DOI: https://doi.org/10.1186/s12917-025-04660-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40205385
تاريخ النشر: 2025-04-09
المؤلف: Zhenyun Du وآخرون
الموضوع الرئيسي: بروسيلا: التشخيص، الوبائيات، العلاج
نظرة عامة
**نظرة عامة**
تسبب داء البروسيلات، الذي تسببه بشكل أساسي *Brucella melitensis*، مخاطر صحية كبيرة على البشر والماشية، وخاصة في الأغنام. ركزت هذه الدراسة على تطوير طريقة غير جراحية وسريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن *Brucella spp.* في حليب الأغنام المجمّع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). تم تحليل ما مجموعه 144 عينة حليب من قطعان الأغنام الإيجابية المصل، مع استخراج الحمض النووي من 186 عينة مجمعة وفردية. تم تحديد حد الكشف لـ qPCR عند 100 CFU/ml، مقارنة بـ 300 CFU/ml لزراعة الميكروبات، مما يبرز حساسية qPCR المتفوقة. من بين المجموعات المختبرة، كانت أربع من أصل ستة إيجابية لـ *Brucella*، مما يظهر فعالية الطريقة في تحديد الحيوانات المصابة ضمن مجموعات أكبر.
تؤكد النتائج على إمكانية استخدام qPCR كأداة تشخيصية مكملة لمراقبة إصابات *Brucella* في قطعان الأغنام. بينما تحتوي الاختبارات المصلية على قيود، خاصة بالنسبة للحيوانات الفردية، فإن طريقة qPCR تقدم بديلاً غير جراحي يقلل من تكرار الاختبارات والمخاطر المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن الاعتماد على عينات الحليب، التي قد لا تكون متاحة دائمًا، يتطلب اعتبارًا دقيقًا لتوقيت جمع العينات لضمان تشخيص دقيق. بشكل عام، يمكن أن تعزز هذه الطريقة المراقبة الوبائية وتوجه ممارسات التجارة العالمية، بشرط أن يتم التحقق من خصائص الاختبار بدقة للتطبيقات المحددة.
مقدمة
تسلط مقدمة ورقة البحث الضوء على انتشار داء البروسيلات عالميًا، وهو مرض حيواني المنشأ مع أكثر من 500,000 حالة جديدة من البشر يتم الإبلاغ عنها سنويًا، يتم نقله بشكل أساسي من خلال الاتصال المباشر مع أنسجة الحيوانات المصابة أو استهلاك منتجات الألبان غير المبسترة. العامل المسبب الرئيسي المرتبط بداء البروسيلات لدى البشر هو *Brucella melitensis*، الذي يشكل خطرًا أكبر بسبب جرعته المعدية المنخفضة مقارنةً بأنواع أخرى. في البلدان النامية، يُقبل استهلاك الحليب الخام من حيوانات متنوعة ثقافيًا، مما يزيد من خطر الانتقال، خاصة في مناطق مثل إيران حيث تعتبر منتجات الألبان غير المبسترة عوامل خطر كبيرة للإصابة.
تواجه الطرق التشخيصية الحالية لداء البروسيلات في الأغنام، مثل عزل البكتيريا والاختبارات المصلية، تحديات تشمل استهلاك الوقت، وانخفاض الحساسية، وإمكانية حدوث نتائج سلبية وإيجابية خاطئة بسبب التفاعل المتبادل مع مسببات الأمراض الأخرى. تهدف هذه الدراسة إلى تقييم فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) كطريقة سريعة وحساسة وغير جراحية للكشف عن *Brucella* في حليب الأغنام المجمّع. من خلال استخدام qPCR، تسعى الدراسة إلى تعزيز كفاءة فحص مسببات الأمراض، وتقليل تكاليف الاختبار، وفي النهاية التخفيف من الآثار الاقتصادية والصحية العامة المرتبطة بداء البروسيلات في الماشية.
طرق
توضح قسم “الطرق” الأساليب التجريبية والتحليلية المستخدمة في الدراسة. تتفصل في الإجراءات المحددة المستخدمة لجمع البيانات، بما في ذلك معايير الاختيار للمشاركين والأدوات المستخدمة للقياس. يصف القسم أيضًا التقنيات الإحصائية المطبقة لتحليل البيانات، مما يضمن أن النتائج قوية وموثوقة.
بالإضافة إلى ذلك، تشمل المنهجية أي ضوابط تجريبية ومتغيرات تم التلاعب بها أو قياسها طوال الدراسة. يسمح هذا النهج الصارم بفهم شامل للظواهر قيد التحقيق، مما يسهل تفسير النتائج في سياق الأدبيات الموجودة. بشكل عام، تم تصميم الطرق المستخدمة لضمان صلاحية وقابلية تكرار نتائج البحث.
نتائج
تظهر نتائج هذه الدراسة فعالية نهج qPCR المجمع للكشف عن *Brucella melitensis* في حليب الأغنام. تم إنشاء منحنى قياسي مع المعادلة \( y = -3.36X + 34.53 \)، مما يظهر كفاءة عالية (0.986) وارتباط قوي (R² = 0.9979). تم تحديد حد الكشف لزراعة البكتيريا عند 300 CFU/ml، مع إيجابية 40% فقط عند 200 CFU/ml. بالمقابل، نجح اختبار qPCR في الكشف عن 10 CFU/100 µl في جميع النسخ، لكنه فشل عند 5 CFU/100 µl. من بين 186 عينة تم تحليلها، كانت أربع من ست مجموعات وست من اثني عشر مجموعة فرعية إيجابية، بينما كانت إيجابية العينات الفردية محدودة بتسع من 144.
تشير النتائج إلى أن تجميع عينات الحليب يمكن أن يقلل بشكل فعال من تكاليف الاختبار مع الحفاظ على دقة التشخيص لفحص قطعان *Brucella melitensis*. تسلط الدراسة الضوء على إمكانية إجراء اختبارات qPCR دورية للعينات المجمعة كطريقة غير جراحية لتحديد الحيوانات المصابة، مما يقلل من الخسائر الاقتصادية ويعزز الصحة العامة. يتماشى هذا النهج مع توصيات منظمة الصحة العالمية لتأكيد داء البروسيلات في العينات الفردية، بينما يعالج أيضًا تحديات مراقبة قطعان الماشية.
مناقشة
تسلط المناقشة الضوء على التأثير الكبير لبكتيريا *Brucella*، وخاصة *B. melitensis*، على صحة الماشية وسلامة العامة، خاصة في المناطق ذات معدل الإصابة العالي بداء البروسيلات. استخدمت الدراسة qPCR للكشف عن أنواع *Brucella* في حليب الأغنام، محققة حساسية قدرها 100 CFU/ml لـ *B. melitensis*، وهو ما يتناقض مع النتائج السابقة التي أفادت بحدود كشف أعلى. تشمل العوامل التي تسهم في هذه التباينات نوع الحليب المستخدم، وطرق استخراج الحمض النووي، وحساسية اختبار qPCR. تؤكد الدراسة على مزايا qPCR مقارنةً بـ PCR التقليدي، بما في ذلك تقليل خطر التلوث وسرعة النتائج، على الرغم من أن التحديات لا تزال قائمة في استخراج الحمض النووي بسبب دهون الحليب.
شملت العينة 144 عينة حليب من أغنام إيجابية مصلية عبر أربع مزارع، مع بروتوكولات صارمة للنظافة لمنع التلوث. استكشفت الدراسة أيضًا كفاءة تجميع العينات للاختبار، محددة أن الحد الأقصى من 24 عينة لكل مجموعة يمكن إدارته بشكل فعال دون فقدان الحالات الإيجابية. تؤكد النتائج على ضرورة التحقق من اختبارات التشخيص مثل qPCR للمراقبة الوبائية والتجارة العالمية، مشيرة إلى أنه بينما يوفر qPCR طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن *Brucella* في الحليب المجمّع، فإن توفر وتوقيت عينات الحليب أمران حاسمان للتشخيص الدقيق.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12917-025-04660-9
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40205385
Publication Date: 2025-04-09
Author(s): Zhenyun Du et al.
Primary Topic: Brucella: diagnosis, epidemiology, treatment
Overview
**Overview**
Brucellosis, primarily caused by *Brucella melitensis*, poses significant health risks to humans and livestock, particularly in sheep. This study focused on developing a noninvasive, rapid, and cost-effective method for detecting *Brucella spp.* in pooled sheep milk using quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). A total of 144 milk samples from seropositive sheep herds were analyzed, with DNA extracted from 186 pooled and individual samples. The limit of detection for qPCR was established at 100 CFU/ml, compared to 300 CFU/ml for microbial culture, highlighting qPCR’s superior sensitivity. Among the tested pools, four out of six were positive for *Brucella*, demonstrating the method’s efficacy in identifying infected animals within larger groups.
The findings underscore the potential of qPCR as a complementary diagnostic tool for monitoring *Brucella* infections in sheep herds. While serological tests have limitations, particularly for individual animals, the qPCR method offers a noninvasive alternative that reduces testing frequency and associated risks. However, the reliance on milk samples, which may not always be available, necessitates careful consideration of sample collection timing to ensure accurate diagnoses. Overall, this approach could enhance epidemiological surveillance and inform global trade practices, provided that the test’s characteristics are thoroughly validated for specific applications.
Introduction
The introduction of the research paper highlights the global prevalence of brucellosis, a zoonotic disease with over 500,000 new human cases reported annually, primarily transmitted through direct contact with infected animal tissues or consumption of unpasteurized dairy products. The primary pathogen associated with human brucellosis is *Brucella melitensis*, which poses a higher risk due to its lower infectious dose compared to other species. In developing countries, the consumption of raw milk from various animals is culturally accepted, increasing the risk of transmission, particularly in regions like Iran where unpasteurized dairy products are significant risk factors for infection.
Current diagnostic methods for brucellosis in sheep, such as bacterial isolation and serological tests, face challenges including time consumption, low sensitivity, and potential for false negatives and positives due to cross-reactivity with other pathogens. This study aims to evaluate the effectiveness of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) as a rapid, sensitive, and non-invasive method for detecting *Brucella* in pooled sheep milk. By employing qPCR, the research seeks to enhance pathogen screening efficiency, reduce testing costs, and ultimately mitigate the economic and public health impacts associated with brucellosis in livestock.
Methods
The “Methods” section outlines the experimental and analytical approaches employed in the study. It details the specific procedures used for data collection, including the selection criteria for participants and the tools utilized for measurement. The section also describes the statistical techniques applied to analyze the data, ensuring that the findings are robust and reliable.
Additionally, the methodology includes any experimental controls and variables that were manipulated or measured throughout the study. This rigorous approach allows for a comprehensive understanding of the phenomena under investigation, facilitating the interpretation of results in the context of existing literature. Overall, the methods employed are designed to ensure the validity and reproducibility of the research findings.
Results
The results of this study demonstrate the effectiveness of a pooled qPCR approach for detecting Brucella melitensis in sheep milk. A standard curve was established with the equation \( y = -3.36X + 34.53 \), showing high efficiency (0.986) and a strong correlation (R² = 0.9979). The detection limit for bacterial culture was determined to be 300 CFU/ml, with only 40% positivity at 200 CFU/ml. In contrast, the qPCR assay successfully detected 10 CFU/100 µl in all replicates, but failed at 5 CFU/100 µl. Among 186 samples analyzed, four out of six groups and six out of twelve subgroups tested positive, while individual sample positivity was limited to nine out of 144.
The findings suggest that pooling milk samples can effectively reduce testing costs while maintaining diagnostic accuracy for herd-level screening of Brucella melitensis. The study highlights the potential for periodic qPCR testing of pooled samples as a non-invasive method to identify infected animals, thereby mitigating economic losses and enhancing public health. This approach aligns with WHO recommendations for confirming Brucellosis in individual samples, while also addressing the challenges of herd-level monitoring.
Discussion
The discussion highlights the significant impact of Brucella bacteria, particularly B. melitensis, on livestock health and public safety, especially in regions with high brucellosis incidence. The study utilized qPCR to detect Brucella species in sheep milk, achieving a sensitivity of 100 CFU/ml for B. melitensis, which contrasts with previous findings that reported higher detection thresholds. Factors contributing to these discrepancies include the type of milk used, DNA extraction methods, and the sensitivity of the qPCR assay. The study emphasizes the advantages of qPCR over traditional PCR, including reduced contamination risk and faster results, although challenges remain in DNA extraction due to milk fat.
Sampling involved 144 milk samples from serologically positive sheep across four farms, with strict hygiene protocols to prevent contamination. The study also explored the efficiency of pooling samples for testing, determining that a maximum of 24 samples per pool could be effectively managed without losing positive cases. The findings underscore the necessity of validating diagnostic tests like qPCR for epidemiological surveillance and global trade, noting that while qPCR provides a rapid and cost-effective method for detecting Brucella in pooled milk, the availability and timing of milk samples are critical for accurate diagnosis.