محور الخلايا العدلة والخلايا العظمية يعزز تدمير العظام في التهاب اللثة The neutrophil–osteogenic cell axis promotes bone destruction in periodontitis

المجلة: International Journal of Oral Science، المجلد: 16، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38413562
تاريخ النشر: 2024-02-27

محور الخلايا العدلة والخلايا العظمية يعزز تدمير العظام في التهاب اللثة

يوتارو أندو ماسيوكي تسوكاساكي نام كونغ نات هوان شيزاو زانغ مينغلو يان ريونسوكي مورو كازوتاكا ناكامورا ماساتسوجو كوماتسوجا نوركو كوماتسو كازو أوكاموتو كينتا ناكانو تاداشي أوكامورا أكيرا ياماغوتشي كازويوكي إيشهارا وهيروشي تاكاياناجي

الملخص

تلعب تفاعلات خلايا المناعة والستروما دورًا رئيسيًا في الصحة والأمراض. في التهاب اللثة، وهو أكثر الأمراض المعدية شيوعًا لدى البشر، تتجمع خلايا المناعة في الغشاء المخاطي الفموي وتعزز تدمير العظام من خلال تحفيز تعبير عامل تنشيط مستقبلات عامل نواة كابا ب (RANKL) في الخلايا العظمية مثل الخلايا البانية للعظام وخلايا الرباط اللثوي. ومع ذلك، فإن الآلية التفصيلية التي تكمن وراء تفاعلات خلايا المناعة والعظام في التهاب اللثة ليست مفهومة تمامًا. هنا، قمنا بإجراء تحليل تسلسل RNA على مستوى الخلية الواحدة على آفات اللثة في الفئران وأظهرنا أن التفاعل بين العدلات والخلايا العظمية يشارك في فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة. أظهرت آفات اللثة تسللًا ملحوظًا للعدلات، واقترحت التحليلات الحاسوبية أن العدلات تفاعلت مع الخلايا العظمية من خلال إنتاج السيتوكينات. من بين السيتوكينات المعبر عنها في العدلات اللثوية، كان الأونكوساتين M (OSM) يحفز بشكل قوي تعبير RANKL في الخلايا البانية للعظام الأولية، وأدى حذف مستقبل OSM في الخلايا العظمية إلى تحسين كبير في فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة. حددت تحليلات البيانات الجينية الوبائية منطقة معزز RANKL المنظمة بواسطة OSM في الخلايا العظمية، وأظهرت الفئران التي تفتقر إلى هذا المعزز انخفاضًا في فقدان العظام اللثوي مع الحفاظ على التمثيل الغذائي العظمي الفسيولوجي. تسلط هذه النتائج الضوء على دور العدلات في تنظيم العظام خلال العدوى البكتيرية، مما يبرز الآلية الجديدة التي تكمن وراء التفاعل المناعي العظمي.

المجلة الدولية لعلوم الفم (2024) 16:18
https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8

مقدمة

تعتبر تجويف الفم بوابة إلى الجهازين الهضمي والتنفس، ويحتوي على ما يقدر بنحو 1000 نوع من البكتيريا. تؤدي اختلال التوازن في المجتمعات الميكروبية الفموية إلى تحفيز استجابات المناعة لدى المضيف وتسبب التهاب اللثة، وهو أكثر الأمراض المعدية انتشارًا بين البشر. التهاب اللثة هو السبب الرئيسي لفقدان الأسنان لدى البالغين ويؤثر أيضًا على العديد من الأمراض الجهازية بما في ذلك السكري، والالتهاب الرئوي، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والتهاب المفاصل الروماتويدي، ومرض الأمعاء الالتهابي. لذا، فإن الفهم التفصيلي للآليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء علم الأمراض المناعي في الغشاء المخاطي الفموي أمر حاسم لتطوير استراتيجيات علاجية ووقائية ضد التهاب اللثة وأمراضه المصاحبة.
لقد قدمت التقدمات الحديثة في تقنيات الأومكس متعددة الخلايا والمساحات صورة خلوية لآفات الغشاء المخاطي الفموي، مما ساهم بشكل حاسم في فهمنا لآلية المرض الكامنة وراء التهاب اللثة. أظهرت الدراسات السابقة أن خلايا المناعة المختلفة، بما في ذلك خلايا T، وخلايا B، والخلايا النخاعية، تتجمع في آفات التهاب اللثة وقد تتفاعل مع خلايا السدى مثل الخلايا الليفية والخلايا الظهارية. ومع ذلك، لم يتم إثبات الأهمية الحية لتفاعلات خلايا المناعة والستروما في التهاب اللثة من خلال أساليب فقدان الوظيفة، و
لا يزال غير واضح كيف تؤدي التفاعلات الخلوية المعقدة في النهاية إلى امتصاص العظام بواسطة الخلايا العظمية.
نماذج الحيوانات التجريبية هي أدوات حيوية للتحقيق في آليات نشوء الأمراض. نموذج الفأر لالتهاب اللثة الناتج عن الرباط هو الأكثر استخدامًا في هذا المجال، وقد كشفت دراسات فقدان الوظيفة الجينية باستخدام هذا النموذج أن خلايا المناعة المختلفة مثل خلايا T المساعدة 17 ( تلعب الخلايا دورًا أساسيًا في تدمير العظام اللثوية. مُنشط مستقبل عامل النواة- الليغاند (RANKL)، السيتوكين الرئيسي الذي يحفز تمايز وتنشيط الخلايا العظمية، يتم إنتاجه بشكل رئيسي بواسطة الخلايا العظمية بما في ذلك الخلايا البانية للعظم وخلايا الرباط السني (PDL) خلال التهاب اللثة. السيتوكينات الالتهابية مثل الإنترلوكين (IL17A/F) و IL-6 يحفزان تعبير RANKL في الخلايا العظمية وخلايا الرباط السني. ومع ذلك، فإن الحذف الجيني لهذه السيتوكينات يثبط فقط جزئيًا تدمير العظام الناتج عن التهاب اللثة، مما يشير إلى أن عوامل أخرى قد تساهم أيضًا في تحفيز RANKL في الخلايا العظمية. للحصول على صورة شاملة عن مسببات التهاب اللثة، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التفصيلية التي تكمن وراء تحفيز RANKL في الخلايا العظمية خلال الالتهاب اللثوي.
في هذه الدراسة، أظهرنا أن تفاعل العدلات مع خلايا تكوين العظام يعزز تدمير العظام في التهاب اللثة من خلال الأونكوساتين. إشارات مستقبلات OSMR. أظهرت تحليلات تسلسل RNA أحادي الخلية (scRNA-seq) لآفات اللثة في الفئران أن العدلات الالتهابية تراكمت بشكل ملحوظ في آفات اللثة. كانت العدلات الالتهابية تعبر عن OSM بشكل مرتفع، مما أدى بقوة إلى تحفيز تعبير RANKL في الخلايا العظمية. تم تثبيط فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة في الفئران التي تفتقر إلى مستقبلات OSMR الخاصة بالخلايا العظمية، مما يوضح الأهمية الحية لتواصل العدلات مع الخلايا العظمية بوساطة OSM. حددنا منطقة معزز RANKL المنظمة بواسطة OSM في الخلايا العظمية، وأظهرت الفئران التي تفتقر إلى هذا المعزز انخفاضًا في فقدان العظام اللثوي مع الحفاظ على التمثيل الغذائي العظمي الفسيولوجي. معًا، تكشف نتائج هذه الدراسة عن الآليات التفصيلية الكامنة وراء تلف العظام المرتبط بالتهاب اللثة، مما يوفر مثالًا جديدًا على تفاعلات الخلايا المناعية مع الخلايا الداعمة في الأمراض المعدية.

النتائج

المنظر الخلوي الفردي لآفات اللثة في الفئران
لفهم البيئة الدقيقة الخلوية التي تقف وراء تدمير العظام في اللثة بدقة خلوية واحدة، قمنا بإجراء تسلسل RNA أحادي الخلية باستخدام خلايا مستمدة من أنسجة اللثة لفئران تم تحفيز التهاب اللثة باستخدام الرباط بعد 7 أيام من وضع الرباط، عندما لوحظت التسلل الملحوظ للخلايا المناعية وتسارع تدمير العظام في الدراسات السابقة. أظهر تحليل التجميع القائم على الرسم البياني غير المراقب أن آفات اللثة في الفئران تتكون من خلايا مناعية (الخلايا المتعادلة، البلعميات، الخلايا، وخلايا B)، والخلايا الظهارية، وخلايا البطانة الوعائية (VEC)، والخلايا الجدارية، والخلايا العظمية (الشكل 1 أ، ب). قمنا بتعليق مجموعة الخلايا العظمية، التي تتميز بتعبير جينات العلامة لكل من الخلايا العظمية (Sp7 وRunx2) وخلايا PDL (S100a4 وPostn). نظرًا لأن خلايا PDL لديها قدرة عظمية وتعمل كمصدر محلي للخلايا العظمية في الجسم، فإنه من الصعب التمييز بدقة بين خلايا PDL والخلايا العظمية باستخدام بيانات التسلسل.
للحصول على رؤى حول دور تفاعلات خلايا المناعة والستروما في تدمير العظام المرتبط بالتهاب اللثة، قمنا بإجراء تحليل CellChat، وهو أداة كمية لقياس شبكات الإشارات بين الخلايا، باستخدام بيانات تسلسل RNA أحادي الخلية الخاصة بنا. قمنا بحساب متوسط شدة التفاعل بين خلايا المناعة وخلايا السدى، ووجدنا أن التفاعل بين العدلات والخلايا العظمية كان بارزًا بين التفاعلات الخلوية في الآفات اللثوية (الشكل 1c، الشكل التكميلي S1a). لقد تم توثيق التفاعل بين العدلات وخلايا بطانة الأوعية الدموية في مسببات مرض التهاب اللثة بشكل جيد من خلال دراسات سابقة. لكن لم يتم الإبلاغ عن دور التفاعل بين العدلات والخلايا العظمية في التهاب اللثة. نظرًا لأن الخلايا العظمية تمثل المصدر الرئيسي لـ RANKL في تلف العظام اللثوي، فقد ركزنا على محور العدلات والخلايا العظمية. أشارت بيانات تحليل CellChat إلى أن الخلايا العظمية تؤثر على العدلات من خلال التعبير عن عوامل مختلفة بما في ذلك جزيئات التصاق الخلايا والكيموكينات (الشكل التوضيحي S1b). يُقترح أن تأثير العدلات على الخلايا العظمية يعتمد إلى حد كبير على السيتوكينات التي تنتجها العدلات (الشكل 1d). لتقييم أهمية العدلات في تدمير العظام اللثوي في الجسم الحي، قمنا بتقليل العدلات عن طريق حقن جسم مضاد مضاد لـ Ly6G، مما أدى إلى تثبيط كبير لفقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة (الشكل 1e). تشير هذه النتائج إلى أن العدلات قد تتفاعل مع الخلايا العظمية من خلال إنتاج السيتوكينات وتعزز تدمير العظام في التهاب اللثة.
يحفز OSM التعبير عن RANKL في الخلايا العظمية. نظرًا لأن الخلايا العظمية تعمل كمصدر رئيسي لـ RANKL في فقدان العظام اللثوي، افترضنا أن العدلات قد تساهم في فقدان العظام اللثوي من خلال تحفيز التعبير عن RANKL
في الخلايا العظمية من خلال إنتاج السيتوكينات. قمنا بتحليل بيانات CellChat من خلال التركيز على التفاعل الذي يتوسطه السيتوكين بين العدلات والخلايا العظمية، ووجدنا أن عامل نخر الورم (TNF) و IL-1 و و OSM أظهرت كثافة تواصل عالية في شبكة العدلات والخلايا العظمية (الشكل 2a). يتم التعبير عن هذه السيتوكينات بشكل خاص في العدلات في الآفة اللثوية (الشكل 2b). من بين السيتوكينات الثلاثة، كان لدى OSM أقوى قدرة على تحفيز التعبير عن RANKL في الخلايا العظمية الأولية المشتقة من القحف في المختبر (الشكل 2c). أكدنا أن OSM يزيد بشكل كبير من التعبير عن RANKL العظمي على مستوى البروتين (الشكل 2d). أظهرت بيانات تحليل scRNA-seq لآفات اللثة البشرية أيضًا أن OSM و OSMR تم التعبير عنهما بشكل كبير في العدلات وخلايا PDL، على التوالي (الشكل 2e). اقترح تحليل CellChat أن محور OSM/OSMR يتوسط أيضًا التفاعل بين العدلات و PDL في آفات اللثة البشرية (الشكل 2f).
للتحقيق في أهمية إشارة OSMR في الخلايا العظمية في تلف العظام الناتج عن التهاب اللثة في الجسم الحي، قمنا بتزاوج الفئران التي تحمل OSMR-floxed مع فئران Sp7-Cre. في نسيج اللثة، تم إظهار أن Sp7-Cre يستهدف كل من الخلايا العظمية وخلايا PDL. نظرًا لأن إشارة OSMR في الخلايا العظمية تشارك في الأيض العظمي الفسيولوجي، استخدمنا نظام Sp7-tTA-tetO-Cre (Sp7-Cre) حيث يتم التعبير عن إنزيم Cre فقط عندما يرتبط المحفز المتحكم فيه بالتتراسيكلين (tTA) بعنصر استجابة للتتراسيكلين (tetO) في غياب الدوكسيسيكلين (Dox). تم علاج الفئران Sp7-Cre المتزاوجة مع الفئران OSMR-floxed منذ الفترة الجنينية باستخدام Dox، الذي تم سحبه عند عمر 4 أسابيع. لم يؤثر هذا البروتوكول على نمو الهيكل العظمي في الفئران (الشكل التوضيحي S2a-c). قمنا بتحفيز التهاب اللثة عند عمر 8 أسابيع، وتم تحليل العظام السنخية بعد 10 أيام من وضع الرباط. من الجدير بالذكر أن فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة تم تثبيطه بشكل كبير في الفئران Osmr flox/flox Sp7-Cre (الشكل 2g). تشير هذه النتائج إلى أن OSM المشتق من العدلات يرتبط بـ OSMR على الخلايا العظمية ويعزز التعبير عن RANKL، مما يبرز أهمية تفاعل العدلات مع الخلايا العظمية في تدمير العظام المرتبط بالتهاب اللثة.
تحديد منطقة معزز RANKL التي ينظمها OSM. يحفز OSM التعبير عن RANKL في الخلايا العظمية من خلال تنشيط عامل النسخ الناقل والمحفز للنسخ 3 (STAT3). بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن ثلاثة مواقع ربط لـ STAT3 upstream من موضع Tnfsf11، وهي RANKL distal enhancer 4 (RL-D4) و RL-D5 و RL-D6 (الشكل 3a). قمنا بتحليل مجموعات بيانات الإبيجينوم المتاحة علنًا من خلايا العظام العظمية للفئران ووجدنا أن علامات المعزز النشطة بما في ذلك أسيتيل هيستون H3 ليسين 27 (H3K27ac) و هيستون H3 ليسين 4 مونو ميثيلايشن (H3K4me1) و هيستون H4 ليسين 5 أسيتيل (H4K5ac) بالإضافة إلى قمة تسلسل الكروماتين القابل للوصول بواسطة الترانسبوزاز (ATAC-seq) كانت غنية في هذه المواقع المرتبطة بـ STAT3، مما يشير إلى أن هذه المناطق قد تعمل كمعززات نشطة في الخلايا العظمية.
في مجموعات البيانات البشرية، عرضت المنطقة المتماثلة لـ RL-D4 أعلى غنى لعلامات المعزز النشطة في الخلايا العظمية وخلايا PDL (الشكل 3b). أكدنا أن أنماط الربط لعوامل النسخ STAT كانت موجودة في المنطقة المتماثلة البشرية لـ RL-D4 (الشكل 3c). أظهرت الدراسات السابقة أن حذف RL-D5 أو RL-D6 يمنع جزئيًا التعبير عن RANKL المستحث بواسطة OSM في الخلايا العظمية، لكن أهمية RL-D4 في الأيض العظمي الفسيولوجي أو المرضي لم يتم استكشافها. لذلك، قمنا بتقييم دور منطقة RL-D4 في فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة من خلال إنشاء فئران تفتقر إلى منطقة RL-D4 باستخدام تقنية تحرير الجينوم المرتبطة بتكرارات متباينة منتظمة (CRISPR)/بروتين 9 المرتبط بـ CRISPR (Cas9). تم تأكيد النجاح في إنشاء فئران RL-D4-knockout (KO) من خلال تسلسل DNA Sanger (الشكل التوضيحي S3a). وُلدت فئران RL-D4-KO بالتردد المتوقع من مندل وعرضت
الشكل 1 تتفاعل العدلات مع الخلايا العظمية من خلال إنتاج السيتوكينات في التهاب اللثة. أ رسم تخطيطي لتقريب متعدد الأبعاد (UMAP) للخلايا من أنسجة اللثة لفئران التهاب اللثة الناتج عن الرباط . رسم نقطي لتعبير الجينات التمثيلية لكل مجموعة. تم توضيح كل نوع من الخلايا باستخدام هذه الجينات المميزة. ج خريطة حرارية تظهر كثافة الشبكة للتفاعلات بين الخلايا المناعية (المرسلة) والخلايا السدوية (المستهدفة). د نسبة مصطلحات علم الجينات على الجزيئات التي تتوسط تأثير العدلات على الخلايا العظمية. هـ تحليل Micro-CT لفقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة في الفئران المعالجة بجسم مضاد للتحكم (rat IgG2a) وأجسام مضادة مضادة لـ Ly6G ( و ، على التوالي). قضبان القياس، 1 مم. تشير الخطوط الحمراء المنقطة العليا إلى نقطة التقاء المينا والملاط، وتشير الخطوط الحمراء المنقطة السفلى إلى قمة العظام السنخية في اللوحة اليسرى. تم قياس فقدان العظام اللثوي في اللوحة اليمنى
انفجار الأسنان الطبيعي وحجم الجسم مشابه لحجم الفئران البرية من نفس السلالة (الشكل التوضيحي S3b).
تم تثبيط فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة في الفئران التي تفتقر إلى RL-D4-
المعطلة
للتحقيق في أهمية منطقة RL-D4 في إعادة تشكيل العظام الفسيولوجية، قمنا أولاً بتحليل العظام الطويلة لفئران RL-D4-KO في حالة مستقرة. أظهرت تحليلات التصوير المقطعي المحوسب (micro-CT) أن فئران RL-D4-KO كانت لديها نمط عظام طبيعي مقارنة بالفئران WT في ظل الظروف الفسيولوجية (الشكل 4a، b).
أظهرت قياسات الهيستومورفومترية الديناميكية عدم وجود فرق بين فئران WT و RL-D4-KO في كل من معايير الخلايا العظمية والخلايا العظمية (الشكل 4c، d).
لتقييم مشاركة RL-D4 في تلف العظام اللثوي، قمنا بتحفيز التهاب اللثة التجريبي في الفئران التي تفتقر إلى RL-D4 ووجدنا أن فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة تم تثبيطه بشكل كبير في هذه الحيوانات (الشكل 4e). عزلنا الخلايا العظمية الأولية من القحف لفئران RL-D4 المعطلة، ووجدنا أن التعبير عن RANKL المستحث بواسطة OSM تم تثبيطه بشكل كبير في غياب منطقة RL-D4 (الشكل 4f). هذه البيانات
الشكل 2 يحفز OSM التعبير عن RANKL في الخلايا العظمية ويعزز تدمير العظام في التهاب اللثة. أ رسم بياني يوضح أزواج تفاعل إشارة السيتوكين في شبكة العدلات والخلايا العظمية. ب رسم نقطي يوضح التعبير عن TNF و IL-1 و و OSM في مجموعات scRNA-seq لآفة التهاب اللثة لدى الفئران. ج تحليل qPCR لنسخ Tnfsf11 في الخلايا العظمية الأولية المشتقة من القحف المعالجة بـ TNF و IL-1 و و OSM أو فيتامين D بالإضافة إلى بروستاجلاندين E2 (PGE2) ( ). تم الحصول على البيانات من تجارب مكررة. د قياس تركيز RANKL بواسطة ELISA في مستخلص الخلايا العظمية الأولية المعالجة بـ OSM أو بدونها. هـ رسم نقطي يوضح التعبير عن OSM و OSMR في مجموعات scRNA-seq لآفة التهاب اللثة البشرية. رسم بياني يوضح أزواج التفاعل الإشاري OSM في شبكة الخلايا البشرية لآفة التهاب اللثة. تحليل الميكرو-CT لفقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة في مجموعة التحكم ( ) وفئران Osmr flox/flox Sp7-Cre ( ). قضبان القياس، 1 مم. الخط الأحمر المنقط العلوي يشير إلى نقطة التقاء الأسمنت والمينا والخط الأحمر المنقط السفلي يشير إلى قمة العظم السنخي في اللوحة اليسرى. تم قياس فقدان العظام اللثوي في اللوحة اليمنى
تشير إلى أن منطقة RL-D4 ليست ضرورية لإعادة تشكيل العظام الفسيولوجية ولكنها تساهم في تدمير العظام اللثوية، ربما من خلال الوساطة في التعبير عن RANKL المستحث بواسطة OSM في الخلايا العظمية.
تشير نتائجنا مجتمعة إلى أن العدلات تساهم في تدمير العظام في التهاب اللثة من خلال تنشيط محور OSMR/RL-D4/RANKL في الخلايا العظمية.

نقاش

العدلات هي أكثر البلعميات وفرة في مجرى الدم لدى البشر، وتعمل كعنصر رئيسي في نظام المناعة الفطري. تفاقم تسلل العدلات المفرط من مسببات التهاب اللثة لدى البشر والفئران. تعزز العدلات المنشطة تدهور الأنسجة اللثوية من خلال إنتاج ميتالوبروتيناز المصفوفة والأكسجين التفاعلي
الشكل 4 المحسن RANKL RL-D4 متورط في فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة ولكن ليس في إعادة تشكيل العظام الفسيولوجية. صور ميكرو-CT تمثيلية (أ) ومعلمات ميكرو-CT (ب) لعظم الفخذ في إناث WT وفئران RL-D4-KO في عمر 12 أسبوعًا ( و ). قضبان القياس، 1 مم. ج صبغة توليلين الأزرق وصبغة TRAP لعظام الساق القريبة لفئران WT وRL-D4-KO في عمر 12 أسبوعًا. البيانات تمثل على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. قضبان القياس، . د تحليل هيستومورفومتري للعظام لعظام الساق القريبة لفئران WT وRL-D4-KO في عمر 12 أسبوعًا ( و ). هـ تحليل الميكرو-CT لفقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة في WT ( ) وفئران RL-D4KO ( ). الخط الأحمر المنقط العلوي يشير إلى نقطة التقاء الأسمنت والمينا والخط الأحمر المنقط السفلي يشير إلى قمة العظم السنخي في اللوحة اليسرى. قضبان القياس، 1 مم. تم قياس فقدان العظام اللثوي في اللوحة اليمنى. تحليل qPCR لنسخ Tnfsf11 في الخلايا العظمية الأولية المستمدة من القحف لفئران WT وRL-D4-KO المعالجة بـ OSM ( ). تم الحصول على البيانات من تجارب مكررة
تمثل هدفًا علاجيًا محتملاً للتخفيف من تدمير العظام لدى المرضى الذين يعانون من التهاب اللثة الوراثي الشديد.
RANKL هو سيتوكين متعدد الوظائف يلعب دورًا أساسيًا في أنظمة بيولوجية متنوعة بما في ذلك العظام ونظام المناعة. لقد حددت مجموعتنا وآخرون مناطق المحسن RANKL التي تعمل بطرق تعتمد على نوع الخلية والسياق. في إعادة تشكيل العظام الفسيولوجية، تتحكم المحسنات الداخلية، RL-D2 وRL-D5، في التعبير عن RANKL في الخلايا الميزانشيمية بما في ذلك الخلايا العظمية والخلايا العظمية. يتم تنشيط المحسن الداخلي في الخلايا العظمية بواسطة إشارات شيخوخة الخلايا، التي أظهرت أيضًا أنها تحفز التعبير عن RANKL في خلايا الرباط اللثوي والخلايا الأسمنتية. لقد أظهرنا سابقًا أن فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة وتطور الخلايا العظمية قد تم قمعه بشكل ملحوظ عندما تم حذف RANKL في الخلايا العظمية وخلايا الرباط اللثوي. في مجموعة بيانات scRNA-seq الخاصة بنا، تم تجميع الخلايا العظمية (المميزة بتعبير Sp7 وRunx2) وخلايا الألياف اللثوية (المميزة بتعبير S100a4 وPostn) ككتلة واحدة بسبب العدد المحدود من الخلايا مقارنة بالدراسات السابقة لـ scRNA-seq. هذه هي قيود رئيسية للدراسة الحالية وسيكون من الضروري توضيح المساهمة النسبية لـ RANKL على خلايا الألياف اللثوية والخلايا العظمية لفقدان العظام اللثوي في الدراسات المستقبلية.
في تدمير العظام المرتبط بـ RA، تنظم منطقة المحسن البعيد E3 التعبير عن RANKL في خلايا الألياف الزليلية. تشير نتائج الدراسة الحالية إلى أن منطقة RLD4 المرتبطة بـ STAT3 قد تكون متورطة في التعبير عن RANKL المستحث بواسطة OSM في الخلايا العظمية وتساهم في تلف العظام في التهاب اللثة. RL-D4 هي نفس المنطقة مثل E2 في دراستنا السابقة على خلايا الألياف الزليلية لـ RA ; لم تساهم هذه المنطقة في تحفيز RANKL في خلايا الألياف الزليلية. تشير هذه النتائج إلى أن الخلايا العظمية وخلايا الألياف الزليلية تستخدم محسنات متميزة لتنظيم RANKL في ظل الظروف الالتهابية. نظرًا لأن أعضاء آخرين من عائلة السيتوكينات IL-6 أيضًا ينشطون STAT3 ويعززون التعبير عن RANKL في الخلايا العظمية، فمن الممكن أن يكون تثبيط فقدان العظام اللثوي في فئران RL-D4KO هو تأثير مشترك لـ OSM وسيتوكينات أخرى مثل IL-6. نظرًا لأن كل من منطقتي RL-D5 وRL-D6 يُزعم أنهما متورطتان في التعبير عن RANKL المستحث بواسطة OSM في الخلايا العظمية في المختبر، تتطلب الدراسات الإضافية فحص مساهمة هذه المحسنات في فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة، وتوضيح دور منطقة RL-D4 بما يتجاوز التهاب اللثة.
من المثير للاهتمام أن المحسنات المرتبطة بالالتهاب بما في ذلك RL-D4 وRL-D5 وRL-D6 وE3 تقع في المنطقة بين الجينات بين RANKL وبروتين ربط A-كيناز 11، وهي منطقة تم توسيعها خلال تطور الفقاريات. نشتبه
في أن ظهور مثل هذه المحسنات المرتبطة بالالتهاب RANKL خلال التطور قد ربط تنشيط المناعة بامتصاص العظام بواسطة الخلايا العظمية وبالتالي دفع ظهور مرض العظام الالتهابي، وأقدم دليل على ذلك هو تلف العظام الناتج عن التهاب اللثة في زاحف أرضي عمره 275 مليون سنة.
لقد كشفت التقدمات الأخيرة في تقنيات الخلايا المفردة عن تباين خلوي بمستوى دقة غير مسبوق، وتم إيلاء اهتمام متزايد للتفاعل بين الخلايا المناعية والخلايا الداعمة بناءً على الاستدلال الحسابي للتفاعلات بين الخلايا باستخدام بيانات تسلسل الخلايا المفردة. في هذه الدراسة، أظهرنا أن التواصل بين العدلات والخلايا العظمية من خلال محور OSM/OSMR يعزز تلف العظام المرتبط بالتهاب اللثة، مما يوفر مثالًا جديدًا للتفاعلات المناعية-الداعمة. ستساعد التحقيقات الإضافية في مثل هذه التفاعلات الخلوية في توفير فهم لآلية تطور مختلف الأمراض بما في ذلك التهاب اللثة.

طرق

الفئران

تم الحفاظ على جميع الحيوانات في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة، وتم إجراء جميع التجارب بموافقة مجلس المراجعة المؤسسي في جامعة طوكيو (طوكيو، اليابان). تم شراء فئران C57BL/6 من CLEA Japan, Inc. (شيزوكوكا، اليابان). تم الحصول على فئران Osmr من مختبر Jaxon. تم وصف فئران Sp7-Cre سابقًا. تم إنشاء فئران RL-D4-KO باستخدام تقنية تحرير الجينوم CRISPR/Cas9 على خلفية C57BL/6J. تم إعداد RNA الدليل الفردي المستهدف لتسلسلات منطقة المحسن البعيد RANKL ( -TGTCCTAAAATGTTGCCATG- و -AATGTGAATGATCA-CAAGCA-3′) وmRNA hCas9 كما تم وصفه سابقًا. كانت البادئات لاكتشاف أليل RL-D4-KO كما يلي: الأمامية، -TTTCGTTGCAAAGTGGGATGAAG-3′ والخلفية، – ACCATTAGCATTCTGGACTGAGAA- . تم تسلسل منتج PCR لأليل RL-D4-KO (362 قاعدة) باستخدام البادئة الأمامية لتأكيد أن النسل المؤسس يحمل حذف منطقة المحسن (حذف 3 412 قاعدة يتوافق مع GRCm39 chr14: 78,613,540-78,616,951/GRCm38 chr14: ). تم تزاوج النسل المؤسس مع فئران C57BL/6J WT لتوليد ذرية هتروزيغوت، ثم تم تزاوجها لتوليد ذرية من فئران WT وRL-D4-KO. تم استخدام فئران متطابقة في العمر والجنس لجميع التجارب ما لم يُذكر خلاف ذلك.

نموذج الفأر لالتهاب اللثة الناتج عن الرباط

لتقييم فقدان العظام الناتج عن التهاب اللثة، تم ربط رباط حرير 5-0 حول الضرس الثاني العلوي الأيسر، وتم ترك السن المقابل غير مربوط ليكون بمثابة التحكم الأساسي، كما تم وصفه سابقًا. تم التضحية بالفئران وتحليلها باستخدام الميكرو-CT بعد 10 أيام من تطبيق الرباط. قبل فحص الميكرو-CT، تم الحفاظ على الفك العلوي في محلول الإيثانول. تم إجراء مسح ميكرو-CT باستخدام جهاز ScanXmateA100S (شركة كومسكانتيك، كاناغاوا، اليابان). تم إعادة بناء بيانات الصور الميكروهيكلية ثلاثية الأبعاد وتم حساب المؤشرات الهيكلية باستخدام برنامج تحليل العظام TRI/3D-BON (شركة RATOC للهندسة النظامية، طوكيو، اليابان). تم استبعاد الفئران التي فقدت الرباطات من البيانات.

تسلسل RNA أحادي الخلية وتحليل البيانات

لعزل خلايا فردية من الأنسجة اللثوية، قمنا بجمع الخلايا من الأنسجة اللثوية وسطح العظم السنخي عن طريق الكشط بالملاقط. بعد ذلك، تم قطع الأنسجة اللثوية المستخرجة إلى قطع صغيرة وهضمها في كولاجيناز النوع 2 (شركة وورثينغتون للكيماويات الحيوية) و DNase النوع 1 (سيغما) لمدة 20 دقيقة عند تم إضافة EDTA وتم تحضين الأنسجة لمدة 10 دقائق أخرى عند .
محور الخلايا المتعادلة – الخلايا العظمية يعزز العظام…

أندو وآخرونأندو وآخرون

بعد الهضم الإنزيمي، تم جمع خلايا اللثة عن طريق الطرد المركزي، بعد الترشيح من خلال شبكة. تم إجراء تحليل تسلسل RNA أحادي الخلية باستخدام نظام 10x Genomics Chromium (10x Genomics، بليزنتون، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم عزل خلايا مفردة من الأنسجة اللثوية لخمس فئران مصابة بالتهاب اللثة. تم إنشاء مكتبات التسلسل من هذه الخلايا باستخدام الجينوميات أحادية الخلية تم استخدام مجموعة الحل (الإصدار 3) ثم خضعت لتسلسل إيلومينا (نظام تسلسل HiSeq 4000؛ إيلومينا، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم إجراء محاذاة وقياس مصفوفات عدد العينات باستخدام خط أنابيب 10x Genomics Cell Ranger (الإصدار 3.0) وتسلسلات مرجعية للفئران (الإصدار mm 10) كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام حزمة Seurat R (الإصدار 4.3.0.1). قمنا بشكل أساسي بتصفية الجينات المعبر عنها في أقل من 3 خلايا والخلايا التي تحتوي على أقل من 200 جين. الخلايا التي تحتوي على أكثر من تم استبعاد قراءات الميتوكوندريا، و7500 nFeature_RNA، و60000 nCounts RNA أيضًا. بعد مراقبة الجودة، تم إجراء تطبيع البيانات باستخدام دالة NormalizeData في Seurat، وتم تحديد أعلى 2000 ميزة متغيرة. تم تطبيق تقنية تقليل الأبعاد المعروفة باسم تقريب وتصور الفضاء الموحد (Uniform Manifold Approximation and Projection) لتصور المجموعات بدقة 0.1. تم تحليل التواصل بين الخلايا باستخدام حزمة CellChat v1.6.1R.

إدارة الأجسام المضادة anti-Ly6G في الجسم الحي

تم إعطاء الفئران جرعة داخل البطن مقدارها 0.4 ملغ من جسم مضاد antiLy6G (النسخة 1A8، BioXCell) أو كنترول من نوع IgG2a من الجرذان (النسخة 2A3، BioXCell). تم حقن الجسم المضاد وفق جدول زمني يتضمن أربع نقاط زمنية: يوم واحد قبل وضع الرباط، و2، 5، و8 أيام بعد وضع الرباط. تم قياس فقدان العظام بعد ذلك بعد 10 أيام من وضع الرباط.

اختبار تحفيز السيتوكين

قمنا بعزل الخلايا العظمية الأولية من قحف حديثي الولادة عن طريق الهضم الإنزيمي باستخدام وسط ألفا الأساسي الأدنى (11900024؛ جيبكو، وولثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) المدعوم بـ الكولاجيناز (038-22361؛ واكو كيميكالز، أوساكا، اليابان) و0.2% ديسباس II (383-02281؛ واكو كيميكالز)، كما هو موصوف سابقًا. بعد الهضم، تم جمع الخلايا العظمية وزرعها في أطباق 24 بئر. بعد يوم واحد من الحضانة، تم تحفيز الخلايا بـ IL-1. (R&D، 401-ML)، TNF-a (R&D، 410-MT)، وOSM (R&D، 495-MO) بتركيز . بعد 72 ساعة، تم جمع الخلايا العظمية المنشطة وخضعت لاختبارات PCR الكمي (qPCR). في التجربة لفحص تحفيز تعبير RANKL بواسطة OSM في الخلايا العظمية المأخوذة من القحف من الفئران التي تفتقر إلى RL-D4، تم جمع الخلايا بنفس الطريقة الموضحة أعلاه. تم زراعة هذه الخلايا العظمية في أطباق ذات 24 بئرًا. بعد يوم واحد من الحضانة، تم تحفيز الخلايا بـ OSM بتركيز بعد 6 ساعات، تم جمع الخلايا العظمية المنشطة وإخضاعها لاختبارات qPCR.

إيليزا

تم وصف عزل الخلايا العظمية الأولية أعلاه. بعد الهضم الإنزيمي، تم جمع الخلايا العظمية وزرعها في أطباق 6 آبار. بعد يوم واحد من الحضانة، تم تحفيز الخلايا باستخدام OSM (R&D، 495-MO) بتركيز بعد 72 ساعة، تم جمع مستخلصات الخلايا من الخلايا العظمية باستخدام محلول RIPA (نقالاي تيسك) الذي يحتوي على 1% من خليط مثبطات البروتياز (نقالاي تيسك) وتم إخضاعها لاختبار ELISA. تم إجراء اختبار ELISA وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (R&D SYSTEMS).

تحليل qPCR

تم استخراج RNA الكلي من الخلايا المعزولة باستخدام نظام ReliaPrep RNA Miniprep (Z6011؛ بروميجا، ماديسون، ويسكونسن، الولايات المتحدة الأمريكية) وتم تحويله عكسيًا باستخدام SuperScript III (11752-250؛ إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك، وولثام، ماساتشوستس). تم إجراء qPCR باستخدام جهاز LightCycler (روش، بازل، سويسرا) باستخدام SYBR Green (تويوبو، أوساكا، اليابان). تم تطبيع النتائج على Gapdh.
مستوى التعبير. كانت البرايمرات المستخدمة هي: Gapdh، 5′-TCCAC-CACCCTGTTGCTGTA-3′ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′; Tnfsf11، -AGCCATTTGCACACCTCAC-3′ و -CGTGGTACCAAGA GGACAGAGT-3′.

تحليل العظام الطويلة

لتحليل الميكرو-CT، تم عزل عظام الفخذ من الفئران WT وRL-D4KO وثُبتت في 70% إيثانول. تم إجراء مسح CT باستخدام جهاز ScanXmate-A100S (Comscantechno). تم إعادة بناء بيانات الصور الميكروهيكلية ثلاثية الأبعاد، وتم حساب المؤشرات الهيكلية باستخدام برنامج TRI/3D-BON (RATOC). بالنسبة للتحليلات الهيستومورفومترية، تم تشريح عظام الساق من الفئران WT وRL-D4-KO، وثُبتت في 70% إيثانول، وخضعت لتحليلات هيستومورفومترية ديناميكية قياسية كما هو موصوف سابقًا. تم التقاط صور صبغة التولويدين الأزرق وصبغة TRAP باستخدام محلل BZ-II (شركة كيينس، أوساكا، اليابان).

بيانات ChIP-seq وتحليلات الأنماط

تم تنزيل بيانات ChIP-seq من قواعد بيانات GEO و ENCODE Project وتم تصورها باستخدام عارض الجينوم التكاملي (الإصدار 2.3.12). تم الحصول على مصفوفات وزن المواضع (PWMs) للأنماط من قاعدة بيانات JASPAR (https:// jaspar.genereg.net/). قمنا بتحليل مواقع ارتباط عوامل النسخ داخل تسلسل الإدخال لـ GRCh37 chr13: استخدام قاعدة بيانات JASPAR. لتحديد الأنماط، استخدمنا مع تعيين قيمة العتبة الافتراضية إلى .

التحليلات الإحصائية

تم تحليل البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 9.5.1 وبرنامج R الإصدار 4.3.1. الاختبارات الإحصائية، قيم n، التجارب المكررة، و -القيم موضحة جميعها في الأشكال و/أو الأساطير. جميع البيانات معبّر عنها كمتوسط س.م. -تم حساب القيم باستخدام اختبار ستودنت اختبار، تحليل التباين (ANOVA) مع اختبار المقارنات المتعددة لدونيت أو توكي (*P < 0.05؛ **P < 0.01؛ ***P < 0.001؛ ****P < 0.0001، في جميع أنحاء الورقة).

توفر البيانات

جميع البيانات التي تدعم الرسوم البيانية داخل هذه الورقة متاحة في النص الرئيسي. تم تنزيل مجموعات البيانات العامة المشار إليها من Gene Expression Omnibus (GEO) (بيانات scRNA-seq لآفات اللثة البشرية؛ GSE164241، مجموعات البيانات الإبيجينية لخلايا العظام؛ GSE51515، GSE54782، وGSM733779) وقواعد بيانات مشروع ENCODE (بيانات DNase-seq لفيبروبلاست اللثة البشرية؛ ENCDO247AAA). تم إيداع الملفات المعالجة لبيانات scRNA-seq لالتهاب اللثة في الفئران في GEO تحت رقم الوصول GSE254766.

شكر وتقدير

نشكر S. Yin و K. Kusubata و A. Suematsu و K. Kubo و T. Tsubokawa و N. Takeda و I. Komuro على المناقشات المدروسة والمساعدة التقنية القيمة. تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل وكالة اليابان للبحوث والتطوير الطبي (AMED) بموجب رقم المنحة JP20ek0410073 و JP23ek0410108 و JP22ek0410100، وAMEDCREST بموجب رقم المنحة JP19gm1210008 وAMED-PRIME بموجب رقم المنحة JP21gm6310029، ومبادرة AMED اليابانية لمراكز البحث والتطوير الرائدة عالميًا في اللقاحات (JP223fa627001)؛ وجمعية اليابان لتعزيز العلوم (JSPS): البحث العلمي S (21H05046)، البحث العلمي B (21H03104 و22H03195 و22H02844) والبحث التحدي (20K21515 و21K18254)؛ وبرنامج JST FOREST (JPMJFR2261 وJPMJFR205Z). تم دعم Y.A. من خلال زمالة بحث JSPS للعلماء الشباب (23KJ1949) ومنحة Kibou من الجمعية اليابانية للمناعة (JSI) لطلاب الدكتوراه في علم المناعة.

مساهمات المؤلفين

قام ي.أ. بمعظم التجارب، وحلل البيانات، وأعد المخطوطة. تصور م.ت. المشروع، وصمم التجارب، وحلل وفسر البيانات، وكتب المخطوطة. ساهم ن.س.ن.هـ، ز.س، م.ي، ر.م، ك.ن، م.ك، ن.ك، ك.أ، ك.ن، ت.أ، أ.ي، و ك.ي في جمع البيانات وتفسيرها. أدار ه.ت. المشروع وكتب المخطوطة.

معلومات إضافية

المعلومات التكميلية تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد تكميلية متاحة على https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8.
المصالح المتنافسة: قسم المناعة العظمية هو قسم مخصص مدعوم بمنحة غير مقيدة من شركة AYUMI للأدوية، ELECOM، JCR للأدوية، كوندوا لصناعة القطن، MIKIHOUSE، MITSUI FUDOSAN، ميجي، نوفير، TAKENAKA، TENNENBUTSU IKAGAKU KENKYU ZAIDAN و Yakult.

REFERENCES

  1. Lamont, R. J., Koo, H. & Hajishengallis, G. The oral microbiota: dynamic communities and host interactions. Nat. Rev. Microbiol. 16, 745-759 (2018).
  2. Darveau, R. P. Periodontitis: a polymicrobial disruption of host homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  3. Maekawa, T. et al. Porphyromonas gingivalis manipulates complement and TLR signaling to uncouple bacterial clearance from inflammation and promote dysbiosis. Cell Host Microbe 15, 768-778 (2014).
  4. Tsukasaki, M. et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nat. Commun. 9, 701 (2018).
  5. Tsukasaki, M. & Takayanagi, H. Osteoimmunology: evolving concepts in bone-immune interactions in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 19, 626-642 (2019).
  6. Hajishengallis, G. & Chavakis, T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities. Nat. Rev. Immunol. 21, 426-440 (2021).
  7. Genco, R. J. & Sanz, M. Clinical and public health implications of periodontal and systemic diseases: An overview. Periodontol 2000 83, 7-13 (2020).
  8. Xiao, E. et al. Diabetes Enhances IL-17 Expression and Alters the Oral Microbiome to Increase Its Pathogenicity. Cell Host Microbe 22, 120-128.e4 (2017).
  9. Graves, D. T., Ding, Z. & Yang, Y. The impact of diabetes on periodontal diseases. Periodontol 2000 82, 214-224 (2020).
  10. Mammen, M. J., Scannapieco, F. A. & Sethi, S. Oral-lung microbiome interactions in lung diseases. Periodontol 2000 83, 234-241 (2020).
  11. Kitamoto, S. et al. The Intermucosal Connection between the Mouth and Gut in Commensal Pathobiont-Driven Colitis. Cell 182, 447-462.e14 (2020).
  12. Caetano, A. J. et al. Defining human mesenchymal and epithelial heterogeneity in response to oral inflammatory disease. Elife 10, e62810 (2021).
  13. Caetano, A. J., Human Cell Atlas Oral and Craniofacial Bionetwork, Sequeira, I. & Byrd, K. M. A Roadmap for the Human Oral and Craniofacial Cell Atlas. J. Dent. Res. 101, 1274-1288 (2022).
  14. Caetano, A. J. et al. Spatially resolved transcriptomics reveals pro-inflammatory fibroblast involved in lymphocyte recruitment through CXCL8 and CXCL10. Elife 12, e81525 (2023).
  15. Qian, S.-J. et al. Single-cell RNA sequencing identifies new inflammationpromoting cell subsets in Asian patients with chronic periodontitis. Front. Immunol. 12, 711337 (2021).
  16. Williams, D. W. et al. Human oral mucosa cell atlas reveals a stromal-neutrophil axis regulating tissue immunity. Cell 184, 4090-4104.e15 (2021).
  17. Kondo, T., Gleason, A., Okawa, H., Hokugo, A. & Nishimura, I. Mouse gingival single-cell transcriptomic atlas: An activated fibroblast subpopulation guides oral barrier immunity in periodontitis. eLife https://doi.org/10.7554/elife. 88183 (2023).
  18. Kondo, T. et al. Oral microbial extracellular DNA initiates periodontitis through gingival degradation by fibroblast-derived cathepsin K in mice. Commun. Biol. 5, 962 (2022).
  19. Abe, T. & Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J. Immunol. Methods 394, 49-54 (2013).
  20. Dutzan, N. et al. A dysbiotic microbiome triggers cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Sci. Transl. Med. 10, eaat0797 (2018).
  21. Udagawa, N. et al. Osteoclast differentiation by RANKL and OPG signaling pathways. J. Bone Miner. Metab. 39, 19-26 (2021).
  22. Tsukasaki, M. RANKL and osteoimmunology in periodontitis. J. Bone Miner. Metab. 39, 82-90 (2021).
  23. Kourtzelis, I. et al. DEL-1 promotes macrophage efferocytosis and clearance of inflammation. Nat. Immunol. 20, 40-49 (2019).
  24. Men, Y. et al. Gli1+ periodontium stem cells are regulated by osteocytes and occlusal force. Dev. Cell 54, 639-654.e6 (2020).
  25. Iwayama, T. et al. Plap-1 lineage tracing and single-cell transcriptomics reveal cellular dynamics in the periodontal ligament. Development 149, dev201203 (2022).
  26. Jin, S. et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat. Commun. 12, 1088 (2021).
  27. Eskan, M. A. et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nat. Immunol. 13, 465-473 (2012).
  28. Shin, J. et al. DEL-1 restrains osteoclastogenesis and inhibits inflammatory bone loss in nonhuman primates. Sci. Transl. Med. 7, 307ra155 (2015).
  29. Schmidt, E. P., Lee, W. L., Zemans, R. L., Yamashita, C. & Downey, G. P. On, around, and through: neutrophil-endothelial interactions in innate immunity. Physiology 26, 334-347 (2011).
  30. Hajishengallis, G. New developments in neutrophil biology and periodontitis. Periodontol 2000 82, 78-92 (2020).
  31. Walker, E. C. et al. Oncostatin M promotes bone formation independently of resorption when signaling through leukemia inhibitory factor receptor in mice. J. Clin. Invest. 120, 582-592 (2010).
  32. Galli, C. et al. Targeted deletion of a distant transcriptional enhancer of the receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand gene reduces bone remodeling and increases bone mass. Endocrinology 149, 146-153 (2008).
  33. Onal, M. et al. Unique distal enhancers linked to the mouse Tnfsf11 gene direct tissue-specific and inflammation-induced expression of RANKL. Endocrinology 157, 482-496 (2016).
  34. Bishop, K. A., Meyer, M. B. & Pike, J. W. A novel distal enhancer mediates cytokine induction of mouse RANKI gene expression. Mol. Endocrinol. 23, 2095-2110 (2009).
  35. Onal, M. et al. The RANKL distal control region is required for the increase in RANKL expression, but not the bone loss, associated with hyperparathyroidism or lactation in adult mice. Mol. Endocrinol. 26, 341-348 (2012).
  36. Silva, L. M., Kim, T. S. & Moutsopoulos, N. M. Neutrophils are gatekeepers of mucosal immunity. Immunol. Rev. 314, 125-141 (2023).
  37. Dutzan, N., Konkel, J. E., Greenwell-Wild, T. & Moutsopoulos, N. M. Characterization of the human immune cell network at the gingival barrier. Mucosal Immunol. 9, 1163-1172 (2016).
  38. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C. & Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. J. Periodontal Res. 50, 330-336 (2015).
  39. Silva, L. M. et al. Fibrin is a critical regulator of neutrophil effector function at the oral mucosal barrier. Science 374, eabl5450 (2021).
  40. Kim, T. S. et al. Neutrophil extracellular traps and extracellular histones potentiate IL-17 inflammation in periodontitis. J. Exp. Med. 220, e20221751 (2023).
  41. Assuma, R., Oates, T., Cochran, D., Amar, S. & Graves, D. T. IL-1 and TNF antagonists inhibit the inflammatory response and bone loss in experimental periodontitis. J. Immunol. 160, 403-409 (1998).
  42. Hajishengallis, G., Lamont, R. J. & Graves, D. T. The enduring importance of animal models in understanding periodontal disease. Virulence 6, 229-235 (2015).
  43. Fan, Y. et al. Creating an atlas of the bone microenvironment during oral inflammatory-related bone disease using single-cell profiling. Elife 12, e82537 (2023).
  44. Cai, B. et al. N2-polarized neutrophils guide bone mesenchymal stem cell recruitment and initiate bone regeneration: a missing piece of the bone regeneration puzzle. Adv. Sci. 8, e2100584 (2021).
  45. Moutsopoulos, N. M. et al. Defective neutrophil recruitment in leukocyte adhesion deficiency type I disease causes local IL-17-driven inflammatory bone loss. Sci. Transl. Med. 6, 229ra40 (2014).
  46. Moutsopoulos, N. M. et al. Interleukin-12 and Interleukin-23 blockade in leukocyte adhesion deficiency type 1. N. Engl. J. Med. 376, 1141-1146 (2017).
  47. West, N. R., Owens, B. M. J. & Hegazy, A. N. The oncostatin M-stromal cell axis in health and disease. Scand. J. Immunol. 88, e12694 (2018).
  48. Boniface, K. et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J. Immunol. 178, 4615-4622 (2007).
  49. Okamoto, H. et al. The synovial expression and serum levels of interleukin-6, interleukin-11, leukemia inhibitory factor, and oncostatin in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 40, 1096-1105 (1997).
  50. Lin, W. et al. Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolution. Bone Res. 9, 17 (2021).
  51. Torossian, F. et al. Macrophage-derived oncostatin M contributes to human and mouse neurogenic heterotopic ossifications. JCI Insight 2, e96034 (2017).
  52. West, N. R. et al. Oncostatin M drives intestinal inflammation and predicts response to tumor necrosis factor-neutralizing therapy in patients with inflammatory bowel disease. Nat. Med. 23, 579-589 (2017).
  53. Friedrich, M. et al. IL-1-driven stromal-neutrophil interactions define a subset of patients with inflammatory bowel disease that does not respond to therapies. Nat. Med. 27, 1970-1981 (2021).
  54. Lin, S.-J., Chen, Y.-L., Kuo, M. Y.-B., Li, C.-L. & Lu, H.-K. Measurement of gp130 cytokines oncostatin M and IL-6 in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis. Cytokine 30, 160-167 (2005).
  55. Okamoto, K. et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol. Rev. 97, 1295-1349 (2017).
  56. Kim, S., Yamazaki, M., Shevde, N. K. & Pike, J. W. Transcriptional control of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand by the protein kinase A activator forskolin and the transmembrane glycoprotein 130-activating cytokine, oncostatin M , is exerted through multiple distal enhancers. Mol. Endocrinol. 21, 197-214 (2007).
  57. Meyer, M. B., Benkusky, N. A., Lee, C.-H. & Pike, J. W. Genomic determinants of gene regulation by 1,25-Dihydroxyvitamin D3 during osteoblast-lineage cell differentiation. J. Biol. Chem. 289, 19539-19554 (2014).
  58. Yan, M. et al. Identification of an intronic enhancer regulating RANKL expression in osteocytic cells. Bone Res. 11, 43 (2023).
  59. Yan, M. et al. ETS1 governs pathological tissue-remodeling programs in diseaseassociated fibroblasts. Nat. Immunol. 23, 1330-1341 (2022).
  60. Onal, M., St John, H. C., Danielson, A. L. & Pike, J. W. Deletion of the distal Tnfsf11 RL-D2 enhancer that contributes to PTH-Mediated RANKL expression in osteoblast lineage cells results in a high bone mass phenotype in mice. J. Bone Miner. Res. 31, 416-429 (2016).
  61. Zhou, Y. et al. RANKL+ senescent cells under mechanical stress: a therapeutic target for orthodontic root resorption using senolytics. Int. J. Oral. Sci. 15, 20 (2023).
  62. Wang, Q. et al. Single-cell transcriptomic atlas of gingival mucosa in type 2 diabetes. J. Dent. Res. 101, 1654-1664 (2022).
  63. O’Brien, C. A. Control of RANKL gene expression. Bone 46, 911-919 (2010).
  64. Tsukasaki, M. & Takayanagi, H. Osteoclast biology in the single-cell era. Inflamm. Regen. 42, 27 (2022).
  65. Armingol, E., Officer, A., Harismendy, O. & Lewis, N. E. Deciphering cell-cell interactions and communication from gene expression. Nat. Rev. Genet. 22, 71-88 (2021).
  66. Robinson, J. T. et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  67. Castro-Mondragon, J. A. et al. JASPAR 2022: the 9th release of the open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 50, D165-D173 (2022).
  68. Grant, C. E., Bailey, T. L. & Noble, W. S. FIMO: scanning for occurrences of a given motif. Bioinformatics 27, 1017-1018 (2011).
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024
  1. Department of Immunology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan; Department of Microbiology, Tokyo Dental College, 2-1-14 Kanda-Misaki-cho, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan; Oral Health Science Center, Tokyo Dental College, 2-9-18, Kanda-Misaki-cho, Chiyodaku, Tokyo, Japan; Department of Osteoimmunology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan; Unit of Prosthodontics, Laboratory of Oral-Maxillofacial Biology Faculty of Odonto-Stomatology, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City, Ho Chi Minh City, Vietnam; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Department of Sensory and Motor System Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, Tokyo, Japan; Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan and Department of Laboratory Animal Medicine, Research Institute, National Center for Global Health and Medicine, Tokyo, Japan
    Correspondence: Masayuki Tsukasaki (tsuka-im@m.u-tokyo.ac.jp) or Hiroshi Takayanagi (takayana@m.u-tokyo.ac.jp)

Journal: International Journal of Oral Science, Volume: 16, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38413562
Publication Date: 2024-02-27

The neutrophil-osteogenic cell axis promotes bone destruction in periodontitis

Yutaro Ando , Masayuki Tsukasaki , Nam Cong-Nhat Huynh , Shizao Zang , Minglu Yan , Ryunosuke Muro , Kazutaka Nakamura , Masatsugu Komagamine , Noriko Komatsu , Kazuo Okamoto , Kenta Nakano , Tadashi Okamura , Akira Yamaguchi , Kazuyuki Ishihara and Hiroshi Takayanagi

Abstract

The immune-stromal cell interactions play a key role in health and diseases. In periodontitis, the most prevalent infectious disease in humans, immune cells accumulate in the oral mucosa and promote bone destruction by inducing receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL) expression in osteogenic cells such as osteoblasts and periodontal ligament cells. However, the detailed mechanism underlying immune-bone cell interactions in periodontitis is not fully understood. Here, we performed single-cell RNAsequencing analysis on mouse periodontal lesions and showed that neutrophil-osteogenic cell crosstalk is involved in periodontitis-induced bone loss. The periodontal lesions displayed marked infiltration of neutrophils, and in silico analyses suggested that the neutrophils interacted with osteogenic cells through cytokine production. Among the cytokines expressed in the periodontal neutrophils, oncostatin M (OSM) potently induced RANKL expression in the primary osteoblasts, and deletion of the OSM receptor in osteogenic cells significantly ameliorated periodontitis-induced bone loss. Epigenomic data analyses identified the OSM-regulated RANKL enhancer region in osteogenic cells, and mice lacking this enhancer showed decreased periodontal bone loss while maintaining physiological bone metabolism. These findings shed light on the role of neutrophils in bone regulation during bacterial infection, highlighting the novel mechanism underlying osteoimmune crosstalk.

International Journal of Oral Science (2024)16:18
https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8

INTRODUCTION

The oral cavity, a gateway to the digestive and respiratory systems, harbors an estimated 1000 bacterial species. Dysbiosis in oral microbial communities stimulates host immune responses and causes periodontitis, the most prevalent infectious disease in humans. Periodontitis is the primary cause of adult tooth loss and also affects various systemic diseases including diabetes, pneumonia, cardiovascular diseases, rheumatoid arthritis (RA), and inflammatory bowel disease. Thus, a detailed understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying oral mucosal immunopathology is critical for developing therapeutic and preventive strategies against periodontitis and its comorbidities.
Recent advances in single-cell and spatial multiomics technologies have provided a cellular landscape of oral mucosal lesions, critically contributing to our understanding of the pathogenesis underlying periodontitis. Previous studies have shown that various immune cells, including T cells, B cells, and myeloid cells, accumulate in periodontitis lesions and may interact with stromal cells such as fibroblasts and epithelial cells. However, the in vivo relevance of immune-stromal cell interactions in periodontitis has not been proven by loss-of-function approaches, and it
remains unclear how the complex cellular interactions ultimately induce osteoclastic bone resorption.
Experimental animal models are critical tools to investigate the mechanisms of disease pathogenesis. The ligature-induced periodontitis mouse model is the most widely used experimental model in the field, and genetic loss-of-function studies using this model have revealed that various immune cells such as T helper 17 ( ) cells play an essential role in periodontal bone destruction. Receptor activator of nuclear factor- ligand (RANKL), the master cytokine inducing osteoclast differentiation and activation, is mainly produced by osteogenic cells including osteoblasts and periodontal ligament (PDL) cells during periodontitis. Inflammatory cytokines such as interleukin (IL17A/F) and IL-6 stimulate RANKL expression in osteoblasts and PDL cells. However, the genetic deletion of these cytokines only partly inhibits periodontitis-induced bone destruction, suggesting that other factors may also contribute to the induction of RANKL in osteogenic cells. To obtain a comprehensive picture of the pathogenesis of periodontitis, it is necessary to understand the detailed molecular mechanisms underlying RANKL induction in osteogenic cells during periodontal inflammation.
In this study, we demonstrated that the neutrophil-osteogenic cell interaction promotes bone destruction in periodontitis through oncostatin receptor (OSMR) signaling. Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyses of the mouse periodontal lesions revealed that inflammatory neutrophils markedly accumulated in the periodontal lesions. Inflammatory neutrophils highly expressed OSM, which strongly induced RANKL expression in osteogenic cells. Periodontitis-induced bone loss was inhibited in osteogenic cell-specific OSMR-deficient mice, demonstrating the in vivo relevance of OSM-mediated neutrophil-osteogenic cell crosstalk. We identified the OSMregulated RANKL enhancer region in osteogenic cells, and mice lacking this enhancer displayed decreased periodontal bone loss while maintaining physiological bone metabolism. Together, the results of this study reveal the detailed mechanisms underlying bone damage associated with periodontitis, providing a novel example of immune-stromal cell interactions in infectious diseases.

RESULTS

Single-cell landscape of mouse periodontal lesions
To understand the cellular microenvironment underlying periodontal bone destruction at a single-cell resolution, we performed scRNA-seq using cells derived from the periodontal tissue of ligature-induced periodontitis mice at 7 days after ligature placement when the marked infiltration of immune cells and accelerated bone destruction were observed in previous studies. Unsupervised graph-based clustering analysis showed that the mouse periodontal lesions comprised immune cells (neutrophils, macrophages, cells, and B cells), epithelial cells, vascular endothelial cells (VEC), mural cells, and osteogenic cells (Fig. 1a, b). We annotated the osteogenic cell cluster, which is characterized by the expression of marker genes for both osteoblasts (Sp7 and Runx2) and PDL cells (S100a4 and Postn). Since PDL cells have osteogenic capacity and serve as the local source of osteoblasts in vivo, it is difficult to rigorously discriminate between PDL cells and osteoblastic cells using sequencing data.
To gain insights into the role of immune-stromal cell interactions in bone destruction associated with periodontitis, we performed CellChat analysis, a quantitative tool for measuring intercellular signaling networks, using our scRNA-seq data. We calculated the mean interaction intensity between immune cells and stromal cells, and found that the interplay between neutrophils and osteogenic cells was pronounced among intercellular interactions in the periodontal lesions (Fig. 1c, Supplementary Fig. S1a). The interaction between neutrophils and VEC in the periodontitis pathogenesis has been well documented by previous studies, but the role of neutrophil-osteogenic crosstalk in periodontitis has never been reported. Since osteogenic cells represent the major source of RANKL in the periodontal bone damage, we focused on the neutrophil-osteogenic axis. The CellChat analysis data suggested that osteogenic cells act on neutrophils by expressing various factors including cell adhesion molecules and chemokines (Supplementary Fig. S1b). The effect of neutrophils on osteogenic cells is suggested to be largely dependent on the cytokines produced by neutrophils (Fig. 1d). To assess the importance of neutrophils in the periodontal bone destruction in vivo, we depleted neutrophils by injecting anti-Ly6G antibody, which led to the significant inhibition of periodontitis-induced bone loss (Fig. 1e). These findings suggest that neutrophils may interact with osteogenic cells through cytokine production and promote bone destruction in periodontitis.
OSM stimulates RANKL expression in osteogenic cells Since osteogenic cells function as the primary source of RANKL in periodontal bone loss, we hypothesized that neutrophils may contribute to periodontal bone loss by inducing RANKL expression
in osteogenic cells through cytokine production. We analyzed the CellChat data by focusing on the cytokine-mediated interaction between neutrophils and osteogenic cells, and found that tumor necrosis factor (TNF), IL-1 , and OSM displayed high communication intensity in the neutrophil-osteogenic network (Fig. 2a). These cytokines are specifically expressed in neutrophils in the periodontal lesion (Fig. 2b). Among the three cytokines, OSM had the strongest capacity to induce RANKL expression in mouse calvariaderived primary osteoblasts in vitro (Fig. 2c). We confirmed that OSM significantly upregulates the expression of osteoblastic RANKL at the protein level (Fig. 2d). The scRNA-seq data analysis of human periodontal lesions also showed that OSM and OSMR were highly expressed in neutrophils and PDL cells, respectively (Fig. 2e). The CellChat analysis suggested that the OSM/OSMR axis also mediates the neutrophil-PDL interaction in human periodontal lesions (Fig. 2f).
To investigate the importance of OSMR signaling in osteogenic cells in periodontitis-induced bone damage in vivo, we crossed OSMR-floxed mice with Sp7-Cre mice. In the periodontal tissue, Sp7-Cre was shown to target both osteoblasts and PDL cells. Because OSMR signaling in osteoblastic cells is involved in physiological bone metabolism, we used a Sp7-tTA-tetO-Cre (Sp7-Cre) system in which Cre recombinase is expressed only when a tetracycline-controlled transactivator (tTA) binds to a tetracycline responsive element (tetO) in the absence of doxycycline (Dox). Sp7-Cre mice crossed with OSMR-floxed mice were treated from the prenatal period with Dox, which was withdrawn at the age of 4 weeks. This protocol did not affect skeletal growth in the mice (Supplementary Fig. S2a-c). We induced periodontitis at the age of 8 weeks, and the alveolar bone was analyzed 10 days after ligature placement. Notably, periodontitis-induced bone loss was significantly inhibited in the Osmr flox/flox Sp7-Cre mice (Fig. 2g). These results suggest that neutrophil-derived OSM binds to the OSMR on osteogenic cells and promotes RANKL expression, underscoring the relevance of the neutrophil-osteogenic cell interaction in bone destruction associated with periodontitis.
Identification of the OSM-regulated RANKL enhancer region OSM stimulates RANKL expression in osteoblastic cells by activating the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) transcription factor. In addition, three STAT3-binding sites upstream of the Tnfsf11 locus, namely RANKL distal enhancer 4 (RL-D4), RL-D5, and RL-D6, have been reported (Fig. 3a). We analyzed various publicly available epigenomic datasets of mouse osteoblastic cells and found that active enhancer markers including histone H3 lysine 27 acetylation (H3K27ac), histone H3 lysine 4 monomethylation (H3K4me1), and histone H4 lysine 5 acetylation (H4K5ac) as well as assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-seq) peak were enriched in these STAT3-binding sites, suggesting that these regions may function as active enhancers in osteoblastic cells.
In human datasets, the homologous region of RL-D4 displayed the highest enrichment of active enhancer markers in osteoblastic cells and PDL cells (Fig. 3b). We confirmed that the binding motifs of STAT transcription factors were present in the human homologous region of RL-D4 (Fig. 3c). Previous studies have shown that deletion of RL-D5 or RL-D6 partly inhibits OSMinduced RANKL expression in osteoblastic cells, but the importance of RL-D4 in physiological or pathological bone metabolism has not been explored. Therefore, we evaluated the role of the RL-D4 region in periodontitis-induced bone loss by generating mice lacking the RL-D4 region using clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-mediated genome editing technology. The successful generation of RL-D4-knockout (KO) mice was confirmed by Sanger DNA sequencing (Supplementary Fig. S3a). The RL-D4-KO mice were born at the expected Mendelian frequency and displayed
Fig. 1 Neutrophils interact with osteogenic cells through cytokine production in periodontitis. a Uniform manifold approximation and projection (UMAP) plot of cells from the periodontal tissues of ligature-induced periodontitis mice . Dot plot of the expression of representative genes for each cluster. Each cell type was annotated using these marker genes. c Heat map showing the network intensity of interactions between immune cells (sender) and stromal cells (target). d Proportion of Gene Ontology terms on molecules mediating the effect of neutrophils on osteogenic cells. e Micro-CT analysis of periodontitis-induced bone loss in mice treated with isotype-control (rat IgG2a) and anti-Ly6G antibodies ( and , respectively). Scale bars, 1 mm . The upper red dotted line indicates the cement-enamel junction, and the lower red dotted line indicates the alveolar bone crest in the left panel. The periodontal bone loss was quantified in the right panel
normal tooth eruption and a body size similar to that of littermate wild-type (WT) controls (Supplementary Fig. S3b).
Periodontitis-induced bone loss is inhibited in RL-D4-
deficient mice
To investigate the importance of the RL-D4 region in physiological bone remodeling, we first analyzed the long bones of RL-D4-KO mice at steady state. Microcomputed tomography (micro-CT) analyses showed that RL-D4-KO mice had normal bone phenotype compared to WT mice under physiological conditions (Fig. 4a, b).
Dynamic bone histomorphometry showed no difference between WT and RL-D4-KO mice in both osteoclastic and osteoblastic parameters (Fig. 4c, d).
To assess the involvement of RL-D4 in periodontal bone damage, we induced experimental periodontitis in the RL-D4deficient mice and found that the periodontitis-induced bone loss was significantly inhibited in these animals (Fig. 4e). We isolated primary osteoblasts from the calvaria of RL-D4-deficient mice, and found that OSM-induced RANKL expression was significantly inhibited in the absence of the RL-D4 region (Fig. 4f). These data
Fig. 2 OSM stimulates RANKL expression in osteogenic cells and promotes bone destruction in periodontitis. a Chord diagram showing cytokine signaling interaction pairs in the neutrophil-osteogenic network. b Dot plot showing the expression of TNF, IL-1 , and OSM in the scRNA-seq clusters of the mouse periodontitis lesion. c qPCR analysis of Tnfsf11 transcripts in calvaria-derived primary osteoblasts treated with TNF, IL-1 , OSM or Vitamin D plus Prostaglandin E2 (PGE2) ( ). The data were obtained from duplicate experiments. d RANKL concentration measured by ELISA in the lysate of primary osteoblasts treated with or without OSM. e Dot plot showing the expression of OSM and OSMR in scRNA-seq clusters of the human periodontitis lesion. Chord diagram showing the OSM signaling interaction pairs in the cellcell network of the human periodontitis lesion. Micro-CT analysis of periodontitis-induced bone loss in the control ( ) and Osmr flox/flox Sp7-Cre mice ( ). Scale bars, 1 mm . The upper red dotted line indicates the cement-enamel junction and the lower red dotted line indicates the alveolar bone crest in the left panel. The periodontal bone loss was quantified in the right panel
suggest that the RL-D4 region is not required for physiological bone remodeling but contributes to periodontal bone destruction, possibly by mediating OSM-induced RANKL expression in osteogenic cells.
Taken together, our findings indicate that neutrophils contribute to bone destruction in periodontitis by activating the OSMR/RL-D4/RANKL axis in osteogenic cells.

DISCUSSION

Neutrophils are the most abundant phagocytes in the bloodstream of humans, functioning as a key component of the innate immune system. Excessive neutrophil infiltration exacerbates the pathogenesis of periodontitis in humans and mice. Activated neutrophils promote periodontal tissue degradation by producing matrix metalloproteinases and reactive oxygen
Fig. 4 The RANKL enhancer RL-D4 is involved in periodontitis-induced bone loss but not in physiological bone remodeling. Representative micro-CT images (a) and micro-CT parameters (b) of the femur in female WT and RL-D4-KO mice at the age of 12 weeks ( and ). Scale bars, 1 mm . c Toluidine blue and TRAP staining of the proximal tibias of WT and RL-D4-KO mice at the age of 12 weeks. The data are representative of at least three independent experiments. Scale bars, . d Bone histomorphometric analysis of the proximal tibias of WT and RL-D4-KO mice at the age of 12 weeks ( and ). e Micro-CT analysis of periodontitis-induced bone loss in WT ( ) and RL-D4KO mice ( ). The upper red dotted line indicates the cement-enamel junction and the lower red dotted line indicates the alveolar bone crest in the left panel. Scale bars, 1 mm . Periodontal bone loss was quantified in the right panel. qPCR analysis of the Tnfsf11 transcripts in the calvaria-derived primary osteoblasts from WT mice and RL-D4-KO mice treated with OSM ( ). The data were obtained from duplicate experiments
represent a potential therapeutic target to mitigate bone destruction in patients with severe hereditary periodontitis.
RANKL is a multifunctional cytokine that plays an essential role in various biological systems including the bone and immune system. Our group and others have identified RANKL enhancer regions that function in cell type- and context- dependent manners. In physiological bone remodeling, the intronic enhancer, RL-D2, and RL-D5 regions control RANKL expression in mesenchymal cells including osteocytes and osteoblasts. The intronic enhancer in osteocytic cells is activated by cellular senescence signals, which were also shown to stimulate RANKL expression in periodontal ligament cells and cementoblasts. We previously demonstrated that periodontitis-induced bone loss and osteoclast development were markedly suppressed when RANKL was deleted in osteoblastic cells and periodontal ligament cells. In our scRNA-seq dataset, the osteoblastic cells (characterized by expression of Sp7 and Runx2) and periodontal ligament fibroblasts (characterized by expression S100a4 and Postn) were clustered as a single population due to the limited number of cells compared to previous scRNA-seq studies. This is a major limitation of the current study and it will be needed to clarify relative contribution of RANKL on periodontal ligament fibroblasts and osteoblasts to periodontal bone loss in future studies.
In bone destruction associated with RA, the distal enhancer E3 region regulates RANKL expression in synovial fibroblasts. The findings of the current study indicate that the STAT3-binding RLD4 region may be involved in OSM-induced RANKL expression in osteogenic cells and contribute to bone damage in periodontitis. RL-D4 is the same region as E2 in our previous study on RA synovial fibroblasts ; this region did not contribute to RANKL induction in the synovial fibroblasts. These findings indicate that the osteogenic cells and synovial fibroblasts utilize distinct enhancers for RANKL regulation under inflammatory conditions. Because other members of the IL-6 family of cytokines also activate STAT3 and promote RANKL expression in osteogenic cells, it is possible that the inhibition of periodontal bone loss in RL-D4KO mice is a combined effect of OSM and other cytokines such as IL-6. As both RL-D5 and RL-D6 regions are reportedly involved in OSM-induced RANKL expression in osteoblastic cells in vitro, further studies are required to examine the contribution of these enhancers to periodontitis-induced bone loss, and to elucidate the role of RL-D4 region beyond periodontitis.
Intriguingly, the inflammation-associated enhancers including RL-D4, RL-D5, RL-D6, and E3 are located in the intergenic region between RANKL and A-kinase anchoring protein 11, an area that has been expanded during vertebrate evolution. We suspect
that the emergence of such inflammation-associated RANKL enhancers during evolution may have linked immune activation to osteoclastic bone resorption and thus driven the emergence of inflammatory bone disease, the earliest evidence of which is periodontitis-induced bone damage in a 275 million-year-old terrestrial reptile.
Recent advances in single-cell technologies have revealed cellular heterogeneity at an unprecedented level of resolution, and increasing attention has been paid to the interaction between immune and stromal cells based on the computational inference of intercellular interactions using single-cell sequencing data. In this study, we demonstrated that neutrophil-osteogenic cell crosstalk through the OSM/OSMR axis promotes bone damage associated with periodontitis, providing a novel example of immune-stromal interactions. Further investigations into such cellular interactions will help provide an understanding of the pathogenesis of various diseases including periodontitis.

METHODS

Mice

All animals were maintained under specific pathogen-free conditions, and all experiments were performed with approval of the institutional review board at The University of Tokyo (Tokyo, Japan). C57BL/6 mice were purchased from CLEA Japan, Inc. (Shizuoka, Japan). Osmr mice were obtained from the Jaxon Laboratory. Sp7-Cre mice were previously described. RL-D4-KO mice were generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing technology on the C57BL/6J background. Single guide RNA targeting the sequences of the RANKL distal enhancer region ( -TGTCCTAAAATGTTGCCATG- and -AATGTGAATGATCA-CAAGCA-3′) and hCas9 mRNA were prepared as previously described. Primers for detection of the RL-D4-KO allele were as follows: forward, -TTTCGTTGCAAAGTGGGATGAAG-3′ and reverse, – ACCATTAGCATTCTGGACTGAGAA- . The PCR product of the RL-D4-KO allele (362 base pairs) was further sequenced using the forward primer to confirm that the founder progenies harbored the enhancer region deletion (3 412 base pair deletion corresponding to GRCm39 chr14: 78,613,540-78,616,951/GRCm38 chr14: ). Founder progenies were mated with C57BL/6J WT mice to generate heterozygous offspring and subsequently intercrossed to generate WT and RL-D4-KO littermate progeny. Age- and sex-matched mice were used for all of the experiments unless otherwise noted.

Ligature-induced periodontitis mouse model

To evaluate the periodontitis-induced bone loss, a 5-0 silk ligature was tied around the maxillary left second molar, and the contralateral tooth was left unligated to serve as the baseline control, as previously described. The mice were sacrificed and analyzed with micro-CT 10 days after ligature application. Prior to micro-CT inspection, the maxillae were preserved in a ethanol solution. Micro-CT scanning was performed with the ScanXmateA100S Scanner (Comscantechno Co. Ltd., Kanagawa, Japan). Three-dimensional microstructural image data were reconstructed and structural indices were calculated using TRI/3D-BON bone analysis software (RATOC System Engineering Co. Ltd., Tokyo, Japan). Mice in which the ligatures were lost were excluded from the data.

Single-cell RNA-seq and data analysis

To isolate single cells from the periodontal tissues, we collected cells from gingival tissues and the alveolar bone surface by curetting with forceps. Subsequently, the obtained periodontal tissues were cut into small pieces and digested in Collagenase Type 2 (Worthington Biochemical Corp.) and DNase Type 1 (Sigma) for 20 min at EDTA was added and the tissue was incubated for another 10 min at .
The neutrophil-osteogenic cell axis promotes bone…

Ando et al.Ando et al.

M After enzymatic digestion, periodontal cells were collected by centrifugation, following filtration through a mesh. Singlecell RNA-seq analysis was performed with the 10x Genomics Chromium system (10x Genomics, Pleasanton, CA, USA). Single cells were isolated from the periodontal tissues of five mice with periodontitis. The sequencing libraries were generated from these cells using the Genomics Single-cell Solution Kit (v.3) and then subjected to Illumina sequencing (HiSeq 4000 Sequencing System; Illumina, San Diego, CA, USA). Alignment and quantitation of sample count matrices were performed using the 10x Genomics Cell Ranger Pipeline (v.3.0) and mouse reference sequences (version mm 10 ) as indicated in the manufacturer’s protocol. Downstream analysis was performed using the Seurat R package (v.4.3.0.1). We primarily filtered out genes expressed in <3 cells and cells with <200 genes. Cells with greater than mitochondrial reads, 7500 nFeature_RNA, and 60000 nCounts RNA were also excluded. After quality control, data normalization was performed using the NormalizeData function in Seurat, and the top 2000 variable features were identified. The Uniform Manifold Approximation and Projection dimensional reduction technique was applied to visualize the clusters at a resolution of 0.1 . The cell-cell communication was analyzed using the CellChat v1.6.1R package.

Administration of anti-Ly6G antibody in vivo

Mice were administered an intraperitoneal dose of 0.4 mg of antiLy6G antibody (clone 1A8, BioXCell) or a rat IgG2a isotype control (clone 2A3, BioXCell). The antibody was injected on a schedule of four time points: one day before ligature placement, and 2,5 , and 8 days after ligature placement. Bone loss was subsequently measured 10 days after ligature placement.

Cytokine stimulation assay

We isolated primary osteoblasts from the calvaria of newborns by enzymatic digestion using Alpha Minimum Essential Medium (11900024; Gibco, Waltham, MA, USA) supplemented with collagenase (038-22361; Wako Chemicals, Osaka, Japan) and 0.2% Dispase II (383-02281; Wako Chemicals), as previously described. After digestion, osteoblasts were collected and seeded in 24-well plates. After 1day of incubation, cells were stimulated with IL-1 (R&D, 401-ML), TNF-a (R&D, 410-MT), and OSM (R&D, 495-MO) at a concentration of . After 72 h , stimulated osteoblasts were collected and subjected to quantitative PCR (qPCR) assays. In the experiment to examine the induction of RANKL expression by OSM in calvaria-derived osteoblasts from RL-D4-deficient mice, cells were collected in the same manner described above. These osteoblasts were seeded in 24 -well plates. After 1 day of incubation, cells were stimulated with OSM at a concentration of . After 6 h , stimulated osteoblasts were collected and subjected to qPCR assays.

ELISA

The isolation of the primary osteoblasts was described above. After enzymatic digestion, osteoblasts were collected and seeded in 6-well plates. After 1 day of incubation, cells were stimulated with OSM (R&D, 495-MO) at a concentration of . After 72 h , cell lysates were collected from the osteoblasts with RIPA Buffer (nacalai tesque) containing 1% Protease Inhibitor Cocktail (nacalai tesque) and subjected to ELISA. ELISA was performed according to the manufacture’s protocol (R&D SYSTEMS).

qPCR analysis

Total RNA was extracted from isolated cells using the ReliaPrep RNA Miniprep System (Z6011; Promega, Madison, WI, USA) and reverse transcribed with SuperScript III (11752-250; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). qPCR was performed with a LightCycler (Roche, Basel, Switzerland) using SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan). The results were normalized to Gapdh
expression level. The primers used were: Gapdh, 5′-TCCAC-CACCCTGTTGCTGTA-3′ and -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′; Tnfsf11, -AGCCATTTGCACACCTCAC-3′ and -CGTGGTACCAAGA GGACAGAGT-3′.

Analysis of the long bones

For micro-CT analysis, femurs were isolated from WT and RL-D4KO mice and fixed in 70% ethanol. CT scanning was performed using the ScanXmate-A100S Scanner (Comscantechno). Threedimensional microstructural image data were reconstructed, and structural indices were calculated using TRI/3D-BON software (RATOC). For histomorphometric analyses, tibias from WT and RL-D4-KO mice were dissected, fixed in 70% ethanol, and subjected to standard dynamic bone histomorphometric analyses as previously described. Toluidine blue and TRAP staining images were captured using the BZ-II Analyzer (Keyence Co., Osaka, Japan).

ChIP-seq data and motif analyses

ChIP-seq data were downloaded from the GEO and ENCODE Project databases and visualized using the Integrative Genomics Viewer (version 2.3.12). Position weight matrices (PWMs) for motifs were obtained from the JASPAR database (https:// jaspar.genereg.net/). We analyzed the transcription factorbinding sites within the input sequence of GRCh37 chr13: using the JASPAR database. For motif identification, we employed with the default threshold value set to .

Statistical analyses

Data were analyzed on GraphPad Prism software v9.5.1 and R software v4.3.1. Statistical tests, n -values, replicate experiments, and -values are all indicated in the figures and/or legends. All data are expressed as the mean s.e.m. -values were calculated using Student’s test, analysis of variance (ANOVA) with Dunnett’s or Tukey’s multiple-comparison test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.000 1, throughout the paper).

DATA AVAILABILITY

All data that support the plots within this paper are available in the main text. The referenced publicly available datasets were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) (scRNA-seq data of human periodontal lesions; GSE164241, the epigenomic datasets of osteogenic cell epigenomic datasets; GSE51515, GSE54782, and GSM733779) and ENCODE Project databases (DNase-seq data of human PDL fibroblasts; ENCDO247AAA). The processed files of scRNA-seq data for mouse periodontitis are deposited in the GEO under accession GSE254766.

ACKNOWLEDGEMENTS

We thank S. Yin, K. Kusubata, A. Suematsu, K. Kubo, T. Tsubokawa, N. Takeda, and I. Komuro for thoughtful discussion and valuable technical assistance. This work was supported in part by the Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) under grant number JP20ek0410073, JP23ek0410108, JP22ek0410100, AMEDCREST under grant number JP19gm1210008 and AMED-PRIME under grant number JP21gm6310029, the AMED Japan Initiative for World leading Vaccine Research and Development Centers (JP223fa627001); Japan Society for the Promotion of Science (JSPS): Scientific Research S (21H05046), Scientific Research B (21H03104, 22H03195, and 22H02844) and Challenging Research (20K21515 and 21K18254); and the JST FOREST Program (JPMJFR2261, JPMJFR205Z). Y.A. was supported by a JSPS Research Fellowship for Young Scientists (23KJ1949) and Japanese Society for Immunology (JSI) Kibou Scholarship for Doctoral Students in Immunology.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Y.A. performed most of the experiments, analyzed the data, and prepared the manuscript. M.T. conceived the project, designed the experiments, analyzed and interpreted data, and wrote the manuscript. N.C.N.H., Z.S., M.Y., R.M., K.N., M.K., N.K., K.O., K.N., T.O., A.Y., and K.I. contributed to data collection and interpretation. H.T. directed the project and wrote the manuscript.

ADDITIONAL INFORMATION

Supplementary information The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1038/s41368-023-00275-8.
Competing interests: The Department of Osteoimmunology is an endowment department supported with an unrestricted grant from AYUMI Pharmaceutical Corporation, ELECOM, JCR Pharmaceuticals, Kondo Cotton Spinning, MIKIHOUSE, MITSUI FUDOSAN, Meiji, Noevir, TAKENAKA, TENNENBUTSU IKAGAKU KENKYU ZAIDAN and Yakult.

REFERENCES

  1. Lamont, R. J., Koo, H. & Hajishengallis, G. The oral microbiota: dynamic communities and host interactions. Nat. Rev. Microbiol. 16, 745-759 (2018).
  2. Darveau, R. P. Periodontitis: a polymicrobial disruption of host homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  3. Maekawa, T. et al. Porphyromonas gingivalis manipulates complement and TLR signaling to uncouple bacterial clearance from inflammation and promote dysbiosis. Cell Host Microbe 15, 768-778 (2014).
  4. Tsukasaki, M. et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nat. Commun. 9, 701 (2018).
  5. Tsukasaki, M. & Takayanagi, H. Osteoimmunology: evolving concepts in bone-immune interactions in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 19, 626-642 (2019).
  6. Hajishengallis, G. & Chavakis, T. Local and systemic mechanisms linking periodontal disease and inflammatory comorbidities. Nat. Rev. Immunol. 21, 426-440 (2021).
  7. Genco, R. J. & Sanz, M. Clinical and public health implications of periodontal and systemic diseases: An overview. Periodontol 2000 83, 7-13 (2020).
  8. Xiao, E. et al. Diabetes Enhances IL-17 Expression and Alters the Oral Microbiome to Increase Its Pathogenicity. Cell Host Microbe 22, 120-128.e4 (2017).
  9. Graves, D. T., Ding, Z. & Yang, Y. The impact of diabetes on periodontal diseases. Periodontol 2000 82, 214-224 (2020).
  10. Mammen, M. J., Scannapieco, F. A. & Sethi, S. Oral-lung microbiome interactions in lung diseases. Periodontol 2000 83, 234-241 (2020).
  11. Kitamoto, S. et al. The Intermucosal Connection between the Mouth and Gut in Commensal Pathobiont-Driven Colitis. Cell 182, 447-462.e14 (2020).
  12. Caetano, A. J. et al. Defining human mesenchymal and epithelial heterogeneity in response to oral inflammatory disease. Elife 10, e62810 (2021).
  13. Caetano, A. J., Human Cell Atlas Oral and Craniofacial Bionetwork, Sequeira, I. & Byrd, K. M. A Roadmap for the Human Oral and Craniofacial Cell Atlas. J. Dent. Res. 101, 1274-1288 (2022).
  14. Caetano, A. J. et al. Spatially resolved transcriptomics reveals pro-inflammatory fibroblast involved in lymphocyte recruitment through CXCL8 and CXCL10. Elife 12, e81525 (2023).
  15. Qian, S.-J. et al. Single-cell RNA sequencing identifies new inflammationpromoting cell subsets in Asian patients with chronic periodontitis. Front. Immunol. 12, 711337 (2021).
  16. Williams, D. W. et al. Human oral mucosa cell atlas reveals a stromal-neutrophil axis regulating tissue immunity. Cell 184, 4090-4104.e15 (2021).
  17. Kondo, T., Gleason, A., Okawa, H., Hokugo, A. & Nishimura, I. Mouse gingival single-cell transcriptomic atlas: An activated fibroblast subpopulation guides oral barrier immunity in periodontitis. eLife https://doi.org/10.7554/elife. 88183 (2023).
  18. Kondo, T. et al. Oral microbial extracellular DNA initiates periodontitis through gingival degradation by fibroblast-derived cathepsin K in mice. Commun. Biol. 5, 962 (2022).
  19. Abe, T. & Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J. Immunol. Methods 394, 49-54 (2013).
  20. Dutzan, N. et al. A dysbiotic microbiome triggers cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Sci. Transl. Med. 10, eaat0797 (2018).
  21. Udagawa, N. et al. Osteoclast differentiation by RANKL and OPG signaling pathways. J. Bone Miner. Metab. 39, 19-26 (2021).
  22. Tsukasaki, M. RANKL and osteoimmunology in periodontitis. J. Bone Miner. Metab. 39, 82-90 (2021).
  23. Kourtzelis, I. et al. DEL-1 promotes macrophage efferocytosis and clearance of inflammation. Nat. Immunol. 20, 40-49 (2019).
  24. Men, Y. et al. Gli1+ periodontium stem cells are regulated by osteocytes and occlusal force. Dev. Cell 54, 639-654.e6 (2020).
  25. Iwayama, T. et al. Plap-1 lineage tracing and single-cell transcriptomics reveal cellular dynamics in the periodontal ligament. Development 149, dev201203 (2022).
  26. Jin, S. et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat. Commun. 12, 1088 (2021).
  27. Eskan, M. A. et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nat. Immunol. 13, 465-473 (2012).
  28. Shin, J. et al. DEL-1 restrains osteoclastogenesis and inhibits inflammatory bone loss in nonhuman primates. Sci. Transl. Med. 7, 307ra155 (2015).
  29. Schmidt, E. P., Lee, W. L., Zemans, R. L., Yamashita, C. & Downey, G. P. On, around, and through: neutrophil-endothelial interactions in innate immunity. Physiology 26, 334-347 (2011).
  30. Hajishengallis, G. New developments in neutrophil biology and periodontitis. Periodontol 2000 82, 78-92 (2020).
  31. Walker, E. C. et al. Oncostatin M promotes bone formation independently of resorption when signaling through leukemia inhibitory factor receptor in mice. J. Clin. Invest. 120, 582-592 (2010).
  32. Galli, C. et al. Targeted deletion of a distant transcriptional enhancer of the receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand gene reduces bone remodeling and increases bone mass. Endocrinology 149, 146-153 (2008).
  33. Onal, M. et al. Unique distal enhancers linked to the mouse Tnfsf11 gene direct tissue-specific and inflammation-induced expression of RANKL. Endocrinology 157, 482-496 (2016).
  34. Bishop, K. A., Meyer, M. B. & Pike, J. W. A novel distal enhancer mediates cytokine induction of mouse RANKI gene expression. Mol. Endocrinol. 23, 2095-2110 (2009).
  35. Onal, M. et al. The RANKL distal control region is required for the increase in RANKL expression, but not the bone loss, associated with hyperparathyroidism or lactation in adult mice. Mol. Endocrinol. 26, 341-348 (2012).
  36. Silva, L. M., Kim, T. S. & Moutsopoulos, N. M. Neutrophils are gatekeepers of mucosal immunity. Immunol. Rev. 314, 125-141 (2023).
  37. Dutzan, N., Konkel, J. E., Greenwell-Wild, T. & Moutsopoulos, N. M. Characterization of the human immune cell network at the gingival barrier. Mucosal Immunol. 9, 1163-1172 (2016).
  38. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C. & Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. J. Periodontal Res. 50, 330-336 (2015).
  39. Silva, L. M. et al. Fibrin is a critical regulator of neutrophil effector function at the oral mucosal barrier. Science 374, eabl5450 (2021).
  40. Kim, T. S. et al. Neutrophil extracellular traps and extracellular histones potentiate IL-17 inflammation in periodontitis. J. Exp. Med. 220, e20221751 (2023).
  41. Assuma, R., Oates, T., Cochran, D., Amar, S. & Graves, D. T. IL-1 and TNF antagonists inhibit the inflammatory response and bone loss in experimental periodontitis. J. Immunol. 160, 403-409 (1998).
  42. Hajishengallis, G., Lamont, R. J. & Graves, D. T. The enduring importance of animal models in understanding periodontal disease. Virulence 6, 229-235 (2015).
  43. Fan, Y. et al. Creating an atlas of the bone microenvironment during oral inflammatory-related bone disease using single-cell profiling. Elife 12, e82537 (2023).
  44. Cai, B. et al. N2-polarized neutrophils guide bone mesenchymal stem cell recruitment and initiate bone regeneration: a missing piece of the bone regeneration puzzle. Adv. Sci. 8, e2100584 (2021).
  45. Moutsopoulos, N. M. et al. Defective neutrophil recruitment in leukocyte adhesion deficiency type I disease causes local IL-17-driven inflammatory bone loss. Sci. Transl. Med. 6, 229ra40 (2014).
  46. Moutsopoulos, N. M. et al. Interleukin-12 and Interleukin-23 blockade in leukocyte adhesion deficiency type 1. N. Engl. J. Med. 376, 1141-1146 (2017).
  47. West, N. R., Owens, B. M. J. & Hegazy, A. N. The oncostatin M-stromal cell axis in health and disease. Scand. J. Immunol. 88, e12694 (2018).
  48. Boniface, K. et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. J. Immunol. 178, 4615-4622 (2007).
  49. Okamoto, H. et al. The synovial expression and serum levels of interleukin-6, interleukin-11, leukemia inhibitory factor, and oncostatin in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 40, 1096-1105 (1997).
  50. Lin, W. et al. Mapping the immune microenvironment for mandibular alveolar bone homeostasis at single-cell resolution. Bone Res. 9, 17 (2021).
  51. Torossian, F. et al. Macrophage-derived oncostatin M contributes to human and mouse neurogenic heterotopic ossifications. JCI Insight 2, e96034 (2017).
  52. West, N. R. et al. Oncostatin M drives intestinal inflammation and predicts response to tumor necrosis factor-neutralizing therapy in patients with inflammatory bowel disease. Nat. Med. 23, 579-589 (2017).
  53. Friedrich, M. et al. IL-1-driven stromal-neutrophil interactions define a subset of patients with inflammatory bowel disease that does not respond to therapies. Nat. Med. 27, 1970-1981 (2021).
  54. Lin, S.-J., Chen, Y.-L., Kuo, M. Y.-B., Li, C.-L. & Lu, H.-K. Measurement of gp130 cytokines oncostatin M and IL-6 in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis. Cytokine 30, 160-167 (2005).
  55. Okamoto, K. et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol. Rev. 97, 1295-1349 (2017).
  56. Kim, S., Yamazaki, M., Shevde, N. K. & Pike, J. W. Transcriptional control of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand by the protein kinase A activator forskolin and the transmembrane glycoprotein 130-activating cytokine, oncostatin M , is exerted through multiple distal enhancers. Mol. Endocrinol. 21, 197-214 (2007).
  57. Meyer, M. B., Benkusky, N. A., Lee, C.-H. & Pike, J. W. Genomic determinants of gene regulation by 1,25-Dihydroxyvitamin D3 during osteoblast-lineage cell differentiation. J. Biol. Chem. 289, 19539-19554 (2014).
  58. Yan, M. et al. Identification of an intronic enhancer regulating RANKL expression in osteocytic cells. Bone Res. 11, 43 (2023).
  59. Yan, M. et al. ETS1 governs pathological tissue-remodeling programs in diseaseassociated fibroblasts. Nat. Immunol. 23, 1330-1341 (2022).
  60. Onal, M., St John, H. C., Danielson, A. L. & Pike, J. W. Deletion of the distal Tnfsf11 RL-D2 enhancer that contributes to PTH-Mediated RANKL expression in osteoblast lineage cells results in a high bone mass phenotype in mice. J. Bone Miner. Res. 31, 416-429 (2016).
  61. Zhou, Y. et al. RANKL+ senescent cells under mechanical stress: a therapeutic target for orthodontic root resorption using senolytics. Int. J. Oral. Sci. 15, 20 (2023).
  62. Wang, Q. et al. Single-cell transcriptomic atlas of gingival mucosa in type 2 diabetes. J. Dent. Res. 101, 1654-1664 (2022).
  63. O’Brien, C. A. Control of RANKL gene expression. Bone 46, 911-919 (2010).
  64. Tsukasaki, M. & Takayanagi, H. Osteoclast biology in the single-cell era. Inflamm. Regen. 42, 27 (2022).
  65. Armingol, E., Officer, A., Harismendy, O. & Lewis, N. E. Deciphering cell-cell interactions and communication from gene expression. Nat. Rev. Genet. 22, 71-88 (2021).
  66. Robinson, J. T. et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  67. Castro-Mondragon, J. A. et al. JASPAR 2022: the 9th release of the open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 50, D165-D173 (2022).
  68. Grant, C. E., Bailey, T. L. & Noble, W. S. FIMO: scanning for occurrences of a given motif. Bioinformatics 27, 1017-1018 (2011).
Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Creative Commons licence, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons licence, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons licence and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this licence, visit http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© The Author(s) 2024
  1. Department of Immunology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan; Department of Microbiology, Tokyo Dental College, 2-1-14 Kanda-Misaki-cho, Chiyoda-ku, Tokyo, Japan; Oral Health Science Center, Tokyo Dental College, 2-9-18, Kanda-Misaki-cho, Chiyodaku, Tokyo, Japan; Department of Osteoimmunology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, The University of Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan; Unit of Prosthodontics, Laboratory of Oral-Maxillofacial Biology Faculty of Odonto-Stomatology, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City, Ho Chi Minh City, Vietnam; Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Department of Sensory and Motor System Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, Tokyo, Japan; Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Keio University School of Medicine, Tokyo, Japan and Department of Laboratory Animal Medicine, Research Institute, National Center for Global Health and Medicine, Tokyo, Japan
    Correspondence: Masayuki Tsukasaki (tsuka-im@m.u-tokyo.ac.jp) or Hiroshi Takayanagi (takayana@m.u-tokyo.ac.jp)