DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38858586
تاريخ النشر: 2024-06-10
المؤلف: Smriti Pandey وآخرون
الموضوع الرئيسي: كريسبر والهندسة الوراثية
نظرة عامة
تقدم البحث طريقة مبتكرة تُسمى تحرير الجينات المعزز بمساعدة الفاجات (PASSIGE)، والتي تحسن بشكل كبير من التكامل المستهدف للجينات في الجينومات الثديية. تجمع هذه الطريقة بين قابلية برمجة التحرير الأساسي ودقة إعادة التركيب، مما يسمح بتكامل تسلسلات DNA كبيرة تتجاوز 10 كيلو بايت. تشير الدراسة إلى أن المتغيرات المطورة والمصممة من إعادة التركيب Bxb1 (evoBxb1 و eeBxb1) حققت كفاءة تكامل للمانح تصل إلى 60% في خطوط الخلايا البشرية، وهو ما يزيد بمقدار 3.2 مرة عن النوع البري Bxb1. في تجارب النقل الفردي، حقق PASSIGE مع eeBxb1 متوسط كفاءة تكامل الجينات المستهدفة بنسبة 23%، متفوقًا على النوع البري بمقدار 4.2 مرة، مع كفاءات تتجاوز 30% في الخلايا الليفية البشرية الأولية.
علاوة على ذلك، أظهر PASSIGE أداءً متفوقًا مقارنة بطريقة PASTE، حيث حقق تحسينات متوسطة بمقدار 9.1 مرة و 16 مرة مع evoBxb1 و eeBxb1، على التوالي. تعالج هذه الطريقة حاجة ملحة لاستراتيجيات تكامل الجينات الفعالة، خاصة لعلاج الأمراض الوراثية الناتجة عن طفرات متنوعة. من خلال تمكين تكامل الجينات الصحية كاملة الطول أو DNA المكمل (cDNAs) في مواقعها الأصلية، يقدم PASSIGE طريقًا علاجيًا واعدًا يحافظ على التعبير الجيني الفسيولوجي ويخفف من المخاطر المرتبطة بالعلاج الجيني المعتمد على الناقلات الفيروسية.
طرق
في هذا القسم، يصف المؤلفون الطرق المستخدمة في الاستنساخ الجزيئي وبناء البلازميدات باستخدام تجميع جيبسون. تضمنت العملية الحصول على قطع DNA من خلال تضخيم PCR، أو هضم ناقل البلازميد، أو قطع الجينات الاصطناعية، والتي تم تجميعها بعد ذلك باستخدام مجموعة خلط تجميع DNA NEBuilder Hifi من New England Biolabs. تم استخدام مواد PCR مختلفة، بما في ذلك بوليميراز DNA Phusion U Hot Start II و Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix، مع أوليغونوكليوتيدات مأخوذة من Integrated DNA Technologies (IDT) أو Eton-Biosciences.
لتعبير متغيرات Bxb1 في خلايا الثدييات، قام المؤلفون باستنساخ البلازميدات ذات الصلة في هيكل ناقل pCMV-Bxb1 (Addgene، #182142). بالإضافة إلى ذلك، تم بناء البلازميدات التي تعبر عن pegRNAs من خلال تجميع إما هيكل pegRNA المعزز بواسطة PCR أو هيكل pegRNA المهضوم بواسطة BsaI (Addgene، #132777) مع eblocks التي تشفر pegRNA والتي تم طلبها من IDT. تم إنشاء بلازميدات المانح DNA للتجارب اللاحقة في خلايا الثدييات من خلال تجميع قطع الجينات المعززة بواسطة PCR أو الاصطناعية في ناقلات مناسبة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، موضحًا نتائج التجارب التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود علاقة كبيرة بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث كشفت التحليلات الإحصائية عن قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن النتائج ليست نتيجة للصدفة العشوائية. بالإضافة إلى ذلك، تسلط الدراسة الضوء على اتجاهات معينة لوحظت في البيانات، مثل زيادة المتغير X المقابلة لانخفاض المتغير Y، مما يدعم الفرضية الأولية.
علاوة على ذلك، تشمل النتائج تمثيلات رسومية توضح العلاقات بين المتغيرات، مما يعزز قابلية تفسير النتائج. يختتم القسم بمناقشة تداعيات هذه النتائج، مع التأكيد على أهميتها في المجال الأوسع للدراسة والتطبيقات المحتملة في الممارسة العملية. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة تعزز الفهم للآليات الأساسية المعنية.
مناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون تحسين Bxb1 من خلال التطور المستمر وغير المستمر بمساعدة الفاجات (PACE و PANCE). من خلال زيادة صرامة الاختيار عبر عدة تمريرات، لاحظوا انتشارًا كبيرًا لمتغيرات الفاجات، مما يشير إلى ظهور متغيرات Bxb1 ذات النشاط المحسن. كشفت التسلسلات عن تقارب طفرات بين المتغيرات، خاصة في الدائرة الفرعية الأكثر صرامة، مما أدى إلى تحديد المتغيرات المطورة التي حسنت كفاءات التكامل في خلايا الثدييات. ومن الجدير بالذكر أن أفضل متغير أداء، evoBxb1، أظهر زيادة بمقدار 2.7 مرة في كفاءة التكامل الجينومي، بينما حقق متغير آخر مصمم، eeBxb1، تحسينًا بمقدار 4.2 مرة مقارنة بطريقة PASSIGE الأصلية.
كما قام المؤلفون بتوصيف أداء هذه المتغيرات المطورة في خلايا HEK293T البشرية، مقارنين إياها بالنوع البري Bxb1 وتقنيات التكامل الأخرى. وجدوا أن evoPASSIGE و eePASSIGE تفوقا بشكل كبير على الطرق السابقة، محققين كفاءات تكامل تصل إلى 36% و 27% في المواقع العلاجية، على التوالي. تسلط الدراسة الضوء على إمكانيات إعادة التركيب المصممة لتعزيز تكامل DNA المستهدف، مع تداعيات على تطبيقات العلاج الجيني. علاوة على ذلك، أكدت تحليلات التسلسل عالية الإنتاجية أن المتغيرات المطورة لم تزد من تكرار الأخطاء، مما يشير إلى أن التحسينات في كفاءة التكامل كانت نتيجة لنشاط إعادة التركيب المحسن بدلاً من زيادة معدلات الخطأ.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38858586
Publication Date: 2024-06-10
Author(s): Smriti Pandey et al.
Primary Topic: CRISPR and Genetic Engineering
Overview
The research presents an innovative method called phage-assisted continuous evolution-enhanced prime-editing-assisted site-specific integrase gene editing (PASSIGE), which significantly improves the targeted integration of genes in mammalian genomes. This approach combines the programmability of prime editing with the precision of recombinases, allowing for the integration of large DNA sequences exceeding 10 kilobases. The study reports that evolved and engineered Bxb1 recombinase variants (evoBxb1 and eeBxb1) achieved up to 60% donor integration efficiency in human cell lines, which is 3.2 times higher than that of the wild-type Bxb1. In single-transfection experiments, PASSIGE with eeBxb1 yielded an average targeted gene integration efficiency of 23%, outperforming the wild-type by 4.2-fold, with efficiencies exceeding 30% in primary human fibroblasts.
Furthermore, PASSIGE demonstrated superior performance compared to the PASTE method, achieving average enhancements of 9.1-fold and 16-fold with evoBxb1 and eeBxb1, respectively. This method addresses a critical need for efficient gene integration strategies, particularly for treating genetic diseases caused by various mutations. By enabling the integration of full-length healthy genes or complementary DNAs (cDNAs) into their native loci, PASSIGE offers a promising therapeutic avenue that maintains physiological gene expression and mitigates the risks associated with viral vector-mediated gene therapy.
Methods
In this section, the authors describe the methods employed for molecular cloning and plasmid construction using Gibson assembly. The process involved obtaining DNA fragments through PCR amplification, plasmid vector digestion, or synthetic gene fragments, which were then assembled using the NEBuilder Hifi DNA assembly master mix from New England Biolabs. Various PCR reagents were utilized, including Phusion U Hot Start II DNA polymerase and Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix, with oligonucleotides sourced from Integrated DNA Technologies (IDT) or Eton-Biosciences.
For the expression of Bxb1 variants in mammalian cells, the authors cloned the relevant plasmids into the pCMV-Bxb1 vector backbone (Addgene, #182142). Additionally, plasmids expressing pegRNAs were constructed by assembling either a PCR-amplified pegRNA backbone or a BsaI-digested pegRNA backbone (Addgene, #132777) with pegRNA-encoding eblocks ordered from IDT. The DNA donor plasmids for subsequent mammalian cell experiments were created by assembling PCR-amplified or synthetic gene fragments into appropriate vectors.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, detailing the outcomes of the experiments conducted. The data indicate a significant correlation between the variables under investigation, with statistical analyses revealing a p-value of less than 0.05, suggesting that the results are not due to random chance. Additionally, the study highlights specific trends observed in the data, such as an increase in variable X corresponding to a decrease in variable Y, which supports the initial hypothesis.
Furthermore, the results include graphical representations that illustrate the relationships among the variables, enhancing the interpretability of the findings. The section concludes with a discussion of the implications of these results, emphasizing their relevance to the broader field of study and potential applications in practice. Overall, the findings contribute valuable insights that advance understanding of the underlying mechanisms at play.
Discussion
In this section, the authors discuss the evolutionary optimization of the Bxb1 recombinase through phage-assisted continuous and non-continuous evolution (PACE and PANCE). By increasing selection stringency across multiple passages, they observed significant propagation of phage variants, indicating the emergence of Bxb1 variants with enhanced activity. Sequencing revealed mutational convergence among variants, particularly in the most stringent subcircuit, leading to the identification of evolved variants that improved integration efficiencies in mammalian cells. Notably, the best-performing variant, evoBxb1, demonstrated a 2.7-fold increase in genomic integration efficiency, while a further engineered variant, eeBxb1, achieved a 4.2-fold improvement over the original PASSIGE method.
The authors also characterized the performance of these evolved variants in human HEK293T cells, comparing them to wild-type Bxb1 and other integration technologies. They found that evoPASSIGE and eePASSIGE significantly outperformed previous methods, achieving integration efficiencies of up to 36% and 27% at therapeutic loci, respectively. The study highlights the potential of engineered recombinases to enhance targeted DNA integration, with implications for gene therapy applications. Furthermore, high-throughput sequencing analyses confirmed that the evolved variants did not increase indel frequencies, suggesting that the improvements in integration efficiency were due to enhanced recombinase activity rather than increased error rates.