DOI: https://doi.org/10.1038/s41531-025-00882-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40021643
تاريخ النشر: 2025-02-28
المؤلف: Elizaveta Gerasimova وآخرون
الموضوع الرئيسي: آليات الالتهاب العصبي والتنكس العصبي
نظرة عامة
تسلط هذه القسم من ورقة البحث الضوء على تطوير نموذج جديد للزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد (3D) يدمج الأورام العضوية المستمدة من خلايا جذعية بشرية في الدماغ الأوسط (hMO) مع خلايا T من الدم المحيطي للتحقيق في تفاعلاتها في سياق مرض باركنسون (PD). تكشف الدراسة أن الأورام تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا الخاصة بالدماغ الأوسط، مما يسهل فحص حركة خلايا T وتفاعلاتها مع أنسجة الدماغ الأوسط ضمن بيئة ميكروية منظمة.
قام الباحثون بتحسين ظروف الزراعة المشتركة، مما يظهر أن خلايا T يمكن أن تتسلل إلى أنسجة hMO، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية. تؤكد هذه النتيجة على إمكانية نموذج الزراعة المشتركة ثلاثي الأبعاد كأداة قيمة لاستكشاف دور الجهاز المناعي التكيفي في الدماغ الأوسط، مما يمهد الطريق للتحقيقات المستقبلية في الآليات الكامنة وراء مرض PD.
طرق
في هذه الدراسة، تم إنتاج وزراعة خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات مستحثة (hiPSCs) باستخدام نقل الفيروسات الرجعية لعوامل النسخ OCT3/4 و c-MYC و SOX2 و KLF4، وفقًا للبروتوكولات المعمول بها. تم فحص خطوط hiPSC من حيث تعدد القدرات والكروموسومات المستقرة من خلال تحليل الكروموسومات باستخدام G-banding، مع الالتزام بالإرشادات الأخلاقية والحصول على موافقة مستنيرة من المتبرعين. تم زراعة hiPSCs على أطباق مغطاة بـ Geltrex في وسط mTeSR Plus عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂، مع تغييرات يومية في الوسط وزراعة عند حوالي 70% من التقاء الخلايا باستخدام ReLeSR.
للتمايز إلى الأورام العضوية في الدماغ الأوسط (hMO)، تم فصل hiPSCs وزراعتها مع مثبط ROCK لتعزيز البقاء. بعد سلسلة من تغييرات الوسط وإضافة SHH-C25II و FGF8 لتشكيل نمط الدماغ الأوسط، تم تضمين hMO في Matrigel وزراعتها في وسط متخصص لدعم نمو الأعصاب الظهارية. بالمثل، تم إنتاج الأورام القشرية البشرية (hCO) من خلال تشكيل أجسام جنينية (EBs) من hiPSCs، تلتها سلسلة من تعديلات الوسط لتسهيل تشكيل الكريات العصبية الظهارية والتضمين اللاحق في Matrigel للنمو ثلاثي الأبعاد. تم زراعة كلا النوعين من الأورام في ظروف تعزز تبادل المغذيات والأكسجين، مع تجديد منتظم للوسط للحفاظ على البقاء على المدى الطويل.
نتائج
في هذه الدراسة، تم إنتاج الأورام العضوية في الدماغ الأوسط (hMO) بنجاح من خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات مستحثة (hiPSCs) مستمدة من متبرعين أصحاء وتمت ملاحظتها من حيث التمايز العصبي على مدى فترة نضوج مدتها 60 يومًا. بحلول اليوم 35، أظهرت hMO تنظيمًا مشابهًا للدماغ الأوسط، مع انخفاض كبير في خلايا SOX2+ العصبية من 63.66% إلى 29.77%، وزيادة في خلايا MAP2+ العصبية الناضجة من 27.6% إلى 37.4%. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد خلايا عصبية دوبامينية (TH+) وسلفها (FOXA2+)، مما يشير إلى انتقال من خلايا عصبية سلفية إلى خلايا عصبية ناضجة مع الاحتفاظ ببعض خلايا السلف. أكدت PCR الكمي في الوقت الحقيقي هذه النتائج، حيث أظهرت انخفاضًا في تعبير SOX2 وزيادة في MAP2 و β3-tubulin، إلى جانب مستويات مستقرة من OTX و FOXA2.
استكشفت الدراسة أيضًا ظروف الزراعة المشتركة المثلى لـ hMO وخلايا T، كاشفة أن الإنترلوكين-2 (IL-2) ضروري لبقاء خلايا T وتنشيطها. أظهرت قياسات التدفق أن خلايا T المنشطة تسللت إلى أنسجة hMO بشكل أكثر فعالية من خلايا T غير المنشطة، حيث نجح حوالي 1.5% من خلايا T المنشطة في الهجرة إلى الأورام. تشير وجود الإنتغرينات LFA-1 و VLA-4 على خلايا T المتسللة إلى أنها مجهزة جيدًا للتفاعل مع الأنسجة، بينما من المحتمل أن يسهل تعبير جزيئات الالتصاق مثل ICAM-1 و VCAM-1 في أنسجة hMO احتفاظ خلايا T. تؤكد هذه النتائج على إمكانية استخدام hMO كنموذج لدراسة تفاعلات خلايا T في أنسجة الدماغ، خاصة في سياق الأمراض التنكسية العصبية.
مناقشة
في هذه الدراسة، تم تطوير نموذج زراعة مشتركة ثلاثي الأبعاد للأورام العضوية في الدماغ الأوسط (hMO) وخلايا T من الدم المحيطي للتحقيق في تفاعلات خلايا T مع خلايا الدماغ، خاصة في سياق الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون (PD). تشير النتائج إلى أن تسلل خلايا T إلى hMO يرتبط بزيادة في موت الخلايا العصبية، كما يتضح من الزيادة الكبيرة في خلايا TUNEL+ وانخفاض إشارة الخلايا العصبية MAP2+. تم تصنيف غالبية خلايا T المتسللة على أنها CD8+ و CD4+، حيث أظهرت خلايا T CD8+ علامات سامة للخلايا مثل granzyme B و CD107a، مما يشير إلى دورها المباشر في تلف الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تطلقها هذه الخلايا T إلى تفاقم إصابة الخلايا العصبية، مما يبرز الآليات المزدوجة التي تساهم من خلالها خلايا T في السمية العصبية.
استكشفت الدراسة أيضًا قابلية hMO لتسلل خلايا T حسب العمر، كاشفة أن الأورام الأقدم (اليوم 60) أظهرت وجودًا أكبر بكثير لخلايا T وفقدانًا عصبيًا مرتبطًا مقارنة بالأورام الأصغر (اليوم 30). علاوة على ذلك، تم تعديل النموذج ليشمل الأورام الدماغية البشرية (hCO)، مما يظهر أنه بينما يمكن لخلايا T التسلل إلى hCO، كانت السمية العصبية الناتجة ضئيلة مقارنة بـ hMO. يشير هذا إلى أن مناطق الدماغ المختلفة قد تظهر تعرضات متفاوتة للتلف الناتج عن خلايا T. يشير غياب تعبير معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الفئة I في hMO إلى أن السمية الملحوظة من المحتمل أن تكون متوسطة من خلال آليات مستقلة عن MHC. بشكل عام، يوفر هذا النموذج للزراعة المشتركة منصة قيمة لدراسة تفاعلات خلايا T مع أنسجة الدماغ وآثارها في الأمراض التنكسية العصبية، مما يمهد الطريق لأبحاث مستقبلية باستخدام خلايا مستمدة من المرضى لفهم استجابات المناعة الخاصة بالمرض بشكل أفضل.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41531-025-00882-8
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40021643
Publication Date: 2025-02-28
Author(s): Elizaveta Gerasimova et al.
Primary Topic: Neuroinflammation and Neurodegeneration Mechanisms
Overview
This section of the research paper highlights the development of a novel three-dimensional (3D) co-culture model that integrates stem cell-derived human midbrain organoids (hMO) with peripheral blood T cells to investigate their interactions in the context of Parkinson’s disease (PD). The study reveals that the organoids contain various midbrain-specific cell types, which facilitate the examination of T cell motility and their interactions with midbrain tissue within a structured microenvironment.
The researchers optimized the co-culture conditions, demonstrating that T cells can infiltrate the hMO tissue, resulting in neural cell loss. This finding underscores the potential of the 3D cell co-culture model as a valuable tool for exploring the role of the adaptive immune system in the midbrain, paving the way for future investigations into the mechanisms underlying PD.
Methods
In this study, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were generated and cultivated using retroviral transduction of the transcription factors OCT3/4, c-MYC, SOX2, and KLF4, following established protocols. The hiPSC lines were screened for pluripotency and stable karyotype through G-banding chromosomal analysis, adhering to ethical guidelines and obtaining informed consent from donors. The hiPSCs were cultured on Geltrex-coated plates in mTeSR Plus media at 37°C with 5% CO₂, with daily media changes and passaging at approximately 70% confluence using ReLeSR.
For differentiation into human midbrain organoids (hMO), hiPSCs were dissociated and plated with a ROCK inhibitor to promote survival. Following a series of media changes and the addition of SHH-C25II and FGF8 for midbrain patterning, the hMO were embedded in Matrigel and cultured in a specialized medium to support neuroepithelial growth. Similarly, human cortical organoids (hCO) were generated by forming embryoid bodies (EBs) from hiPSCs, followed by a series of media adjustments to facilitate neuroectodermal spheroid formation and subsequent embedding in Matrigel for 3D growth. Both organoid types were cultured under conditions that enhanced nutrient and oxygen exchange, with regular media replenishment to maintain long-term viability.
Results
In this study, human midbrain organoids (hMO) were successfully generated from healthy donor-derived induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and characterized for neuronal differentiation over a 60-day maturation period. By day 35, hMO exhibited midbrain-like organization, with a significant decrease in SOX2+ neuroprogenitors from 63.66% to 29.77%, and an increase in mature MAP2+ neurons from 27.6% to 37.4%. Additionally, dopaminergic neurons (TH+) and progenitors (FOXA2+) were identified, indicating a transition from neuroprogenitors to mature neurons while retaining some progenitor cells. Quantitative real-time PCR further confirmed these findings, showing a decrease in SOX2 expression and an increase in MAP2 and β3-tubulin, alongside stable levels of OTX and FOXA2.
The study also explored optimal co-culture conditions for hMO and T cells, revealing that interleukin-2 (IL-2) is crucial for T cell viability and activation. Flow cytometry demonstrated that activated T cells infiltrated hMO tissue more effectively than non-activated T cells, with approximately 1.5% of activated T cells successfully migrating into the organoid. The presence of integrins LFA-1 and VLA-4 on infiltrating T cells suggests they are well-equipped for tissue interaction, while the expression of adhesion molecules such as ICAM-1 and VCAM-1 in hMO tissue likely facilitates T cell retention. These findings underscore the potential of hMO as a model for studying T cell interactions in midbrain tissue, particularly in the context of neurodegenerative diseases.
Discussion
In this study, a 3D co-culture model of human midbrain organoids (hMO) and peripheral blood T cells was developed to investigate T cell-brain cell interactions, particularly in the context of neurodegenerative diseases like Parkinson’s disease (PD). The findings indicate that T cell infiltration into hMO correlates with increased neuronal cell death, as evidenced by a significant rise in TUNEL+ cells and a decrease in MAP2+ neuronal signal. The majority of infiltrating T cells were characterized as CD8+ and CD4+, with CD8+ T cells exhibiting cytotoxic markers such as granzyme B and CD107a, suggesting their direct role in neuronal damage. Additionally, pro-inflammatory cytokines released by these T cells may exacerbate neuronal injury, highlighting the dual mechanisms through which T cells contribute to neurotoxicity.
The study also explored the age-dependent susceptibility of hMO to T cell infiltration, revealing that older organoids (day 60) exhibited significantly greater T cell presence and associated neuronal loss compared to younger organoids (day 30). Furthermore, the model was adapted to include human cerebral organoids (hCO), demonstrating that while T cells could infiltrate hCO, the resulting neurotoxicity was minimal compared to hMO. This suggests that different brain regions may exhibit varying vulnerabilities to T cell-mediated damage. The absence of major histocompatibility complex (MHC) class I expression in hMO indicates that the observed cytotoxicity is likely mediated through MHC-independent mechanisms. Overall, this co-culture model provides a valuable platform for studying T cell interactions with brain tissue and their implications in neurodegenerative diseases, paving the way for future research using patient-derived cells to better understand disease-specific immune responses.