الكلمات الرئيسية مبادئ 3R-التنقيح، الصلاحية العلمية، رفاهية الحيوانات، جودة البحث، الاعتبارات الأخلاقية

لقد كانت الأبحاث على الحيوانات محورية في تقدم المعرفة العلمية والاختراقات الطبية، مما ساهم بشكل كبير في فهمنا للعمليات البيولوجية المعقدة والأمراض البشرية [1]. ومع ذلك، فإن امتياز إجراء الأبحاث على الحيوانات يأتي مع مسؤولية عميقة لضمان المعاملة الأخلاقية ورفاهية الحيوانات المعنية. اعترافًا بهذه المسؤولية، ظهرت مبادئ 3 R كـ

إطار عمل أساسي لتوجيه الباحثين في إجراء تجارب على الحيوانات بشكل أخلاقي داخل معاهد البحث. مبادئ 3R، التي قدمها راسل وبيرش في عام 1959، تدعو إلى الاستبدال، والتقليل، والتحسين في استخدام الحيوانات في البحث. بينما يركز الاستبدال والتقليل على استكشاف طرق بديلة وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة، يتعلق التحسين بالتقنيات التي تخفف من الألم والضيق والمعاناة التي تعاني منها الحيوانات أثناء التجارب. من خلال التأكيد على مبادئ 3R-التحسين، يمكن للباحثين السعي لتعزيز رفاهية الحيوانات دون المساس بالنزاهة العلمية، مما يؤدي إلى نتائج بحثية أكثر إنسانية وموثوقية.
الهدف المركزي من بروتوكول التكرير هو تحقيق توازن دقيق بين تعزيز الرفاهية
حول الحيوانات المختبرية وتحسين دقة التحقيقات العلمية. تعتبر الفئران والجرذان، نظرًا لتشابهها الجيني مع البشر، والتكاثر السريع، والفعالية من حيث التكلفة، وسهولة التعامل، أساسية في البحث العلمي ومناسبة لاعتبارات تحسين 3R. لذلك، يركز هذا المقال الاستعراضي بشكل أساسي على هذه الأنواع، مستكشفًا طرق التحسين المصممة خصيصًا لخصائصها الفريدة. من خلال فحص المكونات الرئيسية لمبادئ التحسين بعناية، يكشف هذا المقال عن مخطط شامل لتنفيذها عبر مراحل مختلفة من تجارب الحيوانات. يركز على إنشاء بيئات سكنية غنية تقلل من التوتر وتعزز السلوكيات الطبيعية، واعتماد طرق غير مقيدة للتعامل والتدريب لتعزيز الثقة والتعاون، واستخدام تقنيات جرعات وأخذ عينات محسنة تعطي الأولوية لراحة الحيوانات [4، 5]. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر تقنيات إدارة الألم والقتل الرحيم حاسمة في الحفاظ على رفاهية الحيوانات والمعايير الأخلاقية [6، 7]. لضمان رفاهية الحيوانات المستمرة، فإن المراقبة والتقييم المنتظمين ضروريان لقياس رفاهية الحيوانات خلال التجربة. تعزز التعاون مع لجان أخلاقيات الحيوانات ثقافة البحث الأخلاقي، بينما يضمن الالتزام بالإرشادات واللوائح ممارسات بحث مسؤولة وشفافة. من خلال تبني مبادئ تحسين 3R، يمكن للباحثين أن يؤثروا بشكل كبير على رفاهية الحيوانات، ويحسنوا من صحة وموثوقية نتائجهم العلمية، ويقللوا من التباين وعدد الحيوانات المستخدمة [8]. في تعزيز التبني الواسع لممارسات التحسين، يستكشف هذا المقال قيمة التعاون مع مختبرات بحثية أخرى، والجهات الراعية والمساهمين، ونشر أفضل الممارسات والإرشادات، وتنفيذ برامج التدريب وورش العمل، ودور الهيئات التنظيمية ولجان المراجعة الأخلاقية [9].

بشكل عام، فإن تنفيذ مبادئ 3R-التنقيح في تجارب القوارض ليس فقط أمرًا أخلاقيًا حاسمًا، بل هو أيضًا ضروري لتعزيز مصداقية وتأثير البحث العلمي. من خلال الالتزام بهذه المبادئ، يمكن للباحثين تحقيق توازن متناغم بين التقدم العلمي والمعاملة الرحيمة للقوارض في المختبر، مما يؤدي في النهاية إلى تقدم المعرفة وتحسين رفاهية الحيوانات في معاهد البحث.

تشكل مبادئ 3R-التنقيح إطارًا محوريًا في السعي نحو البحث الأخلاقي والمسؤول على الحيوانات في المختبر. تشمل المكونات الرئيسية لهذا البروتوكول جوانب مختلفة تعطي الأولوية لرفاهية الحيوانات في المختبر مع الحفاظ على الصرامة العلمية.

وصول الحيوانات إلى منشأة البحث يمثل الخطوة الأولى في رحلتها داخل الإعداد التجريبي، وبروتوكول منظم جيدًا لفك حزم الحيوانات أمر بالغ الأهمية لرفاهيتها. جانب حاسم من فك الحزم يتضمن ضمان التعقيم المناسب لمنع التلوث المتبادل بين شحنات الحيوانات ذات الحالات الصحية المختلفة. لمعالجة ذلك، يقترح لو (1980) جدولة الشحنات من مصادر مختلفة لتصل في أيام منفصلة. بالإضافة إلى ذلك، يجب الإبلاغ عن أي نتائج غير طبيعية مع الحيوانات على الفور إلى المورد أو المؤسسة، ويجب على الأطباء البيطريين في المعهد المستلم إجراء ملاحظات متكررة خلال الـ 24 إلى 48 ساعة الأولى من الاستلام. إن إنشاء إجراءات مراقبة الصحة خلال فترة الحجر الصحي للحيوانات المستلمة حديثًا أمر حاسم لضمان توافقها مع متطلبات المؤسسة. قد تختلف مدة الحجر الصحي وشدة المراقبة بناءً على مصدر الحيوانات وموثوقيته.

التكيف المناسب يقلل من التوتر ويسمح للحيوانات بالتكيف مع بيئتها الجديدة، مما يضمن موثوقية وأخلاقية التجارب اللاحقة [10]. يتضمن ذلك اعتبارات دقيقة، مثل توفير بيئة سكنية ملائمة، وتغذية مخصصة، والسماح بالتفاعلات الاجتماعية عند الاقتضاء. التكيف التدريجي مع المتغيرات البيئية الجديدة، مثل استهلاك الطعام والماء، أمر أساسي؛ على سبيل المثال، تم توثيق أن هذه العوامل تتأثر أثناء النقل إلى مرفق مختلف وعادة ما تستغرق من 3 إلى 5 أيام لتعود إلى طبيعتها [12]. وفقًا لجوردون (2004)، تؤثر اختلافات في بناء الأقفاص ونوع الفراش على الحفاظ على درجة حرارة الجسم في الفئران حيث تتكيف الحيوانات باستمرار مع التغيرات في البيئة المحيطة [13]. يسمح التكيف المستمر بعد النقل المجهد للحيوانات بالتعرف على أصوات ورائحة المرفق ووجود القائمين على الرعاية، مما يساهم في تقليل مستويات التوتر [14]. يجب أن تُمنح الحيوانات شعورًا بالأمان عند الاقتراب من فنيي الحيوانات، بينما يجب أن يمتلك الفنيون القدرة على تفسير إشارات الحيوانات ومراقبة استجاباتها بعناية أثناء التفاعلات. يُظهر أفشاي-إلينر وآخرون (2002) أن التعامل المنتظم مع الحيوانات البحثية خلال حياتها المبكرة، وخاصة تعويدها على المعاملة اللطيفة خلال هذه الفترة، يؤدي إلى تقليل توتر التعامل في المراحل اللاحقة [15]. من خلال اعتماد التعامل اللطيف وتوفير بيئة هادئة، يمكن للباحثين إقامة علاقة إيجابية مع الحيوانات، مما يحدد نغمة المعاملة الإنسانية والأخلاقية طوال فترة إقامتها في معهد البحث.

البيئة السكنية الغنية لا تعزز رفاهية الحيوانات فحسب، بل لها أيضًا آثار محتملة على نتائج البحث. استخدام مساحات الأقفاص الكبيرة (مثل إعادة استخدام…
تسمح أقفاص الأرانب لتربية الفئران وأقفاص الفئران للفئران الصغيرة للجرذان بالمشاركة في سلوكيات طبيعية، بما في ذلك الاستكشاف، والتسلق، والتعشيش، والحفر، مما يقلل من التوتر، ويعزز بيئة معيشية أكثر طبيعية. علاوة على ذلك، لا يمكن التقليل من فوائد السكن الاجتماعي للجرذان. من المرجح أن تعيش الجرذان التي تعيش في مجموعات تجارب اجتماعية إيجابية، مما يمكن أن يؤدي إلى تقليل العدوانية وتحسين المهارات الاجتماعية. ومع ذلك، من الضروري مراعاة التفضيلات الفردية والديناميات السلوكية بعد تشكيل ومراقبة المجموعات الاجتماعية، حيث يمكن أن تؤثر توافق رفقاء القفص بشكل كبير على رفاهيتهم. إن دمج مجموعة متنوعة من مواد الإثراء، مثل الألعاب القابلة للمضغ، ومواد التعشيش، وأماكن الاختباء، وتحديات التسلق/التوازن (مثل أرجوحة الترامبولين، وعجلات الجري، والسلالم)، وإمكانيات الحفر، وخيارات البحث عن الطعام، والاتصالات الاجتماعية، وما إلى ذلك، يوفر للجرذان فرصًا للتحفيز الذهني والتمرين البدني. تساعد هذه الإثراءات في منع السلوكيات النمطية التي قد تنشأ من ظروف السكن الرتيبة، مما يحسن في النهاية من مرونة الحيوانات العاطفية وقدراتها المعرفية. بينما يتم توفير الإثراء، من الضروري تقييم هذه العناصر بانتظام وتدويرها للحفاظ على جاذبيتها وفعاليتها. تخلق صناديق المراقبة شبه مساحة مفتوحة للحيوانات داخل بيئة محكومة، مما يسمح لها بتجربة بيئة أكثر إثراءً، مما يعزز رفاهيتها العامة. كما أنها توفر مساحة قيمة لدراسة سلوك الحيوانات وتفاعلاتها. يمكن للباحثين تحليل استجابات الحيوانات للمؤثرات المختلفة عن كثب ومراقبة آثار التفاعلات السابقة. وبالتالي، فإن الاعتراف بأهمية توفير ظروف معيشية مثيرة وداعمة للجرذان.
يعزز توازنًا وديًا بين المسؤوليات الأخلاقية والتقدم العلمي في بيئات البحث.
في بعض الحالات، قد تتطلب التجارب أقفاصًا أصغر بسبب احتياجات البحث المحددة أو القيود المكانية، مما قد يحد من التطبيق المتسق للبيئات الغنية. هذه incompatibility المحتملة بين الجوانب المثالية والعملية لإسكان القوارض عبر جميع الظروف التجريبية تبرز أهمية نهج دقيق. يعترف هذا النهج بالمتطلبات المتنوعة للتجارب بينما يسعى لتحقيق رفاهية الحيوانات المثلى ضمن القيود القائمة. Advocated Benefiel وآخرون (2005) بوضوح عن تحسين رفاهية الحيوانات ولكنهم اقترحوا أيضًا أن الإثراء البيئي لديه القدرة على التسبب في زيادة التباين التجريبي ونتائج البحث. أشار Toth وآخرون (2011) إلى أن البيئات الغنية يجب أن تُصمم بعناية بحيث تترك النتائج التجريبية دون تغيير وأوصوا بتقييم الإثراء على أساس تجربة بتجربة. استراتيجيات الإثراء، مثل البيئات الكبيرة والمفتوحة، مفيدة بشكل خاص للتجارب التي تركز على علم السموم، وتقييم السمية، وعلم الأدوية الآمن، أو الدراسات السلوكية للوصول إلى آثار الأدوية الجديدة على الحيوانات التجريبية. بينما توفر للقوارض فرصًا للسلوكيات الطبيعية والتفاعلات الاجتماعية، تعزز هذه الإعدادات موثوقية وملاءمة النتائج في مرحلة الحياة في هذه المجالات. ومع ذلك، تظهر تحديات عملية، خاصة في مرافق الحيوانات الصغيرة ذات الموارد المحدودة، حيث قد تتعارض الضوابط البيئية الصارمة، مثل تلك المطلوبة لدراسات العدوى، مع تنفيذ مساحات الأقفاص الكبيرة. إن الاعتراف بهذه القيود أمر حاسم للباحثين لتطبيق استراتيجيات الإثراء بشكل مدروس يتماشى مع التجارب.

الأهداف، مع ضمان الاستخدام الأخلاقي والفعال في سياقات متنوعة.

إعطاء الأولوية لتقنيات التعامل غير المقيدة مع القوارض يحمل أهمية قصوى، حيث إنه يخفف بشكل فعال من التوتر والقلق أثناء الإجراءات التجريبية [25]. تتضمن هذه الأساليب تدريب القوارض على المشاركة طواعية في الإجراءات، متجنبين الحاجة إلى القيود الجسدية أو التلاعب القسري. ومن الجدير بالذكر أن التعامل عبر الأنفاق قد اكتسب شهرة في الأساليب غير المقيدة؛ حيث يتم توجيه الحيوانات برفق إلى أنفاق صغيرة (يمكن توفيرها في قفصها كوسيلة إثراء ويمكن استخدامها لاحقًا كأداة للتعامل)، بدلاً من الإمساك بالذيل [25]. وجد سينيني وآخرون (2020) أن الفئران تفضل استكشاف الأنفاق على التفاعل مع أيدي الباحث، حيث تظهر سلوكيات إيجابية مثل اللمس والتسلق بينما تظهر حفرًا دفاعيًا أقل، مما يبرز تفضيلًا واضحًا لاستكشاف الأنفاق [26]. أظهر هندرسون وآخرون (2020) أن الفئران التي تم التعامل معها من خلال تفاعلات الأنفاق أظهرت استعدادًا أكبر للتفاعل مع المعالجين وانخفاض مستويات القلق في الاختبارات السلوكية حتى بعد القيود المتكررة، على عكس تلك التي تم التعامل معها من خلال ذيولها [27]. أيضًا، يمكن أن يكون استخدام رافع للفئران، أو كوب يد أو أشياء مشابهة لرفع الحيوانات من قفصها مفيدًا أيضًا. على النقيض من ذلك، فإن التعامل بالذيل، المعروف بأنه يثير ردود فعل الخوف والتوتر، يمكن أن يؤثر سلبًا على كل من النتائج التجريبية ورفاهية الحيوانات [28]. لذلك، فإن اعتماد الأساليب غير المقيدة لا يحترم فقط استقلالية الحيوانات، بل يقلل أيضًا من الإصابات والانزعاج المحتمل أثناء التعامل. علاوة على ذلك، فإن دمج مواد متخصصة مثل الفراش المصنوع من الصوف أو الحصير الناعم المصمم للحيوانات لـ
يمكن أن يساعد الراحة على إنشاء مكان ناعم ومريح للقوارض خلال إجراءات التدريب والجرعات. توفر هذه الفراش المصنوع من الصوف، الذي يشير إلى فراش الحيوان الخاص، ليس فقط الألفة والراحة ولكن أيضًا تعزز السلوكيات الطبيعية. وبالمثل، فإن إدخال فراش صوفي قابل للتعقيم في صناديق الوزن يخلق بيئة هادئة وخالية من التوتر أثناء الوزن، مع ضمان النظافة من خلال التعقيم، مما يتماشى بسلاسة مع معايير البحث [29]. لذلك، فإن التعامل المتقن مع القوارض يعزز ثقتها، ويقلل من التوتر، ويضمن سلوكًا تعاونيًا، وهو أمر حاسم للملاحظات العلمية الدقيقة والمعاملة الأخلاقية (الشكل 2).
تدريب الحيوانات قبل التجارب يساهم في بناء الثقة والتعاون، مما يضمن أن تكون هادئة ومستعدة للمشاركة، مما يؤدي إلى إجراءات أكثر سلاسة، وتقليل مستويات التوتر، ونتائج بحث أكثر موثوقية. هناك طرق تدريب محددة للقوارض تتماشى مع مبادئ التحسين، تركز على التعامل اللطيف، والتعزيز الإيجابي، وتقليل التوتر أثناء الإجراءات (الجدول 1).
تدريب الحيوانات المخبرية (حوالي يمكن تقسيم الأوقات) عند وصولهم إلى الجلسات المختلفة التالية التي تعتبر حاسمة لضمان مشاركتهم في التجارب المستقبلية.
جلسة التدريب الأولى: عندما تصل الحيوانات المخبرية لأول مرة إلى منشأة حيوانات، يلعب تدريبها الأولي وتعاملها دورًا حاسمًا في رفاهيتها اللاحقة. توفر الأبحاث العلمية رؤى قيمة حول أهمية بروتوكولات التدريب المنظمة خلال هذه الفترة الحرجة. يبرز مقال لسوان وآخرين (2023) أهمية التعامل اللطيف في تدريب الحيوانات المخبرية. يتناول المقال أهمية بروتوكولات التدريب العامة والتعامل اللطيف في المساهمة في الرفاهية العامة للحيوانات و

التكيف مع الإجراءات المخبرية الشائعة. علاوة على ذلك، تسلط مراجعة من ميسكي وآخرون (2022) الضوء على تأثير البيئة المعيشية المحفزة باستخدام التحفيز المعرفي والتدريب العقلي في القوارض المخبرية، مما يعود بفائدة كبيرة على حالة رفاهيتها [35]. لذلك، فإن هذا النوع من التدريب إذا تم تقديمه خلال المرحلة الأولية من التكيف يمكن أن يقلل بشكل كبير من مستويات التوتر في القوارض التجريبية.

بالإضافة إلى ذلك، فإن فهم السلوكيات الطبيعية للحيوانات أمر حاسم خلال فترة التدريب الأولى. تخاف الحيوانات من الجدة، والروائح، والضوضاء، والحركات المفاجئة، والألم، ونقص السيطرة، مما يظهر سلوكيات نفور مثل التجميد، والهروب، والت vocalizing، وتغيير وضعيات الجسم. يمكن أن يعزز التعرف على مستويات الخوف المتفاوتة في الحيوانات المختلفة الملاحظات ذات الصلة خلال فترة التدريب. يجب أن تعطي التفاعلات المبكرة الأولوية للتدليك اللطيف والتعامل المرح، مما يعزز إدراك الموظفين الودودين وأيديهم الآمنة. وبالتالي، تهدف جلسة التدريب الأولية إلى تعزيز الثقة والتعرف، مع مراقبة استجابة الإجهاد الفردية والاحتمالات الشاذة. من خلال دمج التعامل اللطيف، والتحفيز الذهني، وفهم استجابة الخوف الطبيعية للحيوان، يمكن للباحثين تعزيز التكيف ورفاهية الحيوانات المخبرية.

جلسات التدريب اللاحقة: خلال هذه الجلسات، يتحول التركيز الأساسي نحو إعداد الحيوانات لـ
الإجراءات القادمة. من الضروري مراجعة بروتوكول الدراسة لتحديد أجزاء الجسم المحددة التي تتطلب معالجة إضافية وتقديم الحيوانات للمعدات اللازمة. على سبيل المثال، إذا كان من المخطط إعطاء الجرعة عن طريق الفم، يجب تدريب الحيوانات على استخدام مقبض الجرعة. بحلول جلسة التدريب الأخيرة، يُوصى بتقديم الماء بلطف من خلال أنبوب تغذية فموي ناعم. يجب أن تشمل التدريب تقنيات أخذ عينات متنوعة أيضًا. على سبيل المثال، إذا كانت جمع الدم تتضمن الوريد الذيل، يجب تدليك الذيل بشكل متكرر ولطف. في حالة أخذ عينات من الوريد السافن، يجب أن تتعود الحيوانات على قبضة الفني وصوت آلة الحلاقة. إذا كان من الضروري استخدام أنابيب التقييد، مثل الدراسات المتعلقة بالاستنشاق، يجب أن تتعرف الحيوانات عليها قبل إجراء التقييد الأول. يمكن وضع جهاز التقييد في قفص الحيوانات لمدة عدة أيام، للسماح للحيوانات بالدخول واستكشاف الأنبوب بحرية، حتى تتعرف عليه. الهدف من جلسة التدريب النهائية هو أن تظهر الحيوانات الهدوء والاسترخاء والفضول.

استثمار الوقت في تدريب القوارض قبل بدء الدراسة يثبت أنه إجراء يوفر الوقت. فهو يمنع التحديات التي قد تنشأ أثناء إجراءات الجرعات وأخذ العينات نتيجة للضغط الذي تتعرض له الحيوانات، مما يوفر سلوكًا تعاونيًا بدلاً من ذلك. هذه الألفة تمكن الفنيين من مراقبة سلوك الحيوانات بدقة خلال الدراسة، مما يساعد في التمييز بين الاستجابات الناتجة عن المركبات والسلوكيات المرتبطة بالضغط. وبالتالي، فإن اعتماد أساليب التعامل والتدريب المتطورة ليس فقط هدفًا لضمان رفاهية القوارض المخبرية، بل يضمن أيضًا إنتاج نتائج بحث موثوقة وذات مصداقية.

في إطار مبادئ 3R-التنقيح، تلعب طرق الجرعات وأخذ العينات على القوارض أدوارًا محورية في تقليل تأثير الإجراءات التجريبية على الحيوانات المختبرية. ومن التحسينات الملحوظة في هذا الصدد تنفيذ أنابيب التغذية الفموية الناعمة التي تعطي الأولوية لراحة الحيوان، مما يقلل من احتمال الإصابة أو الانزعاج أثناء الجرعات. تثبت هذه الطريقة أنها مفيدة بشكل خاص عند إعطاء مواد قد تكون مهيجة أو جرعات متكررة، مما يضمن تجربة إنسانية وخالية من التوتر. نظرًا لأن القوارض غير قادرة على القيء، يُوصى باستخدام أقل حجم ممكن للطريق الفموي للإعطاء. وجد تيرنر وآخرون، 2012 أن التغذية عن طريق الفم لمحلولات مائية عند لا تؤثر سلبًا على رفاهية الفئران المخبرية التي تأقلمت مع التعامل [39]. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحقن الوريدي أو تحت الجلد، الخالي من القيود الجسدية، هي تحسينات حاسمة تخفف من الضيق المرتبط بأساليب التقييد التقليدية [40]. إن استخدام حيوانات مدربة جيدًا ومتعاونة يمكّن من إدارة الحقن.
بدون قيود، مما يعزز تجربة أكثر راحة وأقل نفورًا للقوارض. تقنية أخذ عينات الميكرو الشعيرية هي تحسين ملحوظ آخر لجمع كميات صغيرة من الدم، كافية للت quantification البيواناليتيكي مقارنة بالطرق التقليدية ذات الحجم الكبير [41]. تقلل هذه الطريقة من معاناة الحيوانات وتكوين الكدمات، باستخدام جزء فقط من حجم الدم التقليدي. إن إعطاء الأولوية لطرق أقل تدخلاً، مثل أخذ عينات من الوريد الذيل أو الوريد الصافن، بدلاً من أخذ عينات من خلف العين، يبرز الاعتبارات الأخلاقية [42]. أظهرت دراسة من ماير وآخرون (2020) أن تقنيات أخذ عينات الدم من الوريد الوجهي والجيوب خلف العين أثرت بشكل كبير على نشاط الفئران الحركي وسلوك القلق، بينما كان لنزيف الأوعية الدموية في الذيل تأثير ضئيل على المعايير الفسيولوجية والسلوكية المقيمة [43]. لا تحافظ التقنيات الأقل تدخلاً على رفاهية القوارض فحسب، بل تقلل أيضًا من خطر العدوى أو المضاعفات المرتبطة بالطرق الأكثر تدخلاً، مما يقلل في النهاية من استجابات الضغط الفسيولوجي للحصول على بيانات أكثر دقة وموثوقية [44]. علاوة على ذلك، من المرجح أن تظهر الحيوانات التي تعاني من ضغط أقل أثناء الجرعات وأخذ العينات تعاونًا أكبر في الإجراءات اللاحقة، مما يعزز جو البحث المواتي (الشكل 3).

تعتبر التقييم الفعال للألم وإدارته أساسًا لتخفيف معاناة الحيوانات وحماية رفاهيتها طوال رحلة البحث. سلوكان شائعان يُلاحظان في العديد من سلالات القوارض هما الحفر وبناء الأعشاش. ومع ذلك، عندما تعاني الفئران من ألم عصبي أو التهابي، أظهرت الأبحاث انخفاضًا في سلوك الحفر لديهم. يمكن تقييم هذا التغيير في السلوك بسهولة خلال الظروف التجريبية. من خلال استخدام مسكنات مناسبة، يمكن للباحثين تخفيف الانزعاج الناجم عن
التلاعبات التجريبية، التدخلات الجراحية، أو نماذج الأمراض، مما يدعو إلى نهج أكثر إنسانية ورحمة في أبحاث الحيوانات. إن سرعة بدء واستعادة التخدير الغازي، بالإضافة إلى مزايا إدارته غير الغازية، مفيدة بشكل خاص للإجراءات البسيطة؛ ومع ذلك، بالنسبة للجراحات الأكثر تعقيدًا وتوغلًا، يصبح تضمين المسكنات القابلة للحقن أمرًا حاسمًا. من المRemarkably، يكشف الجرعات الدقيقة من المسكنات الوريدية، مقارنة بالحقن الكبيرة داخل الصفاق، عن مزايا ملحوظة. أولاً، تسهل الجرعات الدقيقة الوريدية الإدارة الدقيقة والمستهدفة للمسكنات، مما يدعم نظام إدارة الألم بدقة وفعالية. تضمن هذه الاستراتيجية حصول الحيوانات على الجرعة المطلوبة من تخفيف الألم، مما يقلل من خطر الجرعات غير المثلى أو المفرطة. ثانيًا، تعتبر الحقن الوريدية أقل توغلاً من نظيراتها داخل الصفاق، مما يسبب إزعاجًا طفيفًا، باستثناء حجم السوائل الكبير المرتبط بالحقن داخل الصفاق، والذي يمكن أن يثقب في بعض الأحيان الأعضاء الداخلية.
يجب تشجيع الباحثين على استكشاف استراتيجيات بديلة لإدارة الألم، مثل التخدير الموضعي أو المسكنات متعددة الأنماط – وهي نهج يتضمن دمج مجموعة متنوعة من العوامل المسكنة لتحقيق تخفيف أكثر شمولاً للألم. يحمل هذا الاستراتيجية وعدًا في تقليل الجرعات الفردية من المسكنات، والحد من الآثار الجانبية، وتعزيز نتائج إدارة الألم بشكل عام. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري استخدام تقنيات تقييم الألم غير الغازية لقياس فعالية المسكنات ومراقبة حالة الألم لدى الحيوانات. يساعد التقييم المنتظم للإشارات السلوكية والفسيولوجية للألم، بما في ذلك التغيرات في النشاط، والوضعية، والت vocalization، والعلامات الحيوية، في تمييز مستوى الألم الذي تعاني منه الحيوانات، مما يسهل إجراء التعديلات اللازمة على بروتوكولات المسكنات.

تعد المراقبة المنتظمة والمنهجية لرفاهية الحيوان ضرورية لتحديد أي علامات على الضيق أو الألم أو الانزعاج، مما يمكّن الباحثين من التدخل بسرعة وتقديم الرعاية المناسبة. يجب استخدام مؤشرات رفاهية متنوعة، سلوكية وفسيولوجية، لتقييم رفاهية الحيوانات. قد تشمل المؤشرات السلوكية تغييرات في مستويات النشاط، والوضعية، والعناية الذاتية، والتفاعلات الاجتماعية، والسلوكيات الاستكشافية. يجب أيضًا مراقبة المؤشرات الفسيولوجية، مثل وزن الجسم، ودرجة الحرارة، ومعدل ضربات القلب، ومستويات الهرمونات، لتوفير رؤى حول الصحة العامة للحيوانات واستجاباتها للتوتر. علاوة على ذلك، يجب تشجيع الباحثين على استخدام تقنيات مراقبة متطورة تقلل من الاضطراب المحتمل للحيوانات. تسمح الطرق غير الغازية، مثل المراقبة عن بُعد وتسجيل الفيديو، للباحثين بمراقبة الحيوانات في بيئتها الطبيعية دون تدخل بشري مباشر، مما يقلل من التحيزات المحتملة المرتبطة بالتوتر في التقييم. يعد التدريب المنتظم للموظفين البحثيين في تقييم رفاهية الحيوان أمرًا حيويًا للتعرف على التغيرات الطفيفة في سلوك الحيوان والحالة البدنية، مما يمكّن من الكشف المبكر عن مشكلات الرفاهية والتدخل في الوقت المناسب.

يعد تحديد نقاط النهاية الإنسانية ضمن البروتوكولات التجريبية ممارسة محورية تهدف إلى التخفيف من الضيق والألم الشديد الذي تعاني منه الحيوانات المخبرية أثناء الدراسات. تحدد هذه النقاط العتبات التي يجب ألا تتعرض الحيوانات بعدها لمزيد من الإجراءات، مما يضمن أن رفاهيتها ورفاهيتها هي الأهم. من خلال مراقبة سلوك الحيوان، والمعايير الفسيولوجية، والصحة العامة عن كثب، يمكن للباحثين والأطباء البيطريين تحديد علامات الضيق أو المعاناة بشكل استباقي. على سبيل المثال، أظهر ديفيد وآخرون (2000) نهجًا منهجيًا باستخدام التقييم العددي، ووصف بسيط، وتسجيل علامات سريرية مثل الخمول أو فقدان الوزن الشديد، كعلامات موثوقة للوصول إلى نقاط النهاية الإنسانية في نماذج الأمراض القارضة. استخدم هذا النهج العلامات السريرية لقياس مدى انحراف الحالة البدنية والعقلية للحيوان عن الطبيعي، باستخدام شدة هذه الانحرافات كمعيار للتقييم. عند الوصول إلى هذه النقاط المحددة مسبقًا، يجب اتخاذ الإجراءات المناسبة، مثل إنهاء التجربة أو تنفيذ تدخلات فورية لتخفيف انزعاج الحيوانات. لا يتماشى هذا النهج فقط مع الاعتبارات الأخلاقية، بل يبرز أيضًا مسؤولية الباحثين في حماية رفاهية الحيوان.

عند انتهاء التجارب، فإن تنفيذ طرق إنسانية لقتل القوارض أمر في غاية الأهمية للحفاظ على المعايير الأخلاقية للتجارب على الحيوانات المخبرية. يجب أن تكون إجراءات القتل الرحيم سريعة وتقلل من الألم والضيق، بما يتماشى مع مبادئ 3R-تحسين. إن اتخاذ قرار بشأن كيفية قتل الحيوانات المخبرية أمر معقد ويجب أن يتضمن التشاور مع طبيب بيطري متخصص. أشار كلاركسون وآخرون (2022) إلى أن الطرق الجسدية مثل خلع العنق، والقطع، والارتجاج تثير مخاوف تتعلق بالرفاهية بسبب عدم الدقة المحتملة ومعدلات الفشل العالية، لذلك هناك حاجة إلى برامج تدريب ذات جودة عالية وأدوات متخصصة لتحسين معدلات النجاح والموثوقية. لضمان أن الطريقة المختارة مناسبة للحيوانات البحثية وأهداف الدراسة، فإن إجراء ‘دراسة أولية’ هو وسيلة جيدة لتحديد الطريقة الأكثر ملاءمة للقتل الرحيم للدراسة المحددة ومجموعات القوارض. بعد القتل الرحيم، يجب إجراء التخلص السليم من الجثث مع مراعاة الأمن الحيوي والأثر البيئي. الالتزام بهذه البروتوكولات الإنسانية للقتل الرحيم ليس فقط التزامًا أخلاقيًا، بل يبرز أيضًا الالتزام بالحفاظ على أعلى معايير رعاية الحيوان ورفاهيته طوال عملية البحث.

تلعب لجان رعاية الحيوان والأخلاقيات دورًا حاسمًا في مراجعة والموافقة على بروتوكولات البحث التي تشمل تجارب على الحيوانات، مما يضمن أن جميع التجارب تفي بأعلى المعايير الأخلاقية وتلتزم بالتشريعات ذات الصلة. لا يضمن التعاون مع هذه اللجان الامتثال للإرشادات الأخلاقية فحسب، بل يعزز أيضًا جودة وموثوقية نتائج البحث. تسهل لجان الأخلاقيات الحيوانية أيضًا مبادرات التدريب والتعليم للباحثين لتعزيز الوعي وفهم مبادئ 3R-تحسين. على سبيل المثال، يلعب مركز 3Rs في أوروبا دورًا مهمًا في تعزيز مبادئ 3R-تحسين ضمن المشهد العلمي في أوروبا. من خلال التعاون مع الباحثين والمؤسسات والهيئات التنظيمية، تسهل هذه المراكز نشر أفضل الممارسات، وتبادل المعرفة، وتطوير طرق مبتكرة تعطي الأولوية لرفاهية الحيوان. لذلك، من خلال الانخراط مع لجان رعاية الحيوان، يمكن للباحثين ضمان أن تجاربهم تتماشى مع المعايير الأخلاقية، وتعطي الأولوية لرفاهية الحيوان، وتساهم في تقدم العلم مع تقليل معاناة الحيوانات.

الجدول الملخص أدناه (الجدول 2) يلخص المكونات الرئيسية لمبادئ 3R-تحسين، مقدماً نظرة شاملة على الممارسات الأخلاقية في أبحاث الحيوانات المخبرية، بدءًا من وصول الحيوانات وتكيفها إلى إجراءات القتل الرحيم.

بروتوكول 3R-تحسين له تأثير عميق على أبحاث الحيوانات المخبرية، مما يؤدي إلى فوائد عديدة لكل من الحيوانات والباحثين. إن التأثير والفوائد لبروتوكول 3R-تحسين كما هو موضح أدناه يبرز الدور الحاسم للاعتبارات الأخلاقية في أبحاث الحيوانات المخبرية، مما يعزز علاقة ودية بين التقدم العلمي ورفاهية الحيوانات.

معاملة الحيوانات المختبرية كزملاء ذوي قيمة، بدلاً من كونها مجرد مواضيع بحث، تعزز نهجًا إيجابيًا ومحترمًا تجاه رعايتها والتعامل معها. من خلال اعتماد منهجيات وممارسات متطورة، يعطي الباحثون الأولوية للمعاملة الإنسانية للحيوانات، مما يقلل من الضغوط والمعاناة المحتملة خلال الإجراءات التجريبية. يؤدي هذا النهج إلى تحسين الرفاهية النفسية، كما يتضح من انخفاض مستويات التوتر والقلق في الحيوانات المختبرية. مبادئ 3R-تحسين لا تتماشى فقط مع الاعتبارات الأخلاقية ولكنها تؤثر أيضًا بشكل إيجابي على الرفاهية العاطفية والفسيولوجية للحيوانات المختبرية، مما يعزز في النهاية نهجًا أكثر إنسانية ومسؤولية تجاه أبحاث الحيوانات.

تطبيق بروتوكول 3R-التنقيح يجلب فوائد كبيرة للمجتمع العلمي، لا سيما من حيث تحسين الصلاحية العلمية والموثوقية في أبحاث الحيوانات المخبرية. من خلال الالتزام بهذه المبادئ، يمكن للباحثين تحسين المنهجيات التجريبية، مما يؤدي إلى تقليل العوامل المربكة المحتملة وزيادة دقة البيانات. إن اعتماد تقنيات محسنة وإجراءات غير جراحية يقلل من الاستجابات المرتبطة بالتوتر في الحيوانات، مما يوفر تمثيلاً أكثر دقة للتأثيرات البيولوجية الحقيقية التي يتم دراستها. هذا لا يسهم فقط في تحسين قابلية التكرار والاتساق في نتائج الأبحاث، بل يزيد أيضًا من قوة النتائج العلمية بشكل عام. علاوة على ذلك، تشجع مبادئ 3R-التنقيح على استخدام مجموعات التحكم المناسبة، والتوزيع العشوائي، والتعمية، مما يعزز من الصلاحية الداخلية للتصاميم التجريبية. من خلال التحكم في التحيز المحتمل وتقليل مصادر عدم الاتساق، يمكن للباحثين تحقيق نتائج أكثر موثوقية ودقة.

تظهر تنفيذ بروتوكول 3R-التنقيح تأثيرات وفوائد كبيرة في تقليل التباين وأعداد الحيوانات في أبحاث الحيوانات المخبرية. من خلال اعتماد منهجيات وتقنيات مصقولة، يحصل الباحثون على بيانات أكثر دقة وموثوقية مع عدد أقل من الحيوانات. من خلال دمج التنقيح
في التصاميم التجريبية، يقلل الباحثون من مصادر التباين، مما يؤدي إلى نتائج أكثر اتساقًا وقابلية للتكرار. علاوة على ذلك، يشجع هذا الباحثين على احترام مبدأ 3R-التقليل، أي النظر بعناية في القوة الإحصائية لتجاربهم واستخدام الحد الأدنى من الحيوانات اللازمة لتحقيق نتائج ذات دلالة معنوية وإحصائية. لا يقلل هذا النهج من الاستخدام العام للحيوانات في البحث فحسب، بل يحسن أيضًا من كفاءة وفعالية التكاليف للدراسات العلمية. كما يعزز بروتوكول 3R-التنقيح تبادل أفضل الممارسات وتوحيد المنهجيات، مما يساهم بشكل أكبر في تقليل التباين التجريبي عبر مجموعات البحث المختلفة.

إن تنفيذ بروتوكول 3R-Refinement في أبحاث الحيوانات المخبرية له تأثير عميق على الحصول على ردود فعل إيجابية من الباحثين وموظفي رعاية الحيوانات. من خلال إعطاء الأولوية لرفاهية الحيوانات وتوظيف منهجيات محسّنة، يعزز البروتوكول ثقافة التعاطف والتفاني في الممارسات الأخلاقية بين الباحثين. يقدّر الباحثون الفرصة للعمل بأساليب إنسانية ورحيمة، والتي لا تتماشى فقط مع قيمهم الأخلاقية ولكنها تساهم أيضًا في إنتاج نتائج بحث موثوقة وذات مغزى. كما يشعر موظفو رعاية الحيوانات بالرضا، knowing أنهم يساهمون بنشاط في رفاهية وراحة الحيوانات تحت رعايتهم. تعكس ردود الفعل الإيجابية من كل من الباحثين وموظفي رعاية الحيوانات التزامًا مشتركًا بإعطاء الأولوية لرفاهية الحيوانات أثناء تقدم المعرفة العلمية.

إن اعتماد بروتوكول 3R-التنقيح يعد جزءًا أساسيًا من تعزيز ثقافة الممارسات البحثية الأخلاقية والرحيمة. تهدف هذه المبادرة إلى رفع مستوى رفاهية الحيوانات مع تعزيز الصلاحية العلمية للنتائج التجريبية، ويمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعة من التدابير الاستباقية كما هو موضح أدناه.

من خلال الانخراط النشط ومشاركة التجارب والمعرفة وأفضل الممارسات، يمكن للمؤسسات البحثية العمل معًا نحو تنفيذ مبادئ 3R-التنقيح بشكل أكثر فعالية. تعزز التعاون تبادل الأفكار والحلول المبتكرة من خلال إنشاء قواعد بيانات مشتركة، والبحث في الأدبيات البديلة، وما إلى ذلك، مما يسهل تطوير منهجيات مصقولة تعزز رفاهية الحيوانات وتقلل من التباين في نتائج البحث. تعزز هذه التعاونات نهجًا موحدًا لممارسات البحث الأخلاقي على الحيوانات، مما يضمن تحسين رفاهية الحيوانات.
الرفاهية، تعزيز الصلاحية العلمية، وتعزيز ممارسات البحث المسؤولة اجتماعيًا.

تلعب نشر أو انتشار أفضل الممارسات والإرشادات دورًا حاسمًا في تحقيق اعتماد واسع النطاق بين المؤسسات البحثية وأصحاب المصلحة. من خلال مشاركة تطبيقات ناجحة لمبادئ 3R-تحسين، يمكن للباحثين إلهام الآخرين ليتبعوا نفس النهج، مما يعزز ثقافة التعاطف والرعاية للحيوانات المختبرية. تعتبر المنشورات التي تمت مراجعتها من قبل الأقران منصات للباحثين لتقديم منهجياتهم المحسنة، وبيئات السكن الغنية، واستراتيجيات إدارة الألم الفعالة، مما يؤدي إلى تحسين رفاهية الحيوانات ونتائج بحث علمية قوية [68]. علاوة على ذلك، يمتد نشر أفضل الممارسات إلى ما هو أبعد من المنشورات الأكاديمية، حيث توفر الموارد وقواعد البيانات عبر الإنترنت مستودعًا لدراسات الحالة الناجحة والتقنيات المحسنة [67].

تعزيز اعتماد بروتوكول 3R-تحسين هو جهد متعدد الأبعاد، وتلعب برامج التدريب وورش العمل دورًا محوريًا في تحقيق هذا الهدف. توفر هذه المبادرات التعليمية منصة للباحثين وموظفي رعاية الحيوانات وأعضاء لجان الأخلاقيات للتعرف على مبادئ التحسين وتطبيقها العملي في أبحاث الحيوانات المخبرية [69]. تقدم برامج التدريب وورش العمل مساحة للنقاشات المفتوحة، وتبادل المعرفة، وتبادل الخبرات، مما يطور نهجًا تعاونيًا ومستنيرًا لأبحاث الحيوانات [70]. من خلال إشراك الخبراء في هذا المجال كمسهلين، تضمن هذه البرامج أن يتلقى المشاركون معلومات محدثة وإرشادات قائمة على الأدلة. بالإضافة إلى ذلك، تشجع هذه المبادرات الباحثين على تقييم تصاميمهم التجريبية بشكل نقدي واستكشاف طرق مبتكرة لتقليل معاناة الحيوانات مع الحفاظ على الصرامة العلمية.

تسهّل المشاركة النشطة للهيئات التنظيمية ولجان المراجعة الأخلاقية بشكل كبير تنفيذ بروتوكول 3R-تحسين. تلعب هذه المنظمات دورًا حاسمًا في تشكيل المشهد الأخلاقي لأبحاث الحيوانات المخبرية من خلال تطوير وتنفيذ إرشادات وسياسات تتماشى مع مبادئ 3R-تحسين [71]. تشجع مراقبتها الباحثين على تقييم تصاميمهم التجريبية بشكل نقدي، والنظر في أساليب التحسين، وتبرير عدد الحيوانات المستخدمة، مما يعزز في النهاية ثقافة البحث الأخلاقي والمسؤول عن الحيوانات [72]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للهيئات التنظيمية ولجان المراجعة الأخلاقية التعاون مع الباحثين وفنيي الحيوانات لتطوير
موارد تعليمية وبرامج تدريبية تقدم إرشادات حول التطبيق العملي لمبادئ 3R-تحسين. علاوة على ذلك، تسهل الملاحظات والتوصيات المقدمة من هذه الهيئات التحسين المستمر وتنقيح بروتوكولات البحث، مما يعزز الالتزام الجماعي برفاهية الحيوانات والسعي نحو التميز العلمي.

الإطار الشامل المقدم في هذه المراجعة يبرز أهمية مراعاة رفاهية الحيوانات في كل مرحلة من مراحل البحث، وتأثير هذه الممارسات على الحيوانات والمجتمع العلمي وطرق تنفيذها المحتملة. من خلال تبني بروتوكول 3R-تحسين، لا يلتزم الباحثون بأعلى المعايير الأخلاقية فحسب، بل يعززون أيضًا الجودة العلمية وصلاحية عملهم. يعزز هذا النهج ثقافة التعاطف والمسؤولية والتعاون بين الباحثين وموظفي رعاية الحيوانات والهيئات التنظيمية. من خلال تبني مبادئ التحسين، يمهد الباحثون الطريق لمستقبل تتعايش فيه العلوم المبتكرة والاعتبارات الأخلاقية، مما يعود بالنفع على كل من الإنسانية والحيوانات.

i.v. وريدية
i.p. داخل الصفاق

نشكر جميع موظفي الحيوانات لدينا على عملهم المخلص في 3R-تحسين في قسم السلامة الكيميائية والصيدلانية، معاهد الأبحاث RISE في السويد، سودرتاليا، السويد.

كتب P.R. المخطوطة. ساعد M.E. وI.C. وM.B في إعداد المخطوطة. قرأ جميع المؤلفين ووافقوا على المخطوطة النهائية.

لا ينطبق.

لا ينطبق.

لا توجد تضارب في المصالح لهذا العمل.

تاريخ الاستلام: 29 نوفمبر 2023 / تاريخ المراجعة: 19 مارس 2024 / تاريخ القبول: 20
مارس 2024
نشر على الإنترنت: 29 مارس 2024

Neurosci [Internet]. 2023 [cited 2024 Feb 16];17. Available from: https://www. frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fnbeh.2023.1256744.
33. Tang FMK, Lee RMF, Szeto RHL, Cheung JCT, Ngan OMY. Experiential learning with virtual reality: animal handling training. Innov Educ. 2020;2:2.
34. Swan J, Boyer S, Westlund K, Bengtsson C, Nordahl G, Törnqvist E. Decreased levels of discomfort in repeatedly handled mice during experimental procedures, assessed by facial expressions. Front Behav Neurosci. 2023;17:1109886.
35. Mieske P, Hobbiesiefken U, Fischer-Tenhagen C, Heinl C, Hohlbaum K, Kahnau P, et al. Bored at home?-A systematic review on the effect of environmental enrichment on the welfare of laboratory rats and mice. Front Vet Sci. 2022;9:899219.
36. Tryon SC, Sakamoto IM, Kellis DM, Kaigler KF, Wilson MA. Individual Differences in Conditioned Fear and extinction in female rats. Front Behav Neurosci. 2021;15:740313.
37. Õkva K, Tamoseviciute E, Ciziute A, Pokk P, Ruksenas O, Nevalainen T. Refinements for Intragastric Gavage in rats. Scand J Lab Anim Sci. 2014;33:243-52.
38. Wheatley JL. A gavage dosing apparatus with flexible catheter provides a less stressful gavage technique in the rat. Lab Anim (NY). 2002;31:53-6.
39. Turner PV, Vaughn E, Sunohara-Neilson J, Ovari J, Leri F. Oral gavage in rats: animal welfare evaluation. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2012;51:25-30.
40. Turner PV, Brabb T, Pekow C, Vasbinder MA. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2011;50:600-13.
41. Jonsson O, Palma Villar R, Nilsson LB, Norsten-Höög C, Brogren J, Eriksson M , et al. Capillary microsampling of blood for the determination of toxicokinetic parameters in regulatory studies in animals. Bioanalysis. 2012;4:661-74.
42. Diehl KH, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol JAT. 2001;21:15-23.
43. Meyer N, Kröger M, Thümmler J, Tietze L, Palme R, Touma C. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: taking the animal’s perspective. PLoS ONE. 2020;15:e0238895.
44. Lee G, Goosens KA. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. J Vis Exp. 2015;(99):e52766.
45. Flecknell P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Vet J. 2018;232:70-7.
46. Ahmadi-Noorbakhsh S, Farajli Abbasi M, Ghasemi M, Bayat G, Davoodian N, Sharif-Paghaleh E, et al. Anesthesia and analgesia for common research models of adult mice. Lab Anim Res. 2022;38:40.
47. Gargiulo S, Greco A, Gramanzini M, Esposito S, Affuso A, Brunetti A, et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 2012;53:E55-69.
48. Navarro KL, Huss M, Smith JC, Sharp P, Marx JO, Pacharinsak C. Mouse anesthesia: the art and science. ILAR J. 2021;62:238-73.
49. Turner PV, Pang DS, Lofgren JL. A review of Pain Assessment methods in Laboratory rodents. Comp Med. 2019;69:451-67.
50. Mayer J. Use of behavior analysis to recognize pain in small mammals. Lab Anim (NY). 2007;36:43-8.
51. Bloomsmith MA, Perlman JE, Hutchinson E, Sharpless M. Behavioral Management Programs to Promote Laboratory Animal Welfare. In: Weichbrod RH, Thompson GA (Heidbrink), Norton JN, editors. Manag Anim Care Use Programs Res Educ Test [Internet]. 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2018 [cited 2023 Oct 6]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. gov/books/NBK500424/.
52. Do JP, Defensor EB, Ichim CV, Lim MA, Mechanic JA, Rabe MD, et al. Automated and Continuous Monitoring of Animal Welfare through Digital Alerting. Comp Med. 2020;70:313-27.
53. Kunczik J, Barbosa Pereira C, Zieglowski L, Tolba R, Wassermann L, Häger C, et al. Remote vitals monitoring in rodents using video recordings. Biomed Opt Express. 2019;10:4422-36.
54. Stokes WS. Humane endpoints for laboratory animals used in regulatory testing. ILAR J. 2002;43 Suppl:S31-38.
55. Morton DB. A systematic Approach for establishing Humane endpoints. ILAR J. 2000;41:80-6.
56. Demers G, Griffin G, De Vroey G, Haywood JR, Zurlo J, Bédard M. Animal research. Harmonization of animal care and use guidance. Science. 2006;312:700-1.
57. Leary S, Pharmaceuticals F, Underwood W, Anthony R, Cartner S, Johnson CL et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. American Veterinary Medical Association, 2020. https://www.avma.org/sites/default/ files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020. Accessed 19 March 2024.
58. Clarkson JM, Martin JE, McKeegan DEF. A review of methods used to kill laboratory rodents: issues and opportunities. Lab Anim. 2022;56:419-36.
59. Hagelin J, Hau J, Carlsson H-E. The refining influence of ethics committees on animal experimentation in Sweden. Lab Anim. 2003;37:10-8.
60. Fenwick N, Griffin G, Gauthier C. The welfare of animals used in science: how the three rs ethic guides improvements. Can Vet J. 2009;50:523-30.
61. Neuhaus W, Reininger-Gutmann B, Rinner B, Plasenzotti R, Wilflingseder D, De Kock J, et al. The current status and work of three rs centres and platforms in Europe. Altern Lab Anim ATLA. 2022;50:381-413.
62. Garner JP. Stereotypies and other abnormal repetitive behaviors: potential impact on validity, reliability, and replicability of scientific outcomes. ILAR J. 2005;46:106-17.
63. Poole T. Happy animals make good science. Lab Anim. 1997;31:116-24.
64. Aske KC , Waugh CA . Expanding the 3 R principles: more rigour and transparency in research using animals. EMBO Rep. 2017;18:1490-2.
65. Törnqvist E, Annas A, Granath B, Jalkesten E, Cotgreave I, Öberg M. Strategic focus on principles reveals major reductions in the Use of animals in Pharmaceutical Toxicity Testing. PLoS ONE. 2014;9:e101638.
66. Thomas D. Laboratory animals and the art of empathy. J Med Ethics. 2005;31:197-202.
67. Bratcher NA, Reinhard GR. Creative implementation of 3 Rs principles within industry programs: beyond regulations and guidelines. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2015;54:133-8.
68. Nawroth C, Krause ET. The Academic, Societal and Animal Welfare Benefits of Open Science for Animal Science. Front Vet Sci [Internet]. 2022 [cited 2023 Oct 6];9. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/https://doi. org/10.3389/fvets.2022.810989.
69. Hagelin J, Carlsson HE, Hau J. The importance of student training in experimental procedures on animals in biomedical education. Scand J Lab Anim Sci. 2000;27:35-41.
70. Ahmadi-Noorbakhsh S, Sadighi J, Hatami Z, Shamsi Gooshki E. A proposed framework for holding intensive 3Rs workshops in laboratory animal science. Lab Anim Res. 2022;38:10.
71. Ethics committees for. laboratory animals: a basis for their composition and function / Maggy Jennings. [Internet]. Wellcome Collect. [cited 2023 Oct 6]. Available from: https://wellcomecollection.org/works/uzfrfg4z.
72. Hau J, Carlsson HE, Hagelin J. Animal research. Ethics committees have influenced animal experiments in Sweden. BMJ. 2001;322:1604.

تظل Springer Nature محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

Keywords 3R-Refinement principles, Scientific validity, Animal welfare, Research quality, Ethical considerations

Animal research has been pivotal in advancing scientific knowledge and medical breakthroughs, contributing significantly to our understanding of complex biological processes and human diseases [1]. However, with the privilege of conducting research on animals comes a profound responsibility to ensure the ethical treatment and welfare of the animals involved. In recognition of this responsibility, the 3 R principles have emerged as a

fundamental framework to guide researchers in conducting animal experiments ethically within research institutes. The 3R principles, introduced by Russell and Burch in 1959, advocate for the Replacement, Reduction, and Refinement of animal use in research [2]. While Replacement and Reduction focus on exploring alternative methods and minimizing the number of animals used, Refinement pertains to techniques that alleviate pain, distress, and suffering experienced by animals during experimentation [3]. By emphasizing the 3R-Refinement principles, researchers can seek to enhance animal welfare without compromising scientific integrity, resulting in more humane and reliable research outcomes.
The central objective of the refinement protocol is to strike a delicate balance between elevating the welfare
of laboratory animals and refining the rigor of scientific investigations. Rats and mice, due to their genetic similarities with humans, rapid reproduction, cost-effectiveness, and ease of handling, are fundamental in scientific research and favorable for 3R-Refinement considerations. This review article, therefore, primarily focuses on these species, exploring refinement methods tailored to their unique characteristics. By carefully examining the key components of the refinement principles, this article reveals a comprehensive outline for their implementation across various stages of animal experiments. It focuses on creating enriched housing environments that mitigate stress and promote natural behaviors, adopting non-restraint methods for handling and training to foster trust and cooperation, and employing refined dosing and sampling techniques that prioritize the comfort of the animals [4, 5]. Apart from these, pain management and euthanasia techniques are crucial in maintaining animal welfare and ethical standards [6, 7]. To ensure continual animal welfare, regular monitoring and assessment are essential to gauge the well-being of the animals during the experiment. Collaboration with animal ethics committees fosters ethical research culture, while adhering to guidelines and regulations ensures responsible, transparent research practices. By embracing the 3R-Refinement principles, researchers can significantly impact animal welfare, improve the scientific validity and reliability of their findings, and reduce variability and the number of animals used [8]. In promoting the widespread adoption of Refinement practices, this article explores the value of collaboration with other research laboratories, sponsors and stakeholders, the dissemination of best practices and guidelines, the implementation of training programs and workshops, and the role of regulatory bodies and ethical review committees [9].

Overall, implementing the 3R-Refinement principles in rodent experiments is not only ethically crucial but also essential for enhancing the credibility and impact of scientific research. By adhering to these principles, researchers can strike a harmonious balance between scientific progress and compassionate treatment of laboratory rodents, ultimately advancing knowledge and bettering animal welfare in research institutes.

The 3R-Refinement principles constitute a pivotal framework in the pursuit of ethical and responsible laboratory animal research. The following key components of this protocol encompass various aspects that prioritize the welfare of laboratory animals while upholding scientific rigor.

The arrival of animals at a research facility marks the initial step in their journey within the experimental setting, and a well-structured protocol for unpacking animals is paramount to their welfare. A crucial aspect of unpacking involves ensuring proper disinfection to prevent crosscontamination between shipments of animals with varying health statuses. To address this, Loew (1980) suggests scheduling shipments from different sources to arrive on separate days [10]. Additionally, any abnormal findings with the animals should be promptly reported to the supplier or institution, and veterinarians at the receiving institute should conduct frequent observations within the first 24 to 48 h of receipt [11]. Establishing health monitoring procedures during quarantine for newly received animals is crucial to ensure their compatibility with institutional requirements. Quarantine duration and monitoring intensity may vary based on the animals’ source and its reliability [10].

Proper acclimatization mitigates stress and allows animals to adapt to their new environment, ensuring the reliability and ethicality of subsequent experiments [10]. It involves careful considerations, such as providing a conducive housing environment, tailored nutrition, and allowing for social interactions when applicable. Gradual acclimation to new environmental variables, such as food and water consumption, is essential; for instance, it has been documented that these factors are impacted during transfer to a different facility and typically take 3 to 5 days to normalize [12]. According to Gordon (2004), variations in cage construction and bedding type influence the maintenance of body temperature in mice as the animals consistently adapt to changes in the ambient environment [13]. Steady acclimatization after stressful transportation allows animals to familiarize themselves with the vivarium’s sounds, smells, and the presence of caretakers, all contributing to reduced stress levels [14]. Animals should be afforded a sense of safety when approaching animal technicians, while technicians should possess the ability to interpret animal cues and attentively observe their responses during interactions. Avishai-Eliner et al. (2002) demonstrates that regularly handling research animals during their early life, and particularly habituating them to a gentle treatment during this period, leads to decreased handling stress in later stages [15]. By adopting gentle handling and providing a calm environment, researchers can establish a positive rapport with the animals, setting the tone for humane and ethical treatment throughout their stay in the research institute.

Enriched housing environment not only promotes animal welfare but also has potential implications for research outcomes. Use of large cage spaces (e.g., repurposing
rabbit cages for housing rats and rat cages for mice) allow rodents to engage in natural behaviors, including exploration, climbing, nesting, and burrowing, thus reducing stress, and promoting a more naturalistic living environment [16, 17]. Furthermore, the benefits of social housing for rodents cannot be understated. Group-housed rodents are more likely to experience positive social interactions, which can lead to reduced aggression and improved social skills [18]. However, it is essential to consider individual preferences and behavioral dynamics after forming and observing the social groups, as the compatibility of cage mates can significantly impact their well-being [19]. Incorporating a variety of enrichment materials, such as chewable toys, nesting material, hiding places, climbing/balancing challenges (e.g., trapeze swing, running wheels, ladders), digging possibilities, search for food options, social contacts etc. provide rodents with opportunities for mental stimulation and physical exercise [20, 21] (Fig. 1). These enrichments help prevent stereotypic behaviors that may arise from monotonous housing conditions, ultimately improving the animals’ emotional resilience and cognitive abilities [22]. While providing enrichment, it is crucial to regularly assess and rotate these items to maintain their novelty and effectiveness. Observation boxes create a semblance of open space for animals within a controlled environment allowing them to experience a more enriched setting, enhancing their overall well-being. They also serve as a valuable space for studying animals’ behavior and interactions. Researchers can closely analyze animal’s responses to different stimuli and monitor the effects of previous interactions. Thus, acknowledging the significance of providing stimulating and supportive living conditions for rodents
fosters a friendly balance between ethical responsibilities and scientific advancement in research settings.
In certain situations, experiments may require smaller cages due to specific research needs or spatial constraints, which could limit the consistent application of enriched environments. This potential incompatibility between the ideal and the practical aspects of rodent housing across all experimental conditions underscores the importance of a subtle approach. This approach recognizes the varied demands of experiments while striving for optimal animal welfare within existing constraints. Benefiel et al. (2005) clearly advocated the improved animal welfare but also suggested that environmental enrichment has the potential for causing an increase in experimental variability and research outcomes [23]. Toth et al. (2011) highlighted that enriched environments should be carefully designed as to leave experimental results unaltered and recommended the evaluation of enrichment on an exper-iment-to-experiment basis [24]. Enrichment strategies, such as large and open cage environments, are particularly beneficial for experiments focused on toxicology, toxicity assessment, safety pharmacology, or behavioral studies to access the effects of novel drugs on experimental animals. While providing rodents with opportunities for natural behaviors, and social interactions, these settings enhance the reliability and relevance of in-life phase findings in these domains. However, practical challenges emerge, especially in smaller animal facilities with limited resources, where strict environmental controls, such as those needed for infection studies, may conflict with the implementation of large cage spaces. Acknowledging these constraints is crucial for researchers to thoughtfully apply enrichment strategies aligned with experimental

goals, ensuring ethical and effective utilization in diverse contexts.

Prioritizing non-restraint techniques for handling rodents holds paramount importance, as it effectively mitigates stress and anxiety during experimental procedures [25]. These approaches involve training rodents to willingly engage in procedures, sidestepping the need for physical restraint or forceful manipulation. Notably, tunnel handling has gained prominence in non-restraint methods; animals are gently guided into small tunnels (which can be provided in the home cage as an enrichment source and later can be used as a tool for handling), replacing tail grasping [25]. Sensini et al. (2020) found that mice favored exploring tunnels over interacting with the experimenter’s hands, displaying positive behaviors like touching and climbing while showing less defensive burrowing, highlighting a clear preference for tunnel exploration [26]. Henderson et al. (2020) demonstrated that mice handled through tunnel interactions exhibited heightened willingness to engage with handlers and decreased anxiety levels in behavioral tests even after repeated restraint, contrasting with those handled by their tails [27]. Also, use of a mouse lift, hand cup or other similar things to lift the animals from their home cage can also prove to be helpful. Conversely, tail handling, known to trigger fear and stress reactions, can negatively impact both experimental outcomes and animal welfare [28]. Therefore, adopting non-restraint methods not only respects animals’ autonomy but also curtails injury and potential discomfort during handling. Furthermore, incorporating specialized materials such as fleece bedding or plush mat which are designed for animals to
rest on can help to establishe a soft and comfortable place for rodents during training and dosing procedures. This fleece bedding, indicative of animal’s own bedding, not only provides familiarity and comfort but also nurtures natural behaviors. Similarly, introducing fleecy autoclavable bedding in weighing boxes creates a calm and stress-free environment during weighing, simultaneously ensuring hygiene through autoclaving, aligning seamlessly with research standards [29]. Therefore, refined handling of rodents enhances their trust, reduces stress, and ensures cooperative behavior, crucial for accurate scientific observations and ethical treatment (Fig. 2).
Training animals before experimentation establishes trust and cooperation, ensuring that they are calm and willing to participate, leading to smoother procedures, reduced stress levels, and more reliable research outcomes. There are specific training methods for rodents that align with the principles of refinement, focusing on gentle handling, positive reinforcement, and reduced stress during procedures (Table 1).
Training of the laboratory animals (approximately times) upon their arrival can be divided into following different sessions which are critical for ensuring their involvement throughout the future experiments.
First training session: When laboratory animals first arrive at an animal facility, their initial training and handling plays a crucial role in their subsequent welfare. Scientific research provides valuable insights into the importance of structured training protocols during this critical period. An article by Swan et al. (2023) emphasizes the significance of gentle handling in the training of laboratory animals [34]. The article features the importance of general training and gentling protocols in contributing to the animals’ overall well-being and

adaptability to the common laboratory procedures. Furthermore, a review by Mieske et al. (2022) highlights the impact of stimulating living environment using cognitive stimulation and mental training in laboratory rodents greatly benefits their welfare status [35]. Therefore, such type of training if given during the initial phase of acclimatization can greatly reduce the stress levels in experimental rodents.

In addition to these, understanding animal natural behaviors is crucial during the first training period. Animals fear novelty, odors, noise, sudden movements, pain, and a lack of control, exhibiting aversive behaviors such as freezing, fleeing, vocalizing, and altering body positions [36]. Recognizing varying fear levels in different animals can enhance the relevant observations during the training period. Early interactions should prioritize gentle stroking and playful handling, promoting the perception of friendly staff and their safe hands. Thus, the initial training session aims to foster trust and recognition, while observing individual stress reactivity and potential outliers. By incorporating gentle handling, mental stimulation, and understanding the animal’s natural fear response, researchers can promote the acclimatization and well-being of laboratory animals.

Subsequent training sessions: During these sessions, the primary focus shifts towards preparing animals for
upcoming procedures. It’s essential to review the study protocol to identify specific body parts requiring extra handling and to introduce animals to necessary equipment. For instance, if oral dosing is planned, animals should be trained with the dose grip. By the last training session, a gentle introduction of water through a soft oral feeding tube is recommended. Training should encompass various sampling techniques as well. For example, if blood collection involves the tail vein, the tail should be stroked more often and gently pricked. In the case of saphenous vein sampling, animals should become accustomed to technician grips and the sound of the shaving machine. If restrainer tubes needed to be employed, such as for inhalation studies, animals should get familiarized with them before the first restraint procedure. The restrainer can be placed in the home cage of the animals for few days, to allow the animals to freely enter and explore the tube, so they get familiar with it. The goal of the final training session is for animals to exhibit calmness, relaxation, and curiosity.

Investing time in training rodents before commencing a study proves to be a time-saving measure. It prevents challenges during dosing and sampling procedures arising from stressed animals, offering instead a cooperative behavior. This familiarity enables technicians to accurately observe animal behavior during the study, differentiating between compound-induced responses and stress-related behaviors. Consequently, adopting refined handling and training methods is not only an objective to ensure welfare of laboratory rodents but also guarantees the production of dependable and credible research findings.

Within the framework of the 3R-Refinement principles, rodent dosing and sampling methods play pivotal roles in minimizing the impact of experimental procedures on laboratory animals. A notable refinement in this regard involves the implementation of soft oral feeding tubes which prioritize animal comfort, reducing the likelihood of injury or discomfort during dosing [37]. This approach proves particularly advantageous when administering potentially irritant substances or repeated doses, ensuring a humane and stress-free experience [38]. Since the rodents are unable to vomit, therefore, using the smallest volume possible is recommended for the oral route of administration. Turner et al., 2012 found that orogastric gavage of aqueous solutions at does not negatively affect the welfare of laboratory rats acclimated to handling [39]. Additionally, intravenous, or subcutaneous injections, free from physical restraint, are crucial refinements that alleviate distress linked with traditional restraint methods [40]. Employing well-trained and cooperative animals enables injection administration
without restraint, fostering a more comfortable and less aversive encounter for the rodents. The capillary micro-sampling technique is another noteworthy refinement for collecting small blood volumes, sufficient for the bioanalytic quantification in contrast to traditional large-volume methods [41]. This approach reduces animal suffering and hematoma formation, utilizing only a fraction of the conventional blood volume. Prioritizing less invasive methods, such as tail vein or saphenous vein sampling, over retro-orbital sampling, underscores ethical considerations [42]. Study from Meyer et al. (2020) showed that the blood sampling techniques from the vena facialis and retrobulbar sinus significantly affected mouse locomotor activity and anxiety-related behavior, while tail vessel bleeding had minimal impact on assessed physiological and behavioral parameters [43]. Minimally invasive techniques not only uphold rodent welfare but also mitigate infection or complications tied to more invasive methods, ultimately diminishing physiological stress responses for more accurate and reliable data [44]. Furthermore, animals experiencing reduced stress during dosing and sampling are likely to exhibit heightened cooperation in subsequent procedures, fostering a favorable research atmosphere (Fig. 3).

Effective pain assessment and management stands as a basis for mitigating animals’ suffering and safeguarding their welfare throughout the research journey. Two commonly observed behaviors in many rodent strains are digging and nest building. However, when rats are experiencing neuropathic or inflammatory pain, research has demonstrated a decrease in their digging behavior [45]. This change in behavior can be easily evaluated during experimental conditions. Employing suitable analgesics, researchers can soften discomfort arising from
experimental manipulations, surgical interventions, or disease models, thereby advocating a more compassionate and humane approach to animal research [46, 47]. Gaseous anesthesia’s quick induction and recovery, along with its non-invasive administration advantages, are especially beneficial for minor procedures; however, for more complex and invasive surgeries, the inclusion of injectable analgesics becomes crucial [48]. Remarkably, micro-dosing of intravenous (i.v.) analgesics, as contrast to extensive intraperitoneal (i.p.) injections, unveils notable advantages. Primarily, i.v. micro-dosing facilitates precise, targeted analgesic administration, underpinning an accurate and effective pain management regimen. This strategy assures animals receive the requisite pain relief dose, mitigating the risk of suboptimal or excessive dosing. Secondly, i.v. injections, being less invasive than i.p. counterparts, cause minimal discomfort, excluding the substantial fluid volume associated with i.p. injections, which can at times puncture internal organs.
Researchers should be encouraged to explore alternative pain management strategies, such as localized anesthesia or multimodal analgesia-an approach entailing the combination of diverse analgesic agents for more comprehensive pain alleviation. This strategy holds promise in potentially diminishing individual analgesic dosages, curbing side effects, and enhancing overall pain management outcomes. Besides, it is necessary to employ non-invasive pain assessment techniques for gauging analgesia efficacy and monitoring animals’ pain status [49]. Regular evaluation of behavioral and physiological pain cues, encompassing alterations in activity, posture, vocalization, and vital signs, aids in discerning the level of pain experienced by animals, facilitating adjustments to analgesic protocols as necessary [50].

Regular and systematic monitoring of animal welfare is essential to identify any signs of distress, pain, or discomfort, enabling researchers to promptly intervene and provide appropriate care. Various welfare indicators, both behavioral and physiological, should be utilized to assess the animals’ well-being. Behavioral indicators may include changes in activity levels, posture, grooming, social interactions, and exploratory behaviors [51]. Physiological indicators, such as body weight, temperature, heart rate, and hormone levels, should also be monitored to provide insights into the animals’ overall health and stress responses. Furthermore, researchers should be encouraged to employ refined monitoring techniques that minimize the potential disturbance to the animals [52]. Non-invasive methods, such as remote monitoring and video recording, allow researchers to observe animals in their natural environment without direct human interference, thus reducing potential stress-related biases in the assessment [53]. Regular training of research personnel in animal welfare assessment is vital to recognize subtle changes in animal behavior and physical condition, enabling early detection of welfare issues and timely intervention.

Establishing humane endpoints within experimental protocols is a pivotal practice aimed at mitigating extreme distress and pain experienced by laboratory animals during studies [54]. These endpoints outline the thresholds beyond which animals should not be subjected to further procedures, ensuring that their welfare and well-being are paramount. By closely monitoring animal behavior, physiological parameters, and overall health, researchers and veterinarians can proactively identify signs of significant distress or suffering. For instance, David et al. (2000) demonstrated a systemic approach using numerical rating, simple description, scoring clinical signs such as lethargy or severe weight loss, served as reliable indicators for reaching humane endpoints in rodent models of disease [55]. This approach utilized clinical signs to gauge the extent to which an animal’s physical and mental condition has deviated from the normal, using the severity of these deviations as an assessment criterion. When these predetermined endpoints are reached, appropriate actions must be taken, such as terminating the experiment or implementing immediate interventions to alleviate the animals’ discomfort [56]. This approach not only aligns with ethical considerations but also underscores the responsibility of researchers to safeguard animal welfare.

At the conclusion of experiments, the implementation of humane methods for rodent euthanasia is of paramount importance to uphold ethical standards for experiments on laboratory animals [57]. Euthanasia procedures should be swift and minimize pain and distress, aligning with the principles of 3R-Refinement. Deciding how to euthanize laboratory animals is complex and should involve consultation with a specialized veterinarian. Clarkson et al. (2022) highlighted that the physical methods like cervical dislocation, decapitation, and concussion raise welfare concerns due to potential inaccuracies and high failure rates therefore quality-controlled training programs and specialized tools are needed to improve success rates and reliability [58]. To ensure the chosen method is suitable for the research animals and the study’s goals, conducting a ‘preliminary study’ is a good way to determine the most appropriate euthanasia method for the specific study and groups of rodents [7]. Following euthanasia, proper disposal of carcasses should be carried out with consideration for biosecurity and environmental impact. Adhering to these humane protocols for euthanasia is not only a moral obligation but also underscores the dedication to maintaining the highest standards of animal care and welfare throughout the research process.

Animal Care and Ethics Committees play a crucial role in reviewing and approving research protocols involving animal experimentation, ensuring that all experiments meet the highest ethical standards and comply with relevant regulations [59]. Collaboration with these committees not only ensures compliance with ethical guidelines but also enhances the quality and validity of research outcomes. Animal Ethics Committees also facilitate training and education initiatives for researchers to promote awareness and understanding of the 3R-Refinement principles. The 3Rs Center of Europe, for example, holds a significant role in fortifying the 3R-Refinement principles within Europe’s scientific landscape [60]. Through collaboration with researchers, institutions, and regulatory bodies, these centers facilitate the dissemination of best practices, knowledge sharing, and the development of innovative methods that prioritize animal welfare. Therefore, by engaging with animal care committees, researchers can ensure that their experiments adhere to ethical standards, prioritize animal welfare, and contribute to the advancement of science while minimizing animal suffering.

The summarized table below (Table 2) encapsulates key components of the 3R-Refinement principles, offering a comprehensive overview of ethical practices in laboratory animal research, ranging from animal arrival and acclimatization to euthanasia procedures.

The 3R-Refinement protocol has a profound impact on laboratory animal research, leading to numerous benefits for both animals and researchers. The impact and benefits of the 3R-Refinement protocol as discussed below underscore the critical role of ethical considerations in laboratory animal research, promoting a friendly relationship between scientific advancement and animal welfare.

Treating laboratory animals as valuable colleagues, rather than mere research subjects, fosters a positive and respectful approach towards their care and handling. By adopting refined methodologies and practices, researchers prioritize the humane treatment of animals, reducing potential distress and suffering during experimental procedures. This approach leads to improved psychological welfare, as evidenced by reduced stress and anxiety levels in laboratory animals [61]. The 3R-Refinement principles not only align with ethical considerations but also positively impact the emotional and physiological welfare of laboratory animals, ultimately fostering a more compassionate and responsible approach to animal research.

The implementation of the 3R-Refinement protocol brings about substantial benefits to the scientific community, particularly in terms of improved scientific validity and reliability in laboratory animal research. By adhering to these principles researchers can refine experimental methodologies, leading to a reduction in potential confounding factors and improved data accuracy [62]. The adoption of refined techniques and non-invasive procedures minimizes stress-related responses in animals, thereby provides a more accurate representation of the true biological effects being studied [63]. This not only contribute to better reproducibility and consistency of research outcomes but also increases the overall robustness of scientific findings. Moreover, the 3R-Refinement principles encourage the use of appropriate control groups, randomization, and blinding, further enhancing the internal validity of experimental designs. By controlling potential bias and minimizing sources of inconsistency, researchers can achieve more reliable and precise results.

The implementation of the 3R-Refinement protocol demonstrates significant impact and benefits on reducing variability and animal numbers in laboratory animal research. By adopting refined methodologies and techniques, researchers obtain more precise and reliable data with fewer animals. By incorporating refined
experimental designs, researchers minimize sources of variability, leading to more consistent and reproducible results [64]. Furthermore, this also encourage researchers to admire the 3 R-Reduction principle i.e., carefully consider the statistical power of their experiments and use the minimum number of animals necessary to achieve meaningful and statistically significant results. This approach not only reduce the overall use of animals in research but also improve the efficiency and costeffectiveness of scientific studies [65]. The 3R-Refinement protocol also promotes the sharing of best practices and standardization of methodologies, further contributing to a reduction in experimental variability across different research groups.

The implementation of the 3R-Refinement Protocol in laboratory animal research has a profound impact on eliciting positive feedback from researchers and animal care staff. By prioritizing animal welfare and employing refined methodologies, the protocol fosters a culture of empathy and dedication to ethical practices among researchers [66]. Researchers appreciate the opportunity to work with humane and compassionate approaches, which not only align with their ethical values but also contribute to the generation of reliable and meaningful research outcomes. Animal care staff also experience a sense of fulfillment, knowing that they are actively contributing to the well-being and comfort of the animals under their care. The positive feedback from both researchers and animal care staff reflects a shared commitment to prioritizing animal welfare while advancing scientific knowledge.

Adoption of the 3R-Refinement Protocol is integral to fostering a culture of ethical and compassionate research practices. This initiative aims to elevate animal welfare while enhancing the scientific validity of experimental outcomes and can be achieved through various proactive measures as discussed below.

By actively engaging with and sharing experiences, knowledge, and best practices, research institutions can collectively work towards implementing the 3R-Refinement principles more effectively. Collaboration fosters the exchange of innovative ideas and solutions through creation of common databases, alternative literature searches etc. which further facilitates the development of refined methodologies that enhance animal welfare and reduce variability in research outcomes [67]. These collaborations promote a harmonized approach to ethical animal research practices, ensuring improved animal
welfare, enhanced scientific validity, and the promotion of socially responsible research practices.

Propagation or spread of best practices and guidelines plays a crucial role in achieving widespread adoption among research institutions and stakeholders. By sharing successful implementations of the 3R-Refinement principles, researchers can inspire others to follow suit, fostering a culture of compassion and care for laboratory animals. Peer-reviewed publications serve as platforms for researchers to present their refined methodologies, enriched housing environments, and effective pain management strategies, resulting in improved animal welfare and scientifically robust research outcomes [68]. Furthermore, the dissemination of best practices extends beyond academic publications, with online resources and databases providing a repository of successful case studies and refined techniques [67].

Promoting the adoption of the 3R-Refinement protocol is a multifaceted endeavor, and training programs and workshops play a pivotal role in achieving this goal. These educational initiatives provide a platform for researchers, animal care staff, and ethics committee members to learn about the Refinement principles and their practical implementation in laboratory animal research [69]. Training programs and workshops offer a space for open discussions, knowledge sharing, and the exchange of experiences, developing a collaborative and informed approach to animal research [70]. By engaging experts in the field as facilitators, these programs ensure that participants receive up-to-date information and evi-dence-based guidelines. Besides, these initiatives encourage researchers to critically evaluate their experimental designs and explore innovative ways to reduce animal sufferings while maintaining scientific rigor.

Implementation of the 3R-Refinement protocol is greatly facilitated by the active involvement of regulatory bodies and ethical review committees. These organizations play a critical role in shaping the ethical landscape of laboratory animal research by developing and implementing guidelines and policies that align with the 3R-Refinement principles [71]. Their scrutiny encourages researchers to critically assess their experimental designs, consider refinement approaches, and justify the number of animals used, ultimately fostering a culture of ethical and responsible animal research [72]. Additionally, regulatory bodies and ethical review committees can collaborate with researchers and animal technicians to develop
educational resources and training programs that provide guidance on the practical implementation of the 3R-Refinement principles. Furthermore, the feedback and recommendations provided by these bodies facilitate continuous improvement and refinement of research protocols, promoting a collective commitment to animal welfare and pursuit of scientific excellence.

The comprehensive framework presented in this review features the significance of considering animal welfare at every stage of research, the influence of such practices on animals and scientific community and possible ways of its implementation. By embracing the 3R-Refinement Protocol, researchers not only uphold the highest ethical standards but also advance the scientific quality and validity of their work. This approach fosters a culture of empathy, responsibility, and collaboration among researchers, animal care staff, and regulatory bodies. By embracing the refinement principles, researchers pave the way for a future where innovative science and ethical considerations coexist, benefitting both humanity and the animals.

i.v. intravenous
i.p. intraperitoneal

All our animal staff are acknowledged for their dedicated 3R-Refinement work at the Department of Chemical and Pharmaceutical Safety, RISE Research Institutes of Sweden, Södertälje, Sweden.

P.R. wrote the manuscript. M.E., I.C. and M.B helped in the preparation of the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Not applicable.

Not applicable.

No conflicts of interest for this work.

Received: 29 November 2023 / Revised: 19 March 2024 / Accepted: 20
March 2024
Published online: 29 March 2024

Neurosci [Internet]. 2023 [cited 2024 Feb 16];17. Available from: https://www. frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fnbeh.2023.1256744.
33. Tang FMK, Lee RMF, Szeto RHL, Cheung JCT, Ngan OMY. Experiential learning with virtual reality: animal handling training. Innov Educ. 2020;2:2.
34. Swan J, Boyer S, Westlund K, Bengtsson C, Nordahl G, Törnqvist E. Decreased levels of discomfort in repeatedly handled mice during experimental procedures, assessed by facial expressions. Front Behav Neurosci. 2023;17:1109886.
35. Mieske P, Hobbiesiefken U, Fischer-Tenhagen C, Heinl C, Hohlbaum K, Kahnau P, et al. Bored at home?-A systematic review on the effect of environmental enrichment on the welfare of laboratory rats and mice. Front Vet Sci. 2022;9:899219.
36. Tryon SC, Sakamoto IM, Kellis DM, Kaigler KF, Wilson MA. Individual Differences in Conditioned Fear and extinction in female rats. Front Behav Neurosci. 2021;15:740313.
37. Õkva K, Tamoseviciute E, Ciziute A, Pokk P, Ruksenas O, Nevalainen T. Refinements for Intragastric Gavage in rats. Scand J Lab Anim Sci. 2014;33:243-52.
38. Wheatley JL. A gavage dosing apparatus with flexible catheter provides a less stressful gavage technique in the rat. Lab Anim (NY). 2002;31:53-6.
39. Turner PV, Vaughn E, Sunohara-Neilson J, Ovari J, Leri F. Oral gavage in rats: animal welfare evaluation. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2012;51:25-30.
40. Turner PV, Brabb T, Pekow C, Vasbinder MA. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2011;50:600-13.
41. Jonsson O, Palma Villar R, Nilsson LB, Norsten-Höög C, Brogren J, Eriksson M , et al. Capillary microsampling of blood for the determination of toxicokinetic parameters in regulatory studies in animals. Bioanalysis. 2012;4:661-74.
42. Diehl KH, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol JAT. 2001;21:15-23.
43. Meyer N, Kröger M, Thümmler J, Tietze L, Palme R, Touma C. Impact of three commonly used blood sampling techniques on the welfare of laboratory mice: taking the animal’s perspective. PLoS ONE. 2020;15:e0238895.
44. Lee G, Goosens KA. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. J Vis Exp. 2015;(99):e52766.
45. Flecknell P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Vet J. 2018;232:70-7.
46. Ahmadi-Noorbakhsh S, Farajli Abbasi M, Ghasemi M, Bayat G, Davoodian N, Sharif-Paghaleh E, et al. Anesthesia and analgesia for common research models of adult mice. Lab Anim Res. 2022;38:40.
47. Gargiulo S, Greco A, Gramanzini M, Esposito S, Affuso A, Brunetti A, et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 2012;53:E55-69.
48. Navarro KL, Huss M, Smith JC, Sharp P, Marx JO, Pacharinsak C. Mouse anesthesia: the art and science. ILAR J. 2021;62:238-73.
49. Turner PV, Pang DS, Lofgren JL. A review of Pain Assessment methods in Laboratory rodents. Comp Med. 2019;69:451-67.
50. Mayer J. Use of behavior analysis to recognize pain in small mammals. Lab Anim (NY). 2007;36:43-8.
51. Bloomsmith MA, Perlman JE, Hutchinson E, Sharpless M. Behavioral Management Programs to Promote Laboratory Animal Welfare. In: Weichbrod RH, Thompson GA (Heidbrink), Norton JN, editors. Manag Anim Care Use Programs Res Educ Test [Internet]. 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2018 [cited 2023 Oct 6]. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih. gov/books/NBK500424/.
52. Do JP, Defensor EB, Ichim CV, Lim MA, Mechanic JA, Rabe MD, et al. Automated and Continuous Monitoring of Animal Welfare through Digital Alerting. Comp Med. 2020;70:313-27.
53. Kunczik J, Barbosa Pereira C, Zieglowski L, Tolba R, Wassermann L, Häger C, et al. Remote vitals monitoring in rodents using video recordings. Biomed Opt Express. 2019;10:4422-36.
54. Stokes WS. Humane endpoints for laboratory animals used in regulatory testing. ILAR J. 2002;43 Suppl:S31-38.
55. Morton DB. A systematic Approach for establishing Humane endpoints. ILAR J. 2000;41:80-6.
56. Demers G, Griffin G, De Vroey G, Haywood JR, Zurlo J, Bédard M. Animal research. Harmonization of animal care and use guidance. Science. 2006;312:700-1.
57. Leary S, Pharmaceuticals F, Underwood W, Anthony R, Cartner S, Johnson CL et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. American Veterinary Medical Association, 2020. https://www.avma.org/sites/default/ files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020. Accessed 19 March 2024.
58. Clarkson JM, Martin JE, McKeegan DEF. A review of methods used to kill laboratory rodents: issues and opportunities. Lab Anim. 2022;56:419-36.
59. Hagelin J, Hau J, Carlsson H-E. The refining influence of ethics committees on animal experimentation in Sweden. Lab Anim. 2003;37:10-8.
60. Fenwick N, Griffin G, Gauthier C. The welfare of animals used in science: how the three rs ethic guides improvements. Can Vet J. 2009;50:523-30.
61. Neuhaus W, Reininger-Gutmann B, Rinner B, Plasenzotti R, Wilflingseder D, De Kock J, et al. The current status and work of three rs centres and platforms in Europe. Altern Lab Anim ATLA. 2022;50:381-413.
62. Garner JP. Stereotypies and other abnormal repetitive behaviors: potential impact on validity, reliability, and replicability of scientific outcomes. ILAR J. 2005;46:106-17.
63. Poole T. Happy animals make good science. Lab Anim. 1997;31:116-24.
64. Aske KC , Waugh CA . Expanding the 3 R principles: more rigour and transparency in research using animals. EMBO Rep. 2017;18:1490-2.
65. Törnqvist E, Annas A, Granath B, Jalkesten E, Cotgreave I, Öberg M. Strategic focus on principles reveals major reductions in the Use of animals in Pharmaceutical Toxicity Testing. PLoS ONE. 2014;9:e101638.
66. Thomas D. Laboratory animals and the art of empathy. J Med Ethics. 2005;31:197-202.
67. Bratcher NA, Reinhard GR. Creative implementation of 3 Rs principles within industry programs: beyond regulations and guidelines. J Am Assoc Lab Anim Sci JAALAS. 2015;54:133-8.
68. Nawroth C, Krause ET. The Academic, Societal and Animal Welfare Benefits of Open Science for Animal Science. Front Vet Sci [Internet]. 2022 [cited 2023 Oct 6];9. Available from: https://www.frontiersin.org/articles/https://doi. org/10.3389/fvets.2022.810989.
69. Hagelin J, Carlsson HE, Hau J. The importance of student training in experimental procedures on animals in biomedical education. Scand J Lab Anim Sci. 2000;27:35-41.
70. Ahmadi-Noorbakhsh S, Sadighi J, Hatami Z, Shamsi Gooshki E. A proposed framework for holding intensive 3Rs workshops in laboratory animal science. Lab Anim Res. 2022;38:10.
71. Ethics committees for. laboratory animals: a basis for their composition and function / Maggy Jennings. [Internet]. Wellcome Collect. [cited 2023 Oct 6]. Available from: https://wellcomecollection.org/works/uzfrfg4z.
72. Hau J, Carlsson HE, Hagelin J. Animal research. Ethics committees have influenced animal experiments in Sweden. BMJ. 2001;322:1604.

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.