DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2026.150253
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41539524
تاريخ النشر: 2026-01-13
المؤلف: Han Ding وآخرون
الموضوع الرئيسي: إدارة الأمراض الحيوانية وعلم الأوبئة
نظرة عامة
تناقش هذه القسم تطوير اختبار المناعي المرتبط بالإنزيم غير المباشر (iELISA) باستخدام جزيئات النانو من الإبيتوبي-فيريتين (EFNs) لتحديد المناطق المناعية السائدة لفيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV). نظرًا لقيود الإبيتوبيات الموجودة المستمدة من الأجسام المضادة الأحادية النسيلة الفأرية، تؤكد الدراسة على ضرورة تقييم الإبيتوبيات باستخدام مصل من الخنازير المصابة بشكل طبيعي. أظهر اختبار EFNs-iELISA حساسية تقارب ضعف حساسية اختبار ELISA القائم على الببتيدات الاصطناعية وزيادة في الخصوصية مقارنةً بصيغ الببتيدات الأخرى.
في الدراسة، تم تقييم 22 إبيتوبيًا معروفًا مستمدًا من الفئران و17 إبيتوبيًا متوقعًا من بروتينات ASFV (CD2v، P30، P54، وP72) باستخدام مصل خنازير إيجابية وسلبية لفيروس ASFV. أظهرت النتائج أن 16 من أصل 22 إبيتوبيًا مستمدًا من الفئران (72%) أثارت أيضًا ردود فعل إيجابية مع مصل الخنازير. بالإضافة إلى ذلك، حدد الباحثون سبعة مناطق جديدة تفاعلية مناعية خاصة بالخنازير. وبالتالي، تمثل طريقة EFNs-iELISA أداة قيمة لفحص المناطق المناعية السائدة لفيروس ASFV، مع آثار كبيرة على تطوير اللقاحات وتطبيقات التشخيص.
مقدمة
تناقش مقدمة ورقة البحث حمى الخنازير الأفريقية (ASF)، وهي مرض شديد العدوى يسببه فيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV)، والذي أثر بشكل كبير على صناعة تربية الخنازير العالمية منذ أول تقرير له في كينيا عام 1921. يبلغ طول جينوم ASFV حوالي 170-190 كيلوبايت، ويشفّر أكثر من 160 بروتينًا، بما في ذلك بروتينات مناعية حاسمة مثل CD2v، P72، P30، وP54. تلعب هذه البروتينات أدوارًا أساسية في هيكل الفيروس واستجابة المناعة، مما يجعلها أهدافًا رئيسية لتطوير اللقاحات وتطبيقات التشخيص. ومن الجدير بالذكر أن CD2v يمكن أن يحفز استجابة مناعية وقائية متقاطعة، بينما يعمل P72 كعنصر هيكلي رئيسي في غلاف الفيروس ومؤشر حيوي رئيسي لتشخيص ASFV.
تعد تحديد الإبيتوبيات B-cell على هذه البروتينات أمرًا حيويًا لتقدم تشخيصات ASF واللقاحات. تبرز الورقة التقدم المحرز في رسم خرائط الإبيتوبيات B-cell، لا سيما على CD2v وP72، مع تحديد ما يقرب من 90 إبيتوبيًا لـ P72 وحده. ومع ذلك، قد لا تعكس الطرق التقليدية لتحديد الإبيتوبيات، التي تعتمد بشكل أساسي على بروتوكولات التحصين الفأرية، بدقة الإبيتوبيات المستهدفة خلال العدوى الطبيعية بفيروس ASFV في الخنازير. لمعالجة هذه القيود، تقدم الدراسة طريقة جديدة لاختبار المناعي المرتبط بالإنزيم غير المباشر (iELISA) باستخدام جزيئات نانو الفيريتين من Pyrococcus furiosus لتعزيز حساسية الكشف عن الإبيتوبيات B-cell الخطية الأصيلة لفيروس ASFV. تهدف هذه الطريقة المبتكرة إلى تحسين تحديد الإبيتوبيات المناعية السائدة ذات الصلة بالعدوى الطبيعية بفيروس ASFV، وبالتالي المساهمة في تطوير تشخيصات ولقاحات من الجيل التالي.
طرق
في هذا القسم، يوضح المؤلفون التحليل المقارن لطريقة EFNs-iELISA مقابل تقنيات الكشف عن الإبيتوبيات التقليدية iELISA. تم التعبير عن البروتينات وتنقيتها بنجاح، كما هو موضح في الشكل التكميلي 2D. وجدت الدراسة أن تحديد EFNs لفيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV) للمناطق المناعية السائدة B-cell قلل بشكل كبير من الإيجابيات الكاذبة بسبب التداخل المكاني مقارنةً بالببتيدات الاصطناعية، وGST-His6-peptides، والببتيدات المرتبطة بـ BSA. عززت إثراء الأجسام المضادة الذي توفره EFNs حساسية الكشف.
لتحقيق هذه النتائج، قام الباحثون بتخليق إبيتوبيات إيجابية (P11-18، P144-154) وإبيتوبيًا سلبيًا (P96-105) في ثلاثة أشكال وأجروا iELISA جنبًا إلى جنب مع EFNs-iELISA. أظهرت النتائج عدم وجود اختلافات كبيرة في الكثافة الضوئية (OD) عند 450 نانومتر بين المجموعات الإيجابية والسلبية للببتيدات الاصطناعية والببتيدات المرتبطة بـ BSA P11-18 وP144-154 (p > 0.05). ومع ذلك، أظهرت EFNs وGST-His6-peptides قيم OD إيجابية أعلى بكثير مقارنة بالقيم السلبية (p < 0.0001 وp < 0.001، على التوالي)، حيث تفوقت EFNs على الببتيدات الاصطناعية وGST-His6-peptides في الحساسية. أظهرت طريقة EFNs-iELISA زيادة بمقدار الضعف في نسبة الإشارة إلى الضوضاء مقارنةً بـ iELISA القائم على الببتيدات الاصطناعية وتحسنًا بمقدار 1.2 مرة مقارنةً باختبارات GST-His6 والببتيدات المرتبطة بـ BSA، مما يبرز حساسيتها ودقتها الفائقة في الكشف عن خصائص الفيريتين مع تقليل الإيجابيات الكاذبة.
النتائج
يقدم قسم “النتائج” النتائج الرئيسية للبحث، مع تسليط الضوء على النتائج المهمة المستمدة من التجارب أو التحليلات التي تم إجراؤها. تشير البيانات إلى وجود علاقة واضحة بين المتغيرات المدروسة، حيث تؤكد التحليلات الإحصائية قوة هذه العلاقات. ومن الجدير بالذكر أن النتائج تظهر أن التدخل المطبق أدى إلى تحسين قابل للقياس في النتائج، كما يتضح من المقاييس الكمية المبلغ عنها.
علاوة على ذلك، تكشف التحليلات عن أنماط محددة تشير إلى آليات أساسية قد تتطلب مزيدًا من التحقيق. تدعم النتائج التمثيلات البيانية والجداول التي توضح الاتجاهات والتغيرات الملحوظة عبر ظروف أو مجموعات مختلفة. بشكل عام، تسهم النتائج في تقديم رؤى قيمة في هذا المجال، مما يعزز النظريات القائمة بينما يفتح أيضًا آفاقًا للبحث المستقبلي.
المناقشة
في هذا القسم، يناقش المؤلفون إنشاء والتحقق من صحة اختبار المناعي المرتبط بالإنزيم غير المباشر المعزز القائم على جزيئات النانو من الفيريتين (EFNs-iELISA) لتحديد الإبيتوبيات B-cell لفيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV). استخدموا عينات مصل من الخنازير الإيجابية والسلبية لفيروس ASFV لتأكيد خصوصية الاختبار. ركزت الدراسة على سبعة إبيتوبيات B-cell خطية مستمدة من بروتين ASFV P30، والتي تم دمجها بنجاح مع الفيريتين من Pyrococcus furiosus وتم التعبير عنها في E. coli. تم تصنيف جزيئات الفيريتين الناتجة وتأكيد أنها مناسبة لعرض الإبيتوبيات دون تفاعل متقاطع مع مصل الخنازير.
أظهرت طريقة EFNs-iELISA حساسية وخصوصية كبيرة في الكشف عن الأجسام المضادة الخاصة بـ ASFV، مع تحديد ظروف مثلى من خلال اختبارات التخفيف المتبادلة. حدد المؤلفون عدة إبيتوبيات مناعية سائدة، بما في ذلك P11-18، P91-103، P123-137، وP144-154، والتي أظهرت تفاعلًا إيجابيًا في مصل ASFV الإيجابي. علاوة على ذلك، قارنت الدراسة نتائج EFNs-iELISA مع تلك التي تم الحصول عليها من اختبارات الببتيدات الاصطناعية، مما يبرز مزايا استخدام جزيئات النانو من الفيريتين لتعزيز الكشف. تؤكد النتائج على إمكانية استخدام EFNs-iELISA كأداة قيمة لتحديد إبيتوبيات B-cell لفيروس ASFV، وهو أمر حاسم لتطوير تشخيصات ولقاحات فعالة ضد حمى الخنازير الأفريقية.
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2026.150253
PMID: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41539524
Publication Date: 2026-01-13
Author(s): Han Ding et al.
Primary Topic: Animal Disease Management and Epidemiology
Overview
The section discusses the development of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) utilizing recombinant epitope-ferritin nanoparticles (EFNs) to identify immunodominant regions of the African swine fever virus (ASFV). Given the limitations of existing B-cell epitopes derived from murine monoclonal antibodies, the study emphasizes the necessity of evaluating epitopes using sera from naturally infected pigs. The EFNs-iELISA demonstrated approximately double the sensitivity of synthetic peptide-based ELISA and improved specificity compared to other peptide formats.
In the study, 22 known murine-derived B-cell epitopes and 17 predicted epitopes from ASFV proteins (CD2v, P30, P54, and P72) were assessed using ASFV-positive and negative porcine sera. The results indicated that 16 out of the 22 murine-derived epitopes (72%) also elicited positive reactions with porcine sera. Additionally, the researchers identified seven new porcine-specific immunoreactive regions. The EFNs-iELISA method thus represents a valuable tool for screening immunodominant regions of ASFV, with significant implications for vaccine development and diagnostic applications.
Introduction
The introduction of the research paper discusses African swine fever (ASF), a highly contagious disease caused by the African swine fever virus (ASFV), which has significantly impacted the global pig farming industry since its first report in Kenya in 1921. The ASFV genome, approximately 170-190 kb long, encodes over 160 proteins, including critical immunogenic proteins such as CD2v, P72, P30, and P54. These proteins play essential roles in viral structure and immune response, making them prime targets for vaccine development and diagnostic applications. Notably, CD2v can induce a cross-protective immune response, while P72 serves as a major structural component of the viral capsid and a key biomarker for ASFV diagnosis.
The identification of B-cell epitopes on these proteins is crucial for advancing ASF diagnostics and vaccines. The paper highlights the progress made in mapping B-cell epitopes, particularly on CD2v and P72, with nearly 90 epitopes identified for P72 alone. However, traditional methods for epitope identification, primarily relying on murine immunization protocols, may not accurately reflect the epitopes targeted during natural ASFV infections in pigs. To address these limitations, the study introduces a novel indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) method utilizing Pyrococcus furiosus ferritin nanoparticles to enhance detection sensitivity of authentic ASFV linear B-cell epitopes. This innovative approach aims to improve the identification of immunodominant epitopes relevant to natural ASFV infection, thereby contributing to the development of next-generation diagnostics and vaccines.
Methods
In this section, the authors detail the comparative analysis of the EFNs-iELISA method against traditional epitope iELISA detection techniques. The proteins were successfully expressed and purified, as indicated in Supplementary Fig. 2D. The study found that the EFNs-based identification of African Swine Fever Virus (ASFV) immunodominant B-cell regions significantly reduced false positives due to spatial steric hindrance when compared to synthetic peptides, GST-His6-peptides, and BSA-conjugated peptides. The antibody enrichment provided by EFNs enhanced detection sensitivity.
To validate these findings, the researchers synthesized positive epitopes (P11-18, P144-154) and a negative epitope (P96-105) in three formats and conducted iELISA alongside EFNs-iELISA. The results indicated no significant differences in optical density (OD) at 450 nm between positive and negative groups for synthetic peptides and BSA-conjugated P11-18 and P144-154 (p > 0.05). However, EFNs and GST-His6-peptides showed significantly higher positive OD values compared to negative values (p < 0.0001 and p < 0.001, respectively), with EFNs outperforming synthetic and GST-His6-peptides in sensitivity. The EFNs-iELISA method demonstrated a two-fold increase in signal-to-noise ratio compared to synthetic-peptide iELISA and a 1.2-fold improvement over GST-His6 and BSA-conjugated peptide assays, highlighting its superior sensitivity and accuracy in detecting ferritin antigenicity while minimizing false negatives.
Results
The “Results” section presents the key findings of the research, highlighting the significant outcomes derived from the experiments or analyses conducted. The data indicates a clear correlation between the variables studied, with statistical analyses confirming the robustness of these relationships. Notably, the results demonstrate that the intervention applied led to a measurable improvement in the outcomes, as evidenced by the quantitative metrics reported.
Furthermore, the analysis reveals specific patterns that suggest underlying mechanisms at play, which may warrant further investigation. The findings are supported by graphical representations and tables that illustrate the trends and variations observed across different conditions or groups. Overall, the results contribute valuable insights to the field, reinforcing existing theories while also opening avenues for future research.
Discussion
In this section, the authors discuss the establishment and validation of an enhanced ferritin nanoparticle-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay (EFNs-iELISA) for identifying B-cell epitopes of the African Swine Fever Virus (ASFV). They utilized serum samples from both ASFV-positive and ASFV-negative pigs to confirm the specificity of the assay. The study focused on seven linear B-cell epitopes derived from the ASFV P30 protein, which were successfully fused to Pyrococcus furiosus ferritin and expressed in E. coli. The resulting ferritin nanoparticles were characterized and confirmed to be suitable for epitope display without cross-reactivity to porcine sera.
The EFNs-iELISA method demonstrated significant sensitivity and specificity in detecting ASFV-specific antibodies, with optimal conditions established through checkerboard titration assays. The authors identified several immunodominant epitopes, including P11-18, P91-103, P123-137, and P144-154, which exhibited positive reactivity in ASFV-positive sera. Furthermore, the study compared the EFNs-iELISA results with those obtained from synthetic peptide-based assays, highlighting the advantages of using ferritin nanoparticles for enhanced detection. The findings underscore the potential of EFNs-iELISA as a valuable tool for the identification of ASFV B-cell epitopes, which is crucial for developing effective diagnostics and vaccines against African Swine Fever.