DOI: https://doi.org/10.1093/braincomms/fcag157
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42146854
تاريخ النشر: 2026-01-01
المؤلف: Annemarie Dedek وآخرون
الموضوع الرئيسي: أبحاث علوم الأعصاب وعلم الأدوية العصبية
نظرة عامة
تحدد هذه الفقرة بروتوكولًا جديدًا لتحضير شرائح الحبل الشوكي البشري القابلة للحياة للتسجيلات الكهربية الحادة، مما يعالج فجوة كبيرة في الترجمة بين نماذج القوارض والتطبيقات السريرية البشرية. يتضمن البروتوكول استخراج نسيج الحبل الشوكي من المتبرعين بالأعضاء الذين يوافقون، ويمكن إكماله في 30-50 دقيقة بمساعدة خدمة زراعة الأعضاء وجراح مرخص. بعد الاستخراج، يمكن للطلاب الخريجين المدربين تحضير وتقطيع النسيج في غضون 2.5-5 ساعات، اعتمادًا على متطلبات التجربة.
لضمان جودة الشرائح الشوكية، يتم استخدام صبغة للحيوية، مما يسمح بالتسجيلات اللاحقة باستخدام تقنية الباتش-كلامب لتقييم قابلية إثارة الخلايا العصبية الفردية أو تسجيلات مصفوفة متعددة الأقطاب عالية الكثافة لفحص الدوائر الحسية السليمة. تحافظ الشرائح على قابليتها للحياة لمدة 4 إلى 8 ساعات، مما يسهل استكشاف ديناميات الإشارات على مستوى المشابك والدائرة، بما في ذلك التحقيقات الدوائية للأهداف الجزيئية المحددة. لا يعزز هذا البروتوكول البحث الفسيولوجي القابل للترجمة فحسب، بل يعمل أيضًا كاختبار قيم لتحديد الأهداف الدوائية قبل السريرية والتحقق منها باستخدام الأنسجة البشرية.
مقدمة
تؤكد مقدمة هذه الورقة البحثية على أهمية فهم المحددات الجزيئية في المعالجة الحسية والحركية من خلال نماذج القوارض قبل السريرية كخطوة أساسية لتطوير علاجات جديدة لأمراض الحبل الشوكي. لقد سهلت التقدمات الأخيرة في زراعة الخلايا العصبية الحسية الطرفية البشرية رؤى كبيرة حول الاختلافات بين الأنواع في مجموعات الخلايا العصبية الحسية، والتعبير الجيني المرتبط بالالتهاب، ووظائف قنوات الأيونات. ومن الجدير بالذكر أن تحديد قناة الصوديوم المعتمدة على الجهد 1.8 (Nav1.8) كهدف علاجي أدى إلى تطوير مثبط Nav1.8 المحدد للبشر، سوزيتريجين، الذي حصل على موافقة إدارة الغذاء والدواء لعلاج الألم الحاد.
تسلط الورقة الضوء أيضًا على الدور الحاسم للحبل الشوكي في المعالجة الحسية والحركية، مشيرة إلى النجاح المحدود في ترجمة النتائج من نماذج القوارض إلى التطبيقات السريرية. يقدم المؤلفون عملهم الرائد مع اختبارات فسيولوجيا الحبل الشوكي البشري (hSC)، والتي تسمح بإجراء دراسات مقارنة حول تعبير المستقبلات وخصائص الخلايا العصبية عبر الأنواع وال sexes. تكشف هذه الدراسات عن المحددات الجزيئية المحفوظة للفيزيولوجيا المرضية عبر الأنواع، بينما تحدد أيضًا الاختلافات ذات الصلة سريريًا. تختتم المقدمة بتناول التحديات المتعلقة بإدماج التقنيات الكهربية في اختبارات hSC، والتي تعتبر ضرورية لفحص النقل المشبكي وفعالية الأدوية. يقدم المؤلفون بروتوكولًا لتحضير شرائح hSC الحادة عالية الجودة للتسجيلات الكهربية، مما يعزز الإمكانية للبحث قبل السريري القائم على الأنسجة البشرية.
الطرق
تحدد فقرة الطرق بروتوكولًا مفصلًا لاستخراج وتحضير نسيج الحبل الشوكي البشري (hSC) للتسجيلات الكهربية. تتضمن العملية أربع مراحل رئيسية: الاستخراج الجراحي، والتشريح الدقيق، والتقطيع، واستعادة شرائح النسيج. بعد إزالة الأعضاء للزراعة، يتم جمع hSC من المتبرعين الذين يوافقون ويتم حفظه في محلول سائل الدماغ الشوكي الاصطناعي المؤكسد (aCSF). يخضع النسيج للتشريح الدقيق لإزالة جذور الأعصاب والأغشية، وبعد ذلك يتم تقطيعه إلى شرائح بسمك 500 ميكرومتر باستخدام جهاز الاهتزاز. ثم يتم حضانة هذه الشرائح في غرفة استرداد عند 34 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة قبل أن يتم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة للتسجيلات اللاحقة.
يتطلب تنفيذ هذا البروتوكول التعاون مع خدمات الزراعة والامتثال للموافقات التنظيمية، بما في ذلك موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). يشير المؤلفون إلى أنه منذ إنشاء خط أنابيب جمع الأنسجة الخاص بهم في عام 2017، تمكنوا من الحصول على نسيج hSC بنجاح حوالي عشر مرات في السنة، مع توقف مؤقت خلال جائحة COVID-19. كما تتناول الفقرة المواد والمعدات اللازمة، مع التأكيد على أهمية تقليل فترة ما بعد الوفاة للحفاظ على قابلية النسيج للحياة للدراسات الكهربية.
النتائج
في هذه الفقرة، يوضح المؤلفون نتائج تجارب الكهربية باستخدام تقنية الباتش-كلامب التي أجريت على خلايا عصبية معالجة الألم من الطبقة I من القرن الظهري السطحي (SDH) في الأنسجة البشرية. تضمنت المنهجية اختيار الخلايا العصبية بناءً على معايير شكلية محددة وتسجيل خصائصها الكهربية. أنشأت الدراسة بنجاح تكوينات باتش خلوية كاملة عند جهد ثابت قدره -60 مللي فولت، مما أتاح قياس تيارات ما بعد المشبك المثيرة الصغيرة (mEPSCs) المعتمدة على مستقبلات AMPA. أظهرت mEPSCs المسجلة من ستة خلايا عصبية خصائص موجية متسقة، مع متوسط سعة قدرها $18.44 \pm 8.93 \, \text{pA}$، وزمن ارتفاع قدره $0.27 \pm 0.26 \, \text{ms}$، وثوابت انحلال قدرها $2.76 \pm 1.78 \, \text{ms}$، مما يشير إلى حركية أسرع مقارنةً بالبيانات المبلغ عنها سابقًا من خلايا عصبية الطبقة I للقوارض.
بعد ذلك، تم تحويل الجهد الثابت إلى +60 مللي فولت لالتقاط mEPSCs المعتمدة على مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDAR). كشفت النتائج المتوسطة من تسع خلايا عن ثوابت انحلال قدرها $315.61 \pm 144.66 \, \text{ms}$، وقيم نقل الشحنات قدرها $8.99 \pm 2.90 \, \text{pC}$، وسعات قدرها $21.72 \pm 8.90 \, \text{pA}$. توفر هذه النتائج رؤى حاسمة حول الخصائص الفيزيائية الحيوية لـ mEPSCs المعتمدة على NMDAR، مما يعزز فهم الوظيفة المشبكية والحركية في خلايا SDH البشرية، وهو أمر ضروري لربط الخصائص المشبكية بالنتائج الوظيفية في معالجة الألم.
المناقشة
يبني البروتوكول المطور لتحضير شرائح الحبل الشوكي البشري (hSC) القابلة للحياة للتسجيلات الكهربية على المنهجيات السابقة لزراعة الخلايا العصبية الحسية البشرية وخلايا الجذع/الخلية الجذعية. من خلال استخدام تقنية الاستخراج الجراحي الأمامي، يقلل هذا البروتوكول من الصدمة وفترات ما بعد الوفاة، مما يسهل جمع الأنسجة بكفاءة دون تعطيل الترتيبات الجنائزية. تم إجراء تحسينات رئيسية لاستيعاب الاختلافات التشريحية بين الأنواع، مما يضمن شرائح عالية الجودة مناسبة للفحص الكهربي. أدى دمج الحلول الواقية وتقنيات التقطيع الدقيقة إلى إنشاء اختبار موثوق يسمح بمقارنة الإشارات الجلوتامينية المشبكية والنشاط على مستوى الدائرة عبر الجنس والأنواع، مما يعزز البحث القابل للترجمة وقدرات فحص الأدوية.
تتيح تقنية الكهربية للشرائح الحادة التحقيق في مخرجات عصبية متنوعة، بما في ذلك إمكانيات العمل والنقل المشبكي، والتي كانت صعبة التقييم سابقًا في الأنسجة البشرية. لا يحقق هذا الاختبار فقط نتائج من نماذج القوارض، بل يدعم أيضًا تطبيقات متنوعة مثل تسلسل RNA أحادي النواة والتحليل المناعي النسيجي. تضمن الخطوات التفصيلية للبروتوكول لاستخراج الأنسجة، والتشريح الدقيق، والتقطيع، جنبًا إلى جنب مع إرشادات حل المشكلات، أن الباحثين يمكنهم تعظيم فائدة الأنسجة البشرية الثمينة مع معالجة التحديات المحتملة في قابلية الشرائح للحياة وسلامتها. بشكل عام، يعزز هذا العمل بشكل كبير مجال علم الأعصاب من خلال توفير إطار قوي لدراسة فسيولوجيا الحبل الشوكي البشري وعلم الأمراض.
القيود
تتأثر قيود تحضير الشرائح الحادة بعدة عوامل غير قابلة للتحكم يمكن أن تؤثر على جودة النسيج. يمكن أن تؤثر الصحة العامة للمتبرع قبل جمع الأعضاء والتأخيرات المحتملة في استخراج الأعضاء سلبًا على قابلية النسيج للحياة. في الحالات التي تكون فيها جمع الأعضاء محدودًا، قد يكون الوصول إلى الحبل الشوكي جراحيًا تحديًا، مما يؤدي إلى القدرة على جمع 3-5 سنتيمترات فقط من الحبل الشوكي البشري (hSC) بدلاً من 30 سنتيمترًا المثالية.
بينما يمكن الحصول على أنسجة عالية الجودة من المتبرعين من جميع الأعمار، فإن أولئك الذين قضوا أقل من خمسة أيام في العناية المركزة قبل جمع الأعضاء يميلون إلى إنتاج عينات ذات جودة أعلى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تجارب كهربية ناجحة باستخدام أنسجة من كل من المتبرعين بتحديد الموت العصبي (NDD) وتحديد الموت القلبي (DCD)؛ ومع ذلك، فإن حالات NDD توفر عمومًا أنسجة ذات جودة أعلى بسبب الفترة الزمنية المختصرة بين توقف الرعاية الداعمة وجمع الأنسجة. من المهم ملاحظة أن عملية تحضير الشرائح الحادة تؤدي حتمًا إلى استجابة التهابية وبعض فقدان الخلايا. ومع ذلك، يضمن بروتوكول استرداد الشرائح الموضح، المدعوم بالتحقق من الحيوية من خلال صبغة TTC، أن الأنسجة المستخدمة في التجارب قوية وذات جودة كافية.
DOI: https://doi.org/10.1093/braincomms/fcag157
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42146854
Publication Date: 2026-01-01
Author(s): Annemarie Dedek et al.
Primary Topic: Neuroscience and Neuropharmacology Research
Overview
The section outlines a novel protocol for preparing viable human spinal cord slices for acute electrophysiological recordings, addressing a significant translational gap between rodent models and human clinical applications. The protocol involves the extraction of spinal cord tissue from consenting organ donors, which can be completed in 30-50 minutes with the assistance of a transplant service and a licensed surgeon. Following extraction, trained graduate students can prepare and section the tissue within 2.5-5 hours, depending on experimental requirements.
To ensure the quality of the spinal slices, a viability stain is employed, allowing for subsequent patch-clamp recordings to assess individual neuron excitability or high-density multielectrode array recordings to examine intact sensory circuits. The slices maintain viability for 4 to 8 hours, facilitating the exploration of synaptic and circuit-level signaling dynamics, including pharmacological investigations of specific molecular targets. This protocol not only enhances translational physiological research but also serves as a valuable assay for preclinical drug target identification and validation using human tissue.
Introduction
The introduction of this research paper emphasizes the importance of understanding molecular determinants in sensory and motor processing through rodent preclinical models as a foundational step for developing new treatments for spinal cord diseases. Recent advancements in culturing human peripheral sensory neurons have facilitated significant insights into species differences in sensory neuron subpopulations, inflammation-associated gene expression, and ion channel functionality. Notably, the identification of the voltage-gated sodium channel 1.8 (Nav1.8) as a therapeutic target has led to the development of the human-specific Nav1.8 inhibitor, Suzetrigine, which has received FDA approval for treating acute pain.
The paper also highlights the critical role of the spinal cord in sensory and motor processing, noting the limited success in translating findings from rodent models to clinical applications. The authors introduce their pioneering work with human spinal cord (hSC) physiology assays, which allow for comparative studies of receptor expression and neuronal properties across species and sexes. These studies reveal conserved molecular determinants of pathophysiology across species, while also identifying clinically relevant differences. The introduction concludes by addressing the challenges of incorporating electrophysiological techniques into hSC assays, which are essential for examining synaptic transmission and drug efficacy. The authors present a protocol for preparing high-quality acute hSC slices for electrophysiological recordings, thereby enhancing the potential for human tissue-based preclinical research.
Methods
The methods section outlines a detailed protocol for the extraction and preparation of human spinal cord (hSC) tissue for electrophysiological recordings. The process involves four key stages: surgical extraction, microdissection, sectioning, and recovery of the tissue slices. Following organ removal for transplantation, hSC is collected from consenting donors and preserved in an oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF) solution. The tissue undergoes microdissection to eliminate nerve roots and meninges, after which it is sectioned into 500 µm slices using a vibratome. These slices are then incubated in a recovery chamber at 34°C for 40 minutes before being cooled to room temperature for subsequent recordings.
The implementation of this protocol requires collaboration with transplant services and adherence to regulatory approvals, including Institutional Review Board (IRB) consent. The authors note that since establishing their tissue collection pipeline in 2017, they have successfully obtained hSC tissue approximately ten times per year, with a temporary pause during the COVID-19 pandemic. The section also details the necessary reagents and equipment, emphasizing the importance of minimizing the postmortem interval to maintain tissue viability for electrophysiological studies.
Results
In this section, the authors detail the results of patch-clamp electrophysiology experiments conducted on pain-processing neurons from the lamina I of the superficial dorsal horn (SDH) in human tissue. The methodology involved selecting neurons based on specific morphological criteria and recording their electrophysiological properties. The study successfully established whole-cell patch configurations at a holding potential of -60 mV, enabling the measurement of α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) receptor-mediated miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The recorded mEPSCs from six neurons exhibited consistent waveform characteristics, with an average amplitude of $18.44 \pm 8.93 \, \text{pA}$, a rise time of $0.27 \pm 0.26 \, \text{ms}$, and decay constants of $2.76 \pm 1.78 \, \text{ms}$, indicating faster kinetics compared to previously reported data from rat lamina I neurons.
Subsequently, the holding potential was shifted to +60 mV to capture N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR)-mediated mEPSCs. The averaged results from nine cells revealed decay constants of $315.61 \pm 144.66 \, \text{ms}$, charge transfer values of $8.99 \pm 2.90 \, \text{pC}$, and amplitudes of $21.72 \pm 8.90 \, \text{pA}$. These findings provide critical insights into the biophysical properties of NMDAR-mediated mEPSCs, enhancing the understanding of synaptic function and kinetics in human SDH neurons, which is essential for linking synaptic characteristics to functional outcomes in pain processing.
Discussion
The developed protocol for preparing viable human spinal cord (hSC) slices for electrophysiological recording builds upon prior methodologies for culturing human sensory neurons and neural stem/progenitor cells. By employing an anterior surgical extraction technique, this protocol minimizes trauma and postmortem intervals, facilitating efficient tissue collection without disrupting funeral arrangements. Key optimizations were made to accommodate anatomical differences between species, ensuring high-quality slices suitable for electrophysiological examination. The integration of protective solutions and precise sectioning techniques has resulted in a reliable assay that allows for the comparison of synaptic glutamatergic signaling and circuit-level activity across sex and species, thereby enhancing translational research and drug screening capabilities.
The acute slice electrophysiology technique enables the investigation of various neuronal outputs, including action potentials and synaptic transmission, which were previously challenging to assess in human tissue. This assay not only validates findings from rodent models but also supports diverse applications such as single-nucleus RNA sequencing and immunohistochemical analysis. The protocol’s detailed steps for tissue extraction, microdissection, and sectioning, along with troubleshooting guidelines, ensure that researchers can maximize the utility of the precious human tissue while addressing potential challenges in slice viability and integrity. Overall, this work significantly advances the field of neuroscience by providing a robust framework for studying human spinal cord physiology and pathology.
Limitations
The limitations of acute slice preparation are influenced by several uncontrollable factors that can compromise tissue quality. The overall health of the donor prior to organ harvest and potential delays in organ extraction can adversely affect the viability of the tissue. In instances where organ collection is limited, accessing the spinal cord surgically may be challenging, resulting in the ability to harvest only 3-5 centimeters of human spinal cord (hSC) instead of the optimal 30 centimeters.
While high-quality tissue can be obtained from donors of all ages, those who have spent less than five days in intensive care prior to organ collection tend to yield superior quality samples. Additionally, successful electrophysiological experiments can be conducted using tissue from both neurologic determination of death (NDD) and determination of cardiac death (DCD) donors; however, NDD cases generally provide higher quality tissue due to the reduced interval between the cessation of supportive care and tissue collection. It is important to note that the acute slice preparation process inevitably induces an inflammatory response and some cellular loss. Nonetheless, the outlined slice recovery protocol, complemented by viability validation through TTC staining, ensures that the tissue utilized for experiments is robust and of adequate quality.