منصة نانوية مضادة للميكروبات تعتمد على العلاج الضوئي والعلاج بأكسيد النيتريك: نظام متقدم لري قنوات الجذور لعلاج العدوى البكتيرية في طب الأسنان Photodynamic and nitric oxide therapy-based synergistic antimicrobial nanoplatform: an advanced root canal irrigation system for endodontic bacterial infections

المجلة: Journal of Nanobiotechnology، المجلد: 22، العدد: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12951-024-02483-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38689259
تاريخ النشر: 2024-04-30

منصة نانوية مضادة للميكروبات تعتمد على العلاج الضوئي والعلاج بأكسيد النيتريك: نظام متقدم لري قنوات الجذور لعلاج العدوى البكتيرية في طب الأسنان

يويون زينغ شيانغيو زهيبين كاي دونغتشاو تشيو ينغ ران ييشين دينغ جياي شي شياوجون كاي ويهوى بان

الملخص

الخلفية: القضايا الرئيسية التي تواجه أثناء علاج التهاب اللثة القمي هي إدارة العدوى البكتيرية وتسهيل إصلاح عيوب العظام السنخية لتقصير مدة المرض. تعتبر المواد المستخدمة في غسل قنوات الجذور التقليدية محدودة في فعاليتها وترتبط بعدة آثار جانبية. تقدم هذه الدراسة علاجًا تآزريًا يعتمد على أكسيد النيتريك (NO) والعلاج الضوئي المضاد للميكروبات (aPDT) لعلاج التهاب اللثة القمي. النتائج: طورت هذه الأبحاث جزيئات نانوية متعددة الوظائف، CGP، باستخدام بولي (إيثيلين جلايكول) المشتق من الجوانيدين. تم استخدام بوليمر (كابرو لاكتون) كحامل، محملاً داخليًا بالمواد الحساسة للضوء الكلورين e6. خلال ري قناة الجذر، مكنت مجموعات الغوانيدين على سطح CGP من اختراق البيوفيلم بشكل فعال. تخضع هذه المجموعات للأكسدة بواسطة بيروكسيد الهيدروجين في عملية aPDT، مما يؤدي إلى إطلاق NO دون عرقلة إنتاج الأكسجين الأحادي. عزز NO الناتج بشكل كبير القدرة المضادة للميكروبات وفعالية القضاء على البيوفيلم في aPDT. علاوة على ذلك، لا يتفوق CGP فقط على aPDT التقليدي في القضاء على البيوفيلم، بل يعزز أيضًا بشكل فعال إصلاح عيوب العظام السنخية بعد القضاء. من المهم أن تكشف نتائجنا أن CGP يظهر أمانًا حيويًا أعلى بكثير مقارنةً بالهيبوكلوريت الصوديومي، إلى جانب فعالية علاجية متفوقة في نموذج الفئران لالتهاب اللثة القمي. الاستنتاجات: تُظهر هذه الدراسة أن CGP، وهو نظام فعال لري الجذر يعتمد على aPDT وNO، له تطبيق واعد في علاج قناة الجذر.

الكلمات الرئيسية: العلاج الضوئي المضاد للميكروبات، علاج غاز أكسيد النيتريك، ري قنوات الجذور، الجسيمات النانوية متعددة الوظائف، الأغشية الحيوية، المضادات الميكروبية، تكوين العظام
ساهم يويون زينغ وشياو يهو بشكل متساوٍ في هذا البحث.
*المراسلة:
شياوجون كاي
cxj520118@wmu.edu.cn; cxj520118@njtech.edu.cn
يهوى بان
yihuaipan@wmu.edu.cn
مدرسة ومستشفى طب الأسنان، جامعة ونتشو الطبية، ونتشو 325027، الصين

مقدمة

التهاب جذر السن (AP) هو حالة التهابية ناتجة بشكل أساسي عن العدوى البكتيرية، مما يؤدي إلى تدمير العظم السنخي [1]. إذا لم يتم علاجها بشكل صحيح، يمكن أن تتصاعد AP إلى مضاعفات خطيرة مثل التهاب النسيج الخلوي، والتهاب العظم في الفك، والإنتان [2]. ومن الجدير بالذكر أن انتشار AP على مستوى العالم يُبلغ عنه بأنه حوالي [3]. العلاج التقليدي لقناة الجذر، الذي يهدف
يتضمن معالجة قناة الجذر إزالة الأنسجة اللبية المصابة والميكروبات، تليها تعقيم وملء قناة الجذر بمادة غير نشطة. عادةً ما تستخدم هذه العملية التحضير الميكانيكي والري الكيميائي للسيطرة على العدوى. ومع ذلك، فإن التعقيد في تشريح نظام قناة الجذر، إلى جانب الوجود المستمر للأغشية الحيوية، يعيق بشكل كبير فعالية هذه العلاجات. معدل فشل علاج قناة الجذر هو وبالتالي، فإن تطوير علاجات فعالة لمرض AP أمر بالغ الأهمية.
فشل علاج قناة الجذر يعود أساسًا إلى احتباس الميكروبات، التي تقاوم جهود التعقيم وتشكل أغشية حيوية في قنوات الجذر. في الوقت نفسه، تحمي هذه الأغشية الحيوية البكتيريا من خلال عرقلة اختراق العوامل العلاجية وتعزيز بيئة ملائمة لزيادة مقاومة الأدوية. هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO)، هو المحلول المفضل لري قنوات الجذر في العيادات، ويتميز بخصائص مضادة للميكروبات وقدرة على إذابة الأنسجة. ومع ذلك، قد يؤدي التسرب غير المقصود لـ NaClO خارج قناة الجذر إلى مضاعفات خطيرة، بما في ذلك إصابة التهابية حادة، نخر الغشاء المخاطي، نخر العظام، واحتقان مجرى الهواء الذي قد يهدد الحياة. في التهاب السنخ الحاد، غالبًا ما تؤدي تهيجات مسببة للأمراض في الجزء القمي إلى امتصاص وتدمير العظام السنخية المجاورة. السيطرة الفعالة على العدوى وتسهيل إصلاح عيوب العظام السنخية لتقصير مدة المرض يمثل تحديًا. لذلك، فإن تطوير أنظمة ري قنوات الجذر آمنة وقابلة للتحكم يمكنها اختراق وإزالة الأغشية الحيوية بكفاءة، بالإضافة إلى تعزيز إصلاح العظام السنخية، هو أمر في غاية الأهمية.
العلاج الضوئي المضاد للميكروبات (aPDT) هو استراتيجية مضادة للميكروبات فعالة وغير جراحية، توفر تحكمًا زمنيًا ومكانيًا دقيقًا، وخصائص مضادة للميكروبات واسعة الطيف وإزالة الأغشية الحيوية. يعمل من خلال تنشيط المواد الحساسة للضوء باستخدام الليزر عند أطوال موجية محددة، مما يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، مثل الجذور الهيدروكسيلية، وأنيون السوبر أوكسيد، وبيروكسيد الهيدروجين. وأكسجين مفرد هذه الأنواع من الجذور الحرة (ROS) قاتلة للبكتيريا، مما يسبب ضررًا لأغشية الخلايا والبروتينات والدهون والأحماض النووية [12،13]. تُظهر فعالية في تثبيط الأغشية الحيوية لجرحى الحروق، والقرحات السكرية المزمنة، والأغشية الحيوية الفموية، مما يجعل العلاج الضوئي المعتمد على الأدوية (aPDT) واعدًا لعلاج التهاب اللثة (AP) [14-16]. ومع ذلك، فإن فعاليته تتعرض للتحدي في البيئات الدقيقة منخفضة الأكسجين للأغشية الحيوية بسبب طبيعته المعتمدة على الأكسجين [17، 18]. علاوة على ذلك، فإن معظم المواد الحساسة للضوء العضوية التقليدية غير قابلة للذوبان في الماء وعرضة للتجمع في الظروف الفسيولوجية، مما يقلل من إنتاج الجذور الحرة [19، 20]. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام تركيزات عالية من المواد الحساسة للضوء في العلاج الضوئي المعتمد على الأدوية (aPDT) إلى إنتاج كميات مفرطة من الجذور الحرة. قد تؤدي هذه التركيزات المرتفعة من الجذور الحرة إلى
يؤدي إلى استجابة التهابية مستمرة، والتي بدورها يمكن أن تؤثر سلبًا على عملية تكوين العظام. للتغلب على هذه التحديات، ركزت الأبحاث على دمج العلاج الضوئي المعتمد على الأكسجين مع طرق علاجية بديلة. تستكشف هذه الدراسة دمج العلاج الضوئي المعتمد على الأكسجين مع العلاج بالغاز، بهدف تعزيز فعالية القضاء على الأغشية الحيوية والتخفيف من الآثار الضارة لمستويات ROS المرتفعة.
لقد حظيت علاج الغاز، وخاصة مع أكسيد النيتريك (NO)، وهو جزيء غاز داخلي، مؤخرًا باهتمام كاستراتيجية علاجية خضراء، مشهورة بسميتها الخفيفة وخصائص عدم المقاومة [25، 26]. يلعب NO دورًا متعدد الأوجه، حيث يساهم في مكافحة العدوى، وتنظيم الالتهاب، وتكوين العظام [27-30]. كعامل مضاد للميكروبات قوي، يتفاعل NO مع الجذير الحر سوبر أوكسيد لإنتاج نواتج تفاعلية، مما يؤدي إلى تأثيرات مضادة للميكروبات من خلال أكسدة الدهون، وتلف الحمض النووي، واضطراب البروتينات [29، 31]. بالإضافة إلى ذلك، يُعرف أن NO يحفز تكوين العظام من خلال تعزيز نشاط الخلايا العظمية [32]. أظهرت الدراسات أن خط خلايا العظام MC3T3-E1 أو خلايا اللب، عند معالجتها بمُتبرعات NO، تُظهر زيادة في التعبير عن علامات تكوين العظام [33، 34]. لذلك، فإن القدرة المزدوجة لـ NO على مكافحة وجود الميكروبات بكفاءة وتعزيز إصلاح عيوب العظام تمثل طريقًا واعدًا في إدارة التهاب اللثة.
في دراستنا السابقة [13]، أظهرنا أن الببتيدات الشجرية الغنية بـ L-أرجينين قادرة على العمل كمانحات NO جزيئية كبيرة، حيث تطلق NO استجابةً للأكسدة بواسطة . علاوة على ذلك، فإن وجود مجموعة الغوانيدين في L-أرجينين يعزز بشكل كبير قدرة اختراق البيوفيلم لهذه الببتيدات الشجرية. استنادًا إلى هذه الرؤى، نقترح أن الجسيمات النانوية المعدلة بمجموعات الغوانيدين يمكن أن تعمل بشكل مشابه كمانحات لأكسيد النيتريك وتظهر نفاذية استثنائية للبيوفيلم. هذا المفهوم يدعم نهجنا في تطوير نظام فعال لري قنوات الجذور، مستفيدين من هذه الخصائص لمكافحة العدوى في العلاجات اللبية.
في الدراسة الحالية، قمنا بتطوير وتصنيع بوليمر (البولي إيثيلين جلايكول) المضاف إليه مجموعة جوانيدين. كوبوليمرات الكتلة (PEG-PCL) (كابرو لاكتون) واستخدمناها لتشكيل نانوميسيلات محملة بالكلورين e6 (Ce6)، المسماة CGP (المخطط 1). تم تصميم هذه النانوميسيلات CGP خصيصًا لاختراق الأغشية الحيوية بفعالية خلال عملية ري قناة الجذر. الاستفادة من تم إنتاجه بواسطة Ce6 في عملية aPDT، تم تصميم CGP لأكسدة وإطلاق NO. من المتوقع أن يتعاون هذا الإطلاق لـ NO مع ROS الناتجة خلال aPDT، مما يؤدي إلى نشاط مضاد للبكتيريا قوي وإزالة فعالة للبيوفيلم. بالإضافة إلى ذلك، بعد النجاح في العمل المضاد للبكتيريا وإزالة البيوفيلم، من المتوقع أن تساعد نانوميسيلات CGP في إصلاح عيوب العظام المحيطية.
المخطط 1: مخطط تحضير CGP وتأثير PDT/NO المضاد للبكتيريا التآزري. تمثيل تخطيطي لتحضير CGP، مصحوبًا بتوضيح الآليات الكامنة وراء التأثير المضاد للبكتيريا التآزري الفعال للغاية لـ PDT/NO ودوره في تعزيز شفاء التهاب ذروة السن.
مما يعزز بشكل كبير فعالية العلاج العامة.
يجمع بين aPDT و NO مسارًا واعدًا لتطوير نظام جديد متعدد الوظائف لري قنوات الجذور. تم تصميم هذه الدراسة لتقييم القدرات المضادة للبكتيريا، وإزالة الأغشية الحيوية، والتمايز العظمي لـ CGP من خلال عد المستعمرات، واختبارات صلاحية البكتيريا الحية/الميتة، وري قنوات الجذور المحاكية، وتجارب التمايز العظمي، بالإضافة إلى الاختبارات العلاجية في نموذج التهاب ذروة الأسنان في الجرذان. بالمقارنة مع NaClO، من المتوقع أن يمتلك CGP خصائص مضادة للميكروبات، بالإضافة إلى قدرات تحكم زمنية ومكانية متفوقة، فضلاً عن قدرة فريدة على تسهيل إصلاح عيوب العظام القمية. نتوقع أن تكون هذه الدراسة قد طورت نظام ري قادرًا على علاج التهاب ذروة الأسنان بأمان وفعالية.

المواد والطرق

المواد

بولي (إيثيلين جلايكول) المنتهي بالأمين- كابرو لاكتون -PEG-PCL) تم الحصول عليه من بونسور (شنغهاي، الصين). تم الحصول على Ce6 من Frontier Scientific (الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء 1-أميدينوبيرازول هيدروكلوريد، N، N-دييسوبروبيل إيثيل أمين، ثنائي كلور الميثان، جلاutaraldehyde، إيثانول، ميثانول، كلوريد سيتيل بيريدينيوم، كريستال فيوليت، حمض الأسيتيك، وNaClO من Aladdin (شنغهاي، الصين). تم الحصول على إنزيم البيروكسيداز من الفجل، ملح ثنائي الصوديوم لحمض الإيثيلين ثنائي الأمين، محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS)، محلول ملحي عادي (NS)، مجموعة صبغة هيماتوكسيليين-إيوزين (HE)، ومجموعة صبغة الفوسفاتاز الحمضي المقاوم للتارتارات (TRAP) من Solarbio (الصين). ثنائي ميثيل سلفوكسيد، -غليسيروفوسفات، و
تم الحصول على حمض الأسكوربيك من سيغما-ألدريتش (الولايات المتحدة الأمريكية). كاشف غريس، طقم اختبار، مستشعر الأكسجين الأحادي الأخضر (SOSG)، 2’7′-ثنائي كلوريد ثنائي هيدروفلوريسئين داي أستات (DCFH-DA)، 3-أمين، 4-أمينوميثيل-2’،7′-ثنائي فلوريسئين، داي أستات (DAF-FM DA)، طقم اختبار بروتين BCA، الأدينوزين المعزز -مجموعة اختبار ثلاثي الفوسفات الأدينوزين (ATP)، أمبلكس الأحمر، مجموعة اختبار حيوية الخلايا كالسيين/PI، مجموعة تطوير لون الفوسفات القلوي (ALP) BCIP/NBT، مجموعة صبغ الأليزارين الأحمر S ومجموعة عد الخلايا-8 تم الحصول عليها من بييوتيم (الصين). تم شراء خط الخلايا العظمية MC3T3-E1 وبكتيريا Enterococcus faecalis (E. faecalis، ID: ATCC29212) من مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC). تم شراء خلايا جذعية من الرباط اللثوي البشري (hPDLSCs) من بروسيل لايف ساينس آند تكنولوجي (الصين). وسط الحد الأدنى الأساسي المعدل ألفا (MEM تم الحصول على وسط دلبكو المعدل (DMEM) ومصل الجنين البقري من جيبكو (الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على محلول التحلل المعزز RIPA، ومجموعة اختبار المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) لمؤشر العظام الفأري (OCN)، ومجموعة ELISA لعامل النسخ المرتبط بـ Runt 2 (RUNX2) من جيانغلاي للتكنولوجيا الحيوية (الصين). تم الحصول على مجموعة اختبار الحية/الميت BacLight من إنفيتروجين (الولايات المتحدة الأمريكية). تم شراء مغذيات قلب الدماغ (BHI) من أوكسيد (الولايات المتحدة الأمريكية).

تركيب جزيئات CGP النانوية

تمت عملية تخليق CGP على مرحلتين رئيسيتين. في البداية، تم خلط -PEG-PCL وهيدروكلوريد 1-amidinopyrazole في دورق يحتوي على 10 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. تم إضافة N، N-diisopropylethylamine تدريجياً إلى هذا المزيج تحت جو من
حماية النيتروجين، مع الحفاظ على نسبة مولارية من . تم بعد ذلك تحريك هذا المزيج باستمرار في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة، تلاه عملية غسيل في الماء المقطر لمدة 48 ساعة. تم جمع المنتجات الناتجة، G-PEG-PCL، وتجفيفها بالتجميد، وتخزينها للاستخدام لاحقًا. تم إجراء التأكيد الهيكلي لـ G-PEG-PCL باستخدام جهاز مطياف الرنين المغناطيسي النووي (Bruker AVANCE III HD 600، ألمانيا) يعمل بتردد 600 ميغاهرتز. في الخطوة الثانية، تم إذابة Ce6 (1 ملغ) وG-PEG-PCL (20 ملغ) في 4 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم تمت إضافة هذا المحلول تدريجياً وبشكل قطرة إلى 24 مل من الماء النقي، مع تحريك الخليط في الظلام لمدة 24 ساعة. بعد التحريك، تم جمع العينات، وغسلها بالتناضح، وتجفيفها بالتجميد، وتخزينها لإجراء التجارب اللاحقة. للمقارنة، تم تحضير جزيئات نانوية CPP غير المعدلة بمجموعات جوانيدينو باستخدام -PEG-PCL وفقًا للإجراء الموصوف أعلاه.

الخصائص الفيزيائية الكيميائية لـ CGP

تحليل توزيع حجم الجسيمات وإمكانات زيتا لـ Ce 6 الحر، فارغ تم إجراء تحليل جزيئات نانوية من -PEG-PCL (PP) وجزيئات نانوية فارغة من G-PEG-PCL (GP) وCPP وCGP باستخدام محلل حجم الجسيمات من مالفرن (Zetasizer Nano ZS-90، مالفرن باناليتيكال). تم تصور أشكال CPP وCGP من خلال مجهر إلكتروني نافذ (FEI Talos F200S، ثيرمو فيشر). تم تحديد طيفي الامتصاص والانبعاث لـ Ce6 الحر وCPP وCGP باستخدام مقياس ضوء الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (Ultrospec 7000، بايوكروم) ومقياس الطيف الفلوري (F-2710، هيتاشي).

الارتباط البكتيري واختراق الأغشية الحيوية لـ CGP

لتحديد كمية الارتباط البكتيري المعزز الذي تسهله مجموعات الجوانيدين المعدلة في CGP، تم إجراء تحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي. في البداية، تم إعداد تعليق بكتيري ( تم تحضيرها عن طريق حضانة البكتيريا في وسط BHI على هزاز عند و 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. تلا ذلك الطرد المركزي (4000 دورة في الدقيقة لمدة 6 دقائق) وإعادة التعليق في PBS. بعد ذلك، تم خلط هذا التعليق البكتيري مع من CGP وتم حضنها لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي وإعادة التعليق في PBS، تم تحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي (CytoFlex LX، بيكمان كولتر). كانت عينات التحكم تتكون من PBS، مل” و “CPP ).
لتقييم خصائص نفاذية الأغشية الحيوية لـ CGP، تم استخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر ثلاثي الأبعاد (CLSM، A1، نيكون). SYTO-9 (أخضر، ) و تم استخدامه لتلوين الأغشية الحيوية وتتبع قدرة اختراق CGP. باختصار، تعليق E. faecalis و تم إضافة وسط BHI إلى لوحة تحتوي على 24 بئرًا مزودة بأغطية زجاجية دائرية. اللوحة
ثم تم حضنه في حاضنة لاهوائية عند لمدة 7 أيام للسماح بتكوين الأغشية الحيوية، مع تجديد الوسط كل يومين. بعد نضوج الأغشية الحيوية، تم استبدال الأوساط بـ CGP ( )، وتم حضن العينة لمدة “، مظلم). بعد ذلك، تم صبغ الأغشية الحيوية بصبغة SYTO-9. بعد 15 دقيقة، تم غسل العينات وتجفيفها بشكل طبيعي بعيدًا عن الضوء. أخيرًا، تم تصور الأغشية الحيوية باستخدام CLSM. PBS، Ce6 ( )، و CPP ( ) تم استخدامها كعينات تحكم.

ملفات تعريف توليد ROS و NO لـ CGP

لتقييم توليد NO في CGP عند التعرض للإشعاع الليزري، تم استخدام تحليل جريس المعدل. في هذه الطريقة، يتفاعل NO بسرعة مع كاشف جريس لتكوين مركبات ديازو، التي يمكن اكتشافها في جهاز قراءة الميكرو بلايت ELISA عند 540 نانومتر. في لوحة مكونة من 96 بئرًا، من CGP ( تم خلطه مع لمحلول جريس. بعد 30 دقيقة في الظلام، تعرضت الخلائط للإشعاع بواسطة ليزر بزاوية 660 نانومتر (قوة الإخراج لـ ) ل ، و 10 دقائق. ثم تم قياس امتصاص العينات عند 540 نانومتر باستخدام قارئ ميكرو بلايت ELISA. لمراقبة الإنتاج خلال aPDT، تم إخضاع العينات لإجراء مشابه باستخدام مجموعة الاختبار. في البداية، تم خلط CGP مع كاشف الكشف ثم تم تعريضه للإشعاع كما هو موضح أعلاه. بعد ذلك، تم جمع الخلائط، وتم قياس امتصاصها عند 560 نانومتر باستخدام قارئ ميكروأطباق ELISA. إنتاج تم الكشف عنه باستخدام SOSG. تم خلط CGP أولاً مع SOSG ومعالجته كما هو موضح أعلاه؛ تم قياس شدة الفلورسنت للخلائط بواسطة قارئ ميكروبيوتات ELISA متعدد الوظائف. تضمنت مجموعات التحكم للتجارب المذكورة أعلاه PBS + ليزر، Ce6 + ليزر، CPP + ليزر، و CGP بدون إشعاع ليزر.

تصوير ، و الإنتاج بواسطة CGP في . الفيروكوكس

للكشف عن إطلاق NO من CGP في البكتيريا، تم استخدام المجس الفلوري الحساس لـ NO DAF-FM DA. باختصار، تم خلط تعليق E. faecalis ( ) و CGP ( ) في أنبوب Eppendorf (EP). بعد ذلك، تم حضانة أنبوب EP في حاضنة لاهوائية لمدة ، مظلم). ثم أضيف DAFFM DA ( ) إلى أنبوب EP، تلاه الإشعاع لمدة 5 دقائق. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة، تم غسل العينة ثلاث مرات باستخدام PBS. أخيرًا، من تعليق البكتيريا وُضعت على شريحة وتم تصويرها باستخدام CLSM ( ). لتقييم إنتاج ROS الناتج عن CGP في البكتيريا، تم استخدام المجس الفلوري DCFH-DA. باختصار، تم إضافة تعليق E. faecalis ( ) و CGP ( ،
) إلى أنبوب EP وتم حضانته في حاضنة لاهوائية ( ، ظلام). بعد 30 دقيقة، تم إضافة المجس الفلوري ( ). تمت معالجة العينات كما هو موضح أعلاه وتم تصويرها باستخدام CLSM ( ). للتحقيق في استهلاك بواسطة CGP في البكتيريا تحت ظروف aPDT، تم استخدام Amplex red و peroxidase الفجل. أولاً، تم إضافة تعليق E. faecalis ( ) و CGP إلى أنبوب EP، الذي تم حضانته بعد ذلك في حاضنة لاهوائية ( ، ظلام) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تم إضافة Amplex red ( ) و peroxidase الفجل ( ) إلى أنبوب EP. تمت معالجة العينات بعد ذلك كما هو موضح أعلاه وتم تصويرها باستخدام CLSM ( ). تضمنت مجموعات التحكم للتجارب المذكورة أعلاه PBS + ليزر، Ce6 + ليزر، CPP + ليزر، و CGP بدون إشعاع ليزر.

النشاط المضاد للبكتيريا لـ CGP في المختبر

تم تقييم الأداء المضاد للميكروبات لـ CGP باستخدام طريقة عد المستعمرات. باختصار، تم خلط تعليق بكتيريا E. faecalis ( ) و CGP ( ، ) في أنبوب EP. بعد 5 دقائق من الحضانة في حاضنة لاهوائية ( ، مظلم)، تم إشعاع العينة لمدة 5 دقائق وتمت الحضانة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تم جمع تعليق البكتيريا ( ) وتخفيفه في لوحة 96 بئر في تدرج (من تخفيفات إلى ). تم نشر العينة ( في وقت واحد) بالتنقيط في وسط صلب، وتم تكرار كل تركيز ثلاث مرات قبل الحضانة لمدة 24 ساعة في غرفة لاهوائية. ثم تم عد عدد المستعمرات وحيوية البكتيريا.
لتقييم الخصائص المضادة للميكروبات لـ CGP بشكل أكبر، تم إجراء اختبار حيوية BacLight الحي/الميت. تم معالجة البكتيريا أولاً كما هو موضح أعلاه. بعد المعالجة، تم طرد تعليق البكتيريا وفصلها لإزالة أي بقايا من CGP. ثم تم إعادة تعليق الرواسب وصبغها بـ SYTO-9 و PI لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، بعد جولة أخرى من الطرد والغسل باستخدام PBS لإزالة الصبغة الزائدة، تم ملاحظة البكتيريا باستخدام ميكروسكوب فلوري مقلوب.
لتصور التغيرات الشكلية في البكتيريا المعالجة بـ CGP+ليزر، تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). تم معالجة البكتيريا أولاً كما هو موضح أعلاه. بعد المعالجة، تم طرد خلايا البكتيريا وغسلها مرتين باستخدام NS. ثم تم تثبيت البكتيريا باستخدام 1 مل من الجلوتارالدهيد ( ، طوال الليل). بعد ذلك، تم طرد البكتيريا وغسلها ثلاث مرات باستخدام NS. بعد التجفيف باستخدام تركيزات متدرجة (بما في ذلك 30، 50، 70، 90، و ) من محلول الإيثانول، تم إضافة العينة بالتنقيط إلى رقائق السيليكون وتركها
لتجف بشكل طبيعي. أخيرًا، تم رش البكتيريا بالذهب وتمت ملاحظتها باستخدام مجهر إلكتروني ماسح (SU8010، HITACHI). تضمنت مجموعات التحكم لهذه التجارب PBS + ليزر، CPP، CGP، Ce6 + ليزر، و CPP+ليزر.

تسرب البروتين والتغيرات في مستويات ATP في البكتيريا المعالجة بـ CGP

لتقييم تسرب البروتين البكتيري بعد المعالجة بـ CGP المنشط بواسطة aPDT، تمت معالجة البكتيريا كما هو موضح سابقًا. بعد المعالجة والطرد اللاحق، تم جمع السائل الطافي، وتم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA. ثم تم قياس الامتصاص عند 560 نانومتر باستخدام قارئ ميكرو لوحات ELISA. للكشف عن التغيرات في مستويات ATP داخل البكتيريا، تم معالجة البكتيريا كما هو موضح أعلاه، وجمعها بالطرد، وتحللها باستخدام محلول التحلل ( )، وطردها لمدة . تمت إضافة محلول العمل لاختبار ATP ( ) إلى لوحة 96 بئر؛ بعد ذلك، تمت إضافة العينة إلى اللوحة. تم الكشف عن الكيمياء الضوئية باستخدام وظيفة جهاز قياس الضوء من قارئ ميكرو لوحات ELISA. تضمنت مجموعات التحكم لهذه التجارب PBS + ليزر، CPP، CGP، Ce6 + ليزر، و CPP + ليزر.

تأثير القضاء على البيوفيلم في المختبر لـ CGP

لتقييم فعالية القضاء على البيوفيلم لـ CGP، تم إجراء اختبار حيوية BacLight الحي/الميت. في البداية، تم إضافة مزيج من وسط BHI ( ) وتعليق E. faecalis ( ) إلى كل بئر من لوحة 24 بئر تحتوي على أغطية زجاجية دائرية. ثم تم حضانة هذه اللوحة في غرفة لاهوائية لمدة 7 أيام لتسهيل تشكيل البيوفيلم، مع استبدال الوسط بانتظام كل يومين خلال فترة الحضانة. بعد شفط السائل الطافي، تم إضافة وسط الثقافة ( 250 ) و CGP ( ) وتم حضانتهما معًا لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم إشعاع المزيج لمدة 5 دقائق. بعد 30 دقيقة من الحضانة، تم صبغ البيوفيلم بأصباغ SYTO-9 و PI لمدة 15 دقيقة. بعد غسلين باستخدام PBS، تم السماح للعينة بالجفاف بشكل طبيعي بعيدًا عن الضوء وتم استخدام CLSM لفحص البيوفيلم.
بالإضافة إلى ذلك، لتقييم فعالية القضاء على البيوفيلم ضد . الفيروكوكس، تم استخدام صبغة الكريستال البنفسجي. تم إضافة وسط BHI ( ) وتعليق E. faecalis ( 100 ) إلى لوحة 96 بئر وتم حضانتهما لمدة 7 أيام لتشكيل البيوفيلم، مع تجديد الوسط كل يومين. بعد شفط السائل الطافي، تم إضافة الوسط ( ) و CGP ( ) وتم حضانتهما معًا لمدة 5 دقائق، وتم إشعاعهما لمدة 5 دقائق، وتمت الحضانة لمدة 30 دقيقة أخرى. تلا ذلك تثبيت باستخدام الميثانول ثم صبغ باستخدام الكريستال البنفسجي ( ، لمدة 30 دقيقة)،
تم تصوير البيوفيلم المتبقي باستخدام ميكروسكوب مجسم (SMZ 800N، نيكون). بعد التصوير، تم إذابة البيوفيلم المتبقي باستخدام حمض الأسيتيك وتم قياس الامتصاص عند 596 نانومتر باستخدام قارئ ميكرو لوحات. تم حساب معدل بقاء البيوفيلم كما يلي: حيوية البيوفيلم (مجموعة العينة)/ (مجموعة PBS) . تضمنت مجموعات التحكم للتجارب أعلاه PBS + ليزر، CGP، Ce6 + ليزر، CPP+ليزر، و .

فعالية القضاء على البيوفيلم لـ CGP في قنوات الجذر

تم جمع أسنان ضواحك أحادية القناة تم استخراجها لأسباب تقويمية، وتمت إزالة التيجان على مسافة 12 مم من الفتحة القمية في المقطع العرضي. ثم تم تنظيف العينات وتشكيلها باستخدام ملف ProTaper (Dentsply Sirona) حتى حجم قمي #40. بعد التعقيم، تم إغلاق الفتحة القمية للأسنان باستخدام راتنج مركب قابل للتدفق (3 M، الولايات المتحدة الأمريكية) داخل خزانة أمان حيوي. ثم تم وضع هذه الأسنان المعدة في أنابيب EP سعة 10 مل تحتوي على وسط BHI (4.95 مل) وتعليق E. faecalis (50 . تم حضانة أنابيب EP في غرفة لاهوائية لمدة 14 يومًا، مع تجديد الوسط كل يومين. بعد ذلك، تم ري العينة بـ 5 مل من CGP وتم إشعاعها لمدة 5 دقائق. لجمع البكتيريا المتبقية، تم إدخال ثلاث نقاط ورقية معقمة في قناة الجذر لمدة 30 ثانية. تم وضع هذه النقاط الورقية في أنبوب EP يحتوي على 1 مل من NS وتم تخزينها في لمزيد من التحليل. بعد الغسل والتثبيت، تم تجفيف الجذور باستخدام تركيزات متدرجة ( ، و ) من الإيثانول ثم تم تقسيمها طوليًا على طول المحور الطويل. أخيرًا، تم تصور البيوفيلم الموجود في المناطق القمية للجذور عبر مجهر إلكتروني ماسح. في اليوم المحدد، تم إعادة تسخين أنابيب EP المجمدة عند . تم تخفيف العينات بشكل متدرج، وتم نشر كل تركيز ( ) على الوسط الصلب. بعد الحضانة في ظروف لاهوائية عند لمدة 24 ساعة، تم عد عدد المستعمرات. تضمنت مجموعات التحكم NS، CPP + ليزر، و .

تقييم السلامة الحيوية

تشير تجمع كريات الدم الحمراء والانحلال إلى توافقية الدم للجزيئات النانوية. تم جمع الدم الطازج من الفئران وتحضيره كـ تعليق من كريات الدم الحمراء. باختصار، تم خلط CGP ( ) مع من التعليق وتم حضنه. تم تقييم تجمع كريات الدم الحمراء من خلال مجهر ضوئي بعد 30 دقيقة (NI-B، نيكون). تم إجراء اختبار الانحلال كما يلي: من CGP مل) تم خلطه مع من التعليق وتم حضنه. بعد 6 ساعات، تم طرد الخليط وتم قياس امتصاص السائل الطافي عند 560 نانومتر.
الانحلال عينة . تضمنت عينات التحكم لهذه التجارب PBS، Ce6 ( )، CPP ( )، و (NaClO تم حضنه مع كريات الدم الحمراء لمدة دقيقتين).
لتقييم سلامة CGP بشكل أكبر، تم استخدام اختبار السمية الخلوية. تم زراعة خلايا hPDLSCs أو MC3T3-E1 في DMEM أو MEM- مضافًا إليه مصل بقر جنيني و بنسلين-ستربتوميسين عند . تم زراعة خلايا hPDLSCs وMC3T3-E1 في صفائح 96 بئر (5000 خلية/بئر) وتم حضنها. بعد 24 ساعة، تم استبدال الوسط بوسط جديد يحتوي على CGP ( ) وتم حضنه لمدة 24 ساعة أخرى. تم شفط السائل الطافي من كل بئر، وتم إضافة وسط جديد ( ) يحتوي على كيت عد خلايا-8 ( ). تم قياس الامتصاص باستخدام قارئ ميكروبيوت في 450 نانومتر بعد 4 ساعات من الحضانة. تضمنت مجموعات التحكم PBS، مل)، CPP ( )، و (تم حضنه لمدة دقيقة واحدة).
تم استخدام اختبار بقاء الخلايا باستخدام كالسئين/PI لتقييم السمية الخلوية لـ CGP بشكل أكبر. أولاً، تم زراعة خلايا hPDLSCs في صفيحة 96 بئر (3000 خلية/بئر) وتم حضنها. بعد 24 ساعة، تم استبدال الوسط بوسط جديد يحتوي على CGP ( ) وتم حضنه لمدة 24 ساعة إضافية. تم استبدال السائل الطافي بمحلول كالسئين/PI ( ) وتم حضنه في الظلام. بعد 30 دقيقة، تم ملاحظة شكل الخلايا والفلوريسنس باستخدام مجهر فلوري مقلوب (Axio Observer 3، ZEISS). تضمنت مجموعات التحكم PBS، Ce6 و (تمت معالجتها لمدة دقيقة واحدة).

التمايز العظمي في المختبر

تم تقييم قدرة التمايز العظمي لـ CGP باستخدام صبغة ALP وطريقة صبغة Alizarin Red S. في البداية، تم زراعة خلايا MC3T3-E1 في صفائح 24 بئر بكثافة 25000 خلية/بئر. بعد 24 ساعة، تم استبدال الوسط بوسط MEM- يحتوي على -غليسيرول (10 مليمول)، حمض الأسكوربيك (0.05 مليمول)، مصل بقر جنيني، وCGP . تم تجديد الوسط كل يومين؛ ومن الجدير بالذكر أن وCGP تمت إضافتهما فقط في اليومين و18. بعد 7 أيام، تم تثبيت الخلايا باستخدام فورمالديهايد، وغسلها باستخدام PBS، ثم صبغها بمحلول صبغة ALP لمدة 24 ساعة. أخيرًا، تم ملاحظة الخلايا باستخدام مجهر مجسم ومجهر ضوئي. تم قياس مدى الصبغ باستخدام برنامج ImageJ. بعد 21 يومًا من العلاج، تم تثبيت الخلايا وصبغها بمحلول العمل Alizarin Red لمدة 24 ساعة. تم ملاحظة خلايا MC3T3-E1 بعد ذلك في المجهر المجسم والمجهر الضوئي. أخيرًا، تم إذابة Alizarin Red باستخدام كلوريد سيتيل بيريدينيوم، وتم قياس الامتصاص عند
596 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبيوت. تضمنت مجموعات التحكم PBS، و .
تم فحص مستويات التعبير لـ OCN وRUNX2 في خلايا MC3T3E1 باستخدام ELISA. تم إجراء علاجات تحفيز التمعدن كما هو موضح أعلاه. لقياس OCN، تم جمع سوائل الخلايا من كل مجموعة في اليوم السابع؛ وتم الكشف عن تركيز OCN بواسطة ELISA. لقياس RUNX2، تم تحلل خلايا MC3T3-E1 من كل مجموعة في اليوم الحادي والعشرين، وتم طرد العينات لجمع السوائل الطافية. تم تحديد تركيز البروتين الكلي للسائل الطافي باستخدام مجموعة اختبار تركيز البروتين BCA. أخيرًا، تم قياس تركيز RUNX2 باستخدام ELISA. تضمنت مجموعات التحكم PBS، و و

CPP.

العلاج في الجسم الحي لالتهاب اللثة القمي تم شراء ثلاثين فأرًا أنثويًا من نوع Sprague-Dawley (عمر 6 أسابيع) من شركة Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.، Ltd. (الصين). تم إيواء جميع الحيوانات بشكل فردي داخل حبس معزول ومعقم تحت ظروف قياسية. تم الحفاظ على دورة ضوء نهارية منتظمة من 12 ساعة من الضوء و12 ساعة من الظلام. بعد أسبوع من فترة التكيف، تم توزيع الفئران عشوائيًا إلى خمس مجموعات: صحية، PBS،
ليزر، وCGP+ليزر. تم إجراء العشوائية باستخدام مولد ترتيب عشوائي قائم على الكمبيوتر. في البروتوكول التجريبي لكل حيوان، شارك أربعة باحثين في القدرات التالية: نفذ الباحثان الأولان العلاج وفقًا لمخطط العشوائية. فقط هذان الباحثان كان لديهما معرفة بالتعيين لمجموعات العلاج المعنية. تم إجراء إجراء التخدير فقط بواسطة الباحث الثالث. في النهاية، تم تقييم حيوية البكتيريا والحجم الكلي لفراغات الامتصاص بواسطة الباحث الرابع.
لم تتلق المجموعة الصحية أي علاج. خضعت المجموعات المتبقية للإجراءات التجريبية التالية: أولاً، تم تخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران (RWD Life Science، الصين). بعد ذلك، تم طحن الضرس الأول العلوي الأيسر لكل فأر ميكانيكيًا باستخدام أداة يدوية عالية السرعة بدون ماء للوصول إلى تجويف اللب. ثم تم تشكيل القنوات القريبة باستخدام ملفات K بحجم 10-20# (Dentsply Sirona، الولايات المتحدة الأمريكية). بعد ذلك، تم ملء الفراغات بكرات قطن صغيرة تحتوي على تعليق E. faecalis وتم إغلاقها مؤقتًا باستخدام أسمنت أيون زجاجي (GC، اليابان). بعد أسبوعين، تمت إزالة الأسمنت، تلاها ري قنوات الجذر باستخدام من PBS، أو CGP على التوالي. تم تعريض مجموعات العلاج التي تلقت CPP وCGP للإشعاع باستخدام ليزر 660 نانومتر بقوة إخراج قدرها
لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تم إدخال نقاط ورقية معقمة في القنوات لجمع البكتيريا المتبقية، والتي تم وضعها بعد ذلك في أنابيب EP تحتوي على 1 مل من NS وتم تخزينها عند . بعد ذلك، تم إغلاق الفراغات باستخدام راتنجات مركبة سائلة. بعد 3 أسابيع، تم قتل الفئران بجرعة زائدة من الإيزوفلوران. تم جمع الضرس الأول العلوي الأيسر مع بعض عينات عظم الفك. تم فتح تجويفات اللب للضروس وتم إدخال نقاط ورقية في القنوات لجمع البكتيريا المتبقية، والتي تم وضعها بعد ذلك في أنابيب EP تحتوي على NS وتم تخزينها عند . ثم، تم إعادة تسخين عينات البكتيريا المتبقية ونشرها على وسائط صلبة للحضانة في الأوقات المناسبة. تم حساب عدد المستعمرات وبقاء البكتيريا. تم تثبيت الأسنان باستخدام فورمالديهايد. بعد ذلك، تم تثبيت العينات على المرحلة الماسحة لتصوير الأشعة المقطعية الدقيقة (Skyscan1276، Bruker، ألمانيا) وتم مسحها على مدى 180 درجة عند 100 كيلو فولت و بدقة وبخطوة دوران 0.2 درجة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام برامج CTvox وCTan (من Skyscan) لإعادة بناء وتحليل العينات ثلاثية الأبعاد. ثم تم إزالة الكالسيوم من العينات في محلول ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ثنائي الأمين رباعي الأسيتيك لمدة 6 أسابيع. أخيرًا، تم تثبيت العينات، وتضمينها، وتقطيعها، وصبغها بـ TRAP، وصبغها بـ HE، ورؤيتها باستخدام مجهر ضوئي.

التحليل الإحصائي

تم التعبير عن النتائج كمتوسط SEM. تم استخدام اختبار شابيرو-ويلك واختبار براون-فورسيث لتقييم طبيعة البيانات وتجانس التباين. في الحالات التي تم فيها استيفاء معايير التوزيع الطبيعي وتجانس التباين، تم إجراء تحليل التباين الأحادي مع تحليل توكي اللاحق للمقارنات بين المجموعات المتعددة. تم تطبيق تحليل ويلش عندما أظهرت البيانات كل من التوزيع الطبيعي والتباين غير المتساوي، وتم استخدام اختبار تامهان T2 للمقارنات اللاحقة المتعددة. تم تحليل البيانات باستخدام برنامج Prism 9.0 (GraphPad، لا جولا، كاليفورنيا). تم اعتبار قيم ذات دلالة إحصائية ( . ** , *** , **** , ns: لا دلالة).

النتائج والمناقشة

تخليق وتوصيف CGP

لصنع CGP، كانت الخطوة الأولية تتضمن تحويل الجوانيدين لـ -PEG-PCL باستخدام هيدروكلوريد 1-أميدينوبيرازول لتشكيل G-PEG-PCL [35]. يعمل هذا البوليمر المعدل كحامل فعال للمواد الحساسة للضوء Ce6، مما يشكل CGP. ومن الجدير بالذكر أن G-PEG-PCL يعزز استقرار Ce6 في البيئات الفسيولوجية، ويزيد من ارتباطه بالبكتيريا، ويساعد في تشكيل الأغشية الحيوية.
اختراق، ويعمل أيضًا كمانح لأكسيد النيتريك. تم تأكيد نجاح عملية الغوانيدينيل من خلال ظهور ذروة الرنين المغناطيسي النووي عند . قمم مميزة أخرى عند و 2.27 جزء في المليون
( تم تحديدها، والتي تت correspond إلى مكونات PEG و PCL من المركب، كما هو موضح في الملف الإضافي 1: الشكل S1.
الشكل 1أ يوضح تحضير جزيئات CGP. كانت كفاءة احتجاز Ce6 في CGP
الشكل 1 تصنيع وتوصيف جزيئات CGP. أ رسم توضيحي تخطيطي لتحضير جزيئات CGP. ب توزيع حجم الجسيمات و صور المجهر الإلكتروني الناقل لـ CPP. د توزيع حجم الجسيمات و e صور المجهر الإلكتروني الناقل لـ CGP. ذوبانية Ce6 في مجموعات مختلفة. الجهد الزتاوي لكل مجموعة. استقرار CGP خلال 14 يومًا. أي Ce6 حر، CPP، وCGP تم استيعابها أو مرتبطة بإحكام بـ . فيكالس شدة الفلورسنت الكمية لـ Ce6 في E. faecalis. صور مجهر المسح بالليزر المتماسك تمت معالجة الأغشية الحيوية لـ .faecalis بواسطة مجموعات مختلفة. تُعرض البيانات كمتوسط SEM . مقارنة بين CGP ومجموعات أخرى
وجد أن بقدرة تحميل تبلغ (الملف الإضافي 1: الجدول S1). كتحكم، تم تحضير CPP في نفس الوقت باستخدام -PEG-PCL محملة بـ Ce6. أظهرت أحجام الجسيمات وصور المجهر الإلكتروني الناقل لـ CPP و CGP أشكالاً كروية متجانسة، بأحجام من و (الشكل 1ب-هـ). في المحلول المائي، أظهر CPP و CGP لونًا أخضر مميزًا، على عكس Ce 6 الحر، الذي أظهر قابلية ذوبان ضعيفة في الماء، مما أدى إلى التجمع في قاع أنبوب إيبندورف (الشكل 1و). تؤكد هذه النتائج نجاح تغليف Ce6 المحب للدهون بواسطة -PEG-PCL و G-PEG-PCL، مما يتيح تشتت متجانس في المحلول المائي.
ال -كان جهد PP 7.04 مللي فولت، بينما كان جهد GP 8.72 مللي فولت (الشكل 1g). الزيادة -قد يكون الفرق في القدرة بين GP و PP ناتجًا عن القيمة المرتفعة لـ pKa لمجموعة الجوانيدين، على عكس مجموعة الأمين [35، 36]. علاوة على ذلك، أظهر CGP استقرارًا جيدًا على مدى 14 يومًا في درجة حرارة الغرفة، كما يتضح من لون محلول الماء الثابت (الملف الإضافي 1: الشكل S2)، وحجم الجسيمات، ومؤشر التشتت (الشكل 1h). بالإضافة إلى ذلك، وُجد أن طيف الامتصاص فوق البنفسجي وطيف انبعاث الفلورسنت لـ CGP يتماشى بشكل وثيق مع تلك الخاصة بـ Ce6 الحرة (الملف الإضافي 1: الأشكال S3 و S4)، مما يشير إلى أن التغطية الفيزيائية لـ Ce6 لم تغير خصائصه الأساسية في الامتصاص والانبعاث.

الارتباط البكتيري ونفاذية الأغشية الحيوية لـ CGP

تم استخدام تحليل تدفق الخلايا للتحقيق في تأثير مجموعات الجوانيدين على ارتباط CGP بالبكتيريا. باستخدام Ce6 كمؤشر فلوري، لوحظ أن CGP أظهر درجة أعلى بشكل ملحوظ من التداخل أو الالتصاق بـ بكتيريا E. faecalis، مقارنةً بـ CPP (الشكل 1i). وقد دعمت البيانات الكمية للفلوريسنس هذه الملاحظة، حيث كشفت أن E. faecalis المعالجة بـ CGP أظهرت كثافات فلوريسنس أعلى بحوالي 1.61 مرة من تلك المعالجة بـ CPP (الشكل 1j). تشير هذه النتيجة إلى أن مجموعات الغوانيدين في CGP تعزز بشكل ملحوظ قدراتها على التفاعل مع البكتيريا [37]. إن هذا التعزيز في الارتباط البكتيري أمر حيوي، حيث يعزز بشكل كبير فعالية CGP القاتلة للبكتيريا، مما يجعله عاملاً مضادًا للميكروبات أكثر قوة.
تتأثر فعالية العوامل المضادة للميكروبات بشكل كبير بقدرتها على اختراق الأغشية الحيوية، والتي تُعرف بأنها تعيق الفعالية العلاجية لمثل هذه العوامل. تم تقييم نفاذية الأغشية الحيوية لـ CGP باستخدام المجهر الضوئي الماسح بالليزر، مع استخدام SYTO-9 كمؤشر لتلوين الأغشية الحيوية. بعد 5 دقائق من التعايش المشترك مع أغشية E. faecalis الحيوية، أظهر تحليل المجهر الضوئي الماسح بالليزر توهجًا أحمر خافتًا ينبعث من Ce 6 داخل الأغشية الحيوية المعالجة بـ Ce 6 الحر، مما يشير إلى اختراق محدود.
تؤكد هذه النتيجة التحدي الذي تطرحه الأغشية الحيوية في عرقلة دخول المواد المضادة للبكتيريا. بالمقابل، لوحظت إشارة فلورية أقوى بشكل معتدل في الأغشية الحيوية المعالجة بـ CPP، مما يشير إلى تحسن طفيف في نفاذية الأغشية الحيوية. ومن المRemarkably، أظهرت الأغشية الحيوية المعالجة بـ CGP إشارة فلورية مكثفة بشكل ملحوظ (الشكل 1k). تشير هذه النتائج إلى أنه بينما قد يؤدي تعزيز ذوبانية Ce6 واستقراره، بالإضافة إلى دمج المجموعة الأمينية في CPP، إلى تحسين طفيف في نفاذية الأغشية الحيوية، فإن إدخال الغوانيدين يرفع بشكل ملحوظ من قدرة CGP على اختراق الأغشية الحيوية. تعتبر هذه النفاذية المعززة عاملاً رئيسياً في تعزيز الفعالية المضادة للميكروبات لـ CGP ضد البكتيريا المحمية بالأغشية الحيوية.

توليد الجذور الحرة والأكسيد النيتريكي المدفوع بالعلاج الضوئي المعتمد على الأدوية

بعد تأكيد زيادة الارتباط البكتيري وتحسين اختراق الأغشية الحيوية بواسطة CGP المعدل بالغوانيدين، استخدمنا اختبار جريس لتقييم قدراته على إنتاج NO استجابةً لـ aPDT. كما هو موضح في الشكل 2a، أظهرت PBS + الليزر، CGP، Ce6 + الليزر، وCPP + الليزر إنتاجًا ضئيلًا لـ NO. بالمقابل، أظهر CGP + الليزر إنتاجًا سريعًا لـ في غضون 10 دقائق. تشير هذه النتائج إلى أن قدرة جزيئات CGP النانوية على إنتاج NO من المحتمل أن تعزى إلى وجود مجموعات جوانيدينو وتنشيطها بواسطة aPDT. لتأكيد الفرضية القائلة بأن CGP تستهلك وبالتالي ينتج NO خلال عملية aPDT، استخدمنا طقم اختبار للكشف عن توليد . يعمل التحليل من خلال أكسدة أيونات الحديد الثنائية التكافؤ بواسطة لإنتاج أيونات الحديد ثلاثية التكافؤ، التي تتحد مع زيلينول البرتقالي لتكوين منتج أرجواني [39]. كما هو موضح في الشكل 2ب، فإن CPP + الليزر و CGP + الليزر أنتجوا 25.01 و ، بعد التعرض للإشعاع لمدة 10 دقائق. من الجدير بالذكر أن كان جيل CGP + الليزر (المتزامن مع جيل NO) واضحًا أنه أقل من جيل CPP + الليزر، مما يشير إلى الاستهلاك لـ في سياق عدم وجود جيل. تشير هذه النتيجة إلى أن يتم استهلاكه خلال عملية aPDT في مجموعة CGP + الليزر، لتسهيل توليد NO.
لقد تم الإبلاغ أن كما أنه يؤكسد مجموعات الجوانيدين لإنتاج NO [17]. نظرًا لأن هو عامل محوري في فعالية القتل البكتيري لـ aPDT [40]، توقعنا أن إنتاجه لن يتعرض للخطر. للتحقيق في ذلك، استخدمنا SOSG لمراقبة التغيرات في المستويات داخل CGP تحت aPDT. يمتلك SOSG فلوروسينس أزرق خافت ولكنه يتفاعل مع لإنتاج SOSG endoperoxide، الذي ينبعث منه توهج أخضر قوي [41]. كما هو موضح في الشكل 2c، أظهرت شدة التوهج المقاسة لـ SOSG endoperoxide لكل من CPP + ليزر و CGP + ليزر زيادة مماثلة، مما يشير إلى أن CGP يمكن أن يولد NO بسرعة عن طريق
الشكل 2 ملفات توليد NO و ROS لـ CGP. أ ، و ملفات تعريف الأجيال لكل مجموعة. د، eNO، ، و توليد وكثافة الفلورة المتوسطة في بكتيريا E. faecalis بعد تلقيها علاجات مختلفة. تُعرض البيانات كمتوسط ، ، ns: لا دلالة. مقارنة بين CGP + الليزر مقابل مجموعات أخرى
استهلاك -تم إنتاجه خلال aPDT، دون عرقلة إنتاج هذا أمر حاسم لفعالية الأدوية المضادة للميكروبات وإزالة الأغشية الحيوية بشكل تآزري للعلاج الضوئي الديناميكي وNO.
لتأكيد النتائج المذكورة أعلاه، استخدمنا التصوير المجهري بالليزر المتقارب لمراقبة إنتاج NO و ROS و بواسطة CGP في البكتيريا. تم الكشف عن إنتاج NO بواسطة CGP في البكتيريا باستخدام DAF-FM DA، وهو مركب يعبر غشاء الخلية ويخضع بعد ذلك لعملية تحفيز بواسطة الإستراز الداخلي لتكوين DAF-FM، الذي لا يستطيع عبور غشاء الخلية [42]. يظهر DAF-FM فلورية ضعيفة، لكنه يظهر فلورية قوية عند التفاعل مع NO. كما هو موضح في الشكل 2d و e، تم ملاحظة إشارة فلورية خضراء ملحوظة تشير إلى NO في بكتيريا E. faecalis المعالجة بـ CGP + ليزر، بينما لوحظت فلورية ضئيلة فقط في البكتيريا المعالجة بـ الليزر و CPP+الليزر. للكشف عن ROS الناتجة عن CGP في البكتيريا، استخدمنا DCFH-DA، وهو جزيء غير فلوري يمكنه عبور غشاء الخلية بحرية، وعند دخوله، يتم تحويله إلى DCFH بواسطة الإستراز داخل الخلايا. يمكن أن تؤكسد ROS داخل الخلية DCFH غير الفلوري، مما يحوله إلى المركب الفلوري DCF [43].
كما هو موضح في الشكل 2f و g، كانت الفلورية الخضراء التي تشير إلى ROS في E. faecalis المعالجة بـ CPP + ليزر أعلى قليلاً من تلك الموجودة في البكتيريا المعالجة بـ CGP + ليزر، بما يتماشى مع النتائج التي تم الحصول عليها في مرحلة المحلول (الملف الإضافي 1: الشكل S5). تم الكشف عن CGP الذي تم إنتاجه بواسطة CGP في البكتيريا من خلال استخدام Amplex Red وإنزيم الفجل الحار [44]. تحت تأثير إنزيم الفجل الحار، يؤكسد Amplex red، مما يؤدي إلى إنتاج الفلورسنت الحمراء [45]. توضح الأشكال 2h و i انخفاض الفلورسنت الحمراء لـ في البكتيريا المعالجة بـ CGP+ليزر مقارنة بـ CPP+ليزر. تدعم هذه النتائج بشكل أكبر إمكانية أن إنتاج NO يستهلك فعليًا جزءًا من ROS و تم إنشاؤه خلال aPDT.

التأثير المضاد للميكروبات لـ CGP في المختبر

بعد التأكد من أن توليد NO المدفوع بـ aPDT لم يعيق توليد تم تقييم التأثيرات المضادة للميكروبات التآزرية لـ aPDT و NO من خلال عد مستعمرات البكتيريا وصبغ البكتيريا الحية/الميتة. تُظهر الأشكال 3a و b أن حيوية البكتيريا في CPP و CGP بدون إشعاع كانت أعلى من 8 وحدات لوغاريتمية، وهو ما يتوافق مع PBS + ليزر.
الشكل 3 النشاط المضاد للبكتيريا في المختبر لـ CGP. أ صور تمثيلية لعينات الألواح وحيوية البكتيريا، ج صبغة الحياة/الموت، و صور المجهر الإلكتروني الماسح لبكتيريا E. faecalis بعد تلقيها علاجات مختلفة. e كمية البروتين الكلي المفرز من E. faecalis وأدينوزين داخل الخلايا -مستويات إنتاج ثلاثي الفوسفات في E. faecalis بعد تلقيها علاجات مختلفة. تشير الأسهم الحمراء إلى الثقوب في أغشية الخلايا. تشير الأسهم الحمراء إلى الأغشية البكتيرية التالفة. تُعرض البيانات كمتوسط SEM. في (ب) ، بينما في ( ) I’m sorry, but there is no text to translate. Please provide the text you would like translated. ، “، ns: لا دلالة. في (ب) مقارنة بين PBS مقابل مجموعات أخرى، بينما في ( ) بين مجموعة CGP + الليزر والمجموعات الأخرى
ومع ذلك، لوحظ انخفاض ملحوظ في قابلية البكتيريا للحياة بين المجموعات المتبقية المعرضة للإشعاع بالليزر: Ce6 + ليزر، CPP + ليزر، و CGP + ليزر، مع عدد من القابلية للحياة بـ و0.77 وحدة لوغاريتمية، على التوالي. يبرز هذا الانخفاض الكبير في قابلية البكتيريا على الحياة، خاصة في مجموعة CGP + الليزر،
تأثير مضاد للميكروبات قوي يسهل من خلال الجمع بين العلاج الضوئي المعتمد على الأكسجين (aPDT) وأكسيد النيتريك (NO). لتوضيح التأثيرات على سلامة الخلايا البكتيرية، استخدمنا مجموعة اختبار الحية/الميتة BacLight. في هذه المجموعة، يتمكن صبغة الحمض النووي الفلورية الخضراء SYTO-9 من اختراق جميع البكتيريا، بينما يمكن لصبغة PI اختراق الأغشية المتضررة فقط.
إن إدخال PI يسبب تقليل في فلورية SYTO 9. كما هو موضح في الشكل 3c، لم تُلاحظ إشارات فلورية لـ PI في E. faecalis المعالجة بـ PBS + ليزر، CPP، و CGP، مما يشير إلى أن البكتيريا لديها أغشية سليمة. أظهرت E. faecalis المعالجة بـ CPP + ليزر و Ce6 + ليزر فلورية خضراء وحمراء قوية نسبيًا، مما يدل على حدوث اضطراب معتدل في أغشية البكتيريا. بالمقابل، أظهرت البكتيريا المعالجة بـ CGP + ليزر فلورية حمراء قوية وفلورية خضراء ضعيفة، مما يدل على تلف شديد في أغشية البكتيريا. تؤكد هذه النتائج أن التأثير المضاد للميكروبات لـ CGP + ليزر يتفوق على CPP + ليزر، مما يشير إلى التأثير التآزري المضاد للميكروبات لـ aPDT و NO. علاوة على ذلك، استكشفت الدراسة الآلية المضادة للميكروبات للجزيئات النانوية من خلال تسرب البروتين، والتغيرات في مستويات ATP، والتغيرات في شكل البكتيريا.
تظهر الشكل 3د أن البكتيريا المعالجة بـ PBS + ليزر، CPP، و CGP كانت بشكل رئيسي ناعمة وسليمة، مما يدل على الحد الأدنى من الضرر. ومع ذلك، كانت البكتيريا المعالجة بـ ليزر عرض الليزر أغشية مجعدة قليلاً بها ثقوب صغيرة، مما يشير إلى تلف معتدل. ومن الجدير بالذكر أن البكتيريا في مجموعة CGP+Laser أظهرت ثقوباً واسعة وعميقة في أغشيتها الخلوية، مما يدل على تلف كبير واضطراب. كان مدى تلف أغشية البكتيريا مرتبطاً بدرجة تسرب البروتين الملحوظ. كما تم قياسه في الشكل 3e. توضح هذه الاتجاهات بوضوح القدرة المعززة على إحداث اضطراب في الأغشية لعلاج CGP+Laser. بالإضافة إلى ذلك، فإن مستويات ATP، الضرورية لوظيفة الخلية، عادة ما تنخفض في الخلايا التي تمر بحالة موت خلوي مبرمج أو نخر أو حالة سامة [46]. كما هو موضح في الشكل 3f، تم تقليل مستويات ATP بنسبة ، “ ، و في مجموعات Ce6 + ليزر، CPP + ليزر، و CGP + ليزر، على التوالي، مقارنة بمجموعة PBS. هذه الانخفاض الكبير في مستويات ATP، وخاصة في مجموعة CGP + ليزر، يبرز التأثير العميق للعلاج المشترك aPDT و NO على حيوية البكتيريا. تشير هذه النتائج إلى آلية مضادة للميكروبات تآزرية بين aPDT و NO قد تكون متوافقة مع العوامل التالية: (1) قدرة مجموعات الجوانيدين على اختراق الأغشية الحيوية والارتباط بالبكتيريا، مما يعزز الفعالية العامة للمضادات الميكروبية؛ (2) التأثير التدميري المشترك لل ROS الناتجة عن aPDT و NO على أغشية البكتيريا، مما يؤدي إلى تسرب كبير للبروتينات؛ (3) التثبيط التآزري لإنتاج ATP الميتوكوندري بواسطة كل من ROS و NO، مما يعيق الوظائف الأساسية للبكتيريا؛ و (4) تحفيز أكسدة الدهون، تلف الحمض النووي، وعدم وظيفة البروتينات بواسطة نواتج ROS و NO، مما يؤدي في النهاية إلى موت البكتيريا. علاوة على ذلك، لم يتم تضمين CPP و CGP غير المعرضين للإشعاع في التجارب الأخرى كضوابط بسبب نشاطها المضاد للميكروبات الضئيل.
بعد إثبات التأثير المضاد للميكروبات التآزري لـ aPDT و NO، قمنا بإجراء تحليل إضافي حول العلاقة بين تركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية وفعاليتها المضادة للميكروبات المقابلة. وقارنّا فعالية هذه الجسيمات النانوية المضادة للميكروبات مع تلك الخاصة بـ NaClO، وهو مكون شائع الاستخدام في ري قنوات الجذور السريرية. كما هو موضح في الملف الإضافي 1: الأشكال S6 و S7، فإن التأثيرات القاتلة للبكتيريا لـ أدى استخدام الليزر وCPP+الليزر وCGP+الليزر ضد بكتيريا E. faecalis إلى زيادة تدريجية في الفعالية مع زيادة تركيزات الجسيمات النانوية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت CGP+الليزر عبر جميع التركيزات المختبرة نشاطًا مضادًا للبكتيريا بشكل متفوق باستمرار مقارنةً بـ و CPP+ليزر. هذه الملاحظة تؤكد التأثير المضاد للميكروبات المعزز المنسوب إلى العمل التآزري لـ aPDT و NO. على سبيل المثال، حيوية البكتيريا بعد العلاجات باستخدام PBS، Ce6 ليزر، CPP ليزر، وCGP تم قياس الليزر على أنه ، و 4.30 وحدة لوغاريتمية، على التوالي. علاوة على ذلك، أظهر NaClO خصائص مضادة للبكتيريا قوية، حيث انخفضت قابلية البكتيريا للحياة إلى 3.28 وحدة لوغاريتمية عند تركيز، وغياب كامل للمستعمرات البكتيرية عند تركيز . بالإضافة إلى ذلك، لوحظ أن من CGP أكثر فعالية من ، ومع ذلك ليس بنفس الفعالية مثل بشكل ملحوظ، عند تركيز حقق CGP القضاء التام على المستعمرات البكتيرية. تشير هذه النتائج إلى أن CGP يمكن أن يكون بديلاً قوياً للعوامل المضادة للميكروبات التقليدية في علاج جذور الأسنان، مما يقدم نهجاً جديداً في مكافحة العدوى البكتيرية في العلاجات السنية.

القضاء على الأغشية الحيوية لـ CGP في المختبر

بالنظر إلى القدرات الملحوظة لـ CGP من حيث اختراق الأغشية الحيوية والنشاط المضاد للميكروبات التآزري، افترضنا أنه يمكن أن يقضي بكفاءة على الأغشية الحيوية. كانت تحقيقاتنا الأولية في هذا الشأن تتعلق بتقييم خاصية القضاء على الأغشية الحيوية لـ CGP على أغشية بيوفيلم E. faecalis، باستخدام طريقة صبغ البكتيريا الحية/الميتة. كما هو موضح في الشكل 4a، كانت هناك fluorescence خضراء واضحة من SYTO-9 في بيوفيلم E. faecalis المعالج بـ PBS + ليزر، في حين كانت fluorescence الحمراء من PI بالكاد ملحوظة. تم تصور إشارات قوية نسبيًا لكل من fluorescence الخضراء والحمراء في الأغشية الحيوية المعالجة بـ الليزر و CPP + الليزر، مما يشير إلى أن جزءًا فقط من الأغشية الحيوية قد تم تعطيله. بالمقابل، تم ملاحظة إشارات PI مكثفة في الأغشية الحيوية المعالجة بـ CGP + الليزر و ، مما يوحي بأن الأغشية الحيوية قد تم القضاء عليها تقريبًا. لدعم هذه النتائج، استخدمنا أيضًا صبغة الكريستال البنفسجي لتقييم فعالية القضاء على الأغشية الحيوية بواسطة CGP. كما هو موضح في الشكل 4b و c، ظلت الأغشية الحيوية سليمة نسبيًا بعد العلاج.
الشكل 4 فعالية القضاء على البيوفيلم في المختبر لـ CGP. أ صبغة الحياة/الموت، ب صبغة الكريستال البنفسجي، وج معدلات بقاء بيوفيلم E. faecalis بعد تلقيها علاجات مختلفة. د صور تمثيلية لصفائح العينات، هـ قابلية البكتيريا للحياة، و صور مجهر إلكتروني مسحّي لـ البيوفيلم الخاص بـ .faecalis في الأسنان المستخرجة من البشر بعد تلقيها لريات مختلفة. تُعرض البيانات كمتوسط ، ns: لا دلالة. مقارنة بين مقابل مجموعات أخرى
مع ليزر ليزر. في تناقض حاد، CGP+ليزر و أظهرت فعالية فعالة في القضاء، تاركة فقط و بقايا الأغشية الحيوية. من ناحية، تشير هذه النتائج إلى أن CGP يظهر خصائص متفوقة في القضاء على الأغشية الحيوية بالمقارنة مع aPDT بمفرده. من ناحية أخرى، على الرغم من أن NaClO، بسبب طبيعته المسببة للتآكل، يتفوق قليلاً على CGP في فعالية القضاء على الأغشية الحيوية، إلا أن إمكانياته
يجب الاعتراف بالآثار الجانبية الشديدة والسمية المعروفة. وبالتالي، نعتقد أن CGP لا يزال يحمل إمكانيات للتطبيق في ري قنوات الجذور. بالإضافة إلى ذلك، كان من الواضح أن فعالية المضادات الميكروبية والقضاء على الأغشية الحيوية لـ كانت الليزر أقل نسبياً مقارنة بتلك الخاصة بـ CPP + ليزر و CGP + ليزر. لذلك، في التجارب اللاحقة، تم استبعاد Ce6 + ليزر الحر من الاستخدام كعنصر تحكم.
مجموعة، مما يسمح بتحليل أكثر تركيزًا على الخصائص القوية المستهدفة للبيوفيلم لـ CGP.
تشجيعًا من النتائج الإيجابية لتقنية CGP + الليزر في صبغ البكتيريا الحية/الميتة وصبغ الكريستال البنفسجي، قمنا بزراعة أغشية حيوية لبكتيريا E. faecalis في قنوات الجذور لأسنان بشرية مستخرجة لتقييم فعالية القضاء على الأغشية الحيوية. كما هو موضح في الشكل 4d و e، تم ملاحظة حيوية البكتيريا بعد علاج CPP + الليزر عند الوحدات، في حين أن علاج CGP + الليزر قللها إلى الوحدات. ومن الجدير بالذكر أن فعالية CGP+Laser كانت قريبة جدًا من ، والذي أظهر قابلية بكتيرية تبلغ 0.77 وحدة لوغاريتمية فقط. للحصول على مزيد من الرؤى، تم تشريح السن المعالج طوليًا على طول محوره الطويل، مع التركيز على الجزء القمي من قنوات الجذر للملاحظة التفصيلية تحت المجهر الإلكتروني الماسح. كما هو موضح في الشكل 4f، كانت هناك وفرة من حيوانات E. faecalis الدقيقة التي استعمرت بكثافة جدار قناة الجذر وسدت الأنابيب العاجية في مجموعة التحكم المعالجة بـ NS. على النقيض، كانت هناك بقايا بكتيرية قليلة فقط واضحة في القنوات المعالجة بـ CPP + الليزر، بينما كانت القنوات المعالجة بـ CGP + الليزر و ظهر أن NaClO خالٍ تقريبًا من أي وجود بكتيري. تشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن علاج CGP+الليزر فعال للغاية في القضاء على حيوانات E. faecalis الحيوية داخل قنوات الجذر، مما يظهر فعالية تقارب تلك المستخدمة عادة في الري السني. نظرًا للتحكم الزمني والمكاني، بالإضافة إلى خصائصه المضادة للميكروبات المشابهة وفعاليته في القضاء على الأغشية الحيوية مقارنة بـ NaClO، يظهر CGP كمرشح محتمل للتطبيقات السريرية في طب الأسنان.

اختبارات التوافق الدموي والتوافق الحيوي

تعتبر السلامة الحيوية اعتبارًا بالغ الأهمية للتطبيقات داخل الجسم. في هذا السياق، استخدمنا اختبار تجميع كريات الدم الحمراء واختبار انحلال الدم لإظهار توافق الجسيمات النانوية مع الدم. كما هو موضح في الشكل 5 أ و ب، عند اختبارها مع Ce6 الحر ( )، CPP ( )، و CGP ( )، لم تكن هناك تحسينات ملحوظة في تجمع كريات الدم الحمراء، كما لم تكن هناك أي اضطرابات في شكل كريات الدم الحمراء. علاوة على ذلك، في غياب إشعاع الليزر، أظهرت Ce6 الحرة وCPP وCGP أقل من 0.25% من انحلال كريات الدم الحمراء (الشكل 5c). هذه النتيجة تتناقض بشكل حاد مع نتيجة كريات الدم الحمراء المعالجة بـ التي فقدت سلامتها، تاركة فقط شظايا خلوية يمكن ملاحظتها تحت المجهر. بسبب الخصائص التآكلية والأكسدة القوية لـ NaClO [47]، تم إزالة لون الدم بعد التعايش المشترك مع لمدة دقيقة واحدة.
بالإضافة إلى ذلك، كانت قابلية بقاء الخلايا لـ CGP باستمرار أكبر من بعد التعايش المشترك مع خلايا MC3T3-E1 أو hPDLSCs لمدة 24 ساعة (الشكل 5d و e). ومن الجدير بالذكر أن شكل hPDLSCs لم يتأثر بعد هذه الفترة، دون أي
تمت ملاحظة فلوريسcence حمراء ملحوظة من صبغة PI (الشكل 5f). كما هو متوقع، أظهر NaClO سمية خلوية ملحوظة، مع أقل من نجاة الخلايا بعد دقيقة واحدة من التعايش مع خلايا hPDLSCs و MC3T3-E1. تظهر التجارب السابقة أن CGP يتمتع بتوافق دموي جيد وتوافق حيوي، مع إمكانيات كبيرة للتطبيقات السريرية.

التمايز العظمي في المختبر

في علاج التهاب اللثة، بالإضافة إلى السيطرة على العدوى، نأمل أن يعزز CGP أيضًا إصلاح وتجديد العظام المحيطة بالذروة. تجديد العظام هو عملية معقدة مرتبطة بالالتهاب، وتكوين الأوعية الدموية، وتكوين العظام. قد يلعب NO دورًا مهمًا في نشاط ALP والتعادل المعدني في سلالة الخلايا العظمية [33]. استخدمت تجاربنا الخلوية لتمثيل البيئات الالتهابية، ودفع CGP لإنتاج NO. بعد 7 أيام من معالجة خلايا MC3T3-E1 بـ و تحت ظروف نقص المعادن – الجليسرول وحمض الأسكوربيك في الوسط)، كانت درجة صبغ ALP أقل قليلاً من تلك الخاصة بـ PBS، بينما كان أغمق من PBS (الشكل 6 أ). وقد تم تأكيد ذلك من خلال بيانات ALP الكمية، التي كشفت أن نشاط ALP في الـ مجموعة CGP كانت أعلى مقارنة بـ وحيدًا (الشكل 6ب). خلال تمايز الخلايا العظمية، يتم ترسيب مركبات الكالسيوم على سطح الخلية لتشكيل عقيدات الكالسيوم. يمكن صبغ هذه العقيدات باللون البرتقالي باستخدام صبغة الأليزارين الأحمر [48]. بعد 21 يومًا من العلاج، تم معالجة خلايا MC3T3E1 بـ و أظهرت عددًا أقل من العقيدات المعدنية مقارنة بتلك المعالجة بـ PBS، في حين كانت أكثر وفرة في CGP (الشكل 6 ج و د). تشير هذه النتائج إلى أنه بينما و أعاق بشكل كبير عملية التمعدن لخلايا MC3T3-E1، خفف من الآثار السلبية لـ وأعاد عدد العقد المعدنية إلى مستويات قابلة للمقارنة مع تلك الخاصة بمجموعة PBS.
تم استخدام ELISA لتحليل إفراز علامات مرتبطة بتكوين العظام، بما في ذلك OCN وRUNX2، في خلايا MC3T3-E1 مع علاجات مختلفة. من المعروف أن OCN يلعب دورًا حاسمًا في استقلاب العظام، لا سيما في توازن الكالسيوم وعمليات تكلس العظام [49]. من ناحية أخرى، يعمل RUNX2 في نمو وتمايز الخلايا العظمية من خلال تحفيز التعبير عن علامات حيوية لاحقة [50، 51]. كما هو موضح في الشكل 6e، اختلف تركيز OCN في السائل فوق الخلايا MC3T3-E1 عبر مجموعات العلاج. أظهرت الخلايا المعالجة بـ PBS مستوى OCN من في وجود و ، انخفض هذا المستوى قليلاً إلى 91.9 و ، مما يشير إلى بعض الاضطراب في النشاط العظمي تحت الظروف الالتهابية. ومن المRemarkably، تم معالجة الخلايا بـ
الشكل 5 توافق الدم والتوافق الحيوي لـ CGP. أ صور مجهرية لتجمع كريات الدم الحمراء في مجموعات العلاج المختلفة. ب، ج تأثيرات انحلال الدم في مجموعات العلاج المختلفة. د اختبار عد الخلايا Kit-8 لـ MC3T3-E1 و هـ خلايا hPDLSCs بعد معالجتها بمجموعات مختلفة. تلوين الخلايا الحية/الميتة في مجموعات مختلفة من hPDLSCs. تُعرض البيانات كمتوسط SEM. في (ج) “، بينما في ( ) ، *** , ، ns: لا دلالة إحصائية. في (ج) مقارنة بين PBS مقابل المجموعات الأخرى، بينما في (د، هـ) بين مجموعة التحكم مقابل المجموعات الأخرى
أظهر CGP زيادة ملحوظة في تركيز OCN، حيث وصل إلى . هذا يشير إلى أن وجود CGP لا يخفف فقط من التأثير المثبط لـ ولكنه يعزز أيضًا النشاط العظمي. وبالمثل، أظهرت مستويات RUNX2 في مستخلصات خلايا MC3T3-E1 نمطًا متوافقًا. كانت مستويات RUNX2 في الخلايا المعالجة بـ PBS في وجود و انخفض مستوى CPP هذا بشكل طفيف إلى 143.0 و . ومع ذلك، في مجموعة CGP، كان هناك زيادة ملحوظة في تركيز RUNX2، حيث وصل إلى (الشكل 6f). تشير هذه الزيادة إلى أن CGP يعزز تمايز الخلايا العظمية وتكوين العظام، حتى في ظل ظروف الالتهاب.
تشير هذه النتائج إلى قمع ملحوظ للتمايز العظمي في وجود نظام تشغيل روبوتات
يوجد عادةً في الحالات الالتهابية [52]. ومع ذلك، يبدو أن إدخال CGP يعاكس هذا التأثير المثبط. الآلية الكامنة وراء هذه الظاهرة تتضمن استهلاك بواسطة CGP، مما يؤدي إلى توليد NO. إن إطلاق NO من CGP له دور أساسي في تحفيز التمايز العظمي في خلايا MC3T3، كما يتضح من زيادة نشاط ALP في المراحل المبكرة من التمايز، وبدء ترسيب الكالسيوم في المراحل اللاحقة، وزيادة التعبير عن علامات التمايز العظمي الرئيسية مثل OCN وRUNX2. من الجدير بالذكر أن هذا الاختبار لا يعكس بدقة السيناريو الفعلي في الجسم الحي، ولكن هو نوع من أنواع الجذور الحرة التي توجد بشكل مستمر في مواقع الالتهاب على المدى الطويل، والجذور الحرة التي تنتجها الأنسجة المحيطة بذروة السن تعيق تمايز الخلايا العظمية [53]. في التطبيقات العلاجية، المتبقي
الشكل 6 آليات تعزيز CGP لإصلاح عيوب العظام حول الذروة. صور وبيانات كمية لتلوين ALP و تلون الأليزارين الأحمر في خلايا MC3T3-E1 بعد تلقيها علاجات مختلفة في ظروف التمعدن. e مستويات تعبير OCN و RUNX2 في خلايا MC3T3-E1 بعد تلقيها علاجات مختلفة في ظروف التمعدن. تُعرض البيانات كمتوسط SEM ، *** , **** ، ns: لا دلالة. مقارنة بين CGP مقابل مجموعات أخرى
يمكن أن تؤدي الالتهابات الناتجة عن aPDT أو الالتهابات المحيطية إلى أكسدة CGP، مما ينتج كميات ضئيلة من NO. من المتوقع أن تعزز هذه العملية إصلاح وتجديد عيوب العظام المحيطية، مما يبرز إمكانيات CGP كعامل علاجي في الحالات التي تعيق فيها الالتهابات والإجهاد التأكسدي عمليات الشفاء والتجديد العظمي الطبيعية.

العلاج في الجسم الحي لالتهاب جذر السن

أظهر CGP توافقًا حيويًا جيدًا، وقدرة مضادة للميكروبات، وقدرة على القضاء على الأغشية الحيوية، وتعزيز خصائص التمعدن في تجارب المختبر. وهذا يوفر أساسًا لإجراء تقييم علاجي في الجسم الحي باستخدام نموذج ذي صلة في قمة الجذر. تقدم الشكل 7a الإجراء التجريبي المفصل لإنشاء نموذج AP لتقييم العلاج والتأثير. باختصار، تم فتح تجويف اللب في الضرس الأول العلوي الأيسر للفأر، وتم وضع كرة قطنية صغيرة تحتوي على تعليق من E. faecalis لإصابة قناة الجذر، بعد ذلك تم إغلاق التاج باستخدام أيونات الزجاج. بعد مرور أسبوعين
عند الإصابة، تم علاج الجرذان بمحلول PBS، CPP+ليزر، وCGP+ليزر، على التوالي. بعد 3 أسابيع من العلاج، تم جمع الضرس الأول العلوي الأيسر والمنطقة العلوية المحيطة من الفئران، وتم قياس مدى عيوب العظام حول القمة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. أظهرت النتائج انخفاضات ملحوظة في حيوية البكتيريا عبر جميع مجموعات العلاج في يوم الري (الشكل 7ب و ج) وفي اليوم 21، مما يدل على تأثيرات مضادة للميكروبات كبيرة (الشكل 7د و هـ). يتماشى ذلك مع نتائج ري قنوات الجذور في الأسنان المستخرجة، حيث كان التأثير المضاد للميكروبات أعلى من في جميع المجموعات. توضح الشكل 7 (و) المستويات التاجية والمحورية للصور المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد للضرس الأول التمثيلي لكل مجموعة. يوضح الشكل بوضوح وجود تجويف كبير لامتصاص العظام في الأنسجة المحيطة بالذروة في مجموعة PBS، مما يشير إلى أن عدوى E. faecalis في قناة الجذر أدت إلى عيب كبير في العظام المحيطة بالذروة. على النقيض من ذلك، انخفض هذا العيب بشكل واضح في مجموعة الليزر ومجموعة CGP+الليزر، مما يشير إلى الشفاء التدريجي لـ
الشكل 7 الفعالية العلاجية في الجسم الحي لنموذج الفئران المصابة بالتهاب اللثة القمي CGP. أ تصميم التجربة لنموذج الفئران المصابة بالتهاب اللثة القمي. ب، ج صور تمثيلية للوحة العينة وحيوية البكتيريا. . في أسنان الجرذان بعد تلقيها مختلف عمليات الري في اليوم 0 و اليوم 21. صور تمثيلية و حجم الامتصاص الكلي للضرس الأول العلوي الأيسر في كل مجموعة. تلوين HE التمثيلي و صبغة TRAP. الأسهم الخضراء تشير إلى العدلات والأسهم الحمراء تشير إلى الخلايا العظمية النشطة. البيانات مقدمة كمتوسط . مقارنة بين PBS ومجموعات أخرى
عيب عظمي بعد السيطرة الناجحة على العدوى. ما يلفت الانتباه بشكل خاص هو التجويف الانتصافي الأصغر بكثير الذي لوحظ في مجموعة CGP+Laser مقارنة بالمجموعات الأخرى، حيث تشبه حالته المحيطية بشكل وثيق حالة المجموعة الصحية، مما يشير إلى تعزيز شفاء عيوب العظام المحيطية. و
البيانات الكمية المعروضة في الشكل 7 ج، كان حجم تجويف الامتصاص ، و لـ PBS، CPP + ليزر، و CGP + ليزر، على التوالي. أظهر CPP + ليزر تقليل في عيوب العظام في علاج الالتهاب حول الذروة مقارنة بمجموعة NaClO (مجموعة PBS كـ )، على الأرجح بسبب
تأثير الإخراج لـ NaClO، مما يسبب سمية الأنسجة المحيطة بالذروة [54]. تم استخدام طريقة الري باستخدام الحقنة التقليدية في هذه الدراسة، وكان الإخراج القمي لا مفر منه باستثناء أنظمة الري ذات الضغط السلبي [55]. من المRemarkably، كانت تجويف الامتصاص لـ CGP+Laser أقل من ذلك من CPP+Laser. أظهر CGP+Laser تأثيرات علاجية ممتازة مع تأثيرات مضادة للميكروبات، وساعد إنتاج NO أثناء العلاج في شفاء عيوب العظام المحيطة بالذروة. لقد ثبت أن التطبيق التآزري لـ aPDT مع NO يعالج AP بشكل فعال وآمن.
تم إجراء صبغ H&E و TRAP لتسهيل التقييم الإضافي للتأثير التآزري لـ aPDT و NO. كما هو موضح في الشكل 7h، أظهر منطقة الذروة المحيطية لمجموعة PBS تسربًا وفيرًا للخلايا المتعادلة، في حين أن أظهرت مجموعات CPP+Laser تسربًا طفيفًا لخلايا التهابية، مما يشير إلى أن الالتهاب في الأنسجة المحيطة بالذروة قد تضاءل تدريجياً بعد السيطرة الناجحة على العدوى. على العكس، أظهرت مجموعة CGP+Laser تسربًا ضئيلاً للخلايا المتعادلة، مما يشير إلى استجابة التهابية أخف في هذه المجموعة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأنسجة المحيطة بالذروة في هذه المجموعة سلامة شكلية دون عيوب ملحوظة، مما يدل على أفضل نتيجة علاجية. كما هو موضح في الشكل 7i، أظهر صبغ TRAP العديد من الخلايا العظمية النشطة في الأنسجة المحيطة بالذروة في مجموعة PBS، بينما تم تقليل عدد الخلايا العظمية في مجموعة NaClO وCPP+Laser. ومن الجدير بالذكر أن الخلايا العظمية كانت غائبة تقريبًا في مجموعة CGP + Laser، بينما كانت الميزات النسيجية ومساحة الرباط اللثوي مشابهة لتلك الموجودة في المجموعة الصحية. قد تُعزى هذه النتائج إلى التأثير المضاد للميكروبات القوي والقدرة على تحفيز تجديد العظام المرتبطة بـ CGP+Laser، مما يظهر فعالية علاجية مثلى في العلاج اللبّي. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم ملاحظة سمية كبيرة لـ CGP خلال العلاج، ولم تُلاحظ أي شذوذات مرضية في الأعضاء الرئيسية للفئران (الملف الإضافي 1: الشكل S8)، مما يدل على سلامة منصتنا النانوية المضادة للبكتيريا متعددة الوظائف. تدعم هذه النتائج التطبيق المحتمل المستقبلي لـ CGP + Laser في طب الأسنان اللبّي، بينما تقدم أيضًا استراتيجية علاجية جديدة لعملية ري قنوات الجذور.
على الرغم من أن هذه الدراسة قد أسفرت عن بعض النتائج الواعدة، من المهم الاعتراف ببعض القيود. يجب أن تركز الأبحاث اللاحقة على إجراء تحليلات شاملة للآليات الدقيقة وفعالية CGP داخل الأغشية الحيوية متعددة الأنواع والهياكل المعقدة لقنوات الجذر، مثل القنوات على شكل C، والمنحنية بشدة، والقنوات الإضافية [58]. بينما تظهر تركيزات محددة من CGP + الليزر خصائص مضادة للميكروبات قابلة للمقارنة، لا يزال NaClO يحتفظ بمكانة فريدة في ري قنوات الجذر بفضل خصائصه المضادة للميكروبات القوية.
وخصائص إذابة الأنسجة. ونعتقد أن CGP + الليزر يمكن أن يكون بديلاً جذابًا في بعض الحالات. علاوة على ذلك، قد يحمل وعدًا في علاج أمراض اللثة، وإدارة عدوى الأغشية الحيوية الأخرى، وتطبيقات متنوعة أخرى.

الاستنتاجات

أظهرت هذه الدراسة نظام توليد أكسيد النيتريك (NO) القابل للتحكم المدفوع بالعلاج الضوئي المعتمد على الأكسجين (aPDT)، والذي يُشار إليه باسم CGP، والذي تم استخدامه لعلاج AP بطريقة تآزرية مع aPDT/NO. خلال عملية ري قناة الجذر، تمكنت مجموعات الغوانيدين على سطح CGP من اختراق الأغشية الحيوية بنجاح. يمكن أن تتأكسد هذه المجموعات الغوانيدينية بواسطة تم إنشاؤه خلال aPDT دون التأثير على الجيل. أظهر الجمع بين NO و aPDT تأثيرًا مضادًا للميكروبات ملحوظًا وقدرة رائعة على القضاء على الأغشية الحيوية، سواء في المختبر أو في الكائنات الحية. بعد النجاح في القضاء على الأغشية الحيوية في قنوات الجذور، عزز NO المنتج إصلاح عيوب العظام في الأنسجة المحيطة بالذروة، مما سهل بشكل كبير شفاء التهاب جذر السن. وبالتالي، تم تطوير نظام فعال لري قنوات الجذور.
اختصارات
AP التهاب جذر السن
NaClO هيبوكلوريت الصوديوم
aPDT العلاج الضوئي المضاد للميكروبات
روس أنواع الأكسجين التفاعلية
بيروكسيد الهيدروجين
الأكسجين الأحادي
لا أكسيد النيتريك
جي-بيغ-بي سي إل بوليمر غوانيدينيلاتي بولي (إيثيلين غليكول) – بولي (ɛ-كابرو لاكتون)
-PEG-PCL بولي (إيثيلين غليكول) – بولي (ديلتا-كابرو لاكتون) طرفه أميني
سي 6 كلورين e6
CGP جي-بيغ-بي سي إل محمّل بـ Ce6
CPP -PEG-PCL محمّل بـ Ce6
بي بي جزيئات نانوية فارغة NH2-PEG-PCL
طبيب عام جزيئات نانوية فارغة من G-PEG-PCL
E. faecalis إنتيروكوكوس فاسياليس
PBS محلول ملحي معزز بالفوسفات
NS محلول ملحي عادي
فخ فوسفاتاز الحمض المقاوم للتارتارات
هو الهيماتوكسيلين-إيوزين
SOSG مستشعر الأكسجين الأحادي الأخضر
دي سي إف إتش – دي إيه ديكلوروديهيدروفلورسئين داي أستات
داف-إف إم دا 3-أمينو، 4-أمينوميثيل-2’، 7′-ديفلوريسئين، داي أسيتيت
ATP تغيرات في الأدينوزين 5′-ثلاثي الفوسفات
خلايا جذعية من نسيج اللثة البشري خلايا جذعية من الرباط اللثوي البشري
ALP الفوسفاتاز القلوي
إليزا اختبار الامتزاز المناعي المرتبط بالإنزيم
OCN أوستيوكالسين
RUNX2 عامل النسخ المرتبط بـ Runt 2
CLSM ميكروسكوب المسح بالليزر المتماسك

معلومات إضافية

تحتوي النسخة الإلكترونية على مواد إضافية متاحة علىhttps://doi. org/10.1186/s12951-024-02483-8.
الملف الإضافي 1: الجدول S1. سعة تحميل Ce6 وكفاءة الت encapsulation لـ CGP. الشكل S1. طيف الرنين المغناطيسي النووي
استقرار CGP خلال 14 يومًا. . طيف الامتصاص فوق البنفسجي-المرئي لـ Ce6 الحر، CPP، و CGP. الشكل S4. طيف انبعاث الفلورسنت لـ Ce6 الحر، CP، و CGP. الشكل S5. ملفات توليد ROS الكلي لمجموعات مختلفة على مدى فترات زمنية متنوعة. البيانات مقدمة كمتوسط SEM . مقارنة بين CGP+ليزر مقابل مجموعات أخرى. الشكل S6. صور تمثيلية لعينات الصفائح من Enterococcus faecalis بعد علاجات مختلفة. الشكل S7. حيوية البكتيريا لـ Enterococcus faecalis بعد علاجات مختلفة. الشكل S8. صبغة HE للقلب والرئة والكبد والطحال والكلى في المجموعة الصحية ومجموعة AP المعالجة بـ CGP+ليزر.

شكر وتقدير

لا شيء.

مساهمات المؤلفين

Y. Zeng و X. Hu: ساهموا في الفكرة، التصميم، جمع البيانات، التحليل، والتفسير، وصاغوا وراجعوا المخطوطة بشكل نقدي. Z Cai و D. Qiu: ساهموا في جمع البيانات والتحليل، وصاغوا المخطوطة، وراجعوا المخطوطة بشكل نقدي. Y. Ran و Y. Ding و J. Shi: ساهموا في جمع البيانات، وصاغوا المخطوطة. X. Cai و Y. Pan: ساهموا في الفكرة، التصميم، وراجعوا المخطوطة بشكل نقدي. جميع المؤلفين راجعوا ووافقوا على المخطوطة النهائية.

تمويل

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع ونتشو الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا (ZY2022019)، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ في الصين (LGF21H140005)، ومشاريع خطة العلوم والتكنولوجيا في الطب والصحة في مقاطعة تشجيانغ (2022RC212).

توفر البيانات

تتوفر مجموعات البيانات المستخدمة والمحللة خلال الدراسة الحالية من المؤلف المراسل عند الطلب المعقول.

الإعلانات

تمت الموافقة على التجارب السنية والحيوانية من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية طب الأسنان بجامعة ونتشو الطبية (رقم WYKQ2023005) ولجنة الأخلاقيات الحيوانية بجامعة ونتشو الطبية (رقم wydw2023-0290).
غير قابل للتطبيق.

المصالح المتنافسة

يعلن المؤلفون عدم وجود أي تضارب محتمل في المصالح فيما يتعلق بتأليف و/أو نشر هذه المقالة.
تاريخ الاستلام: 28 يناير 2024 تاريخ القبول: 16 أبريل 2024
نُشر على الإنترنت: 30 أبريل 2024

References

  1. Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ. The effects of surgical exposures of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1965;20:340-9.
  2. Shah AC, Leong KK, Lee MK, Allareddy V. Outcomes of hospitalizations attributed to periapical abscess from 2000 to 2008: a longitudinal trend analysis. J Endod. 2013;39:1104-10.
  3. Tiburcio-Machado CS, Michelon C, Zanatta FB, Gomes MS, Marin JA, Bier CA. The global prevalence of apical periodontitis: a systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 2021;54:712-35.
  4. Persoon IF, Ozok AR. Definitions and epidemiology of endodontic infections. Curr Oral Health Rep. 2017;4:278-85.
  5. Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals. J Endod. 2002;28:689-93.
  6. Mah TF, Pitts B, Pellock B, Walker GC, Stewart PS, O’Toole GA. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 2003:426:306-10.
  7. Zehnder M. Root canal irrigants. J Endod. 2006;32:389-98.
  8. AI-Sebaei MO, Halabi OA, El-Hakim IE. Sodium hypochlorite accident resulting in life-threatening airway obstruction during root canal treatment: a case report. Clin Cosmet Investig Dent. 2015;7:41-4.
  9. Ortiz-Alves T, Diaz-Sanchez R, Gutierrez-Perez JL, Gonzalez-Martin M, Serrera-Figallo MA, Torres-Lagares D. Bone necrosis as a complication of sodium hypochlorite extrusion. A case report. J Clin Exp Dent. 2022;14:e885-889.
  10. Xu R, Guo D, Zhou X, Sun J, Zhou Y, Fan Y, Zhou X, Wan M, Du W, Zheng L. Disturbed bone remodelling activity varies in different stages of experimental, gradually progressive apical periodontitis in rats. Int J Oral Sci. 2019;11:27.
  11. Xiao F, Cao B, Wang C, Guo X, Li M, Xing D, Hu X. Pathogen-specific polymeric antimicrobials with significant membrane disruption and enhanced photodynamic damage to inhibit highly opportunistic bacteria. ACS Nano. 2019;13:1511-25.
  12. Wang D, Niu L, Qiao ZY, Cheng DB, Wang J, Zhong Y, Bai F, Wang H, Fan H. Synthesis of self-assembled porphyrin nanoparticle photosensitizers. ACS Nano. 2018;12:3796-803.
  13. Zhu J, Tian J, Yang C, Chen J, Wu L, Fan M, Cai X. L-Arg-rich amphiphilic dendritic peptide as a versatile NO donor for NO/photodynamic synergistic treatment of bacterial infections and promoting wound healing. Small. 2021;17: e2101495.
  14. Carrinho PM, Andreani DIK, Morete VA, Iseri S, Navarro RS, Villaverde AB. A study on the macroscopic morphometry of the lesion area on diabetic ulcers in humans treated with photodynamic therapy using two methods of measurement. Photomed Laser Surg. 2018;36:44-50.
  15. de Vasconcelos Catao MH, Nonaka CF, de Albuquerque Jr RL, de BentoOliveira Costa PMR. Effects of red laser, infrared, photodynamic therapy, and green LED on the healing process of third-degree burns: clinical and histological study in rats. Lasers Med Sci. 2015;30:421-8.
  16. Gong J, Park H, Lee J, Seo H, Lee S. Effect of photodynamic therapy on multispecies biofilms, including Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, and Candida albicans. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 2019;37:282-7.
  17. Wan SS, Zeng JY, Cheng H, Zhang XZ. ROS-induced NO generation for gas therapy and sensitizing photodynamic therapy of tumor. Biomaterials. 2018;185:51-62.
  18. Xiu W, Gan S, Wen Q, Qiu Q, Dai S, Dong H, Li Q, Yuwen L, Weng L, Teng Z, et al. Biofilm microenvironment-responsive nanotheranostics for dualmode imaging and hypoxia-relief-enhanced photodynamic therapy of bacterial infections. Research (Wash D C). 2020;2020:9426453.
  19. Cao H, Zhong S, Wang Q, Chen C, Tian J, Zhang W. Enhanced photodynamic therapy based on an amphiphilic branched copolymer with pendant vinyl groups for simultaneous GSH depletion and Ce6 release. J Mater Chem B. 2020;8:478-83.
  20. Sun X, Sun J, Lv J, Dong B, Liu M, Liu J, Sun L, Zhang G, Zhang L, Huang G, et al. Ce6-C6-TPZ co-loaded albumin nanoparticles for synergistic combined PDT-chemotherapy of cancer. J Mater Chem B. 2019;7:5797-807.
  21. Liu HD, Ren MX, Li Y, Zhang RT, Ma NF, Li TL, Jiang WK, Zhou Z, Yao XW, Liu ZY, Yang M. Melatonin alleviates hydrogen peroxide induced oxidative damage in MC3T3-E1 cells and promotes osteogenesis by activating SIRT1. Free Radic Res. 2022;56:63-76.
  22. Sheppard AJ, Barfield AM, Barton S, Dong Y. Understanding reactive oxygen species in bone regeneration: a glance at potential therapeutics and bioengineering applications. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10: 836764.
  23. Zhang J, Guo H, Liu M, Tang K, Li S, Fang Q, Du H, Zhou X, Lin X, Yang Y. Recent design strategies for boosting chemodynamic therapy of bacterial infections. Exploration. 2023;2023:20230087.
  24. Liu R, Peng Y, Lu L, Peng S, Chen T, Zhan M. Near-infrared light-triggered nano-prodrug for cancer gas therapy. J Nanobiotechnol. 2021;19:443.
  25. Yang Z, Chen H. Recent deveolpment of multifunctional responsive gas-releasing nanoplatforms for tumor therapeutic application. Nano Res. 2023;16:3924-38.
  26. Opoku-Damoah hang . Therapeutic gas-releasing nanomedicines with controlled release: advances and perspectives. Exploration (Beijing). 2022;2:20210181.
  27. Backlund CJ, Sergesketter AR, Offenbacher S, Schoenfisch MH. Antibacterial efficacy of exogenous nitric oxide on periodontal pathogens. J Dent Res. 2014;93:1089-94.
  28. Barui AK, Nethi SK, Patra CR. Investigation of the role of nitric oxide driven angiogenesis by zinc oxide nanoflowers. J Mater Chem B. 2017;5:3391-403.
  29. Qian Y, Chug MK, Brisbois EJ. Nitric oxide-releasing silicone oil with tunable payload for antibacterial applications. ACS Appl Bio Mater. 2022;5:3396-404.
  30. Lv X, Jiang J, Ren J, Li H, Yang D, Song X, Hu Y, Wang W, Dong X. Nitric oxide-assisted photodynamic therapy for enhanced penetration and hypoxic bacterial biofilm elimination. Adv Healthc Mater. 2023;12: e2302031.
  31. Li G, Yu S, Xue W, Ma D, Zhang W. Chitosan-graft-PAMAM loading nitric oxide for efficient antibacterial application. Chem Eng J. 2018;347:923-31.
  32. Saura M, Tarin C, Zaragoza C. Recent insights into the implication of nitric oxide in osteoblast differentiation and proliferation during bone development. Sci World J. 2010;10:624-32.
  33. Won JE, Kim WJ, Shim JS, Ryu JJ. Guided bone regeneration with a nitricoxide releasing polymer inducing angiogenesis and osteogenesis in critical-sized bone defects. Macromol Biosci. 2022;22: e2200162.
  34. Yasuhara R, Suzawa T, Miyamoto Y, Wang X, Takami M, Yamada A, Kamijo R. Nitric oxide in pulp cell growth, differentiation, and mineralization. J Dent Res. 2007;86:163-8.
  35. Izawa H, Kinai M, Ifuku S, Morimoto M, Saimoto H. Guanidinylated chitosan inspired by arginine-rich cell-penetrating peptides. Int J Biol Macromol. 2019;125:901-5.
  36. Khan NF, Nakamura H, Izawa H, Ifuku S, Kadowaki D, Otagiri M, Anraku M. Evaluation of the safety and gastrointestinal migration of guanidinylated chitosan after oral administration to rats. J Funct Biomater. 2023;14:340.
  37. Andreev K, Bianchi C, Laursen JS, Citterio L, Hein-Kristensen L, Gram L, Kuzmenko I, Olsen CA, Gidalevitz D. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2014;1838:2492-502.
  38. Hu D, Deng Y, Jia F, Jin Q, Ji J. Surface charge switchable supramolecular nanocarriers for nitric oxide synergistic photodynamic eradication of biofilms. ACS Nano. 2020;14:347-59.
  39. Liu H, Yu Y, Xue T, Gan C, Xie Y, Wang D, Li P, Qian Z, Ye T. A nonenzymatic electrochemical sensor for the detection of hydrogen peroxide in vitro and in vivo fibrosis models. Chin Chem Lett. 2024;35: 108574.
  40. Xiu W, Shan J, Yang K, Xiao H, Yuwen L, Wang L. Recent development of nanomedicine for the treatment of bacterial biofilm infections. VIEW. 2021;2:20200065.
  41. Gollmer A, Arnbjerg J, Blaikie FH, Pedersen BW, Breitenbach T, Daasbjerg K, Glasius M, Ogilby PR. Singlet Oxygen Sensor Green : photochemical behavior in solution and in a mammalian cell. Photochem Photobiol. 2011;87:671-9.
  42. Huysseune A, Larsen UG, Larionova D, Matthiesen CL, Petersen SV, Muller M, Witten PE. Bone formation in zebrafish: the significance of DAF-FM DA staining for nitric oxide detection. Biomolecules. 2023;13:1780.
  43. Eruslanov E, Kusmartsev S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods Mol Biol. 2010;594:57-72.
  44. Hsu Y-J, Nain A, Lin Y-F, Tseng Y-T, Li Y-J, Sangili A, Srivastava P, Yu H-L, Huang Y-F, Huang C-C. Self-redox reaction driven in situ formation of Cu2O/Ti3C2Tx nanosheets boost the photocatalytic eradication of multi-drug resistant bacteria from infected wound. J Nanobiotechnol. 2022;20:235.
  45. Votyakova TV, Reynolds IJ. Detection of hydrogen peroxide with Amplex Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation. Arch Biochem Biophys. 2004;431:138-44.
  46. Skulachev V. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis. 2006;11:473-85.
  47. Veisi H. Sodium hypochlorite (NaOCl). Synlett. 2007;2007:2607-8.
  48. Puchtler H, Meloan SN. TERRY MS: On the history and mechanism of alizarin and alizarin red S stains for calcium. J Histochem Cytochem. 1969;17:110-24.
  49. Xiao G, Cui Y, Ducy P, Karsenty G, Franceschi RT. Ascorbic acid-dependent activation of the osteocalcin promoter in MC3T3-E1 preosteoblasts:
    requirement for collagen matrix synthesis and the presence of an intact OSE2 sequence. Mol Endocrinol. 1997;11:1103-13.
  50. Kawane T, Qin X, Jiang Q, Miyazaki T, Komori H, Yoshida CA, MatsuuraKawata VKdS, Sakane C, Matsuo Y, Nagai K. Runx2 is required for the proliferation of osteoblast progenitors and induces proliferation by regulating Fgfr2 and Fgfr3. Sci Rep. 2018;8:13551.
  51. Seweryn A, Alicka M, Fal A, Kornicka-Garbowska K, Lawniczak-Jablonska K, Ozga M, Kuzmiuk P, Godlewski M, Marycz K. Hafnium (IV) oxide obtained by atomic layer deposition (ALD) technology promotes early osteogenesis via activation of Runx2-OPN-mir21A axis while inhibits osteoclasts activity. J Nanobiotechnol. 2020;18:1-16.
  52. Wittmann C, Chockley P, Singh SK, Pase L, Lieschke GJ, Grabher C. Hydrogen peroxide in inflammation: messenger, guide, and assassin. Adv Hematol. 2012;2012: 541471.
  53. Luo X, Wan Q, Cheng L, Xu R. Mechanisms of bone remodeling and therapeutic strategies in chronic apical periodontitis. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12: 908859.
  54. Cai C, Chen , Y, Jiang . Advances in the role of sodium hypochlorite irrigant in chemical preparation of root canal treatment. Biomed Res Int. 2023;2023:8858283.
  55. Azim AA, Aksel H, Margaret Jefferson M, Huang GT. Comparison of sodium hypochlorite extrusion by five irrigation systems using an artificial root socket model and a quantitative chemical method. Clin Oral Investig. 2018;22:1055-61.
  56. Mei Z, Gao D, Hu D, Zhou H, Ma T, Huang L, Liu X, Zheng R, Zheng H, Zhao P, et al. Activatable NIR-II photoacoustic imaging and photochemical synergistic therapy of MRSA infections using miniature Au/Ag nanorods. Biomaterials. 2020;251: 120092.
  57. Badran Z, Rahman B, De Bonfils P, Nun P, Coeffard V, Verron E. Antibacterial nanophotosensitizers in photodynamic therapy: an update. Drug Discov Today. 2023;28: 103493.
  58. Swimberghe RCD, Coenye T, De Moor RJG, Meire MA. Biofilm model systems for root canal disinfection: a literature review. Int Endod J. 2019;52:604-28.

ملاحظة الناشر

تظل شركة سبرينجر ناتشر محايدة فيما يتعلق بالمطالبات القضائية في الخرائط المنشورة والانتماءات المؤسسية.

Journal: Journal of Nanobiotechnology, Volume: 22, Issue: 1
DOI: https://doi.org/10.1186/s12951-024-02483-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38689259
Publication Date: 2024-04-30

Photodynamic and nitric oxide
Check for updates therapy-based synergistic antimicrobial nanoplatform: an advanced root canal irrigation system for endodontic bacterial infections

Youyun Zeng , Xiangyu , Zhibin Cai , Dongchao Qiu , Ying Ran , Yiqin Ding , Jiayi Shi , Xiaojun Cai and Yihuai Pan

Abstract

Background The main issues faced during the treatment of apical periodontitis are the management of bacterial infection and the facilitation of the repair of alveolar bone defects to shorten disease duration. Conventional root canal irrigants are limited in their efficacy and are associated with several side effects. This study introduces a synergistic therapy based on nitric oxide (NO) and antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) for the treatment of apical periodontitis. Results This research developed a multifunctional nanoparticle, CGP, utilizing guanidinylated poly (ethylene glycol)poly ( -Caprolactone) polymer as a carrier, internally loaded with the photosensitizer chlorin e6. During root canal irrigation, the guanidino groups on the surface of CGP enabled effective biofilm penetration. These groups undergo oxidation by hydrogen peroxide in the aPDT process, triggering the release of NO without hindering the production of singlet oxygen. The generated NO significantly enhanced the antimicrobial capability and biofilm eradication efficacy of aPDT. Furthermore, CGP not only outperforms conventional aPDT in eradicating biofilms but also effectively promotes the repair of alveolar bone defects post-eradication. Importantly, our findings reveal that CGP exhibits significantly higher biosafety compared to sodium hypochlorite, alongside superior therapeutic efficacy in a rat model of apical periodontitis. Conclusions This study demonstrates that CGP, an effective root irrigation system based on aPDT and NO, has a promising application in root canal therapy.

Keywords Antimicrobial photodynamic therapy, Nitric oxide gas therapy, Root canal irrigation, Multifunctional nanoparticles, Biofilm, Antimicrobials, Osteogenesis
Youyun Zeng and Xiangyu Hu contributed equally to this research.
*Correspondence:
Xiaojun Cai
cxj520118@wmu.edu.cn; cxj520118@njtech.edu.cn
Yihuai Pan
yihuaipan@wmu.edu.cn
School and Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China

Introduction

Apical periodontitis (AP) is an inflammatory condition primarily caused by bacterial infections, leading to the destruction of alveolar bone [1]. If not properly treated, AP can escalate into serious complications such as cellulitis, jaw osteomyelitis, and sepsis [2]. Notably, the worldwide prevalence of AP is reported to be approximately [3]. Conventional root canal therapy, aimed
at addressing AP, involves the removal of infected pulp tissue and microorganisms, followed by disinfection and filling of the root canal with an inert material. This process typically employs mechanical preparation and chemical irrigation for infection control. However, the complex anatomy of the root canal system, along with the persistent presence of biofilms, significantly hinders the effectiveness of these treatments. The failure rate of root canal treatment is [4]. Consequently, the development of effective AP treatments is crucial.
Root canal treatment failures are primarily due to microbial retention, which resists disinfection efforts and form biofilms in the root canals [5]. Meanwhile, these biofilms protect bacteria by hindering the penetration of therapeutic agents and fostering an environment conducive to increased drug resistance [6]. Sodium hypochlorite ( NaClO ), the preferred root canal irrigant in clinics, possesses potent antimicrobial properties and tissue dissolution ability [7]. However, inadvertent leakage of NaClO beyond the root canal may lead to serious complications, including acute inflammatory injury, mucosal necrosis, osteonecrosis, and potentially life-threatening airway obstruction [8, 9]. In AP, pathogens-induced irritation of the apical portion often results in the resorption and destruction of adjacent alveolar bone [10]. Effectively controlling the infection and facilitating the repair of alveolar bone defects to shorten disease duration is challenging. Therefore, the development of safe and controllable root canal irrigation systems that can efficiently penetrate and eradicate biofilms, as well as promote alveolar bone repair, is of paramount importance.
Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) is an efficient, non-invasive antimicrobial strategy, which offers precise temporal and spatial control, broad-spectrum antimicrobial and biofilm eradication properties [11]. It operates by activating photosensitizers with lasers at specific wavelengths, leading to the generation of reactive oxygen species (ROS), such as hydroxyl radicals, superoxide anion, hydrogen peroxide , and singlet oxygen ( ). These ROS are lethal to bacteria, causing damage to cell membranes, proteins, lipids, and nucleic acids [12,13]. Demonstrating effectiveness in inhibiting biofilms of burn wounds, chronically infected diabetic ulcers, and oral biofilms, aPDT holds promise for treating AP [14-16]. However, its efficacy is challenged in the hypoxic microenvironments of biofilms due to its oxygen-dependent nature [17, 18]. Furthermore, most conventional organic photosensitizers are hydrophobic and prone to aggregation in physiological conditions, reducing the ROS yield [19, 20]. Moreover, the use of high concentrations of photosensitizers in aPDT can result in the production of excessive ROS. This elevated ROS concentration may
lead to a persistent inflammatory response, which, in turn, can adversely affect the process of osteogenesis [21, 22]. To overcome these challenges, research has focused on combining aPDT with alternative therapeutic approaches [23,24]. This study explores the combination of aPDT with gas therapy, aiming to enhance biofilm eradication efficacy and mitigate the detrimental effects of elevated ROS levels.
Gas therapy, particularly with nitric oxide (NO), an endogenous gas molecule, has recently garnered attention as a green therapeutic strategy, acclaimed for its mild toxicity and non-resistance properties [25, 26]. NO plays a multifaceted role, contributing to anti-infection, inflammation regulation, and osteogenesis [27-30]. As a potent antimicrobial, NO interacts with the free radical superoxide to produce reactive byproducts, which lead to antimicrobial effects via lipid peroxidation, DNA damage, and protein dysfunction [29, 31]. Additionally, NO is known to stimulate osteogenesis by enhancing osteoblast activity [32]. Studies have shown that osteoblastic cell line MC3T3-E1 or pulp cells, when treated with NO donors, exhibit increased expression of osteogenic markers [33, 34]. Therefore, NO’s dual capability to efficiently combat microbial presence and promote bone defect repair presents a promising avenue in the management of AP.
In our previous study [13], we demonstrated that dendritic peptide rich in L-arginine are capable of acting as macromolecular NO donors, releasing NO in response to oxidation by . Furthermore, the presence of the guanidino group in L-arginine significantly enhances the biofilm penetration ability of these dendritic peptides. Building on these insights, we propose that nanoparticles modified with guanidino groups could similarly function as NO donors and exhibit exceptional biofilm permeability. This concept underpins our approach in developing an effective root canal irrigation system, leveraging these properties to combat infections in endodontic treatments.
In the present study, we developed and synthesized guanidino-functionalized poly (ethylene glycol)-poly( caprolactone) (PEG-PCL) block copolymers and used them to form chlorin e6 (Ce6)-loaded nanomicelles, named CGP (Scheme 1). These CGP nanomicelles are specifically designed to penetrate biofilms effectively during the root canal irrigation process. Leveraging the produced by Ce6 in the aPDT process, CGP is engineered to oxidize and release NO. This NO release is expected to synergize with the ROS generated during aPDT, resulting in potent antibacterial activity and efficient biofilm eradication. Additionally, following the successful antibacterial action and biofilm removal, CGP nanomicelles are anticipated to aid in the repair of periapical bone defects,
Scheme 1 CGP preparation schematic and synergistic PDT/NO antibacterial effect. Schematic representation of CGP preparation, accompanied by an elucidation of the mechanisms underlying the highly efficient synergistic antibacterial action of PDT/NO and its role in promoting apical periodontitis healing
thereby significantly enhancing the overall treatment efficacy.
The combination of aPDT and NO offers a promising pathway for developing a new multifunctional root canal irrigation system. This study is designed to assess the antibacterial, biofilm eradication, and osteogenic differentiation capabilities of CGP through colony counting, live/dead bacterial viability assays, simulated root canal irrigation, and osteogenic differentiation experiments, along with therapeutic testing in a rat AP model. Compared to NaClO , CGP is anticipated to possess not only antimicrobial properties but also superior temporal and spatial control abilities, as well as a unique capacity to facilitate the repair of apical bone defects. We anticipate that this study has developed an irrigation system capable of safely and effectively treating AP.

Materials and methods

Materials

Amino-terminated poly (ethylene glycol)-poly( caprolactone) ( -PEG-PCL) was obtained from Ponsure (Shanghai, China). Ce6 was obtained from Frontier Scientific (USA). 1-Amidinopyrazole hydrochloride, N, N-diisopropylethylamine, dichloromethane, glutaraldehyde, ethanol, methanol, cetylpyridinium chloride, crystal violet, acetic acid, and NaClO were purchased from Aladdin (Shanghai, China). Horseradish peroxidase, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt, phos-phate-buffered saline (PBS), normal saline (NS), hematox-ylin-eosin (HE) stain kit, and the Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) stain kit were obtained from Solarbio (China). Dimethyl sulfoxide, -glycerophosphate, and
ascorbic acid were obtained from Sigma-Aldrich (USA). The Griess reagent, assay kit, singlet oxygen sensor green (SOSG), 2’7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA), 3-Amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate (DAF-FM DA), BCA protein assay kit, enhanced adenosine -triphosphate (ATP) assay kit, Amplex red, Calcein/PI cell viability assay kit, BCIP/ NBT alkaline phosphatase (ALP) color development kit, Alizarin red S staining kit and cell counting kit- 8 were acquired from Beyotime (China). The osteoblastic cell line MC3T3-E1 and Enterococcus faecalis (E. faecalis, ID: ATCC29212) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). The human periodontal ligament stem cells (hPDLSCs) were purchased from Procell Life Science and Technology (China). Minimum essential medium alpha modification (MEM ), Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), and fetal bovine serum were obtained from Gibco (USA). Enhanced RIPA lysis buffer, mouse osteocalcin (OCN) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit, and mouse Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) ELISA kit were obtained from Jianglai Biotechnology (China). A live/dead BacLight viability kit was obtained from Invitrogen (USA). Brain heart infusion (BHI) was purchased from OXOID (USA).

Synthesis of CGP nanoparticles

The synthesis of CGP was carried out in two main steps. Initially, -PEG-PCL and 1-amidinopyrazole hydrochloride were mixed in a flask containing 10 mL of dimethyl sulfoxide. To this mixture, N, N-diisopropylethylamine was gradually added under an atmosphere of
nitrogen protection, maintaining a molar ratio of . This mixture was then stirred continuously at room temperature for 24 h , followed by dialysis in distilled water for 48 h . The resultant products, G-PEG-PCL, was collected, lyophilized, and stored for further use. The structural confirmation of G-PEG-PCL was performed using a nuclear magnetic resonance spectrometer (Bruker AVANCE III HD 600, Germany) operating at 600 MHz . In the second step, Ce6 ( 1 mg ) and G-PEG-PCL ( 20 mg ) were dissolved in 4 mL of dimethyl sulfoxide. This solution was then gradually and dropwise added to 24 mL of ultrapure water, with the mixture stirred in the dark for 24 h . Post-stirring, the samples were collected, dialyzed, lyophilized, and stored for subsequent experiments. For comparison, CPP nanoparticles unmodified with guanidino groups were prepared using -PEG-PCL following the procedure described above.

Physicochemical characterization of CGP

Particle size distribution and zeta potential analyses of free Ce 6 , blank -PEG-PCL nanoparticles (PP), blank G-PEG-PCL nanoparticles (GP), CPP, and CGP were conducted using a Malvern particle size analyzer (Zetasizer Nano ZS-90, Malvern Panalytical). The morphologies of CPP and CGP were visualized through a transmission electron microscope (FEI Talos F200S, Thermo Fisher). The absorption and emission spectra of free Ce6, CPP, and CGP were determined using an ultra-violet-visible photometer (Ultrospec 7000, Biochrom) and a fluorescence spectrophotometer (F-2710, Hitachi).

Bacterial association and biofilm penetration of CGP

To quantify the enhanced bacterial association facilitated by the modified guanidino groups in CGP, flow cytometric analysis was conducted. Initially, a bacterial suspension ( ) was prepared by incubating the bacteria in BHI medium on a shaker at and 200 rpm for 16 h . This was followed by centrifugation ( 4000 rpm for 6 min ) and resuspension in PBS. Subsequently, of this bacterial suspension was mixed with of CGP and incubated for 5 min . After centrifugation and resuspension in PBS, the samples were analyzed using a flow cytometer (CytoFlex LX, Beckman Coulter). Control samples comprised of PBS, mL ), and CPP ( ).
To assess the biofilm permeation properties of CGP, three-dimensional confocal laser scanning microscope (CLSM, A1, Nikon) was utilized. SYTO-9 (green, ) and were employed for staining the biofilms and tracking the penetration capability of CGP. Briefly, of E. faecalis suspension and of BHI medium were added to a 24 -well plate fitted with round glass coverslips. The plate
was then incubated in an anaerobic incubator at for 7 days to allow biofilms formation, with medium refreshment every 2 days. After biofilm maturation, the mediums were replaced with CGP ( ), and the sample was incubated for , dark). Subsequently, the biofilms were stained with SYTO-9 dye. After 15 min , the samples were washed and dried naturally away from light. Finally, the biofilms were visualized with CLSM. PBS, Ce6 ( ), and CPP ( ) were used as control samples.

ROS and NO generation profiles of CGP

To evaluate NO generation in CGP upon exposure to laser radiation, a modified Griess analysis was employed. In this method, NO rapidly reacts with the Griess reagent to form diazo compounds, which are detectable in the ELISA microplate reader at 540 nm . In a 96 -well plate, of CGP ( ) was mixed with of Griess reagent. After 30 min in the dark, the mixtures underwent irradiation with a 660 nm laser (output power of ) for , and 10 min . The absorbance of the samples was then measured at 540 nm using an ELISA microplate reader. For monitoring production during aPDT, the samples were subjected to a similar procedure using an assay kit. Initially, CGP was mixed with the detection reagent and then irradiated as described above. Following this, the mixtures were collected, and their absorbances at 560 nm were measured using an ELISA microplate reader. The production of was detected using SOSG. CGP was first mixed with SOSG and processed as described above; the fluorescence intensity of the mixtures was measured by a multifunctional ELISA microplate reader ( ). Control groups for the aforementioned experiments included PBS + Laser, Ce6 + Laser, CPP + Laser, and CGP without laser radiation.

Imaging of , and production by CGP in . faecalis

To detect NO release from CGP in bacteria, the NOsensitive fluorescent probe DAF-FM DA was used. Briefly, an E. faecalis suspension ( ) and CGP ( ) were mixed in an Eppendorf (EP) tube. Subsequently, the EP tube was incubated in an anaerobic incubator for , dark). DAFFM DA ( ) was then added to the EP tube, followed by irradiation for 5 min . After a 30 min incubation, the sample was washed three times with PBS. Finally, of the bacterial suspension was placed onto a slide and photographed using CLSM ( ). To assess the ROS production induced by CGP in bacteria, the fluorescent probe DCFH-DA was utilized. Briefly, an E. faecalis suspension ( ) and CGP ( ,
) were added to an EP tube and incubated in an anaerobic incubator ( , darkness). After 30 min , the fluorescent probe ( ) was added. The samples were processed as described above and photographed using CLSM ( ). To investigate the consumption of by CGP in bacteria under aPDT conditions, Amplex red and horseradish peroxidase were employed. First, an E. faecalis suspension ( ) and CGP were added to an EP tube, which was subsequently incubated in an anaerobic incubator ( , darkness) for 30 min . Afterward, Amplex red ( ) and horseradish peroxidase ( ) were added to the EP tube. The samples were processed next as above and photographed using CLSM ( ). Control groups for the aforementioned experiments included PBS + Laser, Ce6 + Laser, CPP + Laser, and CGP without laser radiation.

Antibacterial activity of CGP in vitro

The antimicrobial performance of CGP was evaluated using the colony counting method. Briefly, an E. faecalis bacterial suspension ( ) and CGP ( , ) were mixed in an EP tube. After 5 min of incubation in an anaerobic incubator ( , dark), the sample was irradiated for 5 min and further incubated for 30 min . Subsequently, the bacterial suspension ( ) was collected and diluted in a 96 -well plate in a gradient (from dilutions to ). The sample ( at a time) was spread dropwise in a solid medium, and each concentration was repeated three times before incubation for 24 h in an anaerobic chamber. The number of colonies and bacterial viability were then counted.
To further evaluate the antimicrobial properties of CGP, a live/dead BacLight viability assay was conducted. The bacteria were first treated as described above. After treatment, the bacterial suspension was centrifuged and washed to remove any residues of CGP. The pellet was then resuspended and stained with SYTO-9 and PI for 15 min at room temperature. Then, after another round of centrifuged and washed with PBS to remove excess stain, the bacteria were observed using an inverted fluorescence microscope.
To visualize the morphological changes in bacteria treated with CGP+Laser, scanning electron microscopy (SEM) was utilized. Bacteria were first treated as described above. After treatment, the bacterial cells were centrifuged and washed twice with NS. The bacteria were then fixed using 1 mL of glutaraldehyde ( , overnight). The bacteria were subsequently centrifuged and washed three times with NS. After dehydration with graded concentrations (including 30, 50 , 70,90 , and ) of an ethanol solution, the sample was added dropwise to silicon wafers and allowed to
dry naturally. Finally, the bacteria were sputtered with gold and observed with a scanning electron microscope (SU8010, HITACHI). Control groups for these experiments included PBS + Laser, CPP, CGP, Ce6 + Laser, and CPP+Laser.

Protein leakage and changes in ATP levels in CGP-treated bacteria

To evaluate bacterial protein leakage after treatment with CGP activated by aPDT, the bacteria were processed as previously described. Following the treatment and subsequent centrifugation, the supernatants were collected, and their protein concentration was determined using a BCA protein assay kit. The absorbance at 560 nm was then measured using an ELISA microplate reader. To detect changes in ATP levels within the bacteria, the bacteria were treated as described above, collected by centrifugation, lysed using lysis buffer ( ), and centrifuged for . The ATP assay working solution ( ) was added to the 96-well plate; subsequently, the sample was added to the plate. Chemiluminescence was detected using the luminometer function of the ELISA microplate reader. Control groups for these experiments included PBS + Laser, CPP, CGP, Ce6 + Laser, and CPP + Laser.

In vitro biofilm eradication effect of CGP

To evaluate the biofilm eradication efficacy of CGP, a live/dead BacLight viability assay was performed. Initially, a mixture of BHI medium ( ) and suspension of E. faecalis ( ) was added to each well of a 24 -well plate containing round glass coverslips. This plate was then incubated in an anaerobic chamber for 7 days to facilitate biofilm formation, with regular medium replacement every 2 days during the incubation period. After aspirating the supernatant, culture medium ( 250 ) and CGP ( ) were added and coincubated for 5 min . Subsequently, the mixture was irradiated for 5 min . After 30 min of incubation, the biofilm was stained with SYTO-9 and PI dyes for 15 min . Following two washes with PBS, the sample was allowed to dry naturally away from light and CLSM was used to examine the biofilms.
Additionally, to assess the eradication efficacy against . faecalis biofilms, crystalline violet staining was employed. BHI medium ( ) and E. faecalis suspension ( 100 ) were added into a 96-well plate and incubated for 7 days to form biofilms, with the medium refreshed every 2 days. After aspirating the supernatant, medium ( ) and CGP ( ) were added and coincubated for 5 min , irradiated for 5 min , and further incubated for another 30 min . Subsequent fixation with methanol was followed by staining with crystal violet ( , for 30 min ),
and the residual biofilms were photographed with a stereomicroscope (SMZ 800N, Nikon). After photographing, the residual biofilm was dissolved with acetic acid and the absorbance at 596 nm was measured using a microplate reader. The biofilm survival rate was calculated as follows: biofilm viability (sample group)/ (PBS group) . Control groups for the above experiments included PBS + Laser, CGP, Ce6 + Laser, CPP+Laser, and .

Biofilm eradication efficacy of CGP in root canals

Single-canal premolar teeth extracted clinically for orthodontic reasons were collected, and the crowns were removed to a distance of 12 mm from the apical foramen in cross-section. The samples were then cleaned and shaped using a ProTaper file (Dentsply Sirona) up to a #40 apical size. Following sterilization, the apical foramen of the teeth was sealed using flowable composite resin ( 3 M , USA) within a biosafety cabinet. These prepared teeth were then placed in 10 mL EP tubes containing BHI medium ( 4.95 mL ) and an E. faecalis suspension ( 50 . The EP tubes were incubated in an anaerobic chamber for 14 days, with the medium refreshed every 2 days. Subsequently, the sample was irrigated with 5 mL of CGP and irradiated for 5 min . To collect residual bacteria, three sterile paper points were then inserted into the root canal for 30 s . These paper points were placed in an EP tube containing 1 mL of NS and stored at for further analysis. After washing and fixation, the roots were dehydrated using graded concentrations ( , and ) of ethanol and then split longitudinally along the long axis. Finally, the biofilms located at the apical regions of the roots were visualized via a scanning electron microscope. On the designated day, the frozen EP tubes were rewarmed at . The samples were gradient diluted, and each concentration ( ) was spread onto the solid medium. After anaerobic incubation at for 24 h , the number of colonies was counted. Control groups included NS, CPP + Laser, and .

Biosafety assessment

Erythrocyte aggregation and hemolysis indicate the hemocompatibility of the nanoparticles. Fresh blood from rats was collected and prepared as a suspension of erythrocytes. Briefly, of CGP ( ) was mixed with of the suspension and incubated. Erythrocyte aggregation was assessed through an optical microscope after 30 min (NI-B, Nikon). The hemolysis assay was conducted as follows: of CGP mL ) was mixed with of the suspension and incubated. After 6 h , the mixture was centrifuged and the absorbance of the supernatant at 560 nm was measured.
Hemolysis sample . Control samples for these experiments included PBS, Ce6 ( ), CPP ( ), and ( NaClO coincubated with erythrocytes for 2 min ).
To further assess the biosafety of CGP, a cytotoxicity assay was employed. The hPDLSCs or MC3T3-E1 cells were cultured in DMEM or MEM- supplemented with fetal bovine serum and penicillin-streptomycin at . The hPDLSCs and MC3T3-E1 cells were seeded into 96-well plates (5000 cells/well) and incubated. After 24 h , the media were replaced with fresh media containing CGP ( ) and incubated for another 24 h . The supernatant of each well was aspirated, and fresh media ( ) containing Cell Counting Kit-8 reagent ( ) was added. The absorbances were measured with an ELISA microplate reader at 450 nm after 4 h of incubation. Control groups included PBS, mL ), CPP ( ), and (coincubation for 1 min ).
A calcein/PI cell viability assay was used to further evaluate the cytotoxicity of CGP. Firstly, hPDLSCs were seeded into a 96-well plate (3000 cells/well) and incubated. After 24 h , the mediums were replaced with fresh mediums containing CGP ( ) and incubated for an additional 24 h . The supernatant was replaced by calcein/PI solution ( ) and incubated in the dark. After 30 min , cell morphology and fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope (Axio Observer 3, ZEISS). Control groups included PBS, Ce6 and (treated for 1 min ).

Osteogenic differentiation in vitro

The osteogenic differentiation capacity of CGP was evaluated using ALP staining and the Alizarin Red S staining method. Initially, MC3T3-E1 cells were seeded into 24 -well plates at a density of 25,000 cells/well. After 24 h , the medium was replaced with MEM- medium containing -glycerol ( 10 mM ), ascorbic acid ( 0.05 mM ), fetal bovine serum, , and CGP . The medium was refreshed every 2 days; notably, and CGP were added only on day , and 18 . After 7 days, the cells were fixed with paraformaldehyde, washed with PBS, and then stained with ALP staining solution for 24 h . Finally, the cells were observed by stereomicroscope and optical microscope. The extent of staining was quantified with ImageJ software. After 21 days of treatment, the cells were fixed and stained with alizarin red working solution for 24 h . MC3T3-E1 cells were subsequently observed in stereomicroscope and optical microscope. Finally, alizarin red was dissolved by using cetylpyridinium chloride, and the absorbance at
596 nm was measured with a microplate reader. Control groups included PBS, , and .
The expression levels of OCN and RUNX2 in MC3T3E1 cells were examined using ELISA. Mineralization induction treatments were conducted as described above. For OCN measurement, cell supernatants from each group were collected on day 7 ; and the concentration of OCN was detected by ELISA. For RUNX2 measurement, MC3T3-E1 cells from each group were lysed on day 21, and the samples were centrifuged to collect the supernatants. The total protein concentration of the supernatant was determined with a BCA protein concentration assay kit. Finally, the concentration of RUNX2 was measured using ELISA. Control groups included PBS, , and CPP .

In vivo treatment of apical periodontitis

Thirty female Sprague-Dawley rats ( 6 weeks old) were purchased from Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (China). All animals were individually housed within an isolated and sterile confinement under standard conditions. A regular diurnal light cycle of 12 h of light and 12 h of darkness was maintained. After one week of acclimatization period, the rats were randomly assigned to five groups: healthy, PBS, Laser, and CGP+laser. Randomization was performed using a com-puter-based random order generator. In the experimental protocol for each animal, four researchers were involved in the following capacities: the initial two researchers executed the treatment according to the randomization schema. Exclusively these two researchers had knowledge of the assignment to respective treatment groups. The anesthesia procedure was solely conducted by the third researcher. Ultimately, assessments of bacterial viability and the total volume of resorption cavities were undertaken by the fourth researcher.
The healthy group received no treatment. The remaining groups underwent the following experimental procedures: First, the rats were anesthetized using isoflurane (RWD Life Science, China). Subsequently, the left maxillary first molar of each rat was mechanically ground using a high-speed handpiece without water to access the pulpal cavity. The mesial canals were then shaped using 10-20# K-files (Dentsply Sirona, USA). Following this, the cavities were filled with small cotton balls containing E. faecalis suspension and temporarily sealed with glass ionomer cement (GC, Japan).
After 2 weeks, the cements were removed, followed by the irrigation of the root canals using of PBS, , or CGP , correspondingly. The treatment groups receiving CPP and CGP were subjected to irradiation employing a 660 nm laser with an output power of for a duration
of 5 min . Thereafter, sterile paper points were inserted into the canals to collect residual bacteria, which were then placed into EP tubes containing 1 mL of NS and stored at . Subsequently, the cavities were sealed with flow composite resins. After 3 weeks, the rats were euthanized with an overdose of isoflurane. The left maxillary first molar along with some jawbone specimens was collected. The pulp cavities of the molars were opened and the paper points were inserted into the canals to collect residual bacteria, which were then placed into EP tubes containing NS and stored at . Then, the collected residual bacterial samples were rewarmed and spread onto solid mediums for incubation at the appropriate times. The number of colonies and bacterial survival were calculated. The teeth were fixed using paraformaldehyde. Subsequently, the samples were fixed on the scanning stage of a micro-computed tomography (Skyscan1276, Bruker, Germany) and scanned over 180 degrees at 100 kV and with a resolution of and a rotation step of 0.2 degrees. Additionally, CTvox and CTan software (by Skyscan) were utilized for 3D reconstruction and analysis of the samples. The samples were then decalcified in a ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution for 6 weeks. Finally, the samples were fixed, embedded, sectioned, TRAP stained, HE stained, and visualized with an optical microscope.

Statistical analysis

The results are expressed as the mean SEM. The Sha-piro-Wilk test and Brown-Forsythe test were employed to assess the normality of the data and homogeneity of variance. In instances where the criteria for normal distribution and homogeneity of variance were satisfied, one-way analysis of variance with Tukey’s post hoc analysis was conducted for comparisons among multiple groups. Welch analysis was applied when the data exhibited both normal distribution and uneven variance, and the Tamhane T2 test was utilized for multiple post hoc comparisons. The data were analyzed using Prism 9.0 software (GraphPad, La Jolla, CA). Values of were deemed significant ( . ** , *** , **** , ns: no significance).

Results and discussion

Synthesis and characterization of CGP

To fabricate CGP, the initial step involved the guanidinylation of -PEG-PCL using 1-Amidinopyrazole hydrochloride to form G-PEG-PCL [35]. This modified polymer serves as an effective carrier for the photosensitizer Ce6, forming CGP. Notably, G-PEG-PCL enhances the stability of Ce 6 in physiological environments, boosts its association with bacteria, aids in biofilm
penetration, and additionally functions as a nitric oxide donor. The successful guanidinylation was confirmed by the emergence of of nuclear magnetic resonance peak at . Other characteristic peaks at and 2.27 ppm
( ) were identified, corresponding to the PEG and PCL components of the compound, as depicted in Additional file 1: Fig. S1.
Figure 1a illustrates the preparation of CGP nanoparticles. The encapsulation efficiency of Ce6 in CGP was
Fig. 1 Fabrication and characterization of CGP nanoparticles. a Schematic illustration for the preparation of CGP nanoparticles. b The particle size distribution and transmission electron microscope images of CPP. d The particle size distribution and e transmission electron microscope images of CGP. Solubility of Ce6 in different groups. Zeta potential of each group. Stability of CGP during 14 d. i Free Ce6, CPP, and CGP internalized by or bound tightly to . faecalis and the quantitative fluorescence intensity of Ce6 in E. faecalis. Confocal laser scanning microscope images of . faecalis biofilms treated by various groups. Data are presented as mean SEM, . Comparison between CGP versus other groups
found to be , with a loading capacity of (Additional file 1: Table S1). As a control, CPP was simultaneously prepared using -PEG-PCL loaded with Ce6. The particle sizes and transmission electron microscope images of CPP and CGP exhibited uniform spherical shapes, with sizes of and (Fig. 1b-e). In aqueous solution, CPP and CGP displayed a distinct green color, contrast to free Ce 6 , which exhibited poor water solubility, resulting in aggregation at the bottom of the Eppendorf tube (Fig. 1f). These results confirm the successful encapsulation of lipophilic Ce6 by -PEG-PCL and G-PEG-PCL, enabling homogeneous dispersion in aqueous solution.
The -potential of PP was 7.04 mV , while that of GP was 8.72 mV (Fig. 1g). The increased -potential in GP relative to PP may be due to the elevated pKa value of the guanidino group, as opposed to the amino group [35, 36]. Furthermore, CGP demonstrated good stability over 14 days at room temperature, as evidenced by the consistent aqueous solution color (Additional file 1: Fig. S2), particle size, and dispersibility index (Fig. 1h). Additionally, the ultraviolet absorption and fluorescence emission spectra of CGP were found to be in close alignment with those of free Ce6 (Additional file 1: Figs. S3 and S4), suggesting that the physical encapsulation of Ce 6 did not alter its fundamental absorption and emission characteristics.

Bacterial association and biofilm permeation of CGP

Flow cytometry analysis was utilized to investigate the impact of guanidino groups on the association of CGP with bacteria. Employing Ce6 as a fluorescent indicator, it was observed that CGP exhibited a notably higher degree of internalization or adhesion to . faecalis bacteria, in comparison to CPP (Fig. 1i). The quantitative fluorescence data further substantiated this observation, revealing that E. faecaliss treated with CGP displayed fluorescence intensities approximately 1.61 -fold higher than those treated with CPP (Fig. 1j). This finding indicates that guanidino groups in CGP markedly augments its bacterial interaction capabilities [37]. Such an enhancement in bacterial association is pivotal, as it substantially bolsters the bactericidal efficacy of CGP, making it a more potent antimicrobial agent.
The efficacy of antimicrobial agents is significantly influenced by their ability to penetrate biofilms, which are known to hinder the therapeutic effectiveness of such agents [38]. The biofilm permeability of CGP was assessed using a CLSM, employing SYTO-9 as an indicator for biofilm staining. After 5 min of co-incubation with E. faecalis biofilm, CLSM analysis showed a faint red fluorescence emanating from Ce 6 within the biofilm treated with free Ce 6 , suggesting limited penetration.
This finding underscores the challenge posed by biofilms in obstructing the entry of antibacterial substances. In contrast, a modestly stronger fluorescence signal was observed in the CPP-treated biofilm, implying a slight improvement in biofilm permeability. Remarkably, the CGP-treated biofilm exhibited a significantly intensified fluorescence signal (Fig. 1k). These results suggest that while enhancing Ce6’s solubility and stability, as well as incorporating the amino group in CPP, may slightly improve biofilm permeability, the introduction of guanidinylation markedly enhances CGP’s capacity to penetrate biofilms. This enhanced permeability is a key factor in boosting the antimicrobial efficacy of CGP against bio-film-protected bacteria.

ROS and NO generation driven by aPDT

After confirming increased bacterial association and improved biofilm penetration by guanidinylated CGP, we employed the Griess assay to evaluate its NO production capabilities in response to aPDT. As shown in Fig. 2a, PBS + Laser, CGP, Ce6 + Laser, and CPP + Laser displayed negligible NO production. In contrast, CGP+Laser exhibited a rapid production of within 10 min . These findings suggest that the capability of CGP nanoparticles to produce NO is likely attributed to the presence of guanidino groups and their activation by aPDT. To further validate the hypothesis that CGP consumes and subsequently produces NO during the aPDT process, we employed an assay kit to detect the generation of . The assay operates through the oxidation of divalent iron ions by to produce trivalent iron ions, which combine with xylenol orange to form a purple product [39]. As shown in Fig. 2b, CPP + Laser, and CGP + Laser generated 25.01 and , following irradiation for 10 min . Notably, the generation of CGP + Laser (synchronized with NO generation) was obviously lower than that of CPP + Laser. implying the consumption of in the course of NO generation. This finding suggests that is being consumed during the aPDT process in CGP + Laser group, to facilitate the generation of NO.
It has been reported that also oxidizes the guanidino groups to produce NO [17]. Given that is a pivotal factor in the bactericidal effectiveness of aPDT [40], we anticipated that its production would not be compromised. To investigate this, we employed SOSG to monitor the changes in levels within CGP under aPDT. SOSG possesses faint blue fluorescence but reacts with to produce SOSG endoperoxide, which emits strong green fluorescence [41]. As shown in Fig. 2c, the measured fluorescence intensities of SOSG endoperoxide for both CPP + Laser and CGP + Laser exhibited a similar increase, indicating that CGP can rapidly generate NO by
Fig. 2 NO and ROS generation profiles of CGP. a , and generation profiles of each group. d, eNO, , and generation and mean fluorescence intensity in E. faecalis bacteria after receiving various treatments. Data are presented as mean , , ns: no significance. Comparison between CGP + Laser versus other groups
consuming -produced during aPDT, without hindering the production of . This is crucial for the synergistic antimicrobial and biofilm eradication efficacy of aPDT and NO.
To corroborate the aforementioned results, we employed CLSM to observe the production of NO, ROS, and by CGP in bacteria. The production of NO by CGP in bacteria was detected using DAF-FM DA, a compound that traverses the cell membrane and subsequently undergoes catalysis by intracellular esterase to form DAF-FM, which is incapable of crossing the cell membrane [42]. DAF-FM exhibits weak fluorescence, but it exhibits strong fluorescence upon reacting with NO. As shown in Fig. 2d and e, a notable green fluorescence signal indicative of NO was observed in E. faecalis bacteria treated with CGP + Laser, while only negligible fluorescence was noted in bacteria treated with Laser and CPP+Laser. To detect ROS produced by CGP in bacteria, we used DCFH-DA, a non-fluorescent molecule that and can freely traverse the cell membrane and, once inside, is converted into DCFH by intracellular esterase. ROS within the cell can oxidize nonfluorescent DCFH, transforming it into the fluorescent compound DCF [43].
As shown in Fig. 2f and g, the green fluorescence indicative of ROS in E. faecalis treated with CPP + Laser was slightly higher than in CGP + Laser treated bacteria, in line with the results obtained in the solution phase (Additional file 1: Fig. S5). produced by CGP in bacteria was detected through the utilization of Amplex Red and horseradish peroxidase [44]. Under the action of horseradish peroxidase, oxidizes Amplex red, resulting in the production of the red fluorescent [45]. Figure 2h and i demonstrate a diminished red fluorescence of in CGP+Laser-treated bacteria in comparison to CPP+Laser. These results further support the possibility that the production of NO actually consumes a part of the ROS and generated during aPDT.

Antimicrobial effect of CGP in vitro

After confirming that the generation of NO driven by aPDT did not impede the generation of , the synergistic antimicrobial effects of aPDT and NO were assessed through bacterial colony counting and bacterial live/dead staining. Figure 3a and b displays that the bacterial viability in CPP and CGP without irradiation was higher than 8 log units, which is consistent with that of PBS + Laser.
Fig. 3 In vitro antibacterial activity of CGP. a Representative images of plate samples and bacterial viability, c Live/Dead staining, and scanning electron microscope images of E. faecalis after receiving various treatments. e The amount of total protein released from E. faecalis and fintracellular adenosine -triphosphate production levels in E. faecalis after receiving various treatments. The red arrows point to the holes in cell membranes. The red arrows point to the damaged bacterial membranes. Data are presented as mean SEM. In (b) , while in ( ) . ** , , ns: no significance. In (b) comparison between PBS versus other groups, while in ( ) between the CGP + Laser versus other groups
However, a notable reduction in bacterial viability was observed among the remaining groups exposed to laser irradiation: Ce6 + Laser, CPP + Laser, and CGP + Laser, with viability counts of , and 0.77 log units, respectively. This significant decrease in bacterial viability, especially in the CGP + Laser group, highlights the
potent antimicrobial effect facilitated by the combination of aPDT and NO. To further elucidate the effects on bacterial cell integrity, we utilized the live/dead BacLight viability kit. Within this kit, the green fluorescent nucleic acid dye SYTO-9 penetrates and labels all bacteria, while PI can only penetrate compromised membranes
and the insertion of PI causes a reduction of SYTO 9 fluorescence. As shown in Fig. 3c, PI fluorescence signals were hardly observed in the E. faecalis treated with PBS + Laser, CPP, and CGP, suggesting that the bacteria have intact membranes. CPP + Laser and Ce6 + Lasertreated E. faecalis exhibited relatively strong green and red fluorescence, indicating a moderate disruption of the bacterial membranes. In contrast, the CGP + Lasertreated bacteria exhibited strong red fluorescence and weak green fluorescence, indicating severe damage to the bacterial membranes. These results confirm that the antimicrobial effect of CGP + Laser is superior to that of CPP + Laser, thus indicating the synergistic antimicrobial effect of aPDT and NO. Furthermore, the study explored the antimicrobial mechanism of the nanoparticles through protein leakage, changes in alterations in ATP levels, and alterations in bacterial morphology.
Figure 3d shows that bacteria treated with PBS + Laser, CPP, and CGP were predominantly smooth and intact, indicating minimal damage. However, the bacteria treated with Laser and Laser displayed slightly crumpled membranes with small holes, suggesting moderate damage. Notably, bacteria in the CGP+Laser group displayed extensive and deep holes in their cell membranes, indicative of significant damage and disruption. The extent of bacterial membrane damage correlated with the degree of protein leakage observed. As quantified in Fig. 3e. This trend clearly demonstrates the enhanced membrane-disrupting capability of the CGP+Laser treatment. In addition, ATP levels, crucial for cell function, typically diminish in cells undergoing apoptotic, necrotic, or in a toxic state [46]. As shown in Fig. 3f, ATP levels were reduced by , , and in the Ce6 + Laser, CPP + Laser, and CGP + Laser groups, respectively, compared to the PBS group. This substantial reduction in ATP levels, particularly in the CGP + Laser group, underscores the profound impact of the combined aPDT and NO treatment on bacterial vitality. These fundings suggest a synergistic antimicrobial mechanism of aPDT and NO that may be attuned to the following factors: (1) the ability of guanidino groups to permeate biofilms and associate with bacteria, enhancing the overall antimicrobial action; (2) the combined disruptive effect of aPDT-generated ROS and NO on bacterial membranes, leading to significant protein leakage; (3) the synergistic inhibition of mitochondrial ATP production by both ROS and NO, impeding essential bacterial functions; and (4) the triggering of lipid peroxidation, DNA damage, and protein dysfunction by the byproducts of ROS and NO, ultimately resulting in bacterial death. Moreover, unirradiated CPP and CGP were not included in the other experiments as controls due to their negligible antimicrobial activity.
After establishing the synergistic antimicrobial effect of aPDT and NO, we conducted further analysis on the correlation between various concentrations of nanoparticles and their corresponding antimicrobial effectiveness. And compared the antimicrobial efficacy of these nanoparticles with that of NaClO , a commonly used clinical root canal irrigant. As shown in Additional file 1: Figs. S6 and S7, the bactericidal effects of free Laser, CPP+Laser, and CGP+Laser against E. faecalis bacteria progressively intensified with increasing nanoparticle concentrations. Additionally, across all tested concentrations, CGP+Laser consistently demonstrated superior antibacterial activity compared to and CPP+Laser. This observation reaffirms the enhanced antimicrobial impact attributed to the synergistic action of aPDT and NO. For instance, bacterial viabilities following treatments with PBS, Ce6 Laser, CPP Laser, and CGP Laser were quantified as , and 4.30 log units, respectively. Furthermore, NaClO exhibited strong antibacterial properties, with bacterial viability decreasing to 3.28 log units at a concentration, and a complete absence of bacterial colonies at a concentration of . Additionally, it is observed that of CGP is more effective than , yet not as effective as . Remarkably, at a concentration of , CGP achieved complete eradication of bacterial colonies. These findings indicate that CGP can serve as a formidable alternative to traditional antimicrobial agents in endodontic therapy, offering a novel approach in the fight against bacterial infections in dental treatments.

Biofilm eradication of CGP in vitro

Considering the remarkable abilities of CGP in terms of biofilm penetration and synergistic antimicrobial activity, we postulated that it could efficiently eradicate biofilms. Our initial investigation into this matter involved assessing the biofilm eradication property of CGP on . faecalis biofilms, utilizing the live/dead bacterial staining method. As shown in Fig. 4a, the presence of green fluorescence from SYTO-9 in the E. faecalis biofilm treated with PBS + Laser was evident, whereas the red fluorescence from PI was scarcely observed. Comparatively strong signals of both green and red fluorescence were visualized in the biofilms treated with Laser and CPP + Laser, indicating that only a portion of the biofilms was disrupted. In contrast, intense PI signals were observed in the biofilms treated with CGP+Laser and , implying that the biofilms were nearly eradicated. To corroborate these findings, we also utilized crystal violet staining to evaluate the biofilm eradication efficacy of CGP. As shown in Fig. 4b and c, the biofilms remained relatively intact following treatment
Fig. 4 In vitro biofilm eradication efficacy of CGP. a Live/Dead staining, b crystalline violet staining, and c residual rates of E. faecalis biofilms after receiving various treatments. d Sample plate representative images, e bacterial viability, and f scanning electron microscope images of . faecalis biofilms in human extracted teeth after receiving various irrigations. Data are presented as mean , ns : no significance. Comparison between versus other groups
with Laser and Laser. In stark contrast, CGP+Laser and exhibited efficient eradication efficacy, leaving only and of biofilm residuals. On the one hand, these results further indicate that CGP exhibits superior synergistic biofilm eradication properties compared to aPDT alone. On the other hand, although NaClO , due to its corrosive nature, slightly surpasses CGP in biofilm eradication efficacy, its potential
for severe side effects and well-known cytotoxicity must be acknowledged. Consequently, we believe that CGP still holds potential for application in root canal irrigation. In addition, it was evident that the antimicrobial and biofilm eradication efficacies of free Laser were relatively inferior compared to those of CPP + Laser and CGP+Laser. Therefore, in subsequent experiments, free Ce6+Laser was excluded from being used as a control
group, allowing for a more focused analysis on the potent biofilm-targeting properties of CGP.
Encouraged by the favorable outcomes of CGP + Laser in live/dead bacterial staining and crystal violet staining, we proceeded to cultivate E. faecalis biofilms in the root canals of extracted human teeth to assess the biofilm eradication efficacy. As shown in Fig. 4d and e, the bacterial viability post CPP + Laser treatment was observed at units, whereas CGP + Laser treatment reduced it to units. Notably, the efficacy of CGP+Laser was nearly akin to that of , which showcased a bacterial viability of just 0.77 log units. To gain further insights, the treated tooth was longitudinally dissected along its long axis, focusing on the apical portion of the root canals for detailed observation under a scanning electron microscope. As shown in Fig. 4f, abundant E. faecalis biofilm densely colonizing the root canal wall and obstructing the dentinal tubules in the control group treated with NS. In contrast, only a few bacterial residues were evident in CPP + Laser treated canals, while the canals treated with CGP + Laser and NaClO appeared virtually devoid of any bacterial presence. These results collectively suggest that CGP+Laser treatment is highly effective in eradicating E. faecalis biofilm within the root canals, demonstrating an efficacy nearly comparable to the commonly used endodontic irrigant, . Given the temporal and spatial controllability, along with its similar antimicrobial properties and biofilm eradication efficacy to NaClO , CGP emerges as a potential candidate for clinical applications in endodontics.

Hemocompatibility and biocompatibility assays

Biosafety is a paramount consideration for in vivo applications. In this context, we used erythrocyte aggregation assay and hemolysis assay to demonstrate the blood compatibility of the nanoparticles. As shown in Fig. 5a and b, when tested with free Ce6 ( ), CPP ( ), and CGP ( ), there were no noticeable enhancements in erythrocyte aggregation, nor were there any disruptions in erythrocyte morphology. Moreover, in the absence of laser irradiation, free Ce6, CPP, and CGP exhibited < 0.25% erythrocyte hemolysis (Fig. 5c). This result starkly contrasts with the outcome of erythrocytes treated with , which lost their integrity, leaving only cellular fragments observable under the microscope. Due to the strong corrosive and oxidizing properties of NaClO [47], the blood was decolored after co-incubation with for 1 min .
Besides, the cell viability of CGP was consistently > after co-incubation with MC3T3-E1 cells or hPDLSCs for 24 h (Fig. 5d and e). Notably, the morphology of hPDLSCs remained unaffected after this period, with no
significant red fluorescence from PI staining observed (Fig. 5f). As predicted, NaClO exhibited pronounced cytotoxicity, with less than cell survival after 1 min of co-incubation with hPDLSCs and MC3T3-E1 cells. The above experiments show that CGP has good hemocompatibility and biocompatibility, with great potential for clinical applications.

Osteogenic differentiation in vitro

In the treatment of AP, in addition to controlling the infection, we hope that the CGP will also promote periapical bone repair and regeneration. Bone regeneration is a complex process associated with inflammation, angiogenesis, and osteogenesis. NO may play an important role in ALP activity and mineralization in osteoblastic lineage [33]. Our cellular experiments employed to simulate inflammatory environments, and drive CGP to generate NO. After 7 days of treating MC3T3-E1 cells with and under mineralized conditions (add -glycerol and ascorbic acid in the medium), the degree of ALP staining was slightly lower than that of PBS, while was darker than PBS (Fig. 6a). This was corroborated by quantitative ALP data, which revealed that the ALP activity in the CGP group was higher compared to alone (Fig. 6b). During osteoblast differentiation, calcium compounds are deposited on the cell surface to form calcium nodules. These calcium nodules can be stained orange by using alizarin red staining [48]. After 21 days of treatment, MC3T3E1 cells treated with and showed fewer mineralized nodules than those treated with PBS, whereas they were more abundant in CGP (Fig. 6 c and d ). These findings suggest that while and substantially impeded the mineralization process of MC3T3-E1 cells, alleviated the adverse impacts of and reinstated the count of mineralized nodules to levels comparable to those of the PBS group.
ELISA was utilized to analyze the secretion of oste-ogenesis-related markers, encompassing OCN and RUNX2, in MC3T3-E1 cells with various treatment. OCN is known to play a crucial role in bone metabolism, particularly in calcium homeostasis and bone mineralization processes [49]. RUNX2, on the other hand, functions in the growth and differentiation of osteoblasts by stimulating the expression of subsequent biomarkers [50, 51]. As shown in Fig. 6e, the concentration of OCN in the supernatants of MC3T3-E1 cells varied across treatment groups. The cells treated with PBS showed an OCN level of . In the presence of and , this level decreased slightly to 91.9 and , suggesting some disruption of osteogenic activity under inflammatory conditions. Remarkably, cells treated with
Fig. 5 Blood compatibility and biocompatibility of CGP. a Microscopic images of erythrocyte aggregation in different treatment groups. b, c Hemolytic effects in different treatment groups. d Cell Counting Kit-8 assay of MC3T3-E1 and e hPDLSCs cells after treated with various groups. Live/dead cell staining in different groups of hPDLSCs. Data are presented as mean SEM. In (c) , while in ( ) , *** , , ns: no significance. In (c) comparison between PBS versus other groups, while in (d, e) between the control group versus other groups
CGP demonstrated a significant increase in OCN concentration, reaching . This suggests that the presence of CGP, not only mitigates the inhibitory effect of but also enhances osteogenic activity. Similarly, the RUNX2 levels in MC3T3-E1 cell lysates exhibited a corresponding pattern. Cells treated with PBS had a RUNX2 level of . In the presence of and CPP this level decreased slightly to 143.0 and . However, in the CGP group, there was a notable increase in RUNX2 concentration, reaching (Fig. 6f). This increase suggests that CGP enhances osteoblast differentiation and bone formation, even under conditions of inflammatory.
These results indicate a notable suppression of osteogenic differentiation in the presence of , a ROS that
is commonly present in inflammatory conditions [52]. However, the introduction of CGP appears to counteract this inhibitory effect. The mechanism underlying this phenomenon involves the consumption of by CGP, leading to the generation of NO. This release of NO from CGP is instrumental in stimulating osteogenic differentiation in MC3T3 cells, as evidenced by increased ALP activity at early stages of differentiation, initiation of calcium deposition at later stages, and the up-regulation of key osteogenic markers such as OCN and RUNX2. It is noteworthy that this assay does not accurately mirror the actual in vivo scenario, but is a ROS that persistently exists in inflammatory sites in the long run, and ROS produced by periapical tissues obstruct osteoblast differentiation [53]. In therapeutic applications, residual
Fig. 6 Mechanisms of CGP promoting repair of periapical bone defects. Images and quantitative data of ALP staining and alizarin red staining in MC3T3-E1 cells after receiving various treatments in mineralizing conditions. e The expression levels of OCN and RUNX2 in MC3T3-E1 cells after receiving various treatments in mineralizing conditions. Data are presented as mean SEM, , *** , **** , ns: no significance. Comparison between CGP versus other groups
, either from aPDT or periapical inflammation, could potentially oxidize CGP, thereby producing trace amounts of NO. This process is expected to promote the repair and regeneration of periapical bone defects, highlighting the potential of CGP as a therapeutic agent in conditions where inflammation and oxidative stress impede normal bone healing and regeneration processes.

In vivo treatment of apical periodontitis

CGP exhibited favorable biocompatibility, antimicrobial ability, eradication of biofilm, and promotion of mineralization properties in vitro experiments. This provides a foundation for carrying out in vivo therapeutic evaluation using a rat apical periapical model. Figure 7a presents the detailed experimental procedure for establishing an AP model for treatment and effect assessment. Briefly, the pulp cavity of the left maxillary first molar of the rat was opened, and a small cotton ball containing E. faecalis suspension was placed to infect the root canal, after which the crown was sealed with glass ions. Following 2 weeks
of infection, the rats were treated with PBS, , CPP+Laser, and CGP+Laser, respectively. After 3 weeks of treatment, the left maxillary first molar and the surrounding maxillary area were collected from the rats, and the extent of periapical bone defects was measured using micro-computed tomography. The results revealed notable reductions in bacterial viability across all treatment groups on the day of irrigation (Fig. 7b and c) and at day 21, indicating significant antimicrobial effects (Fig. 7d and e). Consistent with the results of root canal irrigation in extracted teeth, the antimicrobial effect was higher than in all groups. Figure 7 f shows the coronal and sagittal planes of the three-dimensional reconstructed images of the representative first molar for each group. The figure clearly illustrates large bone resorption cavity in the periapical tissues of the PBS group, indicating that E. faecalis infection of the root canal led to substantial periapical bone defect. In contrast, this defect obviously decreased in the Laser, and CGP+Laser groups, indicating gradual healing of the
Fig. 7 In vivo therapeutic efficacy of CGP apical periodontitis model rats. a Experimental design of apical periodontitis model rats. b, c Sample plate representative images and bacterial viability of . faecalis in rat teeth after receiving various irrigations on day 0 and day 21 . Representative images and the total resorption volume of the left maxillary first molar in each group. Representative HE staining and TRAP staining. The green arrows point to the neutrophils and the red arrows point to active osteoclasts. Data are presented as mean . Comparison between PBS versus other groups
bone defect after successful infection control. Particularly noteworthy is the significantly smaller resorption cavity observed in the CGP+Laser group compared to the other groups, with its periapical condition closely resembling that of the healthy group, suggesting enhanced healing of periapical bone defects. And the
quantitative data presented in Fig. 7 g , the volume of the resorption cavity was , and for PBS, , CPP + Laser, and CGP + Laser, respectively. CPP+Laser exhibited a reduction in bone defects in periapical inflammation treatment compared to the NaClO group (PBS group as ), likely due to
the extrusion effect of NaClO , causing periapical tissue toxicity [54]. The conventional syringe irrigation method was employed in this study, and apical extrusion was inevitable except for negative pressure irrigation systems [55]. Remarkably, the resorption cavity of CGP+Laser was lower than that of CPP+Laser. CGP+Laser showed excellent therapeutic effects with antimicrobial effects, and the production of NO during therapy aided in the healing of periapical bone defects. The synergistic application of aPDT with NO has been proven to treat AP both effectively and safely.
H&E and TRAP staining were performed to facilitate additional evaluation of the synergistic impact of aPDT and NO. As shown in Fig. 7h, the periapical area of the PBS group exhibited abundant neutrophil infiltration, whereas the and CPP+Laser groups displayed minor inflammatory cell infiltration, indicates that inflammation in the periapical tissues gradually diminished after successful infection control. Conversely, the CGP+Laser group showed minimal neutrophil infiltration, suggesting a milder inflammatory response in this group. Additionally, the periapical tissues in this group exhibited morphological integrity without discernible defects, indicating the most favorable treatment outcome. As shown in Fig. 7i, TRAP staining showed numerous active osteoclasts in the periapical tissues of the PBS, while the number of osteoclasts was reduced in NaClO and CPP+Laser group. Notably, osteoclasts were virtually absent in CGP + Laser, while histological features and the periodontal ligament space were similar to those of healthy group. These findings may be attributed to the potent antimicrobial effect and the capacity to stimulate bone regeneration associated with CGP+Laser, demonstrating optimal therapeutic efficacy in endodontic treatment. In addition, no significant toxicity of CGP was observed during treatment, and no pathological abnormalities were observed in the major organs of the rats (Additional file 1: Fig. S8), which indicated that the safety of our multifunctional antibacterial nanoplatform [56, 57]. These findings substantiate the potential future application of CGP + Laser in endodontics, while also presenting a novel candidate treatment strategy for root canal irrigation.
Although this study has yielded some promising results, it is important to acknowledge certain limitations. Subsequent research should focus on conducting comprehensive analyses of the exact mechanisms and efficacy of CGP within multispecies biofilms and intricate root canal structures, such as C-shaped, highly curved, and accessory canals [58]. While specific concentrations of CGP + Laser demonstrate comparable antimicrobial properties, NaClO still maintains a unique position in root canal irrigation owing to its potent antimicrobial
and tissue-dissolving characteristics. And we believe that CGP + Laser can serve as a compelling alternative in certain cases. Furthermore, it may hold promise in periodontal therapy, managing other biofilm infections, and various other applications.

Conclusions

This study demonstrated a versatile aPDT-driven controlled NO generation system, denoted as CGP, which was employed for synergistic aPDT/NO treatment of AP. During the root-canal irrigation process, the guanidino groups on the surface of CGP successfully penetrated the biofilms. These Guanidino groups can be oxidized by generated during aPDT without impacting generation. The combination of NO and aPDT exhibited a noteworthy synergistic antimicrobial effect and a remarkable ability to eradicate biofilms, both in vitro and in vivo. Following the successful elimination of root canal biofilms, the produced NO promoted the repair of bone defects in periapical tissues, thereby significantly facilitating the healing of AP. Consequently, an effective root canal irrigation system was developed.
Abbreviations
AP Apical periodontitis
NaClO Sodium hypochlorite
aPDT Antimicrobial photodynamic therapy
ROS Reactive oxygen species
Hydrogen peroxide
Singlet oxygen
NO Nitric oxide
G-PEG-PCL Guanidinylated poly (ethylene glycol)-poly(ɛ-caprolactone)
-PEG-PCL Amino-terminated poly (ethylene glycol)-poly(દ-caprolactone)
Ce6 Chlorin e6
CGP G-PEG-PCL loaded with Ce6
CPP -PEG-PCL loaded with Ce6
PP Blank NH2-PEG-PCL nanoparticles
GP Blank G-PEG-PCL nanoparticles
E. faecalis Enterococcus faecalis
PBS Phosphate-buffered saline
NS Normal saline
TRAP Tartrate-resistant acid phosphatase
HE Hematoxylin-eosin
SOSG Singlet oxygen sensor green
DCFH-DA Dichlorodihydrofluorescein diacetate
DAF-FM DA 3-Amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate
ATP Alterations in adenosine 5′-triphosphate
hPDLSCs Human periodontal ligament stem cells
ALP Alkaline phosphatase
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
OCN Osteocalcin
RUNX2 Runt-related transcription factor 2
CLSM Confocal laser scanning microscope

Supplementary Information

The online version contains supplementary material available at https://doi. org/10.1186/s12951-024-02483-8.
Additional file 1: Table S1. Ce6 loading capacity and encapsulation efficiency of the CGP. Fig. S1. nuclear magnetic resonance spectra
of G-PEG-PCL. Fig. S2. The stability of CGP during 14 days. Fig. . Ultraviolet-visible absorption spectra of free Ce6, CPP, and CGP. Fig. S4. Fluorescence emission spectra of free Ce6, CP, and CGP. Fig. S5. Total ROS generation profiles of different groups over various durations. Data are presented as mean SEM, . Comparison between CGP+Laser versus other groups. Fig. S6. Representative images of plate samples of Enterococcus faecalis after various treatments. Fig. S7. bacterial viability of Enterococcus faecalis after various treatments. Fig. S8. HE staining of heart, lung, liver, spleen, and kidney in healthy group and CGP+Laser treated AP group.

Acknowledgements

None.

Author contributions

Y. Zeng and X. Hu: Contributed to conception, design, data acquisition, analysis, and interpretation, drafted and critically revised the manuscript. Z Cai and D. Qiu: Contributed to data acquisition and analysis, drafted the manuscript, and critically revised the manuscript. Y. Ran, Y. Ding. J. Shi: Contributed to data acquisition, and drafted the manuscript. X. Cai, Y. Pan: Contributed to conception, design, and critically revised the manuscript. All authors reviewed and approved the final manuscript.

Funding

This work was supported by Wenzhou Major Science and Technology Special Project (ZY2022019), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LGF21H140005), and Medicine and Health Science and Technology Plan Projects in Zhejiang province (2022RC212).

Data availability

The datasets used and analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Declarations

The dental and animal experiments were approved by the Ethics Committee of the School of Stomatology, Wenzhou Medical University (No. WYKQ2023005), and the Animal Ethics Committee of Wenzhou Medical University (No. wydw2023-0290).
Not applicable.

Competing interests

The authors declare no potential conflicts of interest with respect to the authorship and/or publication of this article.
Received: 28 January 2024 Accepted: 16 April 2024
Published online: 30 April 2024

References

  1. Kakehashi S, Stanley HR, Fitzgerald RJ. The effects of surgical exposures of dental pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1965;20:340-9.
  2. Shah AC, Leong KK, Lee MK, Allareddy V. Outcomes of hospitalizations attributed to periapical abscess from 2000 to 2008: a longitudinal trend analysis. J Endod. 2013;39:1104-10.
  3. Tiburcio-Machado CS, Michelon C, Zanatta FB, Gomes MS, Marin JA, Bier CA. The global prevalence of apical periodontitis: a systematic review and meta-analysis. Int Endod J. 2021;54:712-35.
  4. Persoon IF, Ozok AR. Definitions and epidemiology of endodontic infections. Curr Oral Health Rep. 2017;4:278-85.
  5. Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals. J Endod. 2002;28:689-93.
  6. Mah TF, Pitts B, Pellock B, Walker GC, Stewart PS, O’Toole GA. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 2003:426:306-10.
  7. Zehnder M. Root canal irrigants. J Endod. 2006;32:389-98.
  8. AI-Sebaei MO, Halabi OA, El-Hakim IE. Sodium hypochlorite accident resulting in life-threatening airway obstruction during root canal treatment: a case report. Clin Cosmet Investig Dent. 2015;7:41-4.
  9. Ortiz-Alves T, Diaz-Sanchez R, Gutierrez-Perez JL, Gonzalez-Martin M, Serrera-Figallo MA, Torres-Lagares D. Bone necrosis as a complication of sodium hypochlorite extrusion. A case report. J Clin Exp Dent. 2022;14:e885-889.
  10. Xu R, Guo D, Zhou X, Sun J, Zhou Y, Fan Y, Zhou X, Wan M, Du W, Zheng L. Disturbed bone remodelling activity varies in different stages of experimental, gradually progressive apical periodontitis in rats. Int J Oral Sci. 2019;11:27.
  11. Xiao F, Cao B, Wang C, Guo X, Li M, Xing D, Hu X. Pathogen-specific polymeric antimicrobials with significant membrane disruption and enhanced photodynamic damage to inhibit highly opportunistic bacteria. ACS Nano. 2019;13:1511-25.
  12. Wang D, Niu L, Qiao ZY, Cheng DB, Wang J, Zhong Y, Bai F, Wang H, Fan H. Synthesis of self-assembled porphyrin nanoparticle photosensitizers. ACS Nano. 2018;12:3796-803.
  13. Zhu J, Tian J, Yang C, Chen J, Wu L, Fan M, Cai X. L-Arg-rich amphiphilic dendritic peptide as a versatile NO donor for NO/photodynamic synergistic treatment of bacterial infections and promoting wound healing. Small. 2021;17: e2101495.
  14. Carrinho PM, Andreani DIK, Morete VA, Iseri S, Navarro RS, Villaverde AB. A study on the macroscopic morphometry of the lesion area on diabetic ulcers in humans treated with photodynamic therapy using two methods of measurement. Photomed Laser Surg. 2018;36:44-50.
  15. de Vasconcelos Catao MH, Nonaka CF, de Albuquerque Jr RL, de BentoOliveira Costa PMR. Effects of red laser, infrared, photodynamic therapy, and green LED on the healing process of third-degree burns: clinical and histological study in rats. Lasers Med Sci. 2015;30:421-8.
  16. Gong J, Park H, Lee J, Seo H, Lee S. Effect of photodynamic therapy on multispecies biofilms, including Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, and Candida albicans. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 2019;37:282-7.
  17. Wan SS, Zeng JY, Cheng H, Zhang XZ. ROS-induced NO generation for gas therapy and sensitizing photodynamic therapy of tumor. Biomaterials. 2018;185:51-62.
  18. Xiu W, Gan S, Wen Q, Qiu Q, Dai S, Dong H, Li Q, Yuwen L, Weng L, Teng Z, et al. Biofilm microenvironment-responsive nanotheranostics for dualmode imaging and hypoxia-relief-enhanced photodynamic therapy of bacterial infections. Research (Wash D C). 2020;2020:9426453.
  19. Cao H, Zhong S, Wang Q, Chen C, Tian J, Zhang W. Enhanced photodynamic therapy based on an amphiphilic branched copolymer with pendant vinyl groups for simultaneous GSH depletion and Ce6 release. J Mater Chem B. 2020;8:478-83.
  20. Sun X, Sun J, Lv J, Dong B, Liu M, Liu J, Sun L, Zhang G, Zhang L, Huang G, et al. Ce6-C6-TPZ co-loaded albumin nanoparticles for synergistic combined PDT-chemotherapy of cancer. J Mater Chem B. 2019;7:5797-807.
  21. Liu HD, Ren MX, Li Y, Zhang RT, Ma NF, Li TL, Jiang WK, Zhou Z, Yao XW, Liu ZY, Yang M. Melatonin alleviates hydrogen peroxide induced oxidative damage in MC3T3-E1 cells and promotes osteogenesis by activating SIRT1. Free Radic Res. 2022;56:63-76.
  22. Sheppard AJ, Barfield AM, Barton S, Dong Y. Understanding reactive oxygen species in bone regeneration: a glance at potential therapeutics and bioengineering applications. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10: 836764.
  23. Zhang J, Guo H, Liu M, Tang K, Li S, Fang Q, Du H, Zhou X, Lin X, Yang Y. Recent design strategies for boosting chemodynamic therapy of bacterial infections. Exploration. 2023;2023:20230087.
  24. Liu R, Peng Y, Lu L, Peng S, Chen T, Zhan M. Near-infrared light-triggered nano-prodrug for cancer gas therapy. J Nanobiotechnol. 2021;19:443.
  25. Yang Z, Chen H. Recent deveolpment of multifunctional responsive gas-releasing nanoplatforms for tumor therapeutic application. Nano Res. 2023;16:3924-38.
  26. Opoku-Damoah hang . Therapeutic gas-releasing nanomedicines with controlled release: advances and perspectives. Exploration (Beijing). 2022;2:20210181.
  27. Backlund CJ, Sergesketter AR, Offenbacher S, Schoenfisch MH. Antibacterial efficacy of exogenous nitric oxide on periodontal pathogens. J Dent Res. 2014;93:1089-94.
  28. Barui AK, Nethi SK, Patra CR. Investigation of the role of nitric oxide driven angiogenesis by zinc oxide nanoflowers. J Mater Chem B. 2017;5:3391-403.
  29. Qian Y, Chug MK, Brisbois EJ. Nitric oxide-releasing silicone oil with tunable payload for antibacterial applications. ACS Appl Bio Mater. 2022;5:3396-404.
  30. Lv X, Jiang J, Ren J, Li H, Yang D, Song X, Hu Y, Wang W, Dong X. Nitric oxide-assisted photodynamic therapy for enhanced penetration and hypoxic bacterial biofilm elimination. Adv Healthc Mater. 2023;12: e2302031.
  31. Li G, Yu S, Xue W, Ma D, Zhang W. Chitosan-graft-PAMAM loading nitric oxide for efficient antibacterial application. Chem Eng J. 2018;347:923-31.
  32. Saura M, Tarin C, Zaragoza C. Recent insights into the implication of nitric oxide in osteoblast differentiation and proliferation during bone development. Sci World J. 2010;10:624-32.
  33. Won JE, Kim WJ, Shim JS, Ryu JJ. Guided bone regeneration with a nitricoxide releasing polymer inducing angiogenesis and osteogenesis in critical-sized bone defects. Macromol Biosci. 2022;22: e2200162.
  34. Yasuhara R, Suzawa T, Miyamoto Y, Wang X, Takami M, Yamada A, Kamijo R. Nitric oxide in pulp cell growth, differentiation, and mineralization. J Dent Res. 2007;86:163-8.
  35. Izawa H, Kinai M, Ifuku S, Morimoto M, Saimoto H. Guanidinylated chitosan inspired by arginine-rich cell-penetrating peptides. Int J Biol Macromol. 2019;125:901-5.
  36. Khan NF, Nakamura H, Izawa H, Ifuku S, Kadowaki D, Otagiri M, Anraku M. Evaluation of the safety and gastrointestinal migration of guanidinylated chitosan after oral administration to rats. J Funct Biomater. 2023;14:340.
  37. Andreev K, Bianchi C, Laursen JS, Citterio L, Hein-Kristensen L, Gram L, Kuzmenko I, Olsen CA, Gidalevitz D. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2014;1838:2492-502.
  38. Hu D, Deng Y, Jia F, Jin Q, Ji J. Surface charge switchable supramolecular nanocarriers for nitric oxide synergistic photodynamic eradication of biofilms. ACS Nano. 2020;14:347-59.
  39. Liu H, Yu Y, Xue T, Gan C, Xie Y, Wang D, Li P, Qian Z, Ye T. A nonenzymatic electrochemical sensor for the detection of hydrogen peroxide in vitro and in vivo fibrosis models. Chin Chem Lett. 2024;35: 108574.
  40. Xiu W, Shan J, Yang K, Xiao H, Yuwen L, Wang L. Recent development of nanomedicine for the treatment of bacterial biofilm infections. VIEW. 2021;2:20200065.
  41. Gollmer A, Arnbjerg J, Blaikie FH, Pedersen BW, Breitenbach T, Daasbjerg K, Glasius M, Ogilby PR. Singlet Oxygen Sensor Green : photochemical behavior in solution and in a mammalian cell. Photochem Photobiol. 2011;87:671-9.
  42. Huysseune A, Larsen UG, Larionova D, Matthiesen CL, Petersen SV, Muller M, Witten PE. Bone formation in zebrafish: the significance of DAF-FM DA staining for nitric oxide detection. Biomolecules. 2023;13:1780.
  43. Eruslanov E, Kusmartsev S. Identification of ROS using oxidized DCFDA and flow-cytometry. Methods Mol Biol. 2010;594:57-72.
  44. Hsu Y-J, Nain A, Lin Y-F, Tseng Y-T, Li Y-J, Sangili A, Srivastava P, Yu H-L, Huang Y-F, Huang C-C. Self-redox reaction driven in situ formation of Cu2O/Ti3C2Tx nanosheets boost the photocatalytic eradication of multi-drug resistant bacteria from infected wound. J Nanobiotechnol. 2022;20:235.
  45. Votyakova TV, Reynolds IJ. Detection of hydrogen peroxide with Amplex Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation. Arch Biochem Biophys. 2004;431:138-44.
  46. Skulachev V. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis. 2006;11:473-85.
  47. Veisi H. Sodium hypochlorite (NaOCl). Synlett. 2007;2007:2607-8.
  48. Puchtler H, Meloan SN. TERRY MS: On the history and mechanism of alizarin and alizarin red S stains for calcium. J Histochem Cytochem. 1969;17:110-24.
  49. Xiao G, Cui Y, Ducy P, Karsenty G, Franceschi RT. Ascorbic acid-dependent activation of the osteocalcin promoter in MC3T3-E1 preosteoblasts:
    requirement for collagen matrix synthesis and the presence of an intact OSE2 sequence. Mol Endocrinol. 1997;11:1103-13.
  50. Kawane T, Qin X, Jiang Q, Miyazaki T, Komori H, Yoshida CA, MatsuuraKawata VKdS, Sakane C, Matsuo Y, Nagai K. Runx2 is required for the proliferation of osteoblast progenitors and induces proliferation by regulating Fgfr2 and Fgfr3. Sci Rep. 2018;8:13551.
  51. Seweryn A, Alicka M, Fal A, Kornicka-Garbowska K, Lawniczak-Jablonska K, Ozga M, Kuzmiuk P, Godlewski M, Marycz K. Hafnium (IV) oxide obtained by atomic layer deposition (ALD) technology promotes early osteogenesis via activation of Runx2-OPN-mir21A axis while inhibits osteoclasts activity. J Nanobiotechnol. 2020;18:1-16.
  52. Wittmann C, Chockley P, Singh SK, Pase L, Lieschke GJ, Grabher C. Hydrogen peroxide in inflammation: messenger, guide, and assassin. Adv Hematol. 2012;2012: 541471.
  53. Luo X, Wan Q, Cheng L, Xu R. Mechanisms of bone remodeling and therapeutic strategies in chronic apical periodontitis. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12: 908859.
  54. Cai C, Chen , Y, Jiang . Advances in the role of sodium hypochlorite irrigant in chemical preparation of root canal treatment. Biomed Res Int. 2023;2023:8858283.
  55. Azim AA, Aksel H, Margaret Jefferson M, Huang GT. Comparison of sodium hypochlorite extrusion by five irrigation systems using an artificial root socket model and a quantitative chemical method. Clin Oral Investig. 2018;22:1055-61.
  56. Mei Z, Gao D, Hu D, Zhou H, Ma T, Huang L, Liu X, Zheng R, Zheng H, Zhao P, et al. Activatable NIR-II photoacoustic imaging and photochemical synergistic therapy of MRSA infections using miniature Au/Ag nanorods. Biomaterials. 2020;251: 120092.
  57. Badran Z, Rahman B, De Bonfils P, Nun P, Coeffard V, Verron E. Antibacterial nanophotosensitizers in photodynamic therapy: an update. Drug Discov Today. 2023;28: 103493.
  58. Swimberghe RCD, Coenye T, De Moor RJG, Meire MA. Biofilm model systems for root canal disinfection: a literature review. Int Endod J. 2019;52:604-28.

Publisher’s Note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.