DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-025-07884-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40108346
تاريخ النشر: 2025-03-19
المؤلف: Zhenyun Du وآخرون
الموضوع الرئيسي: العناصر النزرة في الصحة
طرق
في هذه الدراسة، استخدم الباحثون سلالة E. coli BW25113 من مجموعة Keio لجميع التجارب، بما في ذلك إنشاء سلالة ΔAZY المعطلة، التي تفتقر إلى كامل operon yobA-yebZ-yebY. تم تحقيق الحذف باستخدام الطريقة الموضحة من قبل Datsenko وآخرين، وتم تأكيد غياب الطفرات غير المستهدفة من خلال PCR وتسلسل الجينوم الكامل. بالإضافة إلى ذلك، تم بناء البلازميدات p copA-Lux و p marX-Lux من خلال تضخيم مناطق جينومية محددة من E. coli MG1655 وإدخالها في بلازميد p PL2lux upstream من operon luxCDABE باستخدام الاستنساخ بدون قيود.
لإجراء اختبارات النمو، تم الحفاظ على ثقافات E. coli في وسط M9 الحد الأدنى المضاف إليه الجليسرول والتربتون. تم تحويل الخلايا إما ببلازميد Lux بدون محفز أو بالبلازميدات التي تم بناؤها، وتم مراقبة النمو في لوحة 96 بئر عند 37 درجة مئوية باستخدام قارئ لوحات آلي. تم قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) والضوء المنبعث بشكل مستمر. شملت التجارب تكرارات بيولوجية ثلاثية مع ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات تقنية، وتم إجراء اختبارات إضافية لتقييم النمو تحت ظروف ضغط مختلفة، مثل التعرض للإيثانول، وكبريتات الصوديوم الدودسيل، أو كوليك الصوديوم، مع أخذ القياسات على مدى 12 ساعة.
نتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة أن operon AZY في *E. coli* يلعب دورًا حاسمًا في تعديل مستويات النحاس وتنشيط مسار mar، المرتبط بمقاومة المضادات الحيوية. باستخدام نهج جين التقرير مع operon lux المدمج مع محفز copA، لاحظ الباحثون أن *E. coli* من النوع البري (WT) المحول مع بلازميد p copA-Lux أظهر زيادة كبيرة في الضوء المنبعث عند إضافة كبريتات النحاس (CuSO₄)، مما يدل على تدفق النحاس. في المقابل، أظهرت الخلايا التي تفتقر إلى operon AZY (ΔAZY) استجابة ضوئية أقل بمعدل 3-4 مرات، مما يشير إلى أن بروتينات AZY ضرورية لاستيراد النحاس بشكل فعال. كشفت التجارب الإضافية أن التعبير المفرط عن البروتين عبر الغشاء YebZ أدى إلى زيادة كبيرة في مستويات النحاس داخل الخلايا، بينما عزز التعبير المشترك مع YobA امتصاص النحاس، مما يدل على دور تعاوني في نقل النحاس.
بالإضافة إلى ذلك، وجدت الدراسة أن بروتينات AZY ضرورية لتنشيط operon mar، حيث أظهرت سلالات ΔAZY انخفاضًا بنسبة 80-90% في الضوء المنبعث استجابةً لحمض الساليسيليك، وهو محفز معروف لمسار mar. وقد ارتبط هذا الانخفاض في التنشيط بزيادة القابلية للمضادات الحيوية المرتبطة بـ mar، مثل نورفلوكساسين، سيبروفلوكساسين، وأمبيسيلين، بينما ظلت المقاومة للتتراسيكلين والكلورامفينيكول غير متأثرة. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن operon AZY هو جزء لا يتجزأ من كل من توازن النحاس ومقاومة المضادات الحيوية المعتمدة على mar في *E. coli*، مما يبرز إمكانيته كهدف لتعزيز فعالية المضادات الحيوية.
مناقشة
تسلط الأبحاث الضوء على دور بروتينات AZY في ربط استيراد النحاس بمقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا. على وجه الخصوص، تم تحديد YebZ كمستورد للنحاس يتم تعديل نشاطه بواسطة البروتينات المحيطية YobA وYebY. تظهر النتائج التجريبية أن إزالة النحاس عبر الخالب ثلاثي الإيثيلين تترا مين (TETA) تقلل بشكل كبير من نشاط operon mar وتزيد من القابلية للمضادات الحيوية في الخلايا من النوع البري (WT)، بينما يكون لها تأثير ضئيل على سلالات ΔAZY. وهذا يشير إلى أن النحاس المستورد من خلال نظام AZY ضروري لتنظيم mar ومقاومة المضادات الحيوية.
علاوة على ذلك، تشير تحليل المعلومات الحيوية الشامل لحوالي 50,000 تسلسل من عائلة CopD عبر البروتيوبكتيريا إلى أن آلية استيراد النحاس المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية قد تكون شائعة بين البكتيريا سالبة الجرام. يتم العثور على غالبية تسلسلات CopD في Gammaproteobacteria، وخاصة ضمن عائلة Enterobacteriaceae، مع العديد من الجينات المجاورة المرتبطة بمقاومة النحاس ومسارات الاستيراد. وهذا يشير إلى أن بروتينات AZY قد تلعب دورًا كبيرًا في تعديل مقاومة المضادات الحيوية عبر سلالات بكتيرية مرضية مختلفة، مما يوفر رؤى حول استراتيجيات محتملة لمكافحة مقاومة الأدوية المتعددة.
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-025-07884-5
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40108346
Publication Date: 2025-03-19
Author(s): Zhenyun Du et al.
Primary Topic: Trace Elements in Health
Methods
In this study, the researchers utilized the E. coli strain BW25113 from the Keio collection for all experiments, including the generation of the ΔAZY knockout strain, which lacks the entire yobA-yebZ-yebY operon. The deletion was achieved using the method described by Datsenko et al., and the absence of off-target mutations was confirmed through PCR and whole genome sequencing. Additionally, plasmids p copA-Lux and p marX-Lux were constructed by amplifying specific genomic regions from E. coli MG1655 and inserting them into the p PL2lux plasmid upstream of the luxCDABE operon using restriction-free cloning.
For growth assays, E. coli cultures were maintained in M9 minimal media supplemented with glycerol and tryptone. Cells were transformed with either the promoter-less Lux plasmid or the constructed plasmids, and growth was monitored in a 96-well plate at 37 °C using an automated plate reader. The optical density at 600 nm (OD600) and luminescence were measured continuously. Experiments included biological triplicates with at least three technical replicates, and additional assays were conducted to assess growth under various stress conditions, such as exposure to ethanol, sodium dodecyl sulfate, or sodium cholate, with measurements taken over a 12-hour period.
Results
The results of this study demonstrate that the AZY operon in *E. coli* plays a crucial role in modulating copper levels and activating the mar pathway, which is associated with antibiotic resistance. Using a reporter gene approach with the lux operon fused to the copA promoter, the researchers observed that wild-type (WT) *E. coli* transformed with the p copA-Lux plasmid exhibited a significant increase in luminescence upon the addition of copper sulfate (CuSO₄), indicating copper influx. In contrast, cells lacking the AZY operon (ΔAZY) showed a 3-4 fold lower luminescence response, suggesting that the AZY proteins are essential for effective copper import. Further experiments revealed that overexpression of the transmembrane protein YebZ led to a substantial increase in intracellular copper levels, while coexpression with YobA enhanced copper uptake, indicating a collaborative role in copper transport.
Additionally, the study found that the AZY proteins are vital for the activation of the mar operon, as ΔAZY strains exhibited an 80-90% reduction in luminescence in response to salicylic acid, a known mar pathway inducer. This diminished activation correlated with increased susceptibility to mar-related antibiotics, such as norfloxacin, ciprofloxacin, and ampicillin, while resistance to tetracycline and chloramphenicol remained unaffected. These findings collectively suggest that the AZY operon is integral to both copper homeostasis and mar-mediated antibiotic resistance in *E. coli*, highlighting its potential as a target for enhancing antibiotic efficacy.
Discussion
The research highlights the role of AZY proteins in linking copper import to antibiotic resistance in bacteria. Specifically, YebZ is identified as a copper importer whose activity is modulated by the periplasmic proteins YobA and YebY. Experimental results demonstrate that the removal of copper via the chelator triethylenetetramine (TETA) significantly reduces the activity of the mar operon and increases antibiotic susceptibility in wild-type (WT) cells, while having minimal impact on ΔAZY strains. This suggests that copper imported through the AZY system is crucial for mar regulation and antibiotic resistance.
Furthermore, a comprehensive bioinformatics analysis of approximately 50,000 CopD family sequences across proteobacteria indicates that the copper import mechanism linked to antibiotic resistance may be widespread among gram-negative bacteria. The majority of CopD sequences are found in Gammaproteobacteria, particularly within the Enterobacteriaceae family, with many neighboring genes associated with copper resistance and import pathways. This suggests that the AZY proteins could play a significant role in modulating antibiotic resistance across various pathogenic bacterial strains, thereby providing insights into potential strategies for combating multidrug resistance.