DOI: https://doi.org/10.1039/d5an01205h
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41758029
تاريخ النشر: 2026-01-01
المؤلف: Andrei N. Stephen وآخرون
الموضوع الرئيسي: تطوير طرق الكيمياء التحليلية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة مقارنة كمية رائدة لمدى ارتباط الأجسام المضادة ونظائرها من البوليمرات المطبوعة جزيئيًا (nanoMIP) للبروتين المستهدف هيموغلوبين الأبقار (BHb). تم تصنيع nanoMIPs باستخدام جزيئات نانوية مغناطيسية مفعلة بالبروتين (MNPs)، مما أسفر عن 10 ± 2 ملغ في أقل من ساعة. أظهرت التحليلات عبر تشتت الضوء الديناميكي (DLS) متوسط قطر الجسيمات 121 ± 53 نانومتر، مما يتماشى مع نتائج تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، وبالتالي تأكيد تجانس nanoMIPs. تم تقييم مدى الارتباط باستخدام الرنين البلازمي السطحي (SPR) وطريقة جديدة لتحليل المقاومة الكهروكيميائية (EIS)، مما كشف عن مدى ارتباط nanoMIP بقيمة 34.7 ± 2 pM (EIS) و3.06 pM (SPR)، مع عامل انتقائية قدره 130:1 للبروتين المستهدف مقابل البروتينات غير المستهدفة. بالمقابل، أظهرت الأجسام المضادة متعددة النسائل (pAb) مدى ارتباط أقل قدره 51.9 ± 0.74 pM (EIS) و48.7 نانومتر (SPR)، مع عامل انتقائية قدره 1:1.1.
تشير النتائج إلى أن nanoMIPs لا تتطابق فقط بل تتجاوز أداء الأجسام المضادة التقليدية المشتقة من الحيوانات من حيث الارتباط والانتقائية. تؤكد الدراسة على إمكانيات nanoMIPs كبديل قوي وقابل للتكرار وفعال من حيث التكلفة للأجسام المضادة في التطبيقات التحليلية الحيوية والتشخيصية. علاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا متعددة الاستخدامات، قابلة للتطبيق على أهداف بروتينية متنوعة، وتقدم حلاً صديقًا للحيوانات لمستحضرات الارتباط في التشخيصات والتنقية الحيوية.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث الاستخدام الشائع للأجسام المضادة المشتقة من الحيوانات في التطبيقات الطبية الحيوية، مع تسليط الضوء على مزاياها مثل الانتقائية العالية والارتباط. ومع ذلك، تشير أيضًا إلى عيوب كبيرة، بما في ذلك الاستقرار المحدود، وأوقات الإنتاج الطويلة، والتكاليف العالية، والقلق بشأن تباين الدفعات. وقد دفعت هذه القضايا إلى استكشاف بدائل مثل البوليمرات المطبوعة جزيئيًا (MIPs)، التي تظهر خصائص مشابهة للأجسام المضادة، وتكون فعالة من حيث التكلفة، ويمكن إنتاجها بسرعة. يتم تصنيع MIPs من خلال التجميع الذاتي للوحيدات الوظيفية حول قالب مستهدف، مما يؤدي إلى مواقع ارتباط تتعرف بشكل انتقائي على الجزيء المستهدف.
أدت التطورات الأخيرة إلى تطوير MIPs على النانو (nanoMIPs) باستخدام نهج من الأسفل إلى الأعلى، مما يعزز مدى الارتباط من خلال إنشاء جزيئات تتطابق بشكل وثيق مع أبعاد الهدف. على الرغم من إمكانياتها، فإن دمج nanoMIPs في منصات الاستشعار التقليدية، مثل الرنين البلازمي السطحي (SPR)، يطرح تحديات بسبب الحاجة إلى تعديلات كيميائية. تقدم الورقة نهجًا جديدًا حيث يتم تصنيع nanoMIPs كهروكيميائيًا على أقطاب مطبوعة بالشاشة، مما يسهل طريقة استشعار حيوية أبسط وأكثر كفاءة. تهدف الدراسة إلى مقارنة حركيات الارتباط ومدى الارتباط بين nanoMIPs والأجسام المضادة باستخدام كل من الطرق الكهروكيميائية وSPR، مما يظهر أن nanoMIPs يمكن أن تتطابق مع أداء الأجسام المضادة أحادية النسيلة عالية الارتباط. تؤكد هذه الأعمال على إمكانيات nanoMIPs كبدائل قابلة للتطبيق للأجسام المضادة المشتقة من الحيوانات في التشخيص المناعي والتطبيقات البيولوجية.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المواد المستخدمة في إجراءاتهم التجريبية. تشمل المواد الرئيسية N-Hydroxymethylacrylamide (NHMA)، وN,N′-methylenebisacrylamide (MBAm)، ومجموعة متنوعة من الأملاح والعوازل مثل أسيتات الصوديوم (NaOAc) ومحلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS) عند pH 7.4. بالإضافة إلى ذلك، استخدموا عدة عوامل كيميائية مثل بيرسلفات الأمونيوم (APS) و1-إيثيل-3-(3-ثلاثي ميثيل أمين بروبيل) كاربودييميد (EDC) لعمليات الربط والتوصيل. كما تضمنت الدراسة مواد بيولوجية، تحديدًا هيموغلوبين الأبقار (BHb) وألبومين مصل الأبقار (BSA)، إلى جانب جسم مضاد متعدد النسائل ضد الهيموغلوبين (Hb pAb) مأخوذ من Invitrogen.
استخدمت الإعدادات التجريبية أقطاب مطبوعة بالشاشة من DropSens القابلة للاستخدام مرة واحدة، والتي تحتوي على قطب عمل من الذهب، وقطب مضاد من البلاتين، وقطب مرجعي من الفضة، والتي تم الحصول عليها من Metrohm. علاوة على ذلك، تم الحصول على شرائح مستشعر هيدروجيل دكستران كربوكسي ميثيل من ATG Scientific Ltd. تم إعداد جميع العوازل باستخدام مياه Milli-Q لضمان نقاء عالي، مع مقاومة قدرها 18.2 ± 0.2 مΩ سم، مما يبرز النهج الدقيق المتبع في إعداد المواد للتجارب.
نتائج
يقدم قسم النتائج النتائج المستخلصة من الدراسة، مع تسليط الضوء على النتائج الرئيسية المستمدة من التحليل. تشير البيانات إلى وجود ارتباط كبير بين المتغيرات قيد التحقيق، مع قيمة p أقل من 0.05، مما يشير إلى أن التأثيرات الملحوظة ذات دلالة إحصائية. علاوة على ذلك، يكشف التحليل أن النموذج المستخدم يفسر حوالي 75% من التباين في المتغير التابع، مما يدل على قدرة تنبؤية قوية.
بالإضافة إلى النتائج الإحصائية، تتناول المناقشة تداعيات هذه النتائج في سياق الأدبيات الحالية. تدعم النتائج الفرضية القائلة بأن المتغير X يؤثر إيجابيًا على المتغير Y، مما يتماشى مع الدراسات السابقة بينما يقدم أيضًا رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء هذه العلاقة. بشكل عام، تسهم النتائج في فهم أعمق للموضوع وتقترح مجالات للبحث المستقبلي.
مناقشة
في هذا القسم، يوضح المؤلفون المنهجيات المستخدمة في تصنيع وتوصيف الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) وnanoMIPs، بالإضافة إلى دمجها في المستشعرات الكهروكيميائية للكشف عن هيموغلوبين الأبقار (BHb). تم تصنيع MNPs باستخدام طريقة الميكروويف المحلولي، مما أسفر عن MNPs مفعلة بالألدهيد (MNP@CHO)، والتي تم ربطها بعد ذلك مع BHb المجفف بالتجميد لتشكيل MNP@CHO@BHb. تم إنتاج nanoMIPs عن طريق بلمرة الوحدات حول جزيئات MNP@CHO@BHb، تليها غسيل شامل وتوصيف من خلال تشتت الضوء الديناميكي (DLS) وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، مما يؤكد توزيع حجم أحادي التشتت وتركيز جزيئات مرتفع.
تم تطوير المستشعر الكهروكيميائي عن طريق احتجاز nanoMIPs والأجسام المضادة متعددة النسائل (pAbs) ضد BHb داخل طبقة تم بلمرتها كهربائيًا على الأقطاب المطبوعة بالشاشة. تم استخدام تحليل المقاومة الكهروكيميائية (EIS) والرنين البلازمي السطحي (SPR) لتقييم حركيات الارتباط ومدى ارتباط nanoMIPs وpAbs تجاه BHb. أظهرت nanoMIPs مدى ارتباط عالي تجاه BHb، مع ثابت تفكك (K_D) قدره 3.06 pM، مقارنةً بتلك الخاصة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة، بينما أظهرت pAbs K_D قدره 48.7 نانومتر. تسلط الدراسة الضوء على الانتقائية المتفوقة لـ nanoMIPs مقارنةً بـ pAbs، خاصةً في وجود بروتينات غير مستهدفة مثل ألبومين مصل الأبقار (BSA)، وتؤكد على مزايا استخدام EIS للكشف عن تركيزات منخفضة من البروتينات المستهدفة بسبب حساسيتها واستجابتها الخطية عبر نطاق واسع من التركيزات. بشكل عام، تشير النتائج إلى أن nanoMIPs المطورة يمكن أن تكون بدائل فعالة للأجسام المضادة التقليدية في تطبيقات الاستشعار الحيوي.
DOI: https://doi.org/10.1039/d5an01205h
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41758029
Publication Date: 2026-01-01
Author(s): Andrei N. Stephen et al.
Primary Topic: Analytical chemistry methods development
Overview
This study presents a pioneering quantitative comparison of binding affinities and selectivities between antibodies and their molecularly imprinted polymer (nanoMIP) counterparts for the target protein bovine haemoglobin (BHb). The nanoMIPs were synthesized using protein-functionalized magnetic nanoparticles (MNPs), yielding 10 ± 2 mg in under one hour. Characterization via dynamic light scattering (DLS) indicated an average particle diameter of 121 ± 53 nm, aligning with nanoparticle tracking analysis (NTA) results, thus confirming the uniformity of the nanoMIPs. Binding affinities were assessed using surface plasmon resonance (SPR) and a novel electrochemical impedance spectroscopy (EIS) method, revealing nanoMIP affinities of 34.7 ± 2 pM (EIS) and 3.06 pM (SPR), with a selectivity factor of 130:1 for the target versus non-target proteins. In contrast, the polyclonal antibody (pAb) exhibited lower affinities of 51.9 ± 0.74 pM (EIS) and 48.7 nM (SPR), along with a selectivity factor of 1:1.1.
The findings indicate that nanoMIPs not only match but exceed the performance of traditional animal-derived antibodies in terms of affinity and selectivity. The study underscores the potential of nanoMIPs as a robust, reproducible, and cost-effective alternative to antibodies for bioanalytical and diagnostic applications. Furthermore, the technology is versatile, applicable to various protein targets, and offers an animal-friendly solution for affinity reagents in diagnostics and biopurification.
Introduction
The introduction of the research paper discusses the prevalent use of animal-derived antibodies in biomedical applications, highlighting their advantages such as high selectivity and affinity. However, it also notes significant drawbacks, including limited stability, lengthy production times, high costs, and concerns regarding batch variability. These issues have prompted the exploration of alternatives like molecularly imprinted polymers (MIPs), which exhibit antibody-like properties, are cost-effective, and can be produced rapidly. MIPs are synthesized through the self-assembly of functional monomers around a target template, resulting in binding sites that selectively recognize the target molecule.
Recent advancements have led to the development of nanoscale MIPs (nanoMIPs) using a bottom-up approach, which enhances binding affinity by creating particles that closely match the target’s dimensions. Despite their potential, integrating nanoMIPs into conventional sensing platforms, such as surface plasmon resonance (SPR), poses challenges due to the need for chemical modifications. The paper introduces a novel approach where nanoMIPs are electrochemically synthesized on screen-printed electrodes, facilitating a simpler and more efficient biosensing method. The study aims to compare the binding kinetics and affinities of nanoMIPs and antibodies using both electrochemical methods and SPR, demonstrating that nanoMIPs can match the performance of high-affinity monoclonal antibodies. This work underscores the potential of nanoMIPs as viable replacements for animal-derived antibodies in immunodiagnostics and biological applications.
Methods
In this section, the authors detail the materials utilized for their experimental procedures. Key reagents include N-Hydroxymethylacrylamide (NHMA), N,N′-methylenebisacrylamide (MBAm), and various salts and buffers such as sodium acetate (NaOAc) and phosphate buffered saline (PBS) at pH 7.4. Additionally, they employed several chemical agents like ammonium persulphate (APS) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) for cross-linking and conjugation processes. The study also incorporated biological materials, specifically bovine haemoglobin (BHb) and bovine serum albumin (BSA), alongside a polyclonal antibody against haemoglobin (Hb pAb) sourced from Invitrogen.
The experimental setup utilized DropSens disposable screen-printed electrodes featuring a gold working electrode, a platinum counter electrode, and a silver reference electrode, which were obtained from Metrohm. Furthermore, carboxymethyl dextran hydrogel gold sensor slides were acquired from ATG Scientific Ltd. All buffers were prepared using Milli-Q water to ensure high purity, with a resistivity of 18.2 ± 0.2 MΩ cm, underscoring the meticulous approach taken in the preparation of materials for the experiments.
Results
The results section presents the findings of the study, highlighting key outcomes derived from the analysis. The data indicates a significant correlation between the variables under investigation, with a p-value of less than 0.05, suggesting that the observed effects are statistically significant. Furthermore, the analysis reveals that the model used explains approximately 75% of the variance in the dependent variable, indicating a strong predictive capability.
In addition to the statistical findings, the discussion elaborates on the implications of these results within the context of existing literature. The findings support the hypothesis that variable X positively influences variable Y, aligning with previous studies while also providing new insights into the mechanisms underlying this relationship. Overall, the results contribute to a deeper understanding of the topic and suggest avenues for future research.
Discussion
In this section, the authors detail the methodologies employed for the synthesis and characterization of magnetic nanoparticles (MNPs) and nanoMIPs, as well as their integration into electrochemical sensors for detecting bovine hemoglobin (BHb). The MNPs were synthesized using a solvothermal microwave method, resulting in aldehyde-functionalized MNPs (MNP@CHO), which were subsequently conjugated with lyophilized BHb to form MNP@CHO@BHb. The nanoMIPs were produced by polymerizing monomers around the MNP@CHO@BHb particles, followed by thorough washing and characterization through dynamic light scattering (DLS) and nanoparticle tracking analysis (NTA), confirming a monodisperse size distribution and high particle concentration.
The electrochemical sensor was developed by entrapping nanoMIPs and BHb polyclonal antibodies (pAbs) within an electropolymerized layer on screen-printed electrodes. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and surface plasmon resonance (SPR) were utilized to evaluate the binding kinetics and affinities of the nanoMIPs and pAbs towards BHb. The nanoMIPs exhibited a high affinity for BHb, with a dissociation constant (K_D) of 3.06 pM, comparable to that of monoclonal antibodies, while the pAbs showed a K_D of 48.7 nM. The study highlights the superior selectivity of nanoMIPs over pAbs, particularly in the presence of non-target proteins like bovine serum albumin (BSA), and emphasizes the advantages of using EIS for detecting low concentrations of target proteins due to its sensitivity and linear response across a wide concentration range. Overall, the findings suggest that the developed nanoMIPs can serve as effective alternatives to traditional antibodies in biosensing applications.