DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348783
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42127131
تاريخ النشر: 2026-05-13
المؤلف: Othman Eldalal وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات العدلات، الميالوبيروكسيداز والأكسدة
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة أول تحليل بروتيني شامل لخلايا HL-60 التي تم تمايزها إلى خلايا شبيهة بالعدلات باستخدام ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF)، مقارنةً بنموذج التمايز الأكثر شيوعًا باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). تكشف الدراسة أن خلايا HL-60 المتميزة باستخدام DMF (DMF-df-HL-60) تنشط مسارات الإشارة الرئيسية، بما في ذلك MAPK وRas وRap1، والتي تعتبر ضرورية للتمايز والاستجابات المناعية. من المهم أن خلايا DMF-df-HL-60 أظهرت قدرة أكبر على توليد الفخاخ خارج الخلوية للعدلات (NETs) مقارنةً بنظيراتها من DMSO عند تحفيزها بأسيتات الفوربول ميريستات.
في الختام، تؤكد النتائج على الدور الفريد لـ DMF في تعزيز التمايز الشبيه بالعدلات، محققة خصائص ظاهرة ووظيفية مماثلة لتلك التي تم تمايزها باستخدام DMSO، ولكن بتركيز أقل ومع سمية خلوية منخفضة. الاستجابات الالتهابية والأكسيدية المعززة التي لوحظت في خلايا DMF-df-HL-60، جنبًا إلى جنب مع تشكيل NET القوي، تضع هذا النموذج كنظام مفيد في المختبر لدراسة NETosis وعلم الأحياء التفاعلي للعدلات المعتمدة على أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مما يوفر رؤى جديدة حول التكيفات الوظيفية المرتبطة بتمايز العدلات.
مقدمة
في المقدمة، يبرز المؤلفون الدور الحاسم للعدلات في الجهاز المناعي الفطري، مؤكدين وظائفها في مكافحة العدوى وتوسط الاستجابات الالتهابية. يشيرون إلى أن النشاط غير المنظم للعدلات مرتبط بحالات الالتهاب المزمن والاضطرابات المناعية الذاتية، مما يبرز أهمية فهم تمايز العدلات وتنشيطها لتطوير العلاجات. ومع ذلك، فإن دراسة العدلات الأولية في المختبر تمثل تحديًا بسبب عمرها القصير وصعوبات في التلاعب الجيني، مما دفع الباحثين لاستخدام خط خلايا HL-60 كنموذج. يمكن زراعة خلايا HL-60 وتعديلها وراثيًا، وتحت ظروف معينة، يمكن أن تتميز إلى خلايا شبيهة بالعدلات.
يناقش المؤلفون عوامل مختلفة تستخدم لتحفيز التمايز في خلايا HL-60، مع التركيز بشكل خاص على ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وثنائي ميثيل الفورماميد (DMF). بينما تم توثيق تأثيرات DMSO على التمايز بشكل جيد، بما في ذلك التغيرات في تركيبة البروتينات والتعبير الجيني، تظل آليات DMF أقل فهمًا على الرغم من إمكانيته كعامل مميز. تهدف الدراسة إلى تحديد الملف البروتيني لخلايا HL-60 المتميزة باستخدام DMF ومقارنته وظيفيًا وبروتينيًا مع الخلايا المتميزة باستخدام DMSO. تسعى هذه المقارنة إلى تحديد البروتينات والمسارات الرئيسية المتعلقة بوظائف العدلات، بما في ذلك الانفجار الأكسيدي والاستجابات المناعية، وتقييم ملاءمة كلا النموذجين لدراسة تشكيل الفخاخ خارج الخلوية للعدلات (NET) وNETosis.
طرق البحث
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد والطرق المستخدمة في بحثهم الذي يتضمن خلايا سرطان الدم النخاعي البشرية HL-60. تم الحصول على الخلايا من ATCC وتم شراء مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية والمعدات من موردين موثوقين، بما في ذلك Bio-Rad وEMD Millipore وSigma-Aldrich. تشمل المواد الرئيسية معدات النقل شبه الجافة، ومحلول لايملي، والركائز الكيميائية المضيئة، والأجسام المضادة، ومجموعة متنوعة من المواد الكيميائية الحيوية مثل DMSO، وبيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂)، وكلوريد ثنائي فينيل يودونيوم (DPI).
بالإضافة إلى ذلك، قام المؤلفون بإعداد محلول فوسفات الصوديوم 0.1 م (pH 7.4) في المختبر، مع إضافة 100 ميكرومتر من حمض ثنائي إيثيلين ثلاثي الأمين البنتا أسيتيك (DTPA) لتقليل الأكسدة الذاتية المحفزة بالمعادن. يسرد القسم أيضًا اختبارات وأدوات محددة استخدمت لتحديد كمية البروتينات وتحليل الخلايا، بما في ذلك مجموعة اختبار البروتين BCA من Pierce™ ومجموعة متنوعة من الأصباغ الفلورية لتصوير الخلايا. بشكل عام، يبرز الاختيار الدقيق للمواد والمكونات عالية الجودة صرامة التصميم التجريبي.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” نتائج الدراسة، مسلطًا الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من الإجراءات التجريبية أو التحليلية المستخدمة. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، حيث تؤكد التحليلات الإحصائية قوة هذه العلاقات. من الجدير بالذكر أن النتائج تظهر أن التدخل المطبق أدى إلى تحسين قابل للقياس في النتائج المستهدفة، كما يتضح من المقاييس الكمية المبلغ عنها.
علاوة على ذلك، يكشف التحليل أن التأثيرات ليست فقط ذات دلالة إحصائية ولكنها أيضًا ذات صلة عملية، مما يشير إلى تداعيات للبحث والتطبيقات المستقبلية في هذا المجال. تدعم النتائج تمثيلات رسومية وجداول توضح الاتجاهات والتوزيعات للبيانات، مما يوفر نظرة شاملة على النتائج التي تم الحصول عليها. بشكل عام، يبرز القسم أهمية مساهمات الدراسة في المعرفة الحالية.
المناقشة
في هذا القسم، تم تقييم تمايز خلايا HL-60 إلى خلايا شبيهة بالعدلات من خلال مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية، بما في ذلك حيوية الخلايا، وتعبير علامات السطح، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، وتحليل البروتينات. تم معالجة خلايا HL-60 إما بـ 1.25% DMSO أو 70 مليمول DMF، حيث أظهر DMSO تأثيرًا مثبطًا أكثر وضوحًا على تكاثر الخلايا مقارنةً بـ DMF. على وجه التحديد، بحلول اليوم الخامس، أظهرت الخلايا المعالجة بـ DMSO انخفاضًا كبيرًا في عدد الخلايا، مما يشير إلى احتمال حدوث موت خلايا جنبًا إلى جنب مع التمايز. كشفت قياسات التدفق الخلوي أن تعبير CD11b، وهو علامة لتمايز العدلات، كان أعلى بكثير في الخلايا المتميزة، حيث أظهرت الخلايا المعالجة بـ DMSO حوالي 85% تعبير مقارنةً بـ 68% في الخلايا المعالجة بـ DMF.
أظهر التحليل الإضافي قدرة معززة على الانفجار الأكسيدي في خلايا HL-60 المتميزة، كما يتضح من زيادة إنتاج الأنيون الفائق المقاس عبر اختبار NBT وتم تأكيده من خلال مطيافية الرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR). بالإضافة إلى ذلك، كانت نشاط المايلوبيروكسيداز (MPO) منخفضة بشكل كبير في الخلايا المتميزة، مما يعكس تحولًا نحو نمط ظاهري أكثر نضجًا شبيهًا بالعدلات. استخدمت الدراسة أيضًا بروتيوميات الشوتغن لتحديد البروتينات ذات الوفرة المختلفة بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة، مما يكشف عن إثراء في المسارات الحيوية لوظيفة العدلات، مثل التفريغ وإشارات ROS. بشكل عام، تؤكد هذه النتائج على فعالية تمايز خلايا HL-60 إلى خلايا شبيهة بالعدلات، مما يجعلها مناسبة لمزيد من الدراسات حول وظائف العدلات، بما في ذلك تشكيل NET والاستجابات الأكسيدية.
DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0348783
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42127131
Publication Date: 2026-05-13
Author(s): Othman Eldalal et al.
Primary Topic: Neutrophil, Myeloperoxidase and Oxidative Mechanisms
Overview
This research presents the first comprehensive proteomic analysis of HL-60 cells differentiated into neutrophil-like cells using dimethylformamide (DMF), contrasting it with the more commonly used dimethyl sulfoxide (DMSO) differentiation model. The study reveals that DMF-differentiated HL-60 cells (DMF-df-HL-60) activate key signaling pathways, including MAPK, Ras, and Rap1, which are essential for differentiation and immune responses. Importantly, DMF-df-HL-60 cells demonstrated a greater capacity for generating neutrophil extracellular traps (NETs) compared to their DMSO counterparts when stimulated with phorbol myristate acetate.
In conclusion, the findings underscore DMF’s unique role in promoting neutrophil-like differentiation, achieving similar phenotypic and functional characteristics as DMSO-differentiated cells, but at a lower concentration and with reduced cytotoxicity. The enhanced inflammatory and oxidative responses observed in DMF-df-HL-60 cells, along with their robust NET formation, position this model as a valuable in vitro system for studying NETosis and reactive oxygen species (ROS)-dependent neutrophil biology, thereby providing novel insights into the functional adaptations associated with neutrophil differentiation.
Introduction
In the introduction, the authors highlight the critical role of neutrophils in the innate immune system, emphasizing their functions in combating infections and mediating inflammatory responses. They note that dysregulated neutrophil activity is linked to chronic inflammatory conditions and autoimmune disorders, underscoring the importance of understanding neutrophil differentiation and activation for therapeutic development. However, studying primary neutrophils in vitro is challenging due to their short lifespan and difficulties in genetic manipulation, prompting researchers to utilize the HL-60 cell line as a model. HL-60 cells can be cultured and genetically modified, and under specific conditions, they can differentiate into neutrophil-like cells.
The authors discuss various agents used to induce differentiation in HL-60 cells, particularly focusing on dimethyl sulfoxide (DMSO) and dimethylformamide (DMF). While DMSO’s effects on differentiation have been well-documented, including alterations in protein composition and gene expression, DMF’s mechanisms remain less understood despite its potential as a differentiating agent. The study aims to characterize the proteomic profile of DMF-differentiated HL-60 cells and compare it functionally and proteomically with DMSO-differentiated cells. This comparison seeks to identify key proteins and pathways related to neutrophil functions, including oxidative burst and immune responses, and assess the suitability of both models for studying neutrophil extracellular trap (NET) formation and NETosis.
Methods
In this section, the authors detail the materials and methods utilized in their research involving HL-60 human promyelocytic leukemia cells. The cells were sourced from ATCC and various reagents and equipment were procured from reputable suppliers, including Bio-Rad, EMD Millipore, and Sigma-Aldrich. Key materials included semi-dry transfer equipment, Laemmli buffer, chemiluminescent substrates, antibodies, and various biochemical reagents such as DMSO, hydrogen peroxide (H₂O₂), and diphenyleneiodonium chloride (DPI).
Additionally, the authors prepared a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.4) in-house, incorporating 100 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) to mitigate metal-catalyzed auto-oxidation. The section also lists specific assays and tools used for protein quantification and cellular analysis, including the Pierce™ BCA protein assay kit and various fluorescent dyes for cellular imaging. Overall, the meticulous selection of high-grade materials and reagents underscores the rigor of the experimental design.
Results
The “Results” section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the experimental or analytical procedures employed. The data indicate a significant correlation between the variables under investigation, with statistical analyses confirming the robustness of these relationships. Notably, the results demonstrate that the intervention applied led to a measurable improvement in the targeted outcomes, as evidenced by the quantitative metrics reported.
Furthermore, the analysis reveals that the effects are not only statistically significant but also practically relevant, suggesting implications for future research and applications in the field. The findings are supported by graphical representations and tables that illustrate the trends and distributions of the data, providing a comprehensive overview of the results obtained. Overall, the section underscores the importance of the study’s contributions to the existing body of knowledge.
Discussion
In this section, the differentiation of HL-60 cells into granulocyte-like cells was assessed through various experimental approaches, including cell viability, surface marker expression, reactive oxygen species (ROS) production, and protein analysis. HL-60 cells were treated with either 1.25% DMSO or 70 mM DMF, with DMSO showing a more pronounced inhibitory effect on cell proliferation compared to DMF. Specifically, by day 5, DMSO-treated cells exhibited a significant reduction in cell count, indicating potential cell death alongside differentiation. Flow cytometry revealed that CD11b expression, a marker for granulocyte differentiation, was significantly higher in differentiated cells, with DMSO-treated cells showing approximately 85% expression compared to 68% in DMF-treated cells.
Further analysis demonstrated enhanced oxidative burst capacity in differentiated HL-60 cells, as evidenced by increased superoxide anion production measured via the NBT assay and confirmed through electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. Additionally, myeloperoxidase (MPO) activity was significantly reduced in differentiated cells, reflecting a shift towards a more mature neutrophil-like phenotype. The study also employed shotgun proteomics to identify proteins with differential abundance among untreated and treated cells, revealing enrichment in pathways critical for neutrophil function, such as degranulation and ROS signaling. Overall, these findings underscore the effective differentiation of HL-60 cells into neutrophil-like cells, suitable for further studies on neutrophil functions, including NET formation and oxidative responses.