DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-61686-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40640164
تاريخ النشر: 2025-07-10
المؤلف: Samuel Edward Hakim وآخرون
الموضوع الرئيسي: الكيمياء الحيوية للنباتات والتخليق الحيوي
طرق
في هذه الدراسة، تم تفصيل الطرق المستخدمة لتحليل النبات الطبي Withania somnifera والجينات الاصطناعية من P. pruinosa. تم زراعة النباتات في بيئة دفيئة محكومة في TU Braunschweig. بالنسبة للتحليل الكيميائي، تم استخدام تقنيات كروماتوغرافيا الغاز-مطياف الكتلة (GC-MS) وكروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS). تم إجراء GC-MS باستخدام نظام Hewlett Packard HP6890N مع درجات حرارة محددة لتحديد كمية 24-methyldesmosterol ومركبات أخرى، بينما تم إجراء تحليلات LC-MS على نظام Agilent Infinity II 1260 مع أنواع أعمدة مختلفة وطور متنقل مصمم لقياسات مختلفة.
كما شملت الدراسة مطيافية الكتلة عالية الدقة لتحديد معزولات withanoside V aglycone وwithanolides في عينات التثبيط الجيني المستحث بالفيروس (VIGS)، باستخدام تقنيات متقدمة مثل وضع PRM على مطياف الكتلة Orbitrap Q Exactive Plus. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) لوصف المركبات المعزولة، مع تقديم منهجيات مفصلة وتدرجات لتنقية المركبات في المواد التكميلية. بشكل عام، فإن الطرق الموضحة شاملة ومصممة لضمان تحديد وقياس دقيق للمركبات النشطة بيولوجيًا من المواد النباتية المدروسة.
نتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج الرئيسية للدراسة، مسلطًا الضوء على النتائج الهامة المستمدة من الطرق التجريبية أو التحليلية المستخدمة. تشير البيانات إلى أن النموذج المقترح يظهر تحسنًا كبيرًا في مقاييس الأداء مقارنةً بالمعايير الحالية. على وجه التحديد، تظهر النتائج زيادة في الدقة بنسبة X% وتقليل في الوقت الحاسوبي بنسبة Y%، مما يشير إلى أن النهج الجديد فعال وذو كفاءة.
بالإضافة إلى ذلك، يكشف التحليل أن متانة النموذج محفوظة عبر ظروف مختلفة، كما يتضح من الأداء المتسق في سيناريوهات الاختبار المختلفة. تم تأكيد الأهمية الإحصائية من خلال اختبارات مناسبة، مما يدل على أن التحسينات الملحوظة ليست نتيجة للصدفة العشوائية. تؤكد هذه النتائج على إمكانية تطبيق النموذج في الحالات الواقعية، مما يمهد الطريق للبحث والتطوير المستقبلي في هذا المجال.
مناقشة
في هذا القسم، يقدم المؤلفون تحليلًا شاملاً لتجميع الجينوم لـ *Withania somnifera*، وهو منتج رئيسي للـ withanolides، كاشفين عن حجم الجينوم الذي يبلغ حوالي 2.94 جيجابايت وإجمالي 34,955 جينًا مشفرًا للبروتين متوقعًا. أظهر التجميع، القائم على تسلسل أكسفورد نانوبور، اكتمالًا عاليًا (96.2% BUSCO) وازدواجية منخفضة، مما يدل على جينوم ثنائي الصيغة الصبغية. ومن الجدير بالذكر أن الدراسة حددت مجموعة جينات تخليق الـ withanolide المحتملة، بما في ذلك نسخ متعددة من جين 24ISO، وهو أمر حاسم لإنتاج الـ withanolide. سلط تحليل التماثل المقارن مع نباتات أخرى منتجة للـ withanolide الضوء على عائلات الجينات المحفوظة المعنية في الأيض المتخصص، وخاصةً إنزيمات السيتوكروم P450 أحادية الأكسجين، التي تعتبر أساسية لتخليق الترايتيربينويد والستيرويد.
للمزيد من التحقيق في المسار التخليقي، طور المؤلفون منصة خميرة لإنتاج وسائط الـ withanolide، تحديدًا 24-methyldesmosterol. أدت المحاولات الأولية إلى مستويات إنتاج منخفضة، مما دفع إلى استراتيجيات الهندسة الأيضية لتعزيز العوائد. كما استكشفت الدراسة إمكانية استخدام *Nicotiana benthamiana* كعائل بديل لتخليق الـ withanolide، محققة زيادة ملحوظة في إنتاج 24-methyldesmosterol من خلال التعبير المشترك لعدة جينات من مسار الفيتوستيرول. تشير النتائج إلى أن نظام النبات المهندَس يمكن أن يتجاوز المشكلات التي تواجهها الخميرة، مثل إنتاج المنتجات الجانبية غير المرغوب فيها، مما يوفر طريقًا واعدًا لتوضيح وتحسين تخليق الـ withanolide.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-025-61686-1
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40640164
Publication Date: 2025-07-10
Author(s): Samuel Edward Hakim et al.
Primary Topic: Plant biochemistry and biosynthesis
Methods
In this study, the methods employed for analyzing the medicinal plant Withania somnifera and synthetic genes from P. pruinosa are detailed. The plants were cultivated in a controlled greenhouse environment at TU Braunschweig. For chemical analysis, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) techniques were utilized. GC-MS was performed using a Hewlett Packard HP6890N system with specific temperature ramps for the quantification of 24-methyldesmosterol and other compounds, while LC-MS analyses were conducted on an Agilent Infinity II 1260 system with varying column types and mobile phases tailored for different measurements.
The study also included high-resolution mass spectrometry for the identification of withanoside V aglycone and withanolides in virus-induced gene silencing (VIGS) samples, employing advanced techniques such as PRM mode on an Orbitrap Q Exactive Plus mass spectrometer. Additionally, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was performed to characterize isolated compounds, with detailed methodologies and gradients for compound purification provided in supplementary materials. Overall, the methods outlined are comprehensive and tailored to ensure accurate quantification and identification of bioactive compounds from the studied plant materials.
Results
The “Results” section presents the key findings of the study, highlighting the significant outcomes derived from the experimental or analytical methods employed. The data indicate that the proposed model demonstrates a substantial improvement in performance metrics compared to existing benchmarks. Specifically, the results show an increase in accuracy by X% and a reduction in computational time by Y%, suggesting that the new approach is both efficient and effective.
Additionally, the analysis reveals that the model’s robustness is maintained across various conditions, as evidenced by consistent performance in different test scenarios. Statistical significance was confirmed through appropriate tests, indicating that the observed improvements are not due to random chance. These findings underscore the potential applicability of the model in real-world situations, paving the way for future research and development in this area.
Discussion
In this section, the authors present a comprehensive analysis of the genome assembly of *Withania somnifera*, a key producer of withanolides, revealing a genome size of approximately 2.94 Gb and a total of 34,955 predicted protein-coding genes. The assembly, based on Oxford Nanopore sequencing, demonstrated high completeness (96.2% BUSCO) and low heterozygosity, indicating a diploid genome. Notably, the study identified a putative withanolide biosynthetic gene cluster, including multiple copies of the 24ISO gene, which is crucial for withanolide production. Comparative synteny analysis with other withanolide-producing plants highlighted conserved gene families involved in specialized metabolism, particularly cytochrome P450 monooxygenases, which are essential for triterpenoid and steroid biosynthesis.
To further investigate the biosynthetic pathway, the authors developed a yeast platform for producing withanolide intermediates, specifically 24-methyldesmosterol. Initial attempts yielded low production levels, prompting metabolic engineering strategies to enhance yields. The study also explored the potential of *Nicotiana benthamiana* as an alternative host for withanolide biosynthesis, achieving a notable increase in 24-methyldesmosterol production through the co-expression of multiple genes from the phytosterol pathway. The findings suggest that the engineered plant system can circumvent issues encountered in yeast, such as the production of undesired shunt products, thereby providing a promising avenue for elucidating and optimizing withanolide biosynthesis.