． Int．J．Nanomed． 17 （July），3043－3054．https：／／doi．org／10．2147／IJN．S370585（2022）．
59．Zhihui，J．et al．One－step reinforcement and deacidification of paper．Coatings． 10 （12267），1－15（2020）．
60．Thamilarasan，V．et al．Single step fabrication of Chitosan nanocrystals using Penaeus semisulcatus：Potential as New insecticides， antimicrobials and Plant Growth promoters．J．Clust Sci． 29 （2），375－384．https：／／doi．org／10．1007／s10876－018－1342－1（2018）．
61．Ayoub MMH．Incorporated nano－chitosan．Polym．Bull． 0123456789 https：／／doi．org／10．1007／s00289－023－04768－8（2023）．
62．Sheikhalipour，M．et al．Chitosan－selenium nanoparticle（Cs－se np）foliar spray alleviates salt stress in bitter melon．Nanomaterials． 11 （3），1－23．https：／／doi．org／10．3390／nano11030684（2021）．
63．Luo，Y．，Zhang，B．，Cheng，W．H．＆Wang，Q．Preparation，characterization and evaluation of selenite－loaded chitosan／TPP nanoparticles with or without zein coating．Carbohydr．Polym． 82 （3），942－951．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2010．06．029 （2010）．
64．Chen，Y．et al．Stability and surface properties of selenium nanoparticles coated with chitosan and sodium carboxymethyl cellulose． Carbohydr．Polym． 278 （17），118859．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2021．118859（2022）．
65．Liu，J．，Tian，S．，Meng，X．＆Xu，Y．Effects of Chitosan on control of postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit．Postharvest Biol．Technol． 44 （3），300－306．https：／／doi．org／10．1016／j．postharvbio．2006．12．019（2007）．
66．Ma，Z．，Garrido－Maestu，A．＆Jeong，K．C．Application，mode of action，and in vivo activity of chitosan and its micro－and nanoparticles as antimicrobial agents：A review．Carbohydr．Polym． 176 （July），257－265．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2017．08．082（2017）．
67．Wu，Z．et al．Effect of selenium on control of postharvest gray mold of tomato fruit and the possible mechanisms involved．Front． Microbiol． 6 （JAN），1－11．https：／／doi．org／10．3389／fmicb．2015．01441（2016）．
68．Theodoridis，T．＆Kraemer，J．No 主観的健康感を中心とした在宅高齢者における健康関連指標に関する共分散構造分析 Title．
69．Smolińska，U．＆Kowalska，B．Smolińska－Kowalska2018＿Article＿BiologicalControlOfTheSoil－bor．pdf．J．Plant．Pathol．Published Online 2018：1－12 ．
70．Fatin Najwa，R．＆Azrina，A．Comparison of vitamin C content in citrus fruits by titration and high performance liquid chromatography（HPLC）methods．Int．Food Res．J． 24 （2），726－733（2017）．
71．Satgurunathan，T．，Bhavan，P．S．＆Komathi，S．Green synthesis of selenium nanoparticles from sodium selenite using garlic extract and its enrichment on Artemia Nauplii to feed the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii post－larvae．Res．J．Chem． Environ． 21 （10），1－12（2017）．
72．Nunes，R．，Sousa，Â．，Simaite，A．，Aido，A．＆Buzgo，M．Sub－100 nm Chitosan－Triphosphate－DNA nanoparticles for delivery of DNA vaccines †．Published online 2021：1－7．
73．Yao，H．J．＆Tian，S．P．Effects of a biocontrol agent and methyl jasmonate on postharvest diseases of peach fruit and the possible mechanisms involved．J．Appl．Microbiol． 98 （4），941－950．https：／／doi．org／10．1111／j．1365－2672．2004．02531．x（2005）．
74．Farzand，A．et al．Suppression of sclerotinia sclerotiorum by the induction of systemic resistance and regulation of antioxidant pathways in tomato using fengycin produced by Bacillus amyloliquefaciens FZB42．Biomolecules． 9 （10）．https：／／doi．org／10．3390／b iom9100613（2019）．
75．Finney，D．J．Probit analysis：a statistical treatment of the sigmoid response curve．（1952）．

الشكر والتقدير

نود أن نشكر الدكتور أحمد إبراهيم، والدكتور أحمد م. الخواجة، والدكتور خالد السيد مصطفى (جامعة الجلالة، مدينة الجلالة، السويس، مصر) على مساعدتهم في تقنيات التوصيف المستخدمة في هذه الدراسة.

مساهمات المؤلفين

كان محمد م. دسوقي له دور أساسي في تنفيذ الجوانب العملية للمشروع، وتحليل البيانات، وصياغة المسودة الأولية. قدمت رادوا ح. أبو صالح الإشراف طوال المشروع وكانت مسؤولة عن مراجعة المسودة النهائية للمخطوطة. ساهم طارق أ. أ. موسى في تصميم التجارب، وساعد في العمل العملي، وشارك في تحليل البيانات ومراجعة المسودة النهائية للمخطوطة. كانت هبة م. فهمي مشاركة في تصور العمل، وساعدت في العمل العملي، وساهمت في تحليل البيانات والنقاش، ومراجعة المسودة النهائية للمخطوطة.

التمويل

تم توفير تمويل الوصول المفتوح من قبل هيئة العلوم والتكنولوجيا والابتكار (STDF) بالتعاون مع بنك المعرفة المصري (EKB).

الإعلانات

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

معلومات إضافية

يجب توجيه المراسلات وطلبات المواد إلى ر. ح. أ. – س. أو ط. أ. أ. م.
معلومات إعادة الطبع والتصاريح متاحة على www. nature. com/reprints.
ملاحظة الناشر: تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.
الوصول المفتوح: هذه المقالة مرخصة بموجب رخصة المشاع الإبداعي للاستخدام والمشاركة والتكيف والتوزيع وإعادة الإنتاج في أي وسيلة أو صيغة، طالما أنك تعطي الائتمان المناسب للمؤلفين الأصليين والمصدر، وتوفر رابطًا لرخصة المشاع الإبداعي، وتوضح ما إذا كانت هناك تغييرات قد تم إجراؤها. الصور أو المواد الأخرى من طرف ثالث في هذه المقالة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة، ما لم يُشار إلى خلاف ذلك في سطر الائتمان للمادة. إذا لم تكن المادة مشمولة في رخصة المشاع الإبداعي للمقالة واستخدامك المقصود غير مسموح به بموجب اللوائح القانونية أو يتجاوز الاستخدام المسموح به، ستحتاج إلى الحصول على إذن مباشرة من صاحب حقوق الطبع والنشر. لعرض نسخة من هذه الرخصة، قم بزيارة http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© المؤلفون 2024
  1. قسم الفيزياء الحيوية، كلية العلوم، جامعة القاهرة، الجيزة، مصر. برنامج علوم النانو والتكنولوجيا، كلية العلوم، جامعة الجلالة، مدينة الجلالة، مدينة الجلالة الجديدة 43511، السويس، مصر. مجموعة الفيزياء الحيوية، قسم الفيزياء، كلية العلوم، جامعة المنصورة، المنصورة، مصر. قسم علم النبات والميكروبيولوجيا، كلية العلوم، جامعة القاهرة، الجيزة، مصر. البريد الإلكتروني: R.H.Saleh@gu.edu.eg; tmoussa@sci.cu.edu.eg

Journal: Scientific Reports, Volume: 15, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-024-79574-x
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39762311
Publication Date: 2025-01-06

OPEN

Nano-chitosan-coated, greensynthesized selenium nanoparticles as a novel antifungal agent against Sclerotinia sclerotiorum: in vitro study

Mohamed M. Desouky , Radwa H. Abou-Saleh , Tarek A. A. Moussa & Heba M. Fahmy

Chemical fungicides have been used to control fungal diseases like Sclerotinia sclerotiorum. These fungicides must be restricted because of their toxicity and the development of resistance strains. Therefore, utilizing natural nanoscale materials in agricultural production is a potential alternative. This work aimed to investigate the antifungal properties of a nanocomposite (nano-chitosan-coated, green-synthesized selenium nanoparticles) against the plant pathogenic fungus S. sclerotiorum. Chemical reduction was used to produce selenium nanoparticles from citrus peel extracts, and ionotropic gelation was used to produce chitosan nanoparticles. The nanocomposite has been produced using selenium nanoparticles stabilized by chitosan and cross-linked with sodium tripolyphosphate. Transmission electron microscopy, dynamic light scattering, X-ray diffraction, UV-VIS spectroscopy, and Fourier transform infrared spectroscopy were used to characterize all produced nanostructures. The in vitro antifungal activity and minimum inhibitory concentration of all bulk and nanostructures are investigated at ppm concentrations. Scanning electron microscopy was used to detect structural deformations in the fungal mycelium. The findings support the successful synthesis and characterization of all nanoparticles. Lemon peel extract produced smaller, more stable, and distributed selenium nanoparticles than orange peel extract . Nanostructures, particularly nanocomposite, have shown a considerable increase in antifungal efficacy compared to bulk structures. At a minimum inhibitory concentration of 0.5 ppm , the nanocomposite exhibited inhibitory activity. The nanocomposite with a concentration of 0.5 ppm exhibited the lowest average fungal biomass ( ) among all tested nanostructures. Fungal hyphae treated with 0.5 ppm of nanocomposite within 18 h of treatment revealed substantial damage and deformation. These results provide new insights into the nanocomposite as an eco-friendly and promising antifungal agent against other plant pathogenic fungi.
Keywords Green Synthesis, Chitosan, Selenium, Nanocomposite, Sclerotinia Sclerotiorum
S. sclerotiorum, or white mould, generally has different adverse effects on plant development. For instance, it can cause decreases in the weight of the plant’s stem and root, whether fresh or dry, resulting in the death of host tissues . Oxalic acid and cell wall-degrading enzymes (CWDEs) are considered early toxins of S. sclerotiorum pathogenicity, followed by nutrient elimination from the host cell . Despite being a necrotrophic pathogen, it enters a brief biotrophic phase, which lasts for half or one day after infection . It inhibits the host’s defensive barriers during the phase . Following this, the hyphae of subcutaneous S. sclerotiorum extend into many layers of cells. Upon successfully colonizing its branching hyphae, S. sclerotiorum transitions into a necrotrophic stage,
producing substantial quantities of reactive oxygen species, toxins, and cell wall-degrading enzymes (CWDEs). This process ultimately results in the induction of host cell death and the manifestation of necrotic symptoms .
Recent studies demonstrate the antifungal action of selenium against S. sclerotiorum as a natural material in the form of sodium selenite . Selenium can protect human and animal body tissues from damage caused by free radicals . However, selenate and selenite forms of selenium have the highest toxic effects because of their high solubility and bioavailability . In contrast, Nano-selenium has an advantage over bulk selenium because it can be employed in its zero-oxidation state ( ), which has low toxicity and significant bioavailability Compared to the bulk state . Furthermore, Selenium nanoparticles (Se NPs) have gained interest for usage in agriculture during the last ten years owing to their increased antioxidant and antimicrobial effects with low toxicity compared to bulky selenium .
The antifungal activity of the chemically synthesized Se NPs against S. sclerotiorum was recently tested , offering a great chance to fight S. sclerotiorum. However, producing Se NPs via chemical or physical synthesis has many limitations, including several steps during the synthesis process, significant energy consumption, expensive costs, and toxic effects . Biogenic synthesis, on the other hand, is a viable, low-cost, and echo-friendly alternative because it utilizes natural resources such as microbes and plant materials . Using plant material extracts to reduce metal ions into nanoparticles is considered a single-step green synthesis process . Because of their notable activities, citrus extracts have been widely employed for synthesizing metallic nanoparticles . Ascorbic acid, three times more abundant in citrus peels than other fruit parts, is a powerful reducing agent that can effectively mitigate SS to Se NPs . Therefore, citrus reticulate peel extracts as plant material have been selected to be highly effective in reducing SS into spherical Se NPs compared to other plant extracts .
Chitosan(CS) is a potential natural fungicide selected in this study with Se NPs to treat postharvest infections in fruits and vegetables . The results showed that the treatment with CS at its optimum inhibitory concentration of caused host resistance to S.sclerotiorum . Other studies looked at the antifungal activity of CS and chitosan nanoparticles (CS NPs) at the optimal inhibitory concentrations of against S. sclerotiorum, causing extensive damage to the plasma membrane .
The current study details a systematic approach for preparing and characterizing nano-chitosan-coated green synthesized selenium nanoparticles (NCS-Se NPs). CS NPs will play a dual role as a stabilizing agent for Se NPs and as a natural antifungal agent with Se NPs against the same causal pathogen, S. sclerotiorum. In vitro studies tested the antifungal activity of different concentrations of the bulk and Nanoparticles, compared to the whole nanocomposite (NCS-Se NPs), to study its synergistic effect and determine the minimum inhibitory concentration (MIC). The antifungal activity of the nanostructures was tested at the same concentrations of their bulk forms, influenced by their particle size. The size is often one of the most critical factors affecting the antifungal activity of the tested material . The morphological changes of the pathogen after treatment were also detected.

Results and discussion

Identification of the fungal isolate

The fungal ITS region’s PCR was sequenced and checked with the GenBank sequence databases. All obtained sequences were aligned and analyzed. The best-fitting substitution model for the alignment was the Kimura 2 parameter model with gamma distribution. A neighbor-joining tree was constructed based on the ITS sequence of all strains (Fig. 1). The ITS sequence gave high similarities with S. sclerotiorum, and the sequence had accession number LC799483.

Optimization of the green synthesis of Se NPs

The preparation process and selection of the proper citrus peel were optimized to produce NPs with smaller particle sizes, higher stability, and dispersity. Typically, smaller NPs are known to have more potent antifungal activity than larger NPs . The size distribution of Se NPs synthesized by lemon peel extract (L.P. -Se NPs) and orange peel extract (O.P. -Se NPs) was imaged by TEM. The charge of the nanostructure surface in both cases was detected using zeta potential analysis. Further characterizations of UV, FT-IR, and XRD spectroscopy were also performed to confirm and optimize the green synthesis of Se NPs.
Figure 2a, b shows TEM images for L.P. -Se NPs and O.P. -Se NPs, respectively, showing size distribution histogram (inset in each). The results confirmed the green synthesis of Se NPs with better size distribution of L.P. -Se NPs with no aggregations, as shown in Fig. 2a. In this case, the average diameter was , while the average diameter of O.P. -Se NPs was . The dispersion of both types of NPs was confirmed by measuring the polydispersity index (PDI) of both samples with a Zeta sizer. The results showed that (PDI) was better in the case of L.P. -Se NPs, with a value of 0.196 compared to 0.277 in the case of O.P. -Se NPs. It was previously studied that PDI values below 0.05 were mainly observed in samples with relatively uniform particle sizes. In contrast, PDI values exceeding 0.7 suggest a significantly wide range of particle size distribution . Results for both samples show size ranges below 0.7 , indicating the dispersity of NPs with better size distribution values for L.P. -Se NPs .
Figure 2c, d presents the zeta potential of L.P. -Se NPs and O.P. -Se NPs to be -19 mv and +12 mv , respectively. The zeta potential is the electrostatic potential when measured at the electrical double layer around a nanoparticle in solution. Neutral nanoparticles have a zeta potential between -10 and +10 mV , whereas strongly cationic and strongly anionic nanoparticles have zeta potentials more enormous than +30 mV or less than . Therefore, both zeta values indicate little colloidal stability that could be enhanced using a stabilizing agent . However, L.P. -Se NPs exhibited higher stability than O.P. -Se NPs, distributed without aggregation and agglomeration. These results were aligned with previous studies of synthesized metallic NPs using Lemon peel extract .
Fig. 1. A neighbor-joining tree for the isolated Sclerotinia sclerotiorum strains. The S. sclerotiorum in this study was deposited in GeneBank with accession number LC799483.1.
Fig. 2. TEM Image of Se NPs synthesized by (a) lemon-peel extract (L.P.- Se NPs) with an inset histogram showing the peak diameter at (b) orange-peel extract (O.P.- Se NPs) with an inset histogram showing the peak diameter at . ( & d) represents the zeta potential and PDI for L.P.-Se NPs and O.P.- Se NPs, respectively.
As shown in Fig. 3a, the results of UV analysis revealed peaks that are displayed at 222 nm and 226 nm in the case of L.P. -Se NPs and O.P. -Se NPs, respectively; these peaks represent the formation of Se NPs due to the reduction of selenite ions by ascorbic acid found in lemon-peel and orange-peel extracts into elemental selenium . The UV-visible absorption maximum due to the surface plasmon resonance (SPR) of Se NPs was between 200 and . The significant blue shift in the absorption band of L.P. -Se NPs and O.P. -Se NPs was due to the biogenic origin of the synthesized Se NPs . The little red shift in the absorption band of O.P. -Se NPs compared to those of L.P. -Se NPs indicates a larger particle size .
As shown in Fig. 3b, c, a laser beam was used initially to confirm the formation of NPs in both cases due to the Tyndall effect. The Tyndall effect was tested to verify the colloidal and dispersed structure of nanoparticles . The difference in colors between both samples reflects the particle size in both cases, as the solution of O.P.-Se NPs appears red compared to pale orange or yellow in the case of L.P. -Se NPs . These color changes relate directly to the absorption features of the NPs in the visible spectra region and, consequently, their particle sizes. These results matches well with a previous study related to the size-dependent absorption of . The concentration of reducing agent in both extracts affects the nucleation and growth sequences as the higher concentration of ascorbic acid in lemon-peel extract results in smaller particle size . This result agrees with previous studies, that found that lemon-peel extract contains the most elevated ascorbic acid compared to all other citrus-peel extracts .
In Fig. 4, FT-IR analysis presented the green synthesis of Se NPs, using lemon or orange-peel extract, in the region from to . The observed multiple infra-red absorption bands are due to ionic bond vibrations found in Se metal. The band represents the stretching in alkyl halides. The and bands represent the stretching of the amines, the band is related to the bending in alkanes, a strong band at is noticed, which is due to the C-C Stretching occurred in the ring of aromatics. The diagnostic region involves a band related to stretching in carboxylic acids. This enhanced band appears in the spectrum of L.P. -Se NPs more precise and sharper than those of O.P. -Se NPs, which may indicate the powerful reduction of SS in the case of lemon extract to form Se NPs compared to those in the case of orange extract . Robust and sharp absorption bands at and correspond to stretch alkynes. The broad O-H band observed at is associated with O-H stretching in alcohols; these absorption bands aligned with another study of biogenic Se NPs .
As observed in Fig. 4, the intensity of most absorption bands in the case of L.P. -Se NPs is higher than O.P.-Se NP bands. The reason for this difference is due to the decrease in particle size and the increase in surface area to
Fig. 3. Shows the characterization of the synthesized NPs, (a) UV spectroscopy of green synthesized O.P.- Se NPs, and L.P.- Se NPs ( & C) shows the laser beam used to detect the NP preparation from both Orange and Lemon peels respectively.
Fig. 4. FT-IR spectroscopy of Se NPs synthesized by lemon and orange-peel extracts.
volume ratio, leading to higher intensity of absorption bands in the FT-IR spectrum as smaller particles have a more significant proportion of atoms on the surface, which can interact more readily with the incident infrared radiation, resulting in a stronger absorption signal . Additionally, smaller particles may exhibit quantum confinement effects, leading to changes in the electronic and vibrational properties that can affect the intensity of absorption bands in the FT-IR spectrum. Hence, the FT-IR analysis results confirm the UV analysis results, indicating a lower particle size in the case of L.P. -Se NPs than in the case of O.P. -Se NPs .
The crystallinity of L.P. -Se NPs was further investigated using X-ray powder Diffraction (XRD) analysis. Figure 5 shows a typical XRD pattern of the triagonal structure of L.P. -Se NPs in which the diffraction peaks correspond to the following miller indices: (100), (101), (110), (102), (111), (200), (201), (112), (202), (210), (113). Some previous studies confirmed this result . All these diffraction peaks are associated with the trigonal structure of Se NPs with an average crystallite size of . This Data agrees with those documented in the JCPDS standard card (No. 06-0362) for Se NPs.
The particle size of synthesized NPs is one of the most critical factors affecting the antimicrobial and antifungal activity of NPs. Sribenjarat et al.. noted that Se NPs with a smaller size range showed higher antimicrobial activity . L.P. -Se NPs exhibit higher stability and dispersity relative to O.P. -Se NPs with lower particle size, which may be due to the higher content of ascorbic acid and other capping agents in lemon-peel extract, which are required for the reduction and stabilization of Se . However, a stabilizing agent could improve the little stability of negatively charged L.P. -Se NPs due to their low zeta value. Accordingly, negatively charged L.P. -Se NPs were selected in this study to be stabilized by cationic nano chitosan, which improves its stability and antifungal activity against the causal pathogen .
Fig. 5. XRD pattern of L.P.-Se NPs.

Preparation and characterization of CS NPs and NCS-Se NPs

Due to the number of amino groups on its surface, The cationic nature of chitosan is the reason for its positive zeta potential . This cationic nature helps the coating process and stability of negatively charged L.P. -Se NPs to form NCS-Se NPs. CS NPs and NCS-Se NPs were prepared as described above in the method section.
Figure 6a shows the TEM image of CS NPs with a tiny particle size of an average diameter of . The crystallinity of CS NPs was also investigated by the polycrystalline diffraction pattern (inset in Fig. 6a). Figure 6b exhibited a TEM image of the (uncoated) L.P. -Se NPs with small particle size and good dispersion due to the presence of extract biomolecules that serve as capping agents providing stabilization and reduced particle size with an average diameter of . However, the presence of CS NPs as a coating agent provided L.P. -Se NPs with further stability and produced (coated) L.P. -Se NPs with a smaller particle size of an average diameter of , as shown in TEM images (Fig. 6c, d). previous results confirmed the data obtained from TEM images . The aggregation of particles in the presence of CS may be due to using high molecular weight CS. Higher and medium-molecular-weight CS is considered a flocculant that promotes particle agglomerations by inter-particle bridging .
Dynamic light scattering (DLS) technique has been used to measure the hydrodynamic particle size of prepared CS NPs and NCS-Se NPs. Figure 7a b shows and size peaks of CS NPs and NCSSe NPs, respectively. The size measured by dynamic light scattering is significantly more than the actual size of nanoparticles Since DLS analyzes the particle’s hydrodynamic size in its aqueous state . Figure 7c shows the zeta potential results for CS NPs to be +4.49 mv . Coating of L.P. -Se NPs with CS NPs increases its zeta potential from -19 mv (as shown in Fig. 2) to -7.24 mv due to the positive zeta potential of CS NPs (Fig. 7d), which indicates the efficient coating of CS NPs with Se NPs to form nanocomposite NCS-Se NPs. This data was confirmed by previous surface chemistry studies of Se-NPs after coating them with chitosan The estimated Particle size and zeta potentials of L.P. -Se NPs, O.P. -Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs are illustrated in Table 1.
Figure 8a shows the XRD pattern of CS, CS NPs, L.P. -Se NPs, and NCS-Se NPs. XRD pattern of CS NPs exhibits a broader prominent peak with lower intensity than (CS) at . XRD pattern of NCS-Se NPs has two prominent peaks at , related to nano-chitosan, and , associated with L.P. -Se NPs with lower intensities . This result indicates the efficient coating of L.P. -Se NPs with CS NPs to form NCS-Se NPs.
Fig. 6. TEM images of (a) CS NPs with an inset showing the polycrystalline diffraction pattern of CS NPs, (b) Se NPs, (c) NCS-Se NPs, (d) zoom-in panel from (C) showing NCS-Se NPs with inset showing size distribution with peak Diameter of .
The well-dispersed nano-selenium in the nanocomposite matrix may cause the distinctive XRD peaks of Se NPs and CS NPs to overlap, and the appearance of additional peaks in the nanocomposite structure suggests that ionic interactions are influencing the crystal lattice. Previous studies confirmed these XRD results .
Figure 8b shows the FT-IR pattern of CS, CS NPs, NCS-Se NPs, and L.P. -Se NPs to investigate the intermolecular interaction of nanoparticles. In nano-chitosan, several characterization peaks were noted. The first peak, at , was assumed to represent an stretch. Peaks at and represent stretching from amide bending, and stretching from amide II , respectively. Additional 1458, 1376, and peaks were attributed respectively to skeletal vibration of stretching, bending, and symmetrical deformation. These findings aligned with previous results, indicating the formation of CS NPs . The electrostatic interaction between L.P. -Se NPs and the amino groups of NCS was confirmed by a shift in the absorption peaks of the NCS spectrum of amide I from to and amide II from to when compared to the spectrum of NCS-Se NPs implies that NCS might attach itself to L.P. -Se NPs by forming hydrogen bonds with . The intensity of absorption bands associated with L.P. -Se NPs at and decreased in the NCS-Se NPs spectrum due to the efficient coating of NCS with L.P. -Se NPs in its matrix .
Fig. 7. Size distribution of (a) CS NPs, (b) NCS-Se NPs, and zeta potential of (c) CS NPs, and (d) NCS-Se NPs, respectively.
Nanoparticles Size Range (nm) Mean Diameter (nm) Zeta Potential (mv)
L.P.-Se 42.28 -19.0
O.P.-Se 85.7 +12.0
CS 6.43 +4.49
NCS-Se 32.7 -7.24
Table 1. Particle size distribution and zeta potential of biosynthesized selenium nanoparticles using lemon and orange-peel extracts (L.P.-Se, O.P.-Se), chitosan nanoparticles (CS), and their nanocomposite (NCS-Se).

In vitro antifungal activity

Mycelial growth assay

The antifungal activity of the three prepared nanostructures (CS NPs, L.P. -Se NPs, and NCS-Se NPs) had been studied compared to their bulk sources CS, SS, and a mixture of CS with SS ( ) at the same concentrations ( ) using the well diffusion method.
All calculated values in the above two tables are shown as mean . Data within the groups were analyzed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by a, b, c, d, e, f Duncan’s multiple range test (DMRT), LSD = Least Significant Difference.
The results showed an antifungal activity of all bulk materials at all concentrations, as shown in Table 2, which agrees with previous reports on the antifungal activity of CS and SS against S. sclerotiorum . The plasma membrane of S. sclerotiorum mycelia treated with this optimal inhibitory concentration of and pH 5 of high molecular weight CS was shown to be significantly damaged . The mycelial growth diameter of SS, CS, and their mixture at the MIC of 0.5 ppm were , and , respectively. Their calculated inhibitory percentage was , and , respectively (Fig. 9a).
As shown in Table 3, among all inhibitory concentrations, the MIC of the three nanostructures was also at minimum concentrations of 0.5 ppm with inhibitory percentages of , and , respectively (Fig. 9b).
Fig. 8. (a) XRD of CS, CS NPs, L.P.- Se NPs & NCS-Se NPs & (b) FT-IR of CS, CS NPs, L.P.-Se NPs & NCS-Se NPs.
Concentration (ppm) Growth Diameter (cm)
SS treatment CS Treatment SS + CS ( )
0
0.5
1
5
10
50
100
LSD 0.72 0.59 0.66
Table 2. Growth diameter count of S. sclerotiorum treated with different concentrations of three tested bulk materials (SS, CS, and mixture of SS + CS ( )). These letters are for Duncan’s multiple test, which means the treatments with the same letter are non-significantlydifferent but the treatments with different letters are significantly different.
The antifungal effect of LP- Se NPs at a low concentration of 0.5 ppm with inhibitory percentage was significantly supported after coating with CS NPs. The inhibitory percentage was obtained by NCS-Se NPs, as CS NPs serve as a stabilizing agent, besides their strong antifungal effect, promoting the antifungal activity of green synthesized Se NPs. This finding agrees with a previous study , which found that chemically synthesized Se NPs with Poly-L-Lysine (PLL.P. -Se NPs) can significantly inhibit the growth of S. sclerotiorum but at a maximum concentration of 100 ppm .

Mycelial biomass assay

Freshly prepared fungal biomass treated with each tested nanostructure with the MIC of 0.5 ppm , besides control, were dried and weighed after five days of dynamic incubation using an orbital shaker at and 180 rpm . The results exhibited potent inhibition of the tested pathogen growth, specifically in the case of NCS-Se NPs with the lowest average biomass at compared to the average fungal biomass of other nanostructures and control, as shown in (Table 4). This result reflects the effectiveness of NCS-Se NPs as an eco-friendly antifungal agent against S. sclerotiorum.

Morphological changes in S. sclerotiorum hyphae

The Ultrastructural changes in the hyphae of S. sclerotiorum caused by 0.5 ppm of NCS-Se NPs were detected using a scanning electron microscope (SEM). The untreated hyphae of S. sclerotiorum appeared intact, dense, long, and cylindrical, as shown in Fig. 10a, b, c. In contrast, hyphae treated with 0.5 ppm NCS-Se NPs showed
Fig. 9. The mycelial growth of S. sclerotiorum treated with MIC of (a) SS, CS, and mixture of SS + CS ( ) and (b) Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs.
Concentration (ppm) Growth Diameter (cm)
Se NPs treatment CS NPs Treatment NCS-Se NPs Treatment
0
0.5 N/A N/A
1 N/A
5
10
50
100
LSD 0.56 0.63 0.65
Table 3. Growth diameter count of S. sclerotiorum treated with different concentrations of three tested nanostructures (Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs). means the treatments with the same letter are non-significantlydifferent but the treatments with different letters are significantly different.
Dynamic incubation Treatment concentration
Control CS NPs Se NPs NCS-Se NPs
Average biomass
Table 4. Dry weight yield of S. sclerotiorum treated with 0.5 ppm of CS NPs, Se NPs, and NCS-Se NPs.
deformities and abnormalities in their morphology. These morphological changes include shrinkage, plasmolysis, distortion, and breakdown of fungal hyphae, as shown in Fig. 10d, e, f, and therefore, rupture and damage of . sclerotiorum hyphae, which indicates the ability of our nanocomposite to suppress their vital functions.

Antifungal mechanism of NCS-Se NPs

It has been demonstrated that CS and Se can protect plants from fungal infections . In the current investigation, we discovered that the mycelial growth of . sclerotium was significantly inhibited by MIC of NCS-Se NPs ( 0.5 ppm ), which also alters the organism’s shape and damages its hyphae. This impact could result from the interaction of the positive amino groups in the nanocomposite’s CS coat with the negatively charged macromolecule residues on the fungal cell membrane, altering the plasma membrane’s permeability . Following that, as shown in Fig. 11, the tiny CS NPs and some released green synthesized L.P. -Se NPs could enter the hypha and interact with intracellular organelles/bio-systems to inhibit their essential functions, which consequently lead to fungal deformation and lysis . Moreover, liberated L.P. -Se NPs may improve the release of S. sclerotiorum electrolytes . The changes in osmolyte levels of S. sclerotiorum mycelia may be necessary for the organism to adapt to its surroundings and protect against Se toxicity, leading to membrane system damage and metabolic disorder . More information is needed on the protective effect’s mechanism, which must be
Fig. 10. TEM images of S. sclerotiorum hyphae of (a-c): control micrographs and (d-f): 0.5 ppm of NCS-Se NPs treatment micrographs.
Fig. 11. Schematic diagram showing the adsorption of NCS-Se NPs with S. sclerotiorum mycelia and their damage effect.
investigated. However, identifying the antifungal mechanism that NCS-Se NPs caused to S. sclerotiorum mycelia would aid in developing an efficient, safe, and sustainable strategy for controlling and managing S. sclerotiorum.

Materials and methods Chemicals

Sodium selenite anhydrous AR was purchased from SDFCL Co., India. High molecular weight Chitosan of 350 KD and Deacetylation level of was purchased from Hunan Yun Bang Pharmacy Co., China. Sodium tripolyphosphate (TPP), sodium hydroxide pellets, and concentrated hydrochloric acid were purchased from Sigma Aldrich Co., America. Potato Dextrose Agar (PDA) and potato dextrose broth (PDB) were purchased from Merck Co., Germany. All chemicals were directly used without any further purification.

Isolation and identification of fungal strain

A common fungal disease called Sclerotinia rot, sometimes called white mould on some crops, is brought on by phytopathogenic members of the Sclerotinia genus. Specifically, S. sclerotiorum is regarded as one of the most pernicious and widespread plant infections. Necrotrophic fungal pathogen S. sclerotiorum (Lib.) de Bary causes diseases in various plants . The fungus was isolated from diseased kidney bean legumes, such as cottony mycelium, on potato dextrose agar (PDA). The fungus was identified morphologically and microscopically and confirmed by molecular identification using ITS. The obtained sequence was deposited at NCBI for accession number. The ITS region was sequenced, and DNA was isolated from the fungal isolate to facilitate molecular identification.
A mixer mill isolation process recovered 0.5 g of fungal mycelium after five days of incubation. DNA was extracted, and a triplicate polymerase chain reaction (PCR) was conducted. 1x PCR buffer, , 2 mM dNTP mixture, of each primer (ITS-F -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′, ITS-R -GGAAGTA AAAGTCGTAA CAAGG-3′), of DNA polymerase (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), and 1 ng of template DNA were added to the volume used for the reaction. The PCR amplification process involved an initial denaturation at for cycles of for for annealing for 45 s , and for an extension lasting 45 s each. Purified and sequenced were the PCR products generated from the fungal isolate that showed up as a single band. The GenBank sequencing databases were then consulted. In MEGA5, the acquired sequence was aligned and examined. The Kimura 2 parameter model with gamma distribution was the bestfitting replacement model for the alignment. A maximum-likelihood tree was built based on the ITS sequence and the 1000 bootstrap values provided at the nodes.

Green synthesis of Se NPs

Citrus limon (lemon) and Citrus reticulata (orange) are the citrus peel extracts selected, as both contain the highest ascorbic acid content . All the fruits were purchased from the local market. Samples of citrus fruits were cleaned with double distilled water and dried with sterilized paper tissues. The dried citrus fruits were peeled, and the peels were cut into tiny pieces using a clean knife. of citrus peel pieces was weighed accurately using a sensitive digital balance and stored in sterile conditions. The weighed peels were then ground in a mortar and turned into a fine mixture with a wetted appearance. The mixture was then boiled in 150 ml of double distilled water for 15 min until the color of the water changed into green-yellow, then filtered using Whatman Filter paper no. .
50 ml of the freshly prepared citrus peel extract (lemon or orange-peel extract was precisely heated using a magnetic hot plate stirrer, and conditions were adjusted to and pH 4.5 ml of ( 0.1 M ) Sodium selenite was added immediately. The formation of Se NPs was confirmed by forming a solution with an orange-red color at this optimum condition. The mixture was centrifuged at for 30 min , washed three times with double-distilled water, and a final wash with ethanol, dried, and stored at room temperature .

Preparation of CS solution and CS NPs

Preparation of CS solution

About deacetylation level and 350 KDa average molecular weight of CS powder was used to prepare stock concentration of CS solution in by stirring overnight at room temperature until the whole amount was completely dissolved. and were used to adjust the solution at pH 5.

Preparation of CS NPs

CS NPs were prepared using the ionotropic gelation method between CS and TPP Briefly, TPP was dissolved in double-distilled water to a concentration of under magnetic stirring at room temperature. Then 10 ml of TPP solution was added dropwise with the flow rate of to 50 ml of the diluted previously prepared stock concentration of CS solution with a ratio respectively, the pH level of the CS and TPP solutions was adjusted to pH 5 and pH 2 respectively. The mixture was stirred at 600 rpm for 30 min . Finally, NCS was collected by centrifugation (at for 28 min , washed three times with double distilled water, oven-dried at overnight, and stored at room temperature.

Synthesis of NCS- Se NPs

NCS-Se NPs were green synthesized as Se NPs as described before but in the presence of CS, with some modifications described by Shao et al. , Zeng et al. , and Ayoub et al. . The mixture of (CS-SS) with a ratio of was stirred at 1000 rpm for 30 min and added dropwise to freshly prepared citrus peel extract. The solution was left overnight with gentle stirring. After coating Se NPs with CS, 1 ml of TPP cross-linker was added dropwise for ionotropic gelation. The color of the solution then changes from yellow to reddish-orange,
which confirms the formation of NCS-Se NPs. The unreacted CS, , and TPP are removed by dialysis (MWCO: ) for 48 h at , and a solution of NCS-Se NPs is obtained.

In vitro studies of antifungal activity

Antifungal activity of the bulk materials (CS, SS, and a mixture of both materials with a ratio was evaluated against . sclerotiorum at different concentrations ( and ), then, the antifungal activity of the tested nanomaterials ( Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs ) was also evaluated at the same concentrations via the healthy diffusion method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of each tested material . Finally, fresh mycelial biomass was assayed at the MIC to evaluate the inhibitory effect for each nanomaterial individually as well as the nanocomposite’s synergistic inhibitory effect.

Mycelial growth measurement

S. sclerotiorum was isolated from the infected green bean and kept on potato dextrose agar (PDA). According to Qing and Yao , the impact of each previously prepared material on mycelial growth was evaluated. Briefly, 20 ml of sterilized PDA was prepared and placed in sterilized plates with a 9 cm diameter. Then, Mycelial disks with five mm -diameter from old cultures ( 10 days grown at room temperature) were placed in the center of each plate, three holes were made using sterilized tips in each sterilized PDA around each disk, and 1 ml solution of each prepared concentration in aseptic conditions was withdrawn and distributed in the 3 holes. Each treatment was replicated three times, and the experiment was repeated twice. PDA without any concentration served as a control. Control and treated plates were incubated at for 5 days. After incubation, the mycelial growth was determined by measuring the growth diameter of each tested concentration; the antifungal activity of all tested concentrations on the mycelial growth of S. sclerotiorum was calculated according to the following formula:

Mycelial biomass assay

100 ml of potato dextrose broth (PDB) was prepared and placed in a 250 ml conical flask. Each PDP was diluted by the MIC of each tested nanostructure (Se NPs, NCS, and NCS-Se NPs) until the tested concentrations were obtained. Then, mycelial disks with 5 mm – diameter from old cultures ( 10 days grown at room temperature) were inserted into each treated PDB at . Each treatment was replicated 3 times, and the experiment was repeated twice PDB without any concentrations served as a control. After collecting the fungal biomass, it was washed thrice with double-distilled water and left to dry on filter paper for two hours. Then, the fresh fungal biomass of each treatment and control group was dried and weighed after five days of incubation.

Morphological changes in S. sclerotiorum hyphae

After 18 h of exposure to the minimum inhibitory concentration (MIC) of NCS-Se nanoparticles (NPs), S. sclerotiorum hyphae were fixed with a glutaraldehyde solution and washed three times for 10 min with 100 mM phosphate buffer. The fixed hyphae were then post-fixed for three hours in osmium tetroxide ( ) and dehydrated through an ethanol gradient to examine the ultrastructural changes in the hyphae using a scanning electron microscope (SEM) after coating with gold .

Characterization of the prepared nanostructures

Transmission electron microscopy (TEM)

The formation of the following nanostructures, green synthesized Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs was confirmed using a Transmission electron microscope (TEM) (JEM-2100 PLUS). At an accelerating voltage of 200 KV , TEM was used to study the size, shape, and agglomeration states of Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs. A drop of the diluted samples was placed on a copper-coated carbon grid and allowed to dry for about 15 min . A filter paper was used to remove the excess sample, and then the grid was left in the air to dry before being introduced to the TEM.

Dynamic light scattering (DLS)

The particle size of all prepared nanostructures, Se NPs, CS NPs, and NCS-Se NPs was measured using the Zeta sizer nano series (ZEN3600, Malvern, UK) with a size range (of ) at . Samples were diluted with deionized water before being introduced to the zeta sizer to measure their average diameter and size distribution. The device was outfitted using a laser radiation beam at 633 nm , and the sample suspension was placed in a capillary cuvette. A photomultiplier tube detected the back-scattered light, and the samples’ average size was calculated. DLS also gives information about the surface charges (Zeta Potential) measured using the same capillary cuvette directly after measuring the particle size at the zeta potential range (-200:200 mV).

X-ray diffraction (XRD) analysis

X-ray diffraction analysis (XRD) was done to study the crystal structure, composition, and grain size of nanostructures using an X-ray diffractometer (Angstrom -ADX8000 diffractometer) with CuKal-radiation source of wavelength and two theta angles from 100 to 800 .

Ultraviolet-visible (Uv-Vis) spectroscopy

The absorption spectrum of all prepared nanostructures was determined using UV-Vis. Spectrophotometer (BioWave3-USA) with a wavelength range of at a resolution of 1 nm .

Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy

Further characterization involved Fourier transform infrared spectroscopy (Nicolet iS50 FTIR Spectrometer in KBr with absorption in range ( ) with resolution was used to evaluate the functional groups involved in the formation of green synthesized Se NPs and after coating with nano chitosan. The device was continuously purged with dry air to remove the water vapor from the atmosphere. FTIR helps to observe apparent changes in the structure of the compound by studying the variations of bandwidth and wavelength as well as the intensity and frequency of the vibration modes.

Scanning electron microscopy (SEM)

The morphological changes in the hyphae of the pathogen after treatment with the nanostructures were observed through SEM imaging (TESCAN VEGA COMPACT, Brno, Kohoutovice, Czech) at an accelerating voltage of 10 KeV .

Statistical analysis

Statistical analysis of the collected data was performed via the ONE-WAY ANOVA analysis (at ), Duncan’s multiple range states, and the least significant difference (LSD) statement . The results and data obtained were examined using the SPSS software version.

Conclusion

Generally, we concluded that L.P.-Se NPs exhibit smaller sizes of and a better distribution than O.P.-Se NPs. The lower negative zeta value of L.P.-Se NPs and the smaller particle size enhanced their selection for coating with positively charged nano-chitosan to improve their stability and antifungal efficacy against . sclerotiorum. CS NPs exhibited small particle sizes of with positive zeta value. This cationic nature and small particle size enhanced the properties of CS NPs and improved their antifungal activity against the same causal pathogen with a inhibitory Percentage. Low zeta values of L.P.-Se NPs and CS NPs of -19 mv and +4.49 mv , respectively, limited their stability and bioactivity. Combining NCS with L.P.-Se NPs to form NCS-Se NPs reduced its particle size with an average diameter of and increased its stability and antifungal activity. The antifungal activity of L.P. Se-NPs has been increased from 69 to inhibitory percentage after coating with nano-chitosan at the same MIC of 0.5 ppm . The fungal biomass treated with NCS-Se NPs at the MIC of 0.5 ppm has been reduced to compared to the treated one with L.P.-Se NPs and CS NPs. The enhanced antifungal efficacy of the nanocomposite NCS-Se NPs causes detected damage to fungal hyphae, introducing a novel, promising, eco-friendly antifungal agent against other plant pathogenic fungi.

Data availability

All data generated or analyzed during this study are included in this manuscript.
Received: 29 July 2024; Accepted: 11 November 2024
Published online: 06 January 2025

References

  1. Perveen, K., Haseeb, A. & Shukla, P. K. Effect of Sclerotinia sclerotiorum on the disease development, growth, oil yield and biochemical changes in plants of Mentha arvensis. Saudi J. Biol. Sci. 17 (4), 291-294. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2010.05.008 (2010).
  2. Rollins, J. A. & Dickman, M. B. pH signaling in Sclerotinia sclerotiorum: Identification of a pacC/RIM1 homolog. Appl. Environ. Microbiol. 67 (1), 75-81. https://doi.org/10.1128/AEM.67.1.75-81.2001 (2001).
  3. Qin, L. et al. SsCak1 regulates growth and pathogenicity in Sclerotinia Sclerotiorum. Int. J. Mol. Sci. 24 (16), 1-14. https://doi.org/ 10.3390/ijms241612610 (2023).
  4. Ding, Y. et al. Host-Induced Gene silencing of a multifunction gene Sscnd1 enhances Plant Resistance against Sclerotinia Sclerotiorum. Front. Microbiol. 12 (October), 1-15. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2021.693334 (2021).
  5. Seifbarghi, S. et al. Changes in the Sclerotinia sclerotiorum transcriptome during infection of Brassica napus. BMC Genom. 18 (1), 1-37. https://doi.org/10.1186/s12864-017-3642-5 (2017).
  6. Williams, B., Kabbage, M., Kim, H. J., Britt, R. & Dickman, M. B. Tipping the balance: Sclerotinia sclerotiorum secreted oxalic acid suppresses host defenses by manipulating the host redox environment. PLoS Pathog. 7 (6). https://doi.org/10.1371/journal.ppat. 10 02107 (2011).
  7. Chittem, K., Yajima, W. R., Goswami, R. S. & del Río Mendoza, L. E. Transcriptome analysis of the plant pathogen Sclerotinia sclerotiorum interaction with resistant and susceptible canola (Brassica napus) lines. PLoS One. 15 (3), 1-29. https://doi.org/10.13 71/journal.pone. 0229844 (2020).
  8. Jia, W. et al. Action of selenium against Sclerotinia sclerotiorum: Damaging membrane system and interfering with metabolism. Pestic Biochem. Physiol. 150 (June), 10-16. https://doi.org/10.1016/j.pestbp.2018.06.003 (2018).
  9. Xu, J. et al. Selenium as a potential fungicide could protect oilseed rape leaves from Sclerotinia sclerotiorum infection. Environ. Pollut. 257, 113495. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2019.113495 (2020).
  10. Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E. & Carmona, M. Biosynthesis of selenium nanoparticles by Azoarcus Sp. CIB Microb. Cell. Fact. 15 (1), 1-10. https://doi.org/10.1186/s12934-016-0510-y (2016).
  11. Wang, H., Zhang, J. & Yu, H. Elemental selenium at nano size possesses lower toxicity without compromising the fundamental effect on selenoenzymes: comparison with selenomethionine in mice. Free Radic Biol. Med. 42 (10), 1524-1533. https://doi.org/10 .1016/j.freeradbiomed.2007.02.013 (2007).
  12. Chen, T., Wong, Y. S., Zheng, W., Bai, Y. & Huang, L. Selenium nanoparticles fabricated in Undaria pinnatifida polysaccharide solutions induce mitochondria-mediated apoptosis in A375 human melanoma cells. Colloids Surf. B Biointerfaces. 67 (1), 26-31. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2008.07.010 (2008).
  13. Quiterio-Gutiérrez, T. et al. The application of selenium and copper nanoparticles modifies the biochemical responses of tomato plants under stress by Alternaria Solani. Int. J. Mol. Sci. 20 (8). https://doi.org/10.3390/ijms20081950 (2019).
  14. Vrandečić, K. et al. Antifungal activities of silver and selenium nanoparticles stabilized with different surface coating agents. Pest Manag Sci. 76 (6), 2021-2029. https://doi.org/10.1002/ps. 5735 (2020).
  15. Dhawan, G., Singh, I., Dhawan, U. & Kumar, P. Synthesis and characterization of Nanoselenium: A step-by-step guide for undergraduate students. J. Chem. Educ. 98 (9), 2982-2989. https://doi.org/10.1021/acs.jchemed.0c01467 (2021).
  16. Cittrarasu, V. et al. Green synthesis of selenium nanoparticles mediated from Ceropegia bulbosa Roxb extract and its cytotoxicity, antimicrobial, mosquitocidal and photocatalytic activities. Sci. Rep. 11 (1), 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-80327-9 (2021).
  17. Alvi, G. B. et al. Biogenic selenium nanoparticles (SeNPs) from citrus fruit have anti-bacterial activities. Sci. Rep. 11 (1), 1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-021-84099-8 (2021).
  18. Balakrishnaraja, R., Sasidharan, S. & Biosynthesis of Selenium Nanoparticles Using Citrus Reticulata Peel Extract. Vol 4. (2015).
  19. Mittal, A. K., Chisti, Y. & Banerjee, U. C. Synthesis of metallic nanoparticles using plant extracts. Biotechnol. Adv. 31 (2), 346-356. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.01.003 (2013).
  20. Rao, A. V. & Rao, L. G. Carotenoids and human health. Pharmacol. Res. 55 (3), 207-216. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.01.012 (2007).
  21. Salem, S. S. et al. Green biosynthesis of Selenium nanoparticles using orange peel waste: Characterization, antibacterial and antibiofilm activities against multidrug-resistant bacteria. Life. 12 (6). https://doi.org/10.3390/life12060893 (2022).
  22. Awad, H. Antifungal potentialities of Chitosan and Trichoderma in controlling Botrytis cinerea, causing strawberry gray mold disease. J. Plant. Prot. Pathol. 8 (8), 371-378. https://doi.org/10.21608/jppp. 2017.46342 (2017).
  23. Wang, Q., Zuo, J., Wang, Q., Na, Y. & Gao, L. Inhibitory effect of chitosan on growth of the fungal phytopathogen, Sclerotinia Sclerotiorum, and sclerotinia rot of carrot. J. Integr. Agric. 14 (4), 691-697. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(14)60800-5 (2015).
  24. Molloy, C., Cheah, L. H. & Koolaard, J. P. Induced resistance against Sclerotinia sclerotiorum in carrots treated with enzymatically hydrolysed chitosan. Postharvest Biol. Technol. 33 (1), 61-65. https://doi.org/10.1016/j.postharvbio.2004.01.009 (2004).
  25. El-mohamedy, R. S. R., El-aziz, M. E. A. & Kamel, S. Antifungal activity of chitosan nanoparticles against some plant pathogenic fungi in vitro. 21(4):201-209. (2019).
  26. Slavin, Y. N. & Bach, H. Mechanisms of antifungal properties of metal nanoparticles. Nanomaterials. 12 (24). https://doi.org/10.3 390/nano12244470 (2022).
  27. Martínez, A. et al. Dual antifungal activity against Candida albicans of copper metallic nanostructures and hierarchical copper oxide marigold-like nanostructures grown in situ in the culture medium. J. Appl. Microbiol. 130 (6), 1883-1892. https://doi.org/1 0.1111/jam. 14859 (2021).
  28. De La Rosa-García, S. C. et al. Antifungal activity of ZnO and MgO nanomaterials and their mixtures against colletotrichum gloeosporioides strains from tropical fruit. J Nanomater. 2018 (2018). https://doi.org/10.1155/2018/3498527
  29. Danaei, M. et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 1-17. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics10020057 (2018).
  30. Rao, S., Song, Y., Peddie, F. & Evans, A. M. Particle size reduction to the nanometer range: A promising approach to improve buccal absorption of poorly water-soluble drugs. Int. J. Nanomed. 6, 1245-1251. https://doi.org/10.2147/ijn.s19151 (2011).
  31. Clogston, J. D. & Patri, A. K. Zeta Potential Measurement. Methods Mol. Biol. 697, 63-70. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-19 8-1_6 (2011).
  32. Hasani Bijarbooneh, F. et al. Aqueous colloidal stability evaluated by Zeta potential measurement and resultant TiO 2 for superior photovoltaic performance. J. Am. Ceram. Soc. 96 (8), 2636-2643. https://doi.org/10.1111/jace. 12371 (2013).
  33. JAHAN, I. Lemon Peel Extract for synthesizing non-toxic silver nanoparticles through one-step microwave-accelerated Scheme. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Tarım ve Doğa. Derg. 24 (1), 1-10. https://doi.org/10.18016/ksutarimdoga.vi. 737063 (2021).
  34. Singh, N., Saha, P., Rajkumar, K. & Abraham, J. Biosynthesis of silver and selenium nanoparticles by Bacillus sp. JAPSK2 and evaluation of antimicrobial activity. Der Pharm. Lett. 6 (1), 175-181 (2014).
  35. Ramamurthy, C. H. et al. The extra cellular synthesis of gold and silver nanoparticles and their free radical scavenging and antibacterial properties. Colloids Surf. B Biointerfaces. 102, 808-815. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2012.09.025 (2013).
  36. Khandsuren, B. & Prokisch, J. The production methods of selenium nanoparticles. Acta Univ. Sapientiae Aliment. 14 (1), 14-43. https://doi.org/10.2478/ausal-2021-0002 (2021).
  37. Peng, S., McMahon, J. M., Schatz, G. C., Gray, S. K. & Sun, Y. Reversing the size-dependence of surface plasmon resonances. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107 (33), 14530-14534. https://doi.org/10.1073/pnas. 1007524107 (2010).
  38. İpek, P. et al. Green synthesis and evaluation of antipathogenic, antioxidant, and anticholinesterase activities of gold nanoparticles (au NPs) from Allium cepa L. peel aqueous extract. Biomass Convers. Biorefinery. 14 (9), 10661-10670. https://doi.org/10.1007/s1 3399-023-04362-y (2024).
  39. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L. & Schatz, G. C. The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment. J. Phys. Chem. B. 107 (3), 668-677. https://doi.org/10.1021/jp026731y (2003).
  40. Jiang, F., Cai, W. & Tan, G. Facile synthesis and Optical properties of Small Selenium nanocrystals and Nanorods. Nanoscale Res. Lett. 12, 0-5. https://doi.org/10.1186/s11671-017-2165-y (2017).
  41. Lin, Z. H. & Wang, C. R. C. Evidence on the size-dependent absorption spectral evolution of selenium nanoparticles. Mater. Chem. Phys. 92 (2-3), 591-594. https://doi.org/10.1016/j.matchemphys.2005.02.023 (2005).
  42. Wahab, A., Abou Elyazeed, A. M. & Abdalla, A. E. Bioactive compounds in some Citrus peels as affected by drying processes and quality evaluation of cakes supplemented with Citrus peels powder. 44.; (2018).
  43. El-ghfar, M. H. A. A., Ibrahim, H. M., Hassan, I. M., Abdel Fattah, A. A. & Mahmoud, M. H. Peels of lemon and orange as valueadded ingredients: Chemical and antioxidant properties. Int. J. Curr. Microbiol. Appl. Sci. 5 (12), 777-794. https://doi.org/10.2054 6/ijcmas.2016.512.089 (2016).
  44. Udvardi, B. et al. Effects of particle size on the attenuated total reflection spectrum of minerals. Appl. Spectrosc. 71 (6), 1157-1168. https://doi.org/10.1177/0003702816670914 (2017).
  45. Alagesan, V. & Venugopal, S. Green synthesis of selenium nanoparticle using leaves extract of Withania somnifera and its biological applications and photocatalytic activities. Bionanoscience. 9 (1), 105-116. https://doi.org/10.1007/s12668-018-0566-8 (2019).
  46. Gulley-Stahl, H. J., Haas, J. A., Schmidt, K. A., Evan, A. P. & Sommer, A. J. Attenuated total internal reflection Fourier transform infrared spectroscopy: A quantitative approach for kidney stone analysis. Appl. Spectrosc. 63 (7), 759-766. https://doi.org/10.1366 /000370209788701044 (2009).
  47. Khater, S., Ali, I., Khater, Ahmed, A. & abd el-megid, S. Preparation and characterization of Chitosan-stabilized selenium nanoparticles for ameliorating experimentally Induced Diabetic Nephropathy in rats. Arab. J. Nucl. Sci. Appl. 0 (0), 1-9. https://do i.org/10.21608/ajnsa.2020.19809.1300 (2020).
  48. Saeed, M. et al. Assessment of antimicrobial features of selenium nanoparticles (SeNPs) using cyclic voltammetric strategy. J. Nanosci. Nanotechnol. 19 (11), 7363-7368. https://doi.org/10.1166/jnn.2019.16627 (2019).
  49. Sribenjarat, P., Jirakanjanakit, N. & Jirasripongpun, K. Selenium nanoparticles biosynthesized by garlic extract as antimicrobial agent. Sci. Eng. Heal Stud. 14 (1), 22-31 (2020).
  50. Javed, R. et al. Role of capping agents in the application of nanoparticles in biomedicine and environmental remediation: Recent trends and future prospects. J. Nanobiotechnol. 18 (1), 1-15. https://doi.org/10.1186/s12951-020-00704-4 (2020).
  51. Collado-González, M., Montalbán, M. G., Peña-García, J., Pérez-Sánchez, H. & Víllora, G. Díaz Baños FG. Chitosan as stabilizing agent for negatively charged nanoparticles. Carbohydr. Polym. 161, 63-70. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2016.12.043 (2017).
  52. Aibani, N., Cuddihy, G. & Wasan, E. K. Chitosan Nanoparticles at the Biological interface: Implications for drug delivery. Published online 2021.
53．Salem，M．F．，Abd－elraoof，W．A．，Tayel，A．A．，Alzuaibr，F．M．＆Abonama，O．M．Antifungal application of biosynthesized selenium nanoparticles with pomegranate peels and nanochitosan as edible coatings for citrus green mold protection．J．Nanobiotechnol． Published Online 2022，1－12．https：／／doi．org／10．1186／s12951－022－01393－x
54．Alghuthaymi，M．A．et al．Green biosynthesized selenium nanoparticles by cinnamon extract and their antimicrobial activity and application as edible coatings with nano－chitosan．J Food Qual． 2021 （2021）．https：／／doi．org／10．1155／2021／6670709
55．Soleimani Asl，S．et al．Chitosan－coated selenium nanoparticles enhance the efficiency of stem cells in the neuroprotection of streptozotocin－induced neurotoxicity in male rats．Int．J．Biochem．Cell．Biol． 141 （September），1－9．https：／／doi．org／10．1016／j．bioce 1．2021．106089（2021）．
56．Kulikouskaya，V．et al．Chitosan－capped silver nanoparticles：A comprehensive study of polymer molecular weight effect on the reaction kinetic，physicochemical properties，and synergetic antibacterial potential．SPE Polym． 3 （2），77－90．https：／／doi．org／10．10 02／pls2．10069（2022）．
57．Rao，L．et al．Chitosan－decorated selenium nanoparticles as protein carriers to improve the in vivo half－life of the peptide therapeutic BAY 55－9837 for type 2 diabetes mellitus．Int．J．Nanomed．9，4819－4828．https：／／doi．org／10．2147／IJN．S67871（2014）．
58．Shao，C．et al．Chitosan－coated selenium nanoparticles attenuate PRRSV replication and ROS／JNK－mediated apoptosis in vitro． Int．J．Nanomed． 17 （July），3043－3054．https：／／doi．org／10．2147／IJN．S370585（2022）．
59．Zhihui，J．et al．One－step reinforcement and deacidification of paper．Coatings． 10 （12267），1－15（2020）．
60．Thamilarasan，V．et al．Single step fabrication of Chitosan nanocrystals using Penaeus semisulcatus：Potential as New insecticides， antimicrobials and Plant Growth promoters．J．Clust Sci． 29 （2），375－384．https：／／doi．org／10．1007／s10876－018－1342－1（2018）．
61．Ayoub MMH．Incorporated nano－chitosan．Polym．Bull． 0123456789 https：／／doi．org／10．1007／s00289－023－04768－8（2023）．
62．Sheikhalipour，M．et al．Chitosan－selenium nanoparticle（Cs－se np）foliar spray alleviates salt stress in bitter melon．Nanomaterials． 11 （3），1－23．https：／／doi．org／10．3390／nano11030684（2021）．
63．Luo，Y．，Zhang，B．，Cheng，W．H．＆Wang，Q．Preparation，characterization and evaluation of selenite－loaded chitosan／TPP nanoparticles with or without zein coating．Carbohydr．Polym． 82 （3），942－951．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2010．06．029 （2010）．
64．Chen，Y．et al．Stability and surface properties of selenium nanoparticles coated with chitosan and sodium carboxymethyl cellulose． Carbohydr．Polym． 278 （17），118859．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2021．118859（2022）．
65．Liu，J．，Tian，S．，Meng，X．＆Xu，Y．Effects of Chitosan on control of postharvest diseases and physiological responses of tomato fruit．Postharvest Biol．Technol． 44 （3），300－306．https：／／doi．org／10．1016／j．postharvbio．2006．12．019（2007）．
66．Ma，Z．，Garrido－Maestu，A．＆Jeong，K．C．Application，mode of action，and in vivo activity of chitosan and its micro－and nanoparticles as antimicrobial agents：A review．Carbohydr．Polym． 176 （July），257－265．https：／／doi．org／10．1016／j．carbpol．2017．08．082（2017）．
67．Wu，Z．et al．Effect of selenium on control of postharvest gray mold of tomato fruit and the possible mechanisms involved．Front． Microbiol． 6 （JAN），1－11．https：／／doi．org／10．3389／fmicb．2015．01441（2016）．
68．Theodoridis，T．＆Kraemer，J．No 主観的健康感を中心とした在宅高齢者における健康関連指標に関する共分散構造分析 Title．
69．Smolińska，U．＆Kowalska，B．Smolińska－Kowalska2018＿Article＿BiologicalControlOfTheSoil－bor．pdf．J．Plant．Pathol．Published Online 2018：1－12 ．
70．Fatin Najwa，R．＆Azrina，A．Comparison of vitamin C content in citrus fruits by titration and high performance liquid chromatography（HPLC）methods．Int．Food Res．J． 24 （2），726－733（2017）．
71．Satgurunathan，T．，Bhavan，P．S．＆Komathi，S．Green synthesis of selenium nanoparticles from sodium selenite using garlic extract and its enrichment on Artemia Nauplii to feed the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii post－larvae．Res．J．Chem． Environ． 21 （10），1－12（2017）．
72．Nunes，R．，Sousa，Â．，Simaite，A．，Aido，A．＆Buzgo，M．Sub－100 nm Chitosan－Triphosphate－DNA nanoparticles for delivery of DNA vaccines †．Published online 2021：1－7．
73．Yao，H．J．＆Tian，S．P．Effects of a biocontrol agent and methyl jasmonate on postharvest diseases of peach fruit and the possible mechanisms involved．J．Appl．Microbiol． 98 （4），941－950．https：／／doi．org／10．1111／j．1365－2672．2004．02531．x（2005）．
74．Farzand，A．et al．Suppression of sclerotinia sclerotiorum by the induction of systemic resistance and regulation of antioxidant pathways in tomato using fengycin produced by Bacillus amyloliquefaciens FZB42．Biomolecules． 9 （10）．https：／／doi．org／10．3390／b iom9100613（2019）．
75．Finney，D．J．Probit analysis：a statistical treatment of the sigmoid response curve．（1952）．

Acknowledgements

We want to thank Dr Ahmed Ebrahim，Dr Ahmed M．El－Khawaga，and Dr Khaled Elsayed Mostafa（Galala University，Galala City，Suez，Egypt）for their help in the characterization techniques used in this study．

Author contributions

Mohamed M．Desouky was instrumental in executing the practical aspects of the project，analyzing the data， and drafting the initial manuscript．Radwa H．Abou－Saleh provided supervision throughout the project and was responsible for revising the final draft of the manuscript．Tarek A．A．Moussa contributed to the experimental design，assisted in the practical work，and participated in data analysis and revising the final draft of the manu－ script．Heba M．Fahmy was involved in the conception of the work，assisted in the practical work，contributed to data analysis and discussion，and revised the final draft of the manuscript．

Funding

Open access funding provided by The Science，Technology ＆Innovation Funding Authority（STDF）in cooper－ ation with The Egyptian Knowledge Bank（EKB）．

Declarations

Competing interests

The authors declare no competing interests．

Additional information

Correspondence and requests for materials should be addressed to R．H．A．－S．or T．A．A．M．
Reprints and permissions information is available at www．nature．com／reprints．
Publisher’s note Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024
  1. Biophysics Department, Faculty of Science, Cairo University, Giza, Egypt. Nanoscience and Technology Program, Faculty of Science, Galala University, Galala City, New Galala City 43511, Suez, Egypt. Biophysics Group, Physics Department, Faculty of Science, Mansoura University, Mansoura, Egypt. Botany and Microbiology Department, Faculty of Science, Cairo University, Giza, Egypt. email: R.H.Saleh@gu.edu.eg; tmoussa@sci.cu.edu.eg