DOI: https://doi.org/10.1038/s44318-024-00044-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38337057
تاريخ النشر: 2024-02-09
المؤلف: Esmee Vringer وآخرون
الموضوع الرئيسي: إنترفيرون واستجابات المناعة
نظرة عامة
تناقش هذه الفقرة دور نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (MOMP) في الموت الخلوي المبرمج (الأبوتوز) ووظيفته الناشئة في الاستجابات الالتهابية، خصوصًا في سياق المناعة المضادة للأورام. يسهل MOMP إطلاق السيتوكروم ج، وهو أمر حاسم لتفعيل الكاسبيز والموت الخلوي اللاحق. ومع ذلك، لا تزال الآليات التي من خلالها يحفز MOMP الالتهاب وكيفية تنظيمه غير مفهومة بشكل كافٍ.
تشير نتائج البحث إلى أن MOMP يؤدي إلى يوبيلتيلايشن عشوائي للعديد من البروتينات المرتبطة بكل من الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. هذه اليوبيليتيلايشن ضرورية لتجنيد جزيء التكيف NEMO، الذي ينشط مسار الإشارة الالتهابي NF-κB. تظهر الدراسة أيضًا أن طرقًا مختلفة لتعطيل سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا تشارك آلية إشارة التهابية مماثلة. وبالتالي، يظهر أن سلامة الميتوكوندريا تلعب دورًا محوريًا في تنظيم الالتهاب، حيث تبدأ الميتوكوندريا المنفذة إشارة NF-κB.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث دور نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (MOMP) في الموت الخلوي المبرمج (الأبوتوز) وآثاره على الالتهاب والاستجابات المناعية. يتم تحديد MOMP كحدث حاسم يمكن أن يؤدي إلى موت خلوي يعتمد على الكاسبيز وغير معتمد على الكاسبيز (CICD)، حيث يحدث الأخير بسبب خلل شديد في الميتوكوندريا. تشير النتائج الحديثة إلى أن MOMP هو بطبيعته مؤيد للالتهاب، حيث يسهل إطلاق الحمض النووي الميتوكوندري (mtDNA) الذي ينشط إشارة cGAS-STING، مما يؤدي إلى استجابة إنترفيرون من النوع الأول. بينما لا تكون نشاط الكاسبيز ضرورية للموت الخلوي، إلا أنها تلعب دورًا حاسمًا في تخفيف الالتهاب أثناء الموت الخلوي الميتوكوندري من خلال تقطيع البروتينات المؤيدة للالتهاب وتعزيز إزالة الخلايا الميتة.
يبرز المؤلفون عملهم السابق الذي يظهر أن MOMP يمكن أن يحدث في مجموعة فرعية من الميتوكوندريا – تُسمى MOMP الأقلية – دون أن يؤدي إلى الموت الخلوي، ويمكن أن يؤدي هذا العملية إلى تلف الحمض النووي والالتهاب. يقترحون أن الالتهاب الناتج عن MOMP قد يكون هدفًا علاجيًا في السرطان. تهدف الورقة إلى توضيح الآليات التي من خلالها يحفز MOMP الالتهاب وكيفية تنظيم هذه العملية. تشير النتائج الأولية إلى أن MOMP يؤدي إلى يوبيلتيلايشن واسع النطاق للميتوكوندريا، والتي عادة ما ترتبط بالميتوفاجي. ومع ذلك، يكشف المؤلفون أن الأوتوفاجي ليست ضرورية لتدهور الميتوكوندريا بعد MOMP. بدلاً من ذلك، يكتشفون أن يوبيلتيلايشن الميتوكوندريا يعمل كإشارة التهابية، يجند NEMO ويبدأ استجابة التهابية NF-κB، وبالتالي يربط سلامة الميتوكوندريا بالالتهاب.
طرق البحث
في هذه الدراسة، تم زراعة خطوط خلوية متنوعة، بما في ذلك HEK293FT وSVEC4-10 وMEFs وU2OS، في DMEM عالي الجلوكوز معزز بـ 10% من مصل جنين العجل (FBS) و2 مللي مول من الجلوتامين و1 مللي مول من صوديوم البيروفات، تحت ظروف قياسية من 21% O₂ و5% CO₂ عند 37 درجة مئوية. تم تصنيف خطوط الخلايا MEF Tnf -/-Hoip +/+ وMEF Tnf -/-Hoip -/- مسبقًا (Peltzer et al., 2014)، بينما تم الحصول على خلايا SVEC4-10 من ATCC. خضعت جميع خطوط الخلايا لاختبارات روتينية للكشف عن الميكوبلازما لضمان سلامة الثقافة.
تم استخدام مجموعة من المواد الكيميائية خلال التجارب، بما في ذلك ABT-737 وS63845 وQ-VD-OPh ودوكسيسيكلين هيكل، وإيراستين وTAK-243 وMLN4924 وMG-132 ورابتينال وMitoTracker Green FM وPKmito DeepRed وأوليغوميسين وأنتيميسين A وروتينون وسيكلوسبورين A، تم الحصول عليها من موردين مختلفين مثل APEXBIO وChemgood وAdooQ Bioscience وSigma-Aldrich وBiotechne وMedChemExpress وSelleck Chemical وMillipore Sigma. كانت هذه المواد ضرورية للبروتوكولات التجريبية المستخدمة في الدراسة.
النتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة أن الميتوكوندريا المنفذة تخضع لليوبيلتيلايشن ويمكن تدهورها بشكل مستقل عن الأوتوفاجي التقليدي بعد نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (MOMP). باستخدام خلايا U2OS المعالجة بمقلدات BH3، أكد الباحثون أن MOMP يحفز الموت الخلوي الميتوكوندري، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في محتوى الميتوكوندريا، كما يتضح من انخفاض مستويات الحمض النووي والبروتينات الميتوكوندري في طريقة تعتمد على BAX/BAK. من الجدير بالذكر أن يوبيلتيلايشن الميتوكوندريا زاد بشكل كبير بعد MOMP، مما يشير إلى إشارة محتملة لتدهورها، والتي تم ملاحظتها من خلال تحليل Western blot لعينات غنية بالميتوكوندريا.
كشفت التحقيقات الإضافية أن هذه اليوبيليتيلايشن والتدهور اللاحق للميتوكوندريا حدثت بغض النظر عن الأوتوفاجي، حيث أظهرت خلايا U2OS التي تفتقر إلى بروتينات الأوتوفاجي الأساسية (ATG5 وATG7) انخفاضًا في محتوى الميتوكوندريا بعد المعالجة. بالإضافة إلى ذلك، وجدت الدراسة أن البروتينات الميتوكوندريا تم تدهورها بطريقة تعتمد على اليوبتين والبروتيازوم، حيث أدى تثبيط إما عملية اليوبيلتيلايشن أو وظيفة البروتيازوم إلى إنقاذ مستويات البروتينات الميتوكوندريا. تشير هذه النتائج إلى مسار جديد لإزالة الميتوكوندريا بعد MOMP يعمل بشكل مستقل عن الآليات الأوتوفاجية التقليدية.
المناقشة
في هذه الدراسة، يستكشف المؤلفون يوبيلتيلايشن البروتينات الميتوكوندريا بعد نفاذية الغشاء الخارجي للميتوكوندريا (MOMP)، وهو حدث حاسم في الموت الخلوي المبرمج. باستخدام بروتيوميات بقايا الدي-جليسين، حددوا زيادة كبيرة في اليوبيلتيلوم لخلايا SVEC4-10 التي تخضع لموت خلوي داخلي (CICD)، مع حوالي 80% من البروتينات الموبيلتيلايشن التي تم تحديدها في الميتوكوندريا. من الجدير بالذكر أن سلاسل اليوبتين المرتبطة بـ K63 وM1 كانت غنية على الميتوكوندريا بعد MOMP، حيث كانت اليوبتين المرتبطة بـ K63 ضرورية لتجنيد بروتين التكيف NF-κB NEMO، الذي ينشط لاحقًا إشارة NF-κB. وقد أظهر هذا التجنيد أنه مستقل عن الليغازات E3 الميتوكوندرية التقليدية مثل باركين وPINK1، مما يشير إلى مسار جديد لليوبيلتيلايشن الميتوكوندريا الذي يربط مباشرة سلامة الميتوكوندريا بالإشارة الالتهابية.
تسلط النتائج الضوء على أن فقدان سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا يكفي لتحفيز يوبيلتيلايشن الميتوكوندريا وتجنيد NEMO، مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB. يبدو أن هذه العملية متميزة عن آليات الميتوفاجي التقليدية، حيث يمكن أن يحدث تدهور الميتوكوندريا بشكل مستقل عن الأوتوفاجي. يقترح المؤلفون أن تعرض مكونات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى السيتوسول قد يعمل كنمط جزيئي مرتبط بالتلف، مما يؤدي إلى استجابة مؤيدة للالتهاب مشابهة لتلك التي لوحظت خلال العدوى البكتيرية. بشكل عام، توضح هذه الأبحاث ارتباطًا حاسمًا بين خلل الميتوكوندريا والالتهاب، مع آثار محتملة لاستراتيجيات علاجية تستهدف الأمراض الالتهابية والسرطان.
DOI: https://doi.org/10.1038/s44318-024-00044-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38337057
Publication Date: 2024-02-09
Author(s): Esmee Vringer et al.
Primary Topic: interferon and immune responses
Overview
The section discusses the role of mitochondrial outer membrane permeabilisation (MOMP) in apoptosis and its emerging function in pro-inflammatory responses, particularly in the context of anti-tumour immunity. MOMP facilitates the release of cytochrome c, which is crucial for caspase activation and subsequent cell death. However, the mechanisms by which MOMP induces inflammation and is regulated remain inadequately understood.
The research findings indicate that MOMP leads to the promiscuous ubiquitylation of numerous proteins associated with both inner and outer mitochondrial membranes. This ubiquitylation is critical for the recruitment of the adaptor molecule NEMO, which activates the pro-inflammatory NF-κB signalling pathway. The study further demonstrates that various methods of disrupting mitochondrial outer membrane integrity engage a similar pro-inflammatory signalling mechanism. Consequently, the integrity of mitochondria is shown to play a pivotal role in regulating inflammation, with permeabilised mitochondria initiating NF-κB signalling.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the role of mitochondrial outer membrane permeabilisation (MOMP) in apoptosis and its implications for inflammation and immune responses. MOMP is identified as a critical event that can lead to both caspase-dependent and caspase-independent cell death (CICD), with the latter occurring due to severe mitochondrial dysfunction. Recent findings indicate that MOMP is inherently pro-inflammatory, as it facilitates the release of mitochondrial DNA (mtDNA) that activates cGAS-STING signaling, triggering a type I interferon response. While caspase activity is not necessary for cell death, it plays a crucial role in mitigating inflammation during mitochondrial apoptosis by cleaving pro-inflammatory proteins and promoting the clearance of dying cells.
The authors highlight their previous work demonstrating that MOMP can occur in a subset of mitochondria—termed minority MOMP—without leading to cell death, and this process can induce DNA damage and inflammation. They propose that MOMP-induced inflammation may serve as a therapeutic target in cancer. The paper aims to elucidate the mechanisms by which MOMP triggers inflammation and how this process is regulated. Initial findings indicate that MOMP leads to extensive ubiquitylation of mitochondria, which is typically associated with mitophagy. However, the authors reveal that autophagy is not essential for mitochondrial degradation post-MOMP. Instead, they discover that the ubiquitylation of mitochondria acts as an inflammatory signal, recruiting the NF-κB essential modulator (NEMO) and initiating an NF-κB inflammatory response, thereby linking mitochondrial integrity to inflammation.
Methods
In this study, various cell lines, including HEK293FT, SVEC4-10, MEFs, and U2OS, were cultured in high glucose DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM glutamine, and 1 mM sodium pyruvate, under standard conditions of 21% O₂ and 5% CO₂ at 37 °C. The MEF Tnf -/-Hoip +/+ and MEF Tnf -/-Hoip -/- cell lines were previously characterized (Peltzer et al., 2014), while SVEC4-10 cells were sourced from ATCC. All cell lines underwent routine mycoplasma testing to ensure culture integrity.
A range of chemicals was utilized throughout the experiments, including ABT-737, S63845, Q-VD-OPh, doxycycline hyclate, erastin, TAK-243, MLN4924, MG-132, raptinal, MitoTracker Green FM, PKmito DeepRed, oligomycin, antimycin A, rotenone, and cyclosporin A, sourced from various suppliers such as APEXBIO, Chemgood, AdooQ Bioscience, Sigma-Aldrich, Biotechne, MedChemExpress, Selleck Chemical, and Millipore Sigma. These reagents were critical for the experimental protocols employed in the study.
Results
The results of this study demonstrate that permeabilised mitochondria undergo ubiquitylation and can be degraded independently of canonical autophagy following mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP). Using U2OS cells treated with BH3-mimetics, the researchers confirmed that MOMP triggers mitochondrial apoptosis, leading to a significant reduction in mitochondrial content, as evidenced by decreased mitochondrial DNA and protein levels in a BAX/BAK-dependent manner. Notably, mitochondrial ubiquitylation increased significantly after MOMP, indicating a potential signal for their degradation, which was observed through western blot analysis of mitochondrial-enriched fractions.
Further investigations revealed that this ubiquitylation and subsequent mitochondrial degradation occurred regardless of autophagy, as U2OS cells deficient in essential autophagy proteins (ATG5 and ATG7) still exhibited reduced mitochondrial content following treatment. Additionally, the study found that mitochondrial proteins were degraded in a ubiquitin-proteasome-dependent manner, as inhibiting either the ubiquitylation process or proteasomal function resulted in the rescue of mitochondrial protein levels. These findings suggest a novel pathway for mitochondrial removal post-MOMP that operates independently of traditional autophagic mechanisms.
Discussion
In this study, the authors investigate the ubiquitylation of mitochondrial proteins following mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP), a critical event in apoptosis. Using di-glycine remnant proteomics, they identified a significant increase in the ubiquitylome of SVEC4-10 cells undergoing cell-intrinsic cell death (CICD), with approximately 80% of the ubiquitylated proteins being localized to mitochondria. Notably, both K63- and M1-linked ubiquitin chains were enriched on mitochondria post-MOMP, with K63-linked ubiquitin being crucial for the recruitment of the NF-κB adaptor protein NEMO, which subsequently activates NF-κB signaling. This recruitment was shown to be independent of canonical mitochondrial E3 ligases such as Parkin and PINK1, suggesting a novel pathway for mitochondrial ubiquitylation that directly links mitochondrial integrity to inflammatory signaling.
The findings highlight that loss of mitochondrial outer membrane integrity is sufficient to trigger mitochondrial ubiquitylation and NEMO recruitment, leading to NF-κB activation. This process appears to be distinct from traditional mitophagy mechanisms, as mitochondrial degradation can occur independently of autophagy. The authors propose that the exposure of inner mitochondrial membrane components to the cytosol may serve as a damage-associated molecular pattern, initiating a pro-inflammatory response akin to that observed during bacterial infections. Overall, this research elucidates a critical connection between mitochondrial dysfunction and inflammation, with potential implications for therapeutic strategies targeting inflammatory diseases and cancer.